JPH03206882A - 抗ｈＣＧ―βコアモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ、該モノクローナル抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニツトコア
フラグメント（ｈｕｍａｎ　　ｃｈｏｒｉｏｎｉｃｇｏ
ｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ　　　β　　５ｕｂｕｎｉｔ　　
　ｃｏｒｅ　　　ｆｒａｇｍｅｎｔ、以下、ｈＣＧ−β
コアと略記する）およびｈｃｃ−βサブユニットを認識
するモノクローナル抗体を産生ずる新規ハイブリドーマ
および該モノクローナル抗体に関する。さらに本発明は
、該モノクローナル抗体を利用することを特徴とする免
疫化学的測定法ならびに測定試薬に関する。

従来の技術 ｈＣＧは妊娠と同時に形成される絨毛細胞から産生され
る蛋白ホルモンの一種であり、プロゲステロンの分泌を
促進する。ｈＣＧの検出は妊娠の初期診断に汎用されて
いる。さらに胞状奇胎、破壊胞状奇胎、絨毛層など絨毛
性疾患において、尿中、血中など体液中のｈＣＧ測定は
、これらの疾Φの早期発見、治療効果の判定、予後管理
などの面から極めて重要であることが判明している。

しかし、これらの診断には約１００１０／＆以下の微ｆ
ｆ１ｈＣＧの測定が必要であり、この際、問題となるの
はｈＣＧと類似の構造を有する蛋白ホルモン、すなわち
黄体形成ホルモン（以下、ｈｔ、ｏと略称することもあ
る）、卵胞刺激ホルモン（以下、ｈＦＳＩ−１と略称す
ることもある）および甲状腺刺激ホルモン（以下、ｈＴ
ｓＩＩと略称することらある）との免疫学的な交差反応
である。特にｈＬＩＩはｈＣＧと類似性か高く、生理的
な尿中のｈＬＩｌは１５０１ＬＪ／ｌ！に達することも
あるので、微量の体液中のｈＣＧを測定するためにはｈ
ＣＧとｈＬｔｌとを免疫学的に区別することが必要であ
る。

一方、これらの蛋白ホルモンの化学的解析から、その交
差反応性が共通構造の多いそれぞれのαサブユニット部
分に起因することが判明している。

そこで、比較的類似性の少ないｈＣＧのβ−サブユニッ
ト（以下、ｈＣＧ−βと略称することらある）を分離精
製し、抗ｈＣＧ−β抗体を作製してｈＣＧを特異的に検
出する試みがなされている。

しかしながら、ｈＣＧとｈＬｔｌとのβ−サブユニツ１
、間になお存在する共通のアミノ酸配列のため、抗ｈＣ
Ｇ−β抗体の使用ではｈＬ）ｌとの交差反応性を完全（
こ（＄除去できない。ところが、ｈＣＧ−βのＣ末端に
ある約３０個のアミノ酸よりなるペプチドはｈＬＨには
存在しないアミノ酸配列を示しており、この部分におい
てはｈＣＧとｈＬＨとを完全に識別することが可能とな
る。ｈＣＧ−βのＣ末端領域に対する抗体は、ｈＣＧ−
βのみと反応し、ｈＬＨとの交差反応を受けない。さら
に、ｈＣＧ−βに関する研究が進み、ｈＣＧ−βコア領
域（以下、単にβコアと称する場合もある）の存在する
ことが推定されるに至った。すなわち、βコアは、ヒト
絨毛性ゴナドトロピンβサブユニ・ソト（ｈＣＧ−β）
のアミノ酸残基６〜４０および５５〜９２の２つのペプ
チドがジスルフィド結合した分子量１２〜１７Ｋ　ダル
トンの糖蛋白質であり［エンドクリノロジー（Ｅ　ｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、　１２３　。

５７２．１９８８年］、卵巣癌、子宮癌を初めとする産
婦人科系の悪性腫瘍のみならず、胃癌、腎癌などの各種
悪性腫瘍患者尿中に存在することが明らかにされた［ジ
ャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・ア
ンド・メタボリズム（Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｔｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、）
、　５３　、　ｌ　ＯＩ　４　。

１９８１年；キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）、４５．２５
８３　。

１９８０年：アクタ・エンドクリノロシカ（ＡｃｔａＥ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、（Ｃｏｐｅｎｈ））、Ｉ　Ｉ　２
．４１５　、　Ｉ　９８６年］。しかしながら、その生
成、分泌、生理学的意義等については、定説といわれる
しのはなく、βコアの生物学的測定法は皆無である。ま
た、免疫学的測定法としてはＳｎ２と称されるポリクロ
ーナルな抗ｈＣＧ−β抗体を用いたラジオイムノアッセ
イが確立されているが［アメリカン・ジャーナル・オブ
・オブステトリクス・アンド・ノネコロジー（Ａｎ、　
Ｊ　、０ｂｓｔｅｔ、Ｇｙｎｅｃｏｌ、）、　Ｉ　ｌ　
３　。

７５１　１９７２年］、該抗体の親和性はβコアとヒト
絨毛性ゴナドトロピンおよびｈＣＧ−βとの間で差はな
く、区別することはできない。

近年、βコアを免疫原としてβコアを認識するモノクロ
ーナル抗体Ｂ２Ｏ２やＢ２０４が作製され［エンドクリ
ノロジー（Ｅ　ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、　Ｉ　２
３　。

５８４．１９８８年］、βコアのラジオイムノアッセイ
が報告された［キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓ、）、４８．１３６１．１９８８年；Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓ。

４８．１３５６．１９８８年］。

発明が解決しようとする課題 Ｓｎ２はポリクローナル抗体であり、ラジオイムノアッ
セイに利用した場合、βコア、ｈＣＧおよびｈＣＧ−β
と同様の親和性を示し、さらにｈｉ、■１とも約１０％
の交差反応性を有する。

Ｂ２Ｏ２やＢ２０４などはβコアを免疫して得られたモ
ノクローナル抗体である。エイ・クリチェフスキー（Ａ
　、　Ｋ　ｒｉｃｈｅｖｓｋｙ）らは前記エンドクリノ
ロノー（Ｅ　ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇＶ）、　１２３　
、５８４５９３１９８８年にてβコアに対する数種のモ
ノクローナル抗体を作製し、それらの性質について言及
している。しかし、この論文においては、ｈＣＧ−βを
免疫原とした場合、βコアに対する抗体は全く得ること
ができなかったと明言している。

一方、臨床検査の分野において、高感度のアツセイを可
能とする親和性の高い新規なβコアに対するモノクロー
ナル抗体の出現が待望されている。

また、従来のβコアのＲＩ　Ａでは尿のみを測定対象と
してアッセイ系か組まれており、βコアの生合成、分泌
、分布、代謝および生理生物学的作用、疾患との関連性
などを研究するために不可欠の体液組織液、組織抽出液
および組織培養上清を測定−４゛るには不十分てあった
。

課題を解決するための手段 本発明各らはこれまでの抗βコアモノクローナル抗体取
得法と異なり、ｈＣＧ−βを免疫原として動物を免疫し
た後、細胞融合法により得たモノク〔１−ナル抗体がｈ
ＣＧや類似の溝造を（ｆする蛋白ホルモンとは反応せず
、かつ、βコアおよびｈＣＧ−βザブユニットを認識し
、該モノク【１−ナル抗体の使用がとくに診断薬として
重要性が高いことを見い出し、本研究を完成するに至っ
た。

すなわち、本発明は、ロ→ｈＣＧ−βサブユニットで免
疫した哺乳動物の抗体産生細胞とリンパ球様細胞株とを
融合した、ｈｃｃ−βコア領域およびｈＣＧ−βサブユ
ニットを認識するモノクローナル抗体を産生ずる新規ハ
イブリドーマ、（２）該ハイブリドーマが産生する、ｈ
ＣＧ−βコア領域およびｈＣＧ−βサブユニットを認識
するモノクローナル抗体、および（３）該モノクローナ
ル抗体を用い、免疫化学的に該モノクローナル抗体と反
応する物質、例えば、βコア自体やｈＣＧ−β等、該モ
ノクローナル抗体が認識できるβコア領域および／また
はｈＣＧ−βサブユニットを含む物質を検出、測定する
ことを特徴とする免ＤＴ−的測定法を提供するものであ
る。

本発明のハイブリドーマ作製に用いるｈＣＧβは自体公
知の方法で調製することができる。例えば、妊婦尿から
濃縮精製されたｈＣＧから、エフ・ノエイ・モーガン（
Ｆ　、　Ｊ　、Ｍｏｒｇａｎ）らの方法［エンドクリノ
ロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、　８８　。

１０／１５−１０５３．１９７１年コに準じてｈＣＧβ
を精製することができる。より具体的には、天然ｈＣＧ
を例えば１０Ｍ尿素中に溶解してｈＣＧαとｈＣＧ−β
とに解離させ、ＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓ　ｅｐｈ
ａｄｅｘ）Ａ　−２５を充てんしたカラムにかけてｈＣ
Ｇ−βの溶出フラクンヨンを得ることができる。

免疫においては、ｈＣＧ−β、ｈＣＧ−βトキャリア用
高分子物質を結合什しめた生成物あるいはこれらの両方
のいずれをも免疫原として用いることができる。

ここで用いられているペプチドとキャリア用高分子物質
との結合は、常套手段［例、ホルモン・アンド・メタポ
リツク・リサーチ（Ｈｏｒｍｏｎ　　ａｎｄＭｃｔａｂ
ｏｌｉｃ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、８，２４１　、　！
　９７６年］を用いて実施し得る。結合に用いる試薬と
しては、例えば、ゲルタールアルデヒド、水溶性カルボ
ッイミドなどが挙げられる。また、キャリア用高分子物
質としては、例えば、牛ヂログロプリン、牛血清アルブ
ミン、牛ガンマグロブリン、ヘモシアニンなどが挙げら
れる。ペプチドとキャリア用高分子物質の使用比は、１
・１〜！＝４が適当であり、反応１１１０は、中性付近
、特に７．３而後が良好な結果を与える場合が多い。ま
た、反応に要する時間は、２〜６時間が良い場合が多い
が、特に、３時間か適当である。このようにして作成さ
れた生成物は、常套手段により４℃萌後で水に対して透
析し、凍結して保存しても良いし、凍結乾燥して保存し
てし良い。

免疫ずろ哺乳動物として、例えば、マウス、ラット、ハ
ムスターなどの実験動物が有利に使用でき、とりわけマ
ウスが好ましい。抗体産生細胞は免疫した動物の脛細胞
が有利に使用される。株化されたヒト牌細胞株でもよい
。

免疫される動物の細胞ならびに融合相手となるリンパ球
様細胞株として６種の組合わせが可能であるが、細胞融
合実験で最も実績があり、細胞融合効率その他において
条件のよいマウス細胞間の融合、すなわち、抗原で過免
疫したマウスの抗体産生細胞と細胞融合効率、増殖性等
のすぐれたマウスミエローマ細胞とくにヒボキサンチン
−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株
（Ｉ（ＧＰ１１’ｒ−株）やチミジンキナーゼ欠損（Ｔ
Ｋ−）のようなマーカーをもった適当な同種または異種
（好ましくは同種）のミエローマ［例、ＰＩＸ６３Ａｇ
８−Ｕｌ（市森ら、ツヤ−ナル・オブ・イムノロジカル
・メソッド、８０，５５．１９８５年）、Ｘ６３−Ａｇ
８−６．５．３（サルマン、エム（Ｓｈｕｌｍａｎ、　
Ｍ）ら、ネイチャー、２７６．２６９゜１９７８年）、
マウスミエローマ系細胞ＳＰ２１０−Ａｇ＋４（ＳＦ３
）ネイチャー、２７６．２　Ｇ　９゜１９７８年］など
が挙げられる。

また、ヒトのリンパ球様細胞でもよく、この場合は、ヒ
トから取り出され、株化されたものがＴｒ利に用いられ
る。

モノクローナル抗体を得るためには、ラット、マウスが
好ましい。免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、
皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等のい一４゛れの
ルー！・からでも可能であるか、主として皮下、腹腔内
、静脈内に（とりわけ皮下に）注入するのが好ましい。

また、接種間隔、接種量等ら可変度は高く、種々の方法
が可能であるが、例えば、２週間隔で２〜８回接種し、
最終免疫後、１〜５０、好ましくは２〜４日後の脛細胞
を用いる方法が好適に用いられる。接種量は１回にｈＣ
Ｇ−β量として、マウス当り０．１μ９以上、好ましく
はｌＯμ９〜１００μ９用いることが望ましい。

リンパ球原として鯉臓細胞を用いる場合において、胛臓
を摘出する場合は、その萌に部分採血を行い、血中の抗
体価の上昇を確認した上で、融合実験を行うことが望ま
しい。

リンパ球とリンパ球様細胞株との細胞融合は、例えば、
免疫したマウスのリンパ球（とりわけ牌臓細胞由来のも
の）をヒボキサンチンーグアニンホスホリボンルトラン
スフエラーゼ欠損（ＩＩ　Ｇ　Ｐ　ＲＴ−）ヤチミノン
キナーゼ欠損（１’に−）ノようなマーカーを持った適
当な同種または異種動物（好ましくは同種）のミエロー
マ等の、リンパ球様細胞株との間で融合させる。融合に
は、センダイウィルス、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）等の融合剤が用いられる。らちるん、ジメチルスル
ポキンド（ＤＭＳＯ）その他の融合促進剤を加えること
も可能である。Ｐ　Ｅ　Ｇの平均分子量は、ふつう１０
００〜＋　００００、好ましくは１０００〜６０００、
時間は０．５〜３０分、濃度は１０％〜８０％等が採用
されるが、好ましい条件の一例として、ＰＥＧ　６００
０を３５〜５５％で４〜１０分処理することにより、効
率よく融合させることができる。融合細胞（ハイブリド
ーマ）は、ヒボキサンヂンーアミノブテリンーチミジン
培地［１１Ａ　Ｔ培地：ネイチャー、２５６，４９５−
４９７゜１９７５年］等を用いて、選択的に増殖させる
ことができる。

マウスの血清や増殖して来た細胞の培養１−清は、［ｊ
的とする抗体産生があるか否かについてスクリニングを
行うことができるが、抗体価のスクリニングはつぎのよ
うに行うことかできる。すなわち、放射線免疫測定法（
ＲＩＡ法）または酵素免疫測定法（Ｅ　Ｉ　Ａ法）等の
方法で調べることができるが、これらの方法についても
種々の変法が可能である。好ましい測定法の一例として
、ＥＩＡを用いる方法について記載する。同相に抗マウ
スイムノグロブリンを常法に従って固定（例えば、９６
穴のマイクロタイタープレートを固相として用いるとマ
ルヂスキャン等を用いた迅速な測定が可能となり（Ｔ利
である）させておき、これに測定したい培養上清や、マ
ウスの血清を加え、一定時間、一定温度（以下４〜４０
℃を示す）で反応させる。

ついで、反応物をよく洗った後、酵素で標識したｈＣＧ
−βらしくはβコアを加え、一定時間、定温度で反応さ
せる。反応物をよく洗った後、酵素基質を加え、一定時
間、一定温度で反応させ、その後、生成発色物を吸光度
または蛍光強度等で測定することができる。選択培地で
増殖を示し、βコアに対して抗体活性のみられたウェル
の細胞は、限界希釈法等によりクローニングを行うこと
が望ましい。クローン化された細胞の−Ｌ清について同
様にスクリーニングを行い、抗体価の高いウェルの細胞
を増やすことにより、目的とする本発明のモノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られる。

本発明の抗ｈＣＧ−βコアモノクローナル抗体は、この
ようにしてクローン化されたハイブリド−マを、液体培
地中または哺乳動物の腹腔内で増殖させることにより得
られる。例えば、［？　Ｐ　Ｍ　ｌｌ６４０に０．１〜
４０％の牛血清を加えた液体培地等で２〜１０日間、好
ましくは３〜５０間培養ずろことにより、培養液から該
モノクローナル抗体を得ることができるが、この他にマ
ウス等の適当な哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖
させ、腹水を採取することにより、細胞培養上清よりら
はるかに高力価の抗体を、多量に効率よく取得すること
がてきる。ごのためには、例えば、マウスの場合、ミネ
ラルオイル等を１１１１らって接種したＩｉ　Ａ　Ｌ　
１３　／　ｃ等のマウスにｌＸｌ０’　〜ｌＸ１０７個
、好ましくは５ＸＩ０５〜２ＸＩ０６個のハイブリト−
マを腹腔内等に接種し、７〜２０Ｉ］後、好ましくは１
０〜１４日後に腹水液等を採取する。腹水に生成蓄積し
た抗体は、例えば、硫安分画、Ｉ）ｌεＡＥ−セルロー
スカラムクロマト、プロティンＡセファロースカラムク
ロマト等により容易にモノクロナール抗体を純粋な免疫
グ【Ｊプリンとして単離することができる。

本発明の抗ｈＣＧ−βコアモノクローナル抗体は以下の
性状を有ケる。

（１）βコアに対して反応性を有する。

（２）ｈＣＧ−βに対して反応性を有する。

（３）ヒト癌患者の尿に高率に反応性を有する。

（４）ヒト癌患者の血清に高率に反応性を有する。

（５）抗体のクラスはＩｇＧ１である。

後記の検出、測定にこの抗体を用いる際の抗体分子とし
ては、フラクションでもよく、該フラクションとしては
例えば、Ｆ　ａｂ、　Ｆ　ａｂ’、Ｆ　（ａｂ’　）。

が挙げられる。

かくして、本発明のモノクローナル抗体は、■ε［Ａ法
、Ｅｌ、ＩＳＡ法、Ｉｔ　Ｉ　Ａ法などの免疫化学的手
法を用いた系でのβコア領域認識による癌の診断に大変
ｒＴ利である。

これらの免疫化学的手法は、一般に、つぎの方法に大別
４”ることかできろ。

（１）競合法：未知量の抗原を含む被検液と標識剤で標
識した抗原の一定量とを対応する抗体の一定量に対して
競合反応させ、抗体と結合した標識剤もしくは抗体と結
合しなかった標識剤の活性を測定“４′る。

（２）サンドイッチ法：未知量の抗原を含む被検液に担
体上に保持された過剰量の抗体を加えて反応させ（第１
反応）、次に標識剤で標識した過剰量の抗体の一定量を
加えて反応させる（第２反応）。

担体」−に保持された標識剤もしくは担体上に保持され
なかった標識剤の活性を測定ずろ。第１反応、第２反応
は同時に行ってもよいし時間をずらして行ってらよい。

本発明の免疫学的測定法においては、（１）および（２
）のいずれを用いてらよいが、（２）のサンドイツチ法
による方法が効果的である。サンドイツチ法において、
担体上に保持される抗体は、標識剤を結合させた抗体に
おける抗体と一σいに抗原決定部位か重複しない抗体で
あり、一方の抗体を本発明のβコアと反応ずろモノク［
１−ナル抗体とする。他方の抗体はｈＣＧ−βと反応す
る抗体であれば、モノクローナル抗体あるいは７１！リ
クロ一ナル抗体のいずれであってもよい。該ｈＣＧ−β
と反応する抗体の作製法としては自体公知の方法を実施
することができろが、例えば、ポリクローナル抗体の場
合、ｈＣＧ−βとキャリア蛋白との複合体を免疫原とし
、ウサギ等の哺乳動物に数回免疫し、得られた抗血清を
ｈＣＧ−β固相化アフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーで精製して抗ｈＣＧ−β抗体を得ることができる。

また、標識もしくは標準化に用いるβコアの精製には公
知の手段を用いることができる。エンドクリノロジー、
１２３，５７２．−５８３，１９８８年に記載されてい
るように、市販の部分精製ｈＣＧからゲルクロマトグラ
フィーならびにイムノアフィニチイ・クロマトグラフィ
ーでβコアを得ることができる。

かかる検出、測定に供せられる患者由来の試料としては
、例えば血清、尿、脳を髄液等の体液や、時には組織お
よびその抽出物などが挙げられる。

本発明の測定方法のＥＩＡの例として、標識剤がペルオ
キシダーゼの場合について以下に具体的に説明するが、
ペルオキシダーゼに限定されるものではない。

■　まず、担体に保持された抗体に被検試料を加えて結
合反応を起こさせ、これに、ペルオキシダーゼを結合し
た抗体を加え反応させる。

■　■て得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生した物質の吸光度らしくは蛍光強度を測定す
ることにより前記の反応生成物の酵素活性を知る。

■　前記■〜■の操作を既知量の該抗体反応物質の標型
溶液に対してあらかしめ行い、反応物質と吸光度らしく
は蛍光強度との関係を標準曲線として作成しておく。

■　未知量の分析対象物（被検試料）について得られた
吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析対
象物中の当該モノクローナル抗体と反応する物質の…を
測定する。

本発明の測定方法のＲＩ　Ａの例として、標識剤がｌｔ
Ｊの場合について以下に具体的に説明するが、１″！に
限定されるものではない。

■　まず、担体に保持された抗体に測定すべき被検試薬
を加えて結合反応を起こさせ、これにｔＪ標識抗体を加
え反応させる。

■　■で得られた反応生成物のγ−放射活性を測定する
。

■　に記■〜■の操作を既知量の該抗体反応物質の標を
液に対してあらかしめ行い反応物質とγ放射活性の関係
を標準曲線として作成しておく。

■　未知量の分析対象物（被検試料）について得られた
γ−放射活性を標準曲線にあてはめ、分析対象物中の該
抗体反応物質の量を測定する。

標識剤としては前記の酵素、放射性同位元素類の他、蛍
光物質、発光性物質などが挙げられる。

放射性同位元素としては、例えばＩｔＪ、１３１１、’
１１、”Ｃなどが、酵素としては、安定で比活性の大き
なものが好ましく、例えば、（１）カルボヒドラーゼ［
例、グリコンダーゼ（例、β−ガラクトノダーゼ、β−
グルコノダーゼ、β−グルクロニグーゼ、β−フルクト
ンダーゼ、α−ガラクトンダーゼ、α−グルコシダーゼ
、α−マンノシダーゼ）、アミラーゼ（例、α−アミラ
ーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラ
ーゼ、タカアミラーゼＡ）、セルラーゼ、リゾデーム］
、（２）アミダーゼ（例、ウレアーゼ、アスパラギナー
ゼ）、（３）エステラーゼ［例、コリンエステラーゼ（
例、アセチルコリンエステラーゼ）、ホスファターゼ（
例、アルカリホスファターゼ）、スルファダーゼ、リパ
ーゼコ、（４）ヌクレアーゼ（例、デオキンリポヌクレ
アーゼ、リボヌクレアーゼ）、（５）鉄・ポルフィリン
酵素（例、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、チトクロー
ムオキシダーゼ）、（６）銅酵素（例、チロシナーゼ、
アスコルビン酸オキンダーゼ）、（７）脱水素酵素（例
、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱
水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素）などが、蛍光物質
としては、フルオレスカミン、フルオレッセンスイソヂ
オンアネートなとか、発光物質としては、ルミノール、
ルミノール誘導体、ルンフェリン、ルンゲニンなどがそ
れぞれ挙げられる。

抗体と標識剤とを結合させるには、常套手段であるクロ
ラミン’ｒ法［ネイヂ＋　　（Ｎａｔｕｒｅ）。

１９４．４９５．１９６２年］、過ヨウ素酸法［ジャー
ナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・ザイトケミ
ストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩｌｉｓｔｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　
２２　、１０８４　、１９７４年］、マレイミド法［ジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ　ｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　［３ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　７９　。

２３３．１９７６年］などが用いられる。

ザンドイッヂ法による特異的免疫化学的測定方法を実施
するには、未知量のβコアを含有する被検試料に常套手
段で物理的もしくは化学的に抗体を結合させた固相を加
えて反応させる（第１反応）。

固相を洗浄した後、標識剤で標識した抗体の一定量を加
えて反応させる（第２反応）。ついで、通常、同相をよ
く洗浄し、固相」二に結合している標識剤の活性を測定
する。標識剤が放射性同位元素である場合、ウェルカウ
ンターらしくは液体ンンチレーションカウンターで測定
する。標識剤が酵素である場合、基質を加えて放置し、
比色法らしくは蛍光法で酵素活性を測定する。標識剤か
蛍光物質、発光物質であっても、それぞれ公知の方法に
従つて測定する。かかるアッセイ方法においては、第１
反応と第２反応の間における洗浄を省略してもよいし、
さらに簡略化するために被検液、抗体結合固相および標
識剤で標識した抗体を同時に加えて反応させてしよい。

すなわち、本発明で用いられる抗体は互いに抗原決定部
位が異なっているため、試薬の添加順序、添加時間、洗
浄操作のａ無などによって影響を受けないという極めて
優れた特色を１７するものである。

かくして、本発明によれば、っぎの効果が得られる。

（１）ｈＣＧ、ｈＬＩＩなとのベブヂドポルモンによる
影響を完全に受けることなく＠り１のβ二ｊアおよびｈ
ＣＧ−βを測定できる。

（２）検出、測定に供Ｕられる小品由来の試料としては
、尿が特にａ効であるが、その他としては血Ｍ等ら利用
できろ。

（３）測定対象疾患として、各種悪性腫瘍とくに産科婦
人科領域ならびに生殖器関連の癌が選ばれ、これらの疾
患の診断や予後管理に極めて適用性の高いものである。

本発明の、例えば、サンドイツチ法によるβコア領域の
免疫化学的測定法の実施には、例えば、定量用キットを
用いることができ、該キットとしては、主として、以下
の（１）〜（６）の試薬からなるものが挙げられる。

（１）担体上に保持された抗体 （２）標識化された抗体 （３）標準βコアもしくはｈＣＧ−β （４）これら（＋）〜（３）の試薬および被検試料の希
釈に用いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に用
いることができる緩衝剤であればいずれでもよいが、そ
の−例としてはｐＨ６〜９のリン酸緩衝液またはグリシ
ン緩衝液が挙げられる。） （５）インキュベーンジン後、担体の洗浄に用いる緩衝
液（該担体の洗浄に用いることができろ緩衝剤であれば
いずれでもよいが、その−例としてはリン酸緩衝液また
はグリシン緩衝液が挙げられる。） （６）標識剤として酵素を用いる場合は、酵素の測定に
必要な試薬（その−例として、ペルオキシダーゼにおい
て蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロキシフェ
ニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、０−フェニレン
ジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる緩衝液
（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止液が挙
げられる。）このキットは、例えば、以下の方法により
使用することかできる。

標準βコア、ｈＣＧ−βもしくは被検液約ＩＯないし２
００μＱに試薬（４）を加えて希釈し、定量の試薬（＋
）を加えて約０ないし４０℃で約１ないし４８時間反応
させる。担体を水洗後、試薬（２）の約１０ないし３０
０μｇを加えた後、約０ないし４０℃で反応させる。約
１ないし４８時間反応後、担体を洗浄し担体上に結合し
ているベルオキノダーゼ活性を測定する。すな４つち、
ペルオキシダーゼの基質液約１０〜ｌ０００ｚｌ＆を加
えて約２０〜４０℃で約ＯＩ〜２時間反応させた後、酵
素反応を停止させ、反応液中の吸光度もしくは蛍光強度
を測定する。

本発明の免疫化学的分析法を用いれば、本発明のモノク
ローナル抗体かβコアおよびｈＣＧ−βノ両方ト反応シ
、ｈＬ　Ｉｆ、　ｈＦ　Ｓ’ｌｌオ、ｋＵｈ’Ｉ”　Ｓ
　ＩＩとは交差反応性を有しないので、βコア、ｈＣＧ
βまたはβコアとｈＣＧ−βの両方を、通常の臨床検査
テストにおける簡単な技術で、高感度で１回の測定によ
り定量できる。

害上 以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１（ハイブリドーマの製造） １３ＡＬＢ／ｃマウス５匹に、−匹あたり生理食塩液０
．５肩Ｑに溶解したｈｃｃ−β１００μ２とフロイント
・コンプリート・アノユバント０　、５　ｔｔｒ（１を
懸濁した溶液を腹腔に注射し、２週から１２週間後にマ
ウスの尾静脈に一匹あたり生理食塩液０．２５ｚＱに溶
解したｈｃｃ−β５０μ９を追加免疫した。最終免疫か
ら３日後に細胞融合のためマウスの婢細飽を取りだした
。

採取した胛細胞（１，０ｘｌＯＢ個）とミエローマ細胞
Ｐ３−Ｘ６３−Ａ９８−ＬＪＩ（１，Ｏｘ　Ｉ　０７個
）をＩＩＰＭ１１６４０培地中で混合し、１．００Ｏｒ
ｐｍで５分間、遠心分離した。得られた沈杏に５０％ボ
ＩＪ　エチ’ｖングリ：Ｉ−ルｌ　５００　１　ｍＱを
３７℃で１分間徐々に加えて細胞融合さｌ、３７０Ｃの
ｌｔＰＭＩ−１６４０７ｍＱを５分間かけて加えた後、
遠心した。得られた融合細胞を■Δ′１゛培地３０ｍ（
ｌで希釈し、９６穴マイタ［１プレートに０　、１　ｍ
（１４’ッ分注した後、２〜３１１間隔テｌ　ｌ　Ａ　
ｉ’培地を半り１ず−ノ交換しながら培養を続けた。７
〜＋４１１後、全２８８ウエル中約６０％（＋７０／２
８８）でハイシリトーマが増殖し、そのうち４０％（６
８／Ｉ　７０）が抗ｈＣＧ−β抗体を産生していた。さ
らに、そのうち約３０％（１７／６８）がβコア結合活
性を示した。

最も高い抗体価を示したウェルの細胞を限界希釈法によ
りクローン化した。ずなわら、フィーグー細胞としてＩ
（ＡＬＩ３／ｃマウス胸腺細胞を１０５個／ウェル、ハ
イブリドーマを１個／ウェルに加え、ＩＩ　′Ｉ’培地
中で培養し、この操作を２回行った。

クローニングによって最ら安定に大量に抗体を産生ずる
クローンを選択し、２２９と命名した。また、同様の操
作によりハイブリドーマ２３３を確立し　）こ。

ハイブリドーマ２２９は、通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所（Ｐｆｌｌ）に１９８９年９月２６Ｉ」
からＦＥＲＭ　　Ｂｌ”−２６１４として寄託されてい
る。

抗体価の測定は以下のようにして行った。

抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇΔ）抗
体を固相化したマイクロプレートに、ハイブリトーマ培
養上清５０μＱを添加し、４℃１日反応させた。洗浄後
、ベルオキノダーゼ標識ｈＣＧβもしくはβコアを加え
てさらに４℃１日反応さ什た。再び洗浄した後、酵素基
質０−フエニレンノアミン（以下、ＯＰＤと略記する）
溶液を加え、その吸光度を測定ずろことにより、ハイブ
リトーマ培養上清の抗体価を求めた。ペルオキシダーゼ
標識抗原は、次のようにして調製した。５００μ９／酎
のｈＣＧ−βまたはβコア溶液１ｘＱに３肩９／ｍ（１
（１）　４−　（Ｎ−マレイミドメヂル）ンクロヘキザ
ン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル溶液！００μＱを加
えて室温で９０分間反応さｌ”、反応液をセファデック
スＧ−２５のカラムでゲル濾過してマレイミド化抗原を
得た。０．１Ｍ塩化ナトリウト添加００２Ｍリン酸緩衝
液に溶解した７肩９の西洋ワサビペルオキシダーゼに、
２０倍川用Ｎサクンンイミジル３−（２−ピリノルジヂ
オ）ブ【１ビオネートを室温で１時間反応さ０゛、さら
に、０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４、５に溶解したジヂオス
レイトール０２５好を加えて室温で３０分間反応させた
。反応液をセファデックスＧ−２５でゲル濾過した溶液
とマレイミド化抗原を混合し、４℃で２０時間反応後ウ
つトロケル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）八ｃＡ４４でゲル濾過
して精製した。

実施例２（モノクローナル抗体の製造）予めブリスタン
０．５酎を腹腔に投与して前処理しノこ■３△Ｌ　Ｉ（
／　ｃマウスの腹腔内に、０　、５　ｘ（ｌの１目’Ｍ
ｌ−１６４０に懸濁した５ｘ１０６個のハイブリドーマ
２２９を注射した。Ｉθ〜１４０後に貯留した腹水を採
取し、プロティンＡ−セファロースにより精製してモノ
クローナル抗体２２９を得た。得られたモノクローナル
抗体２２９は、腹水ＩｍＱあたり３　、５　Ｒｇであっ
た。

このモノクローナル抗体のアイソタイプはオフタロニー
法でＩｇＧ、と決定された。その反応性は、βコア、ｈ
ＣＧ−β、絨毛性および下垂体性糖蛋白ホルモンに対す
る交差反応性をト〕ＩＡで調へることにより決定した。

その結果を第１図に示４−０該モノクローナル抗体はβ
コア、ｈＣＧ−βにほぼ同じ強さで反応し、ヒト絨し性
ゴナドトロピンにはほとんど反応しない。一方、ハイブ
リドーマ２３３を用いて同様にして得られたモノクロー
ナル抗体２３３は、前記のＦＩＡにおいてモノクローナ
ル抗体２２９と同時に加えても競合反応を生しないこと
から、モノクローナル抗体２２９の認識部位とは異なる
別のβコアのエピトープを認識していると考えられた。

実施例３（測定キットの調製） （１）固定化抗体の調製 ポリスチレンピーズ（直径１／４インチ、プリシジョン
・プラスナック・ポール・カンパニ（米国ノカゴ）社製
）５０個を、５０μ９／ＩＩ（１…のモノタ〔１−ナル
抗βコア抗体（モノクローナル抗体２２９）か含まれる
０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、０）　７　、５　ｍｆ
！に入れ、室温で一夜放置した。このポリスチレンピー
ズをリン酸緩衝液で洗浄し、０１％のアジ化ナトリウノ
、を加え、冷蔵庫中で保（ｊ　し　）こ。

（２）酵素標識抗体の調製 ｈＣＧ−β２０ｍ９およびラン血清サイ［ｌグ（Ｊゾリ
ン２０乃を（１、０５Ｍリン酸緩衝液ｐｉｔ　７　、５
に溶解し、これに終濃度として０２％となるようにグル
タルアルデヒドを加えて４℃で２時間反応させた。この
反応液を蒸留水２Ｑに対して４℃で３回透析した後、凍
結乾燥してｈＣＧ−β−ウシ血清ザイ［ｌグロブリン複
合体３５肩９を得た。

ウサギ１匹当り−に記複合体Ｉｍｇを、フロイント完全
アジュバントと共に２週間隔で６回ウサギの背部皮下に
免疫し、最終投与後１４日目に頚動脈から全採血して抗
ｈＣＧ−βウサギ血清を得た。

抗ｈＣＧ−βウサギ血清１０ｘ（に終濃度として１６４
Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加えて塩析し、１０
，０００ｒｐｍＳＩ　Ｏ分間遠心分離した。沈澱物は５
ｘ（７の０．０２Ｍホウ酸緩衝液叶■８０に溶解し、同
緩衝液に透析した。上澄液を同緩衝液で平衡化したｈＣ
Ｇ−β結合セファロース４Ｂのカラム（２，Ｏｘ４．８
ｃｍ）に通し、０．２Ｍグリンン塩酸緩衝液ｐ＋−１２
、３で溶出して、精製抗ｈＣＧ−β抗体２０肩９を得た
。

得られた抗ｈＣＧ−β抗体２０幻にブタ胃粘膜由来ペブ
ソン０　、４６を加えて、０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐａｔ　
４　、５で３７°ＣＩ６時間反応させた。反応物を中和
後、ウルトロゲルＡｃＡ−４４のカラム（１，９ｘ　９
０ＣＪＩ）にかけ、０．ＩＭホウ酸緩衝液ｐＨ８、０で
溶出してＦ　（ａｂ’　）ｔ　Ｉ　Ｏｙｓ９を得た。

Ｆ　（ａｂ’　）ｔ　Ｉ　Ｏｍｇを２ｍＭ　　ＥＤ’ｌ
’Ａを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６、Ｏに溶解し、
２−メルカプトエチルアミンを加え、３７℃で９０分間
反応させた。次いで、反応物をセファデックスＧ−２５
のカラム（ｌＸ３０ｃｍ）にかけ、２　ｍＭ　　Ｅｌ）
　’ｌ”　Ａを含むＯ，１Ｍリン酸緩衝液ｐｏ６．０で
溶出して、Ｆａｂ’７肩９を得た。

西洋ワサビペルオキンダーゼ＋ｏｍｙを１．４ｊ！Ｑの
０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ（６、８に溶解した溶液に、
９．７乃の１（Ｎ−マレイミドメチル）ノクロヘキザン
酸・Ｎ−スクンンイミドエステルを溶解した８０μＱの
Ｎ、Ｎ−ジメチルホルノ、アミドを添加し、３０°Ｃで
１時間反応さｌ−た。反応物を遠心分離後、」二清液を
セファデックスＧ−２５のプＪラム（ｌＸ３０ｃｍ）に
通して０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６、８で溶出してマレ
イミド化ベルオキンダーゼ７乃を調製した。

１１；ｉ記のようにして調製したＦａｂ’　７　ｍｙ　
＆マレイミド化ベルオキンダーゼ７幻を、１ｙｔｔＱの
２＋＋＋ＭＥ　Ｄ　’Ｉ’　Ａを含存する０、１Ｍリン
酸緩衝液ｐ　１−１６．５中で、４°Ｃで２０時間反応
さｌた。反応液をＡｃへ４４のカラム（１，５Ｘ９０ｃ
ｍ）に通し、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ１６、５で溶出
した。このようにして目的の抗ｈＣＧ−βＰ　ａｂ’−
ペルオキシダーゼ標識体約９１を得た。

実施例４（癌の診断） （＋）測定 試験管（１２ｘ７５ｍ＋ｎ）に、被測定検体またはβコ
ア標準液１００μＱと０．１％ウノ血清アルブミン含有
０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）２００μＱを添
加し、固相化抗体（ポリスチレンピーズ）１個を加えて
、室温（２０〜３０℃）で１時間静置した。精製水４ｘ
Ｑで２回洗浄後、抗ｈＣＧ−βＰ　ａｂ’−ペルオキシ
ダーゼ約５００ｎ９と０．１％ウノ血清アルブミン含有
００２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）３００μＱとを混
合し、室温（２０〜３０℃）で１時間静置した。溶液部
分を除去し、ポリスチレンピーズを上記と同様２回洗浄
した後、別の試験管に移した。結合しているペルオキシ
ダーゼの活性は、過酸化水素共存下にＯＰＤを基質とし
て、室温暗所で３０分間静置した時の波長４９２ｎｍの
吸光度によって測定した。

本発明の酵素免疫測定法試薬において、モル基準でのｈ
ＣＧ−βとの交差反応率は約１００％であり、βコアと
ｈＣＧ−βに対してほぼ同一の反応性を示した。一方、
糖タンパクポルモンであるヒト絨毛性ゴナドトロピン、
ヒト黄体形成ホルモン、ヒト卵胞刺激ホルモン、ヒト甲
状腺刺激ホルモンとの交差反応率は、谷々２．２％、０
．２９％０．０１％以下、０．０１％以丁と極めて低値
であった。それらの結果を第２図に示した。

また、測定限界は、βコア２　ｐ＆（０、Ｉ　３　ｆｍ
ｏｌ）／チューブ（２０ｐｇ／ｙ＋２）と極めて高感度
であった（第２図）。

精製したβコアを免疫原として得られたｈＣＧβコア領
域を認識するハイブリドーマ２８１の産生ずるモノクロ
ーナル抗体２８１および本発明のモノクローナル抗体２
２９の反応性について比較した。固相化抗体に各々のモ
ノクローナル抗体を用いたサンドイツチ法で各種の蛋白
ホルモンとの反応性を比較した時、モノクローナル抗体
２２９がβコアとｈＣＧ−βに対してほぼ同一の反応性
を示４−のに対して、モノクローナル抗体２８１は、β
コアを１００％とした時、モル基準でｈＣＧ−βに１４
．０％、ｈＣＧに１．２％の反応性を示しヒト黄体形成
ホルモン、ヒト卵胞刺激ホルモンおよびヒト甲状腺刺激
ホルモンにはいずれし０．０１％以下であった。この試
験成績から、ｈＣＧ−βを免疫原としたモノクローナル
抗体２２９とβコアを免疫原とするモノクローナル抗体
２８１とは、βコア領域の異なるエピトープを認識して
いると考えられる。

（２）健常人における尿中βコアレベル健常人（ｎ＝２
３１）における尿中βコアレベルを本発明試薬によって
測定したところ、平均Ｑ　、　Ｑ　５　ｎｇ／１ｌ（ｌ
で２標亭偏差を加えた値は０．１８ｎｅ／ｍＱてあった
。モノクローナル抗体２８１を用いたところ、尿中βコ
アレベルは平均０．０１ｎｇ／ｍＱで２標準偏差を加え
た場合０．０３ｎｇ／ｍＱてあった。

（３）各種疾患患各尿および血清の測定本測定キットを
用いて各種疾患患各の尿および血清中のβコアおよび／
もしくはｈＣＧ−β値を測定した。また、対照として、
同相化抗体にモノクローナル抗体２８１を用いてβコア
値を測定した（第１表）。

尿検体においては妊娠では高値を示したが、ｈ種癌患省
゛において１７例中１２例（約７１％）テ正常レベルの
カットオフとしている０　、　２　ｎｆｌ／　Ｍ（１以
上の値を与え、陽性と判断された。これに対して、対照
のモノクローナル抗体２８１を用いてβコア値を測定す
ると、正常レベルのカットオフ値０　、０３　ｎｇ／ｘ
Ｑ以上を示した検体は１７例中９例（約５３％）であっ
た。

一方、血清検体においては、各種癌患者で１７例中８例
（約４７％）で０　、２　ｎｇ／ｘ（１以上の値を与え
、陽性と判断された。血清での陽性率は従来公表されて
いる約Ｉθ〜２０％と比べ極めて高いものであった。

さらに、第３図に産科婦人科疾患患者尿における測定結
果を示した。卵巣癌、子宮癌、絨毛癌て極めて高い陽性
結果を与えた。

４男μ力果 本発明によって製造されるモノクローナル抗体は古種癌
但考尿、血清等と高率に反応するので癌の診断薬なとと
してｆ１利に使用できる。

また、本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫化学的
測定試薬で短時間に極めて高感度な測定が可能となり健
常人レベルも知ることができる。

このように、本発明による測定試薬の確立により、βコ
アの生合成、分泌、代謝等の基礎研究の促進が期待でき
るたけでなく、本発明の測定法か高陽性率と、正確な結
果を与えるので、産婦人科領域の悪性腫瘍は熱論のこと
谷種癌の診断および治療経過の簡便かつ正確な観察が可
能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図はβコア（○）、ｈＣＧ−β（・）、ｈＣＧ（■
）ならびに６種糖タンパクポルモン表本発明のモノク［
ｌ−ナル抗体との反応性を示す。 第２図は本発明試薬によるβコアの標■曲線（○）、ｈ
ＣＧ−βの反応性（・）、ならびに各種糖タンパクホル
モンとの交差反応性示す。 第３図は産科婦人科系疾患患各尿における測定結果を示
す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｈＣＧ−βサブユニットで免疫した哺乳動物の抗
   体産生細胞とリンパ球様細胞株とを融合した、ｈＣＧ−
   βコア領域およびｈＣＧ−βサブユニットを認識するモ
   ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ。
2. （２）請求項（１）記載のハイブリドーマが産生する、
   ｈＣＧ−βコア領域およびｈＣＧ−βサブユニットを認
   識するモノクローナル抗体。
3. （３）請求項（２）記載のモノクローナル抗体を用いて
   ｈＣＧ−βコア領域およびｈＣＧ−βサブユニットのい
   ずれか一方または両方を検出することを特徴とする免疫
   学的測定法。
4. （４）請求項（３）記載の免疫学的測定法を用いて患者
   からの検体中のｈＣＧ−βコア領域の検出を行うことを
   特徴とする癌の診断方法。