NO172084B

NO172084B - Monoklonalt antistoff, anvendelse derav samt reagenssystem for immunologisk bestemmelse av fritt protein s og c4bp-protein s kompleks

Info

Publication number: NO172084B
Application number: NO875215A
Authority: NO
Inventors: Yukiya Koike; Kenji Wakabayashi; Yoshihiko Sumi; Yataro Ichikawa
Original assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1986-12-15
Filing date: 1987-12-14
Publication date: 1993-02-22
Also published as: DK654787D0; EP0271810B1; EP0271810A2; DE3789284T2; DE3789284D1; NO875215D0; NO172084C; NO875215L; DK654787A; EP0271810A3

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro for bestemmelse av fritt humant protein S eller et kompleks av humant protein S og humant komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp) i en assayprøve. Mere spesielt omhandler oppfinnelsen immunologisk bestemmelse av fritt humant protein S eller ovennevnte kompleks i en assayprøve ved "Sandwich" metoden ved å bruke et nytt spesifikt monoklo-nalt antistoff som binder til fritt humant protein S eller tidligere nevnte kompleks samt et nytt antistoff som kan brukes i denne metode, et reagenssystem brukt i denne metode og anvendelsen av det nye monoklonale antistoff ved separasjon og gjenvinning av fritt humant protein S.

Protein S, lik protein C, er et vitamin K-avhengig protein. Det ble først isolert av Discipio et al. fra kveg og mennesker i 1977 (se Discipio, R.G., Hermodson, M.A., Yates, S. G. og Davie, E. M.: Biochemistry, 16, 696-706, 1977).

Protein S er et enkeltkjedet glykoprotein med en molekylvekt på 69 000 (humant) som er tilstede i en mengde på ca. 10 mg per liter i en normal human plasmaprøve. Dets struktur er meget lik den til andre vitamin K-avhengige faktorer og har ca. 10 gammakarboksyglutaminsyre (Gla) enheter ved NH2 ter-minalen. Protein S eksisterer i to former i blodet. En er fritt protein S som virker som en kofaktor til aktivert protein C. Den andre er et kompleks av protein S og komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp) hvor protein S er ikke-kovalent bundet til høymolekylært C4b-bindende pro-tein (C4bp), en kontrollfaktor i et komplementsystem (komplekset vil enkelte ganger bli forkortet "C4bp-protein

S kompleks"). Forholdet mellom fritt protein S og C4bp proteinkompleks er ca. 1:1.

Viktigheten av funksjonen av protein S i C4bp protein S komplekset er at det har en meget sterk affinitet for en negativt ladet overflate av et fosfolipid (Nelsestuen, G.L., Kisiel, W. og Discipio, R. G: Biochemistry, 17: 2134-2138, 1978). Det er antatt at når en celle skades eller aktiveres, binder Gla-domenet i protein S til fosfolipidet i nærvær av Ca<2+>, og C4bp binder ytterligere til protein S for å danne et kompleks hvorved protein S utfører sin funksjon (Dahlback, K.B: Semin. Thromb. Haemostas., 10, 139-148, 1984).

Nylige studier har vist at protein S spiller en meget viktig rolle i mekanismen for å kontrollere koaguleringen og fibri-nolysesystemet til protein C, og dets fysiologiske signifi-kans i relasjon til trombose har vakt interesse. Det har blitt rapportert at medfødt mangel på protein S kunne være en årsak til trombose (Comp. P. C., Nixon, R. R., Cooper, N. R. og Esmon, C. T. : J. Clin. Invest. , 7_4: 2082-2088, 1984).

Dersom det er mulig å utarbeide virkningsmekanismen til protein S og måle mengdene av antigen og aktiviteten til protein S i blodet, ville det være av meget stor viktighet i områdene basal medisin og klinisk medisin.

På den annen side har monoklonale antistoff nylig kommet til utstrakt bruk for analyse av funksjoner og strukturer av antigenproteiner eller for immunoassays (EIA, RIA) pga. for-delene at de er spesifikke kun til en enkel epitop, og monoklonale antistoffer med samme spesifisitet kan bli dannet stabilt. Spesielt for funksjonell og molekylær analyse av antigenproteiner vil dette være en passende metode for å oppdage et antistoff som gjenkjenner et sete som er inn-volvert i funksjonen av antigenproteinene eller deres spesielle strukturelle seter.

Konvensjonelle metoder for bestemmelse av protein S innebefatter f.eks Laurellmetoden som bruker et antiserum til protein C og RIA (radioimmunoassay) og EIA (enzym immuno-assay) innbefattende bruken av polyklonale antistoff. Disse metoder tillater imidlertid bare måling av den totale mengde fritt protein S og dets kompleks med C4bp. De tidligere metoder har de ulemper at animalske antisera med en fast aktivitet er ekstremt vanskelig å holde stabilt i store mengder, og serumets aktivitet må korrigeres ved å bruke en standard. Det har også den defekt at en lang tidsperiode er krevet for immunodiffusjon. I henhold til sistnevnte metoder må antistoffene renses fra antisera og stabile antistoffer er vanskelige å erholde.

Oppfinnerne merket seg at protein S danner et kompleks med komplement kofaktor C4b-bindende protein, C4bp, og tenkte at, dersom et monoklonalt antistoff som binder selektivt bare til fritt protein S og et monoklonalt antistoff som binder selektivt kun til C4bp protein S komplekset kan erholdes, ville det være mulig å utføre selektiv immunologisk bestemmelse av fritt protein S og C4bp protein S kompleks enkelt og nøyaktig uten ulempene forbundet med tidligere teknikk. Utstrakte undersøkelser basert på denne antagelse har nå ført til den suksessrike dannelse av spesifikke monoklonale antistoffer.

Oppfinnelsen omfatter således det for in vitro anvendbare monklonale antistoff som er angit i krav l's karakteriserende del samt det for in vitro anvendbare mpnoklonale antistoff ifølge den karakteriserende delen av krav 2.

I henhold til et aspekt av foreliggende oppfinnelse anvendes det monoklonale antistoff angitt i krav 1 for immunologisk bestemmelse av fritt humant protein S i en prøve, og dette omfatter å omsette et primært antistoff festet til et oppløselig fast bæremiddel og et merket sekundært antistoff i kontakt med prøven hvor det primære og sekundære antistoff har egenskapen å binde til forskjellige epitoper av fritt humant protein S, og ett av de primære og sekundære antistoff er et monoklonalt antistoff med egenskapen ikke å binde til et kompleks av det humane protein S og humant komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp), men spesifikt å binde til det fri humane protein S.

I henhold til et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse anvendes det monoklonale antistoff angitt i krav 2 for immunologisk bestemmelse av et kompleks av humant protein S og humant komplement kofaktor 4b-bindende protein (C4bp) i en prøve, og dette omfatter å sette et primært antistoff festet til et uløselig fast bæremiddel og et merket sekundært antistoff i kontakt med prøven, hvor ett av det primære og sekundære antistoff er et monoklonalt antistoff med egenskapen ikke å binde til fritt humant protein S og humant komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp), men å binde spesifikt til nevnte kompleks og hvor det andre er et antistoff med egenskapen å binde til det humane komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp).

Metoden med immunologisk bestemmelse av et spesifikt antigen i en assayprøve ved å bruke et primært antistoff festet til et uløselig fast bæremiddel og et merket sekundært antistoff er kalt "Sandwich-metoden" og er f.eks. beskrevet i Wide "Radioimmunoassay Methods" 199-206 (1970).

Anvendelsen av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er særpreget ved at, basert på prinsippet ved Sandwich-metoden, et av fritt humant protein S og C4bp protein S kompleks i en prøve bestemmes selektivt: a) et monoklonalt antistoff med egenskapen ikke å binde til C4bp protein S kompleks, men som spesifikt binder til fritt humant protein S (vil refereres til som "monoklonalt antistoff A" for letthets skyld i foreliggende beskrivelse).

b) et monoklonalt antistoff med egenskapen ikke å binde til fritt humant protein S og C4bp, men som spesifikt binder

til C4bp-protein S kompleks (vil refereres til som "monoklo-nalt antistoff B" for letthet skyld i foreliggende beskrivelse) .

Disse monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen tillater måling av fritt humant protein S eller C4bp-protein S kompleks i en assayprøve (f.eks.plasma) med konstant og god nøyaktighet uten variasjon i kvaliteten av reagenser. I henhold til anvendelsen av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fritt humant protein S og C4bp-protein S kompleks måles direkte, og nøyaktige målinger innenfor korte tidsperioder kan bli utført uten noen innvirkning fra fremmede materialer i prøven.

In vitro-anvendelsen av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse tillater således diagnose av trombosetUstandene med kreft som basissykdom, nephrosis, osv. og nøyaktig bestemmelse av den fibrinolytiske tilstand av toxemia i graviditet og den fibrinolytiske tilstand hos pasienter som har undergått kirurgisk operasjon, og som tidligere i det store og hele har vært umulig. Dette fremskaffer store fordeler i medisinen.

Oppfinnelsen vil bli beskrevet i større detalj.

1) Bestemmelse av fritt humant protein S i en prøve ved å bruke monoklonalt antistoff A;

I fremgangsmåten ved immunologisk bestemmelse av fritt humant protein S i en assayprøve i henhold til foreliggende oppfinnelse blir et (primært antistoff) av de to antistoff festet til et uløselig bæremiddel og det andre (sekundært antistoff) blir brukt i merket tilstand. Det monoklonale antistoff kan bli brukt som primært antistoff festet til det uløselige faste bæremiddel eller som merket sekundært antistoff. I hvert tilfelle har det i hovedsak ingen effekt på resultatene ved bestemmelse av humant protein S.

Antistoffene brukt i kombinasjon med det monoklonale antistoff A kan være ethvert monoklonalt eller polyklonalt antistoff som gjenkjenner en epitop av humant protein S som er forskjellig fra den gjenkjent av det monoklonale antistoff A og binder til dette. Generelt er det imidlertid passende å bruke et monoklonalt antistoff som gjenkjenner og binder til en epitop av fritt humant protein S som er forskjellig fra det gjenkjent av det monoklonale antistoff A, og som er dannet fra et hybridom erholdt som et biprodukt under av-skjermingen av et hybridom som danner det monoklonale antistoff A.

Det primære antistoff kan festes til den uløselige faste bærer ved i for seg kjente metoder. F.eks festes en oppløs-ning av det primære antistoff og det uoppløslige faste bæremiddel i kontakt med hverandre og oppbevares hvorved antistoffet absorberes fysisk på bæremidlet. Det er også mulig å kombinere de funksjonelle grupper til antistoffet, såsom en karboksylamino eller hydroksylgruppe kjemisk med det uløs-lige faste bæremiddel. Fortrinnsvis er overflaten til bæremidlet til hvilket det primære antistoffet har blitt festet belagt med en passende substans såsom bovin serumalbumin for å unngå ikke-spesifikk kombinasjon med det sekundære antistoff eller prøven.

Eksempler^ på det uløselige faste bæremiddel brukt for å fiksere det primære antistoff innebefatter polymere materialer så som polystyren, polyetylen, polypropylen, poly-estere, polyakrylnitril, fluorinneholdende resiner, nitrocellulose, fornettet dekstran, polysakkarider og agarose, uorganiske materialer såsom glass og metall og kombinasjoner av disse. Det faste bæremiddel kan være i forskjellig form, f.eks i form av et brett, kuler, fiber, partikkel, kjede, skive, stav, beger, celle eller forsøks-rør. Spesielle eksempler på det uløselige faste bæremiddel er plastbegere, plastkjeder, glasskjeder og metallpartikler.

Det sekundære antistoff merkes med radioisotoper, enzymer eller luminisente substanser. Eksempler på radioisotoper er 125I, 131I, 14C og <3>H. Eksempler på enzymene er alkalisk fosfase, peroksydase og beta-D-galaktosidase. Eksempler på luminisent substans er fluorescin, isotiocyanat og tetra-metyl rodamin isotiocyanat. Disse er kun illustratoriske og andre merkestoff brukt i immunologiske assays kan også bli brukt. Kombinasjonen av merkesubstanser med det sekundære antistoff, kan utføres på i og for seg kjente måter, f.eks ved metodene beskrevet i G.S. David; Biochem. Biophys. Res. Commun., 48, 464-471, (1972), M. Imagawa et al., Anal. Lett., 16, 1509-1523 (1983) og M. Nishioka et al., Cancer Res., 32, 162-166 (1972).

Det fikserte primære antistoff og det merkede sekundære antistoff blir så bragt i kontakt med en assayprøve for bestemmelse av humant protein S ved en totrinnsmetode omfattende å sette prøven først i kontakt med det fikserte primære antistoff og så med det merkede sekundære antistoff, eller ved en entrinnsmetode omfattende å sette prøven i kontakt med det sekundære antistoff samtidig med det primære antistoff. Entrinnsmetoden er fordelaktig i forhold til totrinnsmetoden fordi den tillater en enklere og raskere bestemmelse av humant protein S.

I totrinnsmetoden blir det fikserte primære antistoff og prøven satt i kontakt med hverandre og omsatt ved en gitt temperatur over en gitt tidsperiode. I løpet av denne tid kombinerer det fikserte primære antistoff seg med det humane protein S i prøven. Etter vask med en egnet vaskeopp-løsning settes reaksjonsproduktet i kontakt og omsettes med en oppløsning (f.eks en vandig oppløsning) av det merkede sekundære antistoff ved en gitt temperatur en gitt tidsperiode. Reaksjonsproduktet vaskes med en passende vaske-oppløsning og mengden merket substans som er tilstede på det uløselige faste bæremiddel må holdes. Mengden av humant protein S i prøven kan bestemmes ved å sammenligne mengden av merket substans med en kalibreringskurve tegnet ved å bruke en assayprøve som inneholder humant protein S i en kjent konsentrasjon.

I entrinnsmetoden blir det fikserte primære antistoff satt i kontakt og omsatt med assayprøven og det merkede sekundære antistoff samtidig, fortrinnsvis med en blanding av prøven og det merkede sekundære antistoff ved en gitt temperatur over en gitt tidsperiode. Produktet blir så vasket med en egnet vaskeoppløsning og mengden merket substans som er tilstede på det uløselige faste bæremiddel, måles som beskrevet ovenfor. Som et resultat kan mengden av humant protein S i prøven bli bestemt. I henhold til metodene beskrevet ovenfor kan mengden av humant protein S i assayprøven måles lett og med god reproduserbarhet og stor nøyaktighet. Humant plasma, humant serium og en supernatant fra en cellekultur er eksempler på prøver som kan undersøkes ved ovenfor nevnte metoder.

For utføring av ovenfor nevnte metoder gir foreliggende oppfinnelse et reagenssystem ifølge krav 6 som omfatter det primære antistoff fiksert til det uløselige faste bæremiddel og det merkede sekundære antistoff. En kit kan bli dannet fra dette reagenssystem og forskjellige hjelpemidler for å bruke reagenssystemet effektivt og enkelt. Eksempler på hjelpemidler innbefatter oppløsningsmidler for å oppløse det faste sekundære antistoff, vaskemidler for å vaske det uløselige bæremiddel, substrater for å måle enzymaktiviteten til enzymer som kan bli brukt som merkesubstanser for det sekundære antistoff og reaksjonsstoppere for disse som nor-malt blir brukt i reagenskit for immunologisk assay. 2) Bestemmelse av et humant C4bp- protein S kompleks i en assayprøve ved å bruke det monoklonale antistoff B. Anvendelse av et monoklonalt antistoff for immunologisk bestemmelse av humant C4bp-protein S kompleks i en assay-prøve i henhold til foreliggende oppfinnelse og reagenssystemet brukt for dette, kan være lik metoden for reagenssystemet beskrevet i punkt 1 ovenfor, bortsett fra at i reagenssystemet blir det monoklonale antistoff B brukt istedenfor det monoklonale antistoff A, samt et monoklonalt eller polyklonalt antistoff som er i stand til å gjenkjenne og binde til C4bp blir brukt istedenfor det monoklonale eller polyklonale antistoff som gjenkjenner og binder til et epitop av humant protein S forskjellig fra det som gjen-kjennes av det monoklonale antistoff A. Gjentagelse av metodebeskrivelsen vil følgelig bli utelatt. 3) Monoklonale antistoff A og B oa fremstilling derav. De monoklonale antistoff A eller B kan erholdes ved å eta-blere en hybridom cellelinje som er i stand til å danne slike antistoff og derpå dyrke hybridomet.

Hybridomet som er i stand til å danne det monoklonale antistoff A eller B kan dannes ved en teknikk kjent som Kohler og Milstein metoden (Kohler og Milstein, Nature, 256. 495-497, 1975). Spesielt blir et pattedyr, f.eks en mus, immunisert med fritt humant protein S og antistoff produserende celler, f.eks. miltceller fra dette dyr, fuseres med myelomceller. De fuserte celler skjermes ved kloning for fuserte celler som er istand til å danne det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen. F.eks blir de fuserte celler som dannes, systematisk skjermet for et antistoff som reagerer med fritt humant protein S eller C4bp-protein S kompleks fiksert til mikrotiterplater.

Det monoklonale antistoff A eller B kan erholdes fra produktet fremskaffet av dette hybridom. Det resulterende monoklonale antistoff virker monospesifikt på epitopen av fritt humant protein S eller C4bp-protein S kompleks.

Det monoklonale antistoff A eller B og fremgangsmåten for å danne dette vil nå bli beskrevet i større detaljer.

a) Isolering og rensing av et antigen.

Fritt humant protein S brukt som et antigen isoleres i ren

form fra en human plasmaprøve ved metoden til BaJaj et al.

[BaJaj S.P., Rapaport S. I., Maki S.L., Brown S. F.: Prep. Biochem., 13, 191, (1983)].

b) Immunisering av pattedyr med fritt humant protein S. Det er ingen spesiell begrensning på dyrene som skal immuni-seres, og forskjellige pattedyr så som mus, rotter, marsvin, kaniner, sauer og geiter, hunder og katter kan bli brukt. På grunn av letthet ved behandling blir Balb/c hannmus vanligvis brukt. Mus fra andre stammer kan også brukes. Immuni-seringen bør være planlagt og konsentrasjonen av fritt humant protein S som skal brukes ved immunisering bør være valgt ut slik at tilstrekkelige mengder antigenstimulerte lymfosytter kan bli dannet. F.eks blir en mus immunisert intraperitonealt flere ganger med en liten mengde fritt humant protein S med visse intervaller, og antigenet blir videre tilført intravenøst flere ganger for å øke titere til antistoffet. Flere dager etter den endelige immunisering blir antistoffproduserende celler f.eks. lymfocytter, fortrinnsvis miltceller, tatt ut fra det immuniserte dyr. Den følgende beskrivelse er gitt med hensyn til bruken av miltceller som antistoff-produserende celler, men det er underforstått at andre antistoff-produserende celler isolert fra immuniserte dyr like godt kan bli brukt for cellefusjonen.

c) Cellefusion.

Milten blir tatt ut aseptisk fra det immuniserte dyr og en

miltcellesuspensjon fremstilles fra dette. Miltcellene blir så fusert med myelomceller tatt fra en egnet cellelinje i et fusjonsmedium i nærvær av en passende fusjonspromotor. Myelomcellene brukt til fusjon kan erholdes fra ethvert pattedyr, men generelt er de som stammer fra samme type dyr som det immuniserte dyr foretrukket. Det foretrukkede bland-ingsforhold mellom miltceller og myelomceller er generelt i området fra ca. 20:1 til ca. 2:1, fortrinnsvis fra 10:1 til 2:1. Vanligvis er bruken av 0,5 til 1,5 ml av fusjonsmediet pr. ca. IO<8> miltceller egnet. Egnede fusjonsmedier er f.eks fysiologisk saltvann, bufret vann, et serumfritt medium hvorav hvert inneholder fusjonspromotoren i en konsentrasjon på 30 - 70%.

Mange myelomceller som er egnet for cellefusjonen, er kjente. I eksemplene som blir gitt nedenfor, P3-X63-Ag8-Ul celler (som skal forkortes som P3-U1) [(se D.E. Yelton et al.: Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1

(1978)]. De er en 8-azaguanin-resistent cellelinje. De mangler hypoxantin-guanin fosforibosyl transferase og over-lever følgelig ikke i HAT medium (inneholdende hypoxantin, aminopterin og tymidin). Videre, siden denne cellelinje er av en ikke-utskillende type som ikke skiller ut et antistoff i seg selv, er den egnet for dannelsen av hybridomet påtenkt ved foreliggende oppfinnelse. Andre myelomceller kan også bli brukt. Eksempler innebefatter P3-NSl-l-Ag4-l, NSl-Ag4/l, P3-X63-Ag8, (MPCH-45, 6. TG1.7), SP2/0-Agl4, FO, X-63Ag8-6.5.3, 210.RCY3.Agl.2.3, S194/5XXO.BU.1, SKO.007, og CM15006TG-A12.

Polyetylenglykol med en gjennomsnittlig molekylvekt på f.eks 1000 - 4000 kan fordelaktig bli brukt som fusjonpromotor. Det kan også bli brukt andre fusjonspromotorer kjent i faget så som Sendai virus. I de følgende eksempler ble polyetylenglykol med en gjennomsnittlig molekylvekt på 1540 brukt.

d) Påvisning av fuserte celler.

En blanding av de fuserte celler, ikke-fuserte miltceller og

ikke-fuserte myelomceller fortynnes i et separat beger (så som en mikrotiterplate) med et selektivt medium hvori de ikke-fuserte myelomceller ikke kan overleve og dyrkes i en tilstrekkelig tidsperiode for å tillate de ikke-fuserte celler å dø (ca. 1 uke). Kulturmediet kan være et som er tilsatt en droge som 8-azaguanin og hvor de ikke-fuserte myelomceller ikke kan overleve, f.eks. det tidligere nevnte HAT medium. I det selektive medium dør de ikke-fuserte myelomceller. Siden de ikke-fuserte miltceller er ikke-tumorale, dør de etter en viss tidsperiode (ca. 1 uke). På den annen side kan de fuserte celler overleve i det selektive medium fordi de har både den tumorbærende natur til de opprinnelige myelomceller og naturen til de opprinnelige miltceller. e) Bestemmelse av et antistoff mot fritt humant protein S i hver brønn.

Etter at hybridomcellene blir påvist som angitt ovenfor, blir supernatanten til kulturvæsken samlet opp og skjermet for et antistoff mot fritt humant protein S eller C4bp-protein S kompleks ved enzymtilknyttet immunosorbent assay [(se f.eks. A. H. W. M. Schuurs og B. K. Van Weemen: Clin. Chim. Acta, 81, 1-40 (1977)]. f) Klonin<g> av hybridomer som er istand til å produsere antistoff A eller B.

Hybridomet som er istand til å produsere det ønskede antistoff, kan klones ved en passende metode såsom en begrensende fortynningsmetode på to forskjellige måter. I en metode dyrkes hybridomet i et passende medium i en gitt tidsperiode, og det dannende monoklonale antistoff av hybridomet kan erholdes fra supernatanten av kulturvæsken. I den andre kan hybridomet injiseres intraperitonealt i en syngenisk mus. Etter en viss tidsperiode kan det monoklonale antistoff A eller B dannet av hybridomet erholdes fra blod og bukvæske fra vertsdyret.

g) Egenskaper til de monoklonale antistoff A og B.

Det monoklonale antistoff A dannet som angitt ovenfor, har

et isoelektrisk punkt i området mellom en pH på 6,2 og 6,8 og binder selektivt kun til fritt humant protein S. Klassen til dets H-kjeder er ^ jL, og klassen til dets L-kjeder er K. Dets dissosiasjonskonstant (KD) målt ved metoden til Frankel og Gerhard [(Frankel, M. E., Gerhard, W.: Mol. Immunol. 16, 107 (1979)], er 0,5 til 1,5 x 10~<9>M med hensyn til fritt protein S, men kan ikke bli målt med hensyn til C4bp-protein S kompleks fordi det i hovedsak ikke binder seg til dette kompleks.

Det monoklonale antistoff B har et isoelektrisk punkt i området mellom en pH på 5,6 og 6,2 og binder selektivt kun til C4bp-protein S kompleks (dvs. binder ikke i vesentlig grad til fritt protein S eller C4bp). Klassen til dets H-kjeder er ^ 2b' 0<3 klassen til dets L-kjeder er K . Dissosiasjonskonstanten (KD) til det monoklonale antistoff B målt ved metoden til Frankel og Gerhard er 4,0 til 6,0 x 10~<8>M med hensyn til fritt protein S og 1,0 til 2,0 x 10~<9>M med hensyn til C4bp protein S kompleks. Dets dissosiasjonskonstant med hensyn til C4bp kan ikke bli målt, fordi det binder ikke i vesentlig grad til C4bp (dissosiasjonskonstanten med hensyn til fritt protein S kan ikke bli målt ved EIA metoden fordi det ligger utenfor påvisningsgrensen).

Litwiller et al. ^) og Malm et al. <2>) rapporterte separat monoklonale antistoff til humant protein S spesifikke for en Ca<2+->stabilisert epitop t<1>) R.D. Litwiller, R. J. Henny, J. A. Katzmann, R. S. Miller, og K. G. Mann: Blood, vol. 67, No. 6, pp. 1583-1590 (1986); <2>) J. Malm, U.Persson og B. Dahlback: European Journal of Biochemistry, vol. 165, s. 36-45 (1987]. Epitopene for disse monoklonale antistoff er lokalisert i Gla regionen til protein S i en nært beliggende trombin-sensitiv region. Disse monoklonale antistoff gjenkjenner både fritt protein S og C4bp-protein S kompleks. Foreliggende oppfinnelse fremskaffer de monoklonale antistoffer A og B. Det monoklonale antistoff A gjenkjenner kun fritt protein S og binder ikke til C4bp protein S kompleks, mens det monoklonale antistoff B gjenkjenner C4bp-protein S kompleks spesifikt. Dette faktum viser at de monoklonale antistoffer A og B er forskjellige og karakteristiske fra de monoklonale antistoffer til Litwiller et al. og Malm et al.

Det monoklonale antistoff A i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan også brukes til separasjon eller gjenvinning av fritt humant protein S fra en væske innholdende det fri humane protein S, fordi det har funksjonen å spesifikt binde til epitopen av det fri humane protein S.

I henhold til ennå et aspekt av foreliggende oppfinnelse er det således fremskaffet en selektiv adsorbent for fritt humant protein S omfattende et uløselig fast bæremiddel og det monoklonale antistoff A fiksert på dette, og som kan brukes for å separere og gjenvinne fritt humant protein S fra en væske innholdende fritt humant protein S ved å bringe væsken inneholdende fritt humant protein S i kontakt med den selektive adsorbent for å forårsake at fritt humant protein S blir adsorbert på asorbenten og separere adsorbenten fra væsken, og om nød-vendig desorbere fritt humant protein S fra adsorbenten og gjenvinne dette.

Generelt kalles kromatografi basert på anvendelsen av den biologiske affinitet til en adsorbent for separasjon og opprensing av et biologisk stoff, for affinitetskromatografi [Ichiro Chihata, Tetsuya Tosa and Yushi Matsuo, Experi-mental and Applied Affinity Chromatography" (Japansk pub-likasjon) , Kodansha Co. Ltd.].

Uttrykkene "affinitet", "ligand", "uløselig fast bæremiddel" og "adsorbent" som brukt heri, bør være underforstått og ha følgende betydninger

Affinitet: spesifik affinitet mellom to stoffer,

ligand: et stoff med affinitet for et stoff som skal adsorberes eller renses,

uløselig fast bæremiddel: et fast støttemiddel som er uløselig i vann (bortsett fra liganden),

adsorbent: det uløselige faste bæremiddel til hvilket liganden er fiksert.

I det følgende vil den selektive adsorbent for humant protein S og metoden for å separere eller gjenvinne humant protein S fra en væske inneholdende det human protein S og som er fremskaffet av foreliggende oppfinnelse, bli beskrevet i detalj.

Det monoklonalee antistoff A til humant protein S eller til dets Fab region-inneholdende fragment i henhold til foreliggende oppfinnelse er kjemisk bundet som en ligand til et passende uløselig bæremiddel (f.eks. sefarose), og bæremidlet blir så pakket i en kolonne. Kolonnen ekvilibreres med passende buffer (f.eks. 50 mM Tris buffer, pH 7,4, 0,15 M NaCl). En væske inneholdende humant protein S som skal behandles (såsom en human plasma- eller serumprøve), til-settes til den resulterende adsorbent for å adsorbere humant protein S på adsorbenten. Urenheter blir så fjernet fra adsorbenten med en passende vaskeoppløsning (f.eks. 50 mM Tris buffer, pH 7,4, 0,15 M NaCl). Derpå blir mengden av humant protein S i en fraksjon som har passert gjennom kolonnen ("gjennompassasje-fraksjonen") og en fraksjon som har blitt vasket ut fra kolonnen ("vasket fraksjon") målt. Fra de målte verdier kan graden av separasjon av humant protein S fra prøvevæsken regnes ut.

Forskjellige stoffer kan brukes som uløselig fast bæremiddel brukt i den selektive adsorbent ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis er denne laget av f.eks. agarose, polyakrylamid, cellulose, dekstran, maleinsyrepolymer eller en blanding derav. Det uløselige faste bæremiddel kan være i forskjellige former, f.eks. i form av et pulver, granuler, pelle-ter, kuler, film eller fiber.

Fiksering av det monoklonale antistoff eller dets fragment til det uløselige faste bæremiddel utføres generelt ved kjemisk binding av dette til bæremidlet. For eksempel kan det utføres ved å aktivere Sepharose ved virkningen av CNBr og fiksere antistoffet til dette [R. Axén et al.: Nature, 214/ 1302-1304 (1967)].

Når adsorbenten med det humane protein S adsorbert derpå ved kontakt med væsken inneholdende humant protein S separeres fra væsken, kan det humane protein S som er tilstede i væsken bli fjernet. Dersom humant plasma eller serum blir brukt som væske, kan humant plasma eller serum i hovedsak fritt for humant protein S, erholdes. Slikt humant protein S-fritt humant plasma eller serum kan fordelaktig brukes

f.eks. i plasma- eller serumskifteterapi.

Adsorbenten med humant protein S adsorbert derpå og sepa-rert fra assayvæsken kan bli underkastet en desorbsjons-behandling for å eluere humant protein S fra adsorbenten og gjenvinne dette. Det gjenvundne humane protein S kan brukes f.eks. som et supplement i arvelig protein S-defisi-enslidelse og leverlidelser, eller som hemostat. Desorbsjonsbehandlingen kan utføres ved å behandle adsorbenten med humant protein S adsorbert derpå med en eluent. En vandig oppløsning av natriumtiocyanat med en pH på 2,5 - 12,5, fortrinnsvis 4,0 - 9,0, kan fordelaktig brukes som eluent. Andre eksempler på eluent som kan brukes, innbefatter en vandig oppløsning av glycerol, en vandig oppløsning av glycin, en vandig oppløsning av propionsyre, en vandig oppløsing av etylenglykol og en vandig oppløsning av guanidin.

Konsentrasjonen av natriumtiocyanat i den vandige natrium-tiocyanatoppløsning er fordelaktig 0,5 M til 6 M, fortrinnsvis 2M til 4 M. For pH-justering kan den vandige oppløsning innbefatte passende pH-justerende midler, f.eks. hydrok-syder, såsom natriumhydroksyd eller kaliumhydroksyd, salt såsom Tris salter, fosfatsalter eller Veronalsalt, syrer såsom saltsyre, salpetersyre, eddiksyre, sitronsyre og oksalsyre, aminer såsom etanolamin, ammoniakk eller urea. Desorbsjonsbehandlingen utføres ved en temperatur over frysepunktet, men ikke overskridende 37°C, fortrinnsvis ved 2-10°C. Desorbsjonsbehandlingen utføres ved en kolonne-metode, en satsvis metode osv. Tiden som kreves for eluering er ønskverdig kort, men kan vare opptil ca. 2 døgn.

Fra eluatet inneholdende det eluerte humane protein S kan det humane protein S separeres og renses ved i og for seg kjente metoder, f.eks. ved dialyse, konsentrasjon eller væskekromatografi.

Som angitt ovenfor, har det monoklonale antistoff A eller dets Fab-regioninneholdende fragment funksjnen å spesifikt blokkere det C4bp-bindende sete til humant protein S, dvs. det sete til humant protein S som binder C4b-bindende protein (C4bp). Humant protein S eksisterer i plasma i to former.

En er det fri protein S og den andre er C4bp proteinkom-plekset. Kun det fri protein S virker som en kofaktor ved inaktiveringen av koaguleringsfaktorene Va og VIII ved aktivert protein C, som er en vitamin K-avhengig serin protease. Funksjonen til disse kofaktorer tapes når pro-tein S binder seg til C4b-bindende protein. Når det monoklonale antistoff A i henhold til foreliggende oppfinnelse binder seg til protein S kan C4b-bindende protein (C4bp) ikke binde seg til protein S monoklonalt antistoff-immunokomplekset, men immunokomplekset virker som en kofaktor overfor aktivert protein C.

Kort beskrivelse av de medfølgende tegninger

Fig. 1 viser bindingsstyrken av de monoklonalee antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse til humant protein S. Fig. 2 viser bindingsstyrken av de monoklonale antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse overfor C4bp-protein S komplekset. Fig. 3 viser de isoelektriske punkter av de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen. Fig. 4 er en kalibreringskurve som viser relasjonen mellom konsentrasjonen av humant protein S og forandringene i absorbans. Fig. 5 er en kalibreringskurve som viser relasjonen mellom mengden av det humane C4bp-protein S kompleks og forandringer i absorbans. Fig. 6 viser de faktisk målte mengder av humant protein S og

humant C4bp-protein S kompleks i plasmaprøver tatt fra menneskelige pasienter.

De følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse i større detalj. I disse eksempler er protein S enkelte ganger forkortet som "PS".

Eksempel 1

To Balb/C hunmus (4 uker gamle) ble immunisert 4 ganger med renset humant PS med 14 dagers intervaller. I den første immunisering ble 50 \ ig av humant PS oppløst i PBS og blandet med en lik mengde fullstendig Freund's tilsetning og den resulterende emulsjon ble tilført intraperitonealt (0,5 mg pr. mus) . I andre og tredje immunisering ble 50 >ig humant PS blandet på lignende måte med Freund's ufullstendige tilsetning og tilført intraperitonealt. I den endelige immunisering ble 30 jjg av humant PS i PBS tilført direkte gjennom halevenen. Tre dager etter den endelige immunisering ble miltceller fra de immuniserte mus brukt i cellefusjonen.

Miltcellene til de immuniserte mus og myelomceller (P3U1) fra mus av samme stamme ble blandet i et forhold på fra ca. 5:1 til ca. 7:1 og fusert i samsvar med metoden til Kohler og Milstein i nærvær av 50% etylenglykol 1540 (et produkt fra Wako Pure Chemicals Co., Ltd.). De fuserte celler ble suspendert i 10% FCS-RPM1-1640 medium, slik at cellekonsen-trasjonen var 1 x IO<6> celler/ml. Suspensjonen ble helt opp i en 95 brønners mikroplate (laget av Coster Company) i en mengde på 100 mikroliter pr. brønn.

De fuserte celler ble dyrket i en C02 inkubator (5% C02, 37°C). Mediet ble erstattet med et medium inneholdende hypoxantin, aminopterin og tymidin (HAT medium), og cellene ble dyrket i HAT-mediet. Hybridomer beståene av miltceller og myelomceller ble isolert ved skjerming.

Antistoffene i supernatanten av kulturvæsken fra hybridomet ble påvist ved ELISA metoden ved å bruke mikrotiterplater belagt med antigen humant PS. Alkalisk fosfatasekonjugert kanin anti-muse IgG antistoff ble brukt som et andre antistoff og bindingsegenskapene til antistoffene overfor det antigene PS ble undersøkt. Blant 494 brønner totalt hvori de fuserte celler hadde blitt satt ut, ble dannelsen av kolonier observert i 437 brønner. Av disse var 94 brønner positive i antistoffproduksjon og viste den egenskap å binde til PS-antigenet.

I 4 brønner av de positive brønner ble kloning utført to ganger ved den begrensende fortynningsmetode og 6 kloner ble erholdt. De erholdte kloner ble suspendert i 90% FCS-10% DMSO og lagret i flytende nitrogen.

Monoklonale antistoffer dannet av disse kloner ble dyrket i bukhulen til Balb/C-mus og renset fra bukvannet til musene ved å bruke en protein A-Sepharose 4B kolonne.

Eksempel 2

De rensede monoklonale antistoffers egenskaper

Klonene renset fra bukvannet til musene ble undersøkt for IgG-klasser og bindeegenskaper overfor humant protein S

(PS) .

De spesielle klasser av muse monoklonale antistoffer ble besstemt ved Ouchterlonymetoden ved å bruke anti-muse antisera spesifikke for de individuelle klasser. Resultatene er vist i tabell 2.

Bindingsegenskapene til antiistoffene overfor humant protein S ble vurdert ved å reagere humant protein S festet til mikrotiterplater med de monoklonale antistoffer fortynnet til egnet konsentrasjon og å påvise reaksjonsproduktene ved å bruke alkalisk fosfatasekonjugert geite anti-muse IgG. Bindingsstyrkene til de 6 monoklonale antistoffer overfor humant protein S er: 2B9F12=2B9C10 > 3C3G8 > 3C4G4 > 2B9G2 » 2E12C7.

Resultatene er vist i fig. l.

Eksempel 3

Reaktivitet med humant C4b-bindende protein og protein S kompleks (C4bp-PS kompleks): Tre rensede monoklonale antistoffer (2B9F12, 2B9C10, 2E12C7) og geite anti-PS antistoff ble belagt på mikrotiterplater i en konsentrasjon på 10 jjg/ml og blokkert med 1% BSA. Derpå ble C4bp-protein S komplekset fortynnet til en egnet konsentrasjon, tilsatt og reagert med det monoklonale antistoff. Derpå ble alkalisk fosfatasekonjugert anti-C4pb antistoff tilsatt og bindingsegenskapene til de tre monoklonale antistoffer overfor C4bp-protein S komplekset ble påvist.

Monoklonalt antistoff 2E12C7 hadde meget svak binding til fritt protein S, men viste en høy grad av spesifik binding til C4bp-protein S komplekset. På den annen side viste 2B9F12 ingen binding til C4bp-protein S komplekset. Resultatene er vist i figur 2.

På denne måte, ved å bruke forskjellige antistoffer i det immunologiske forsøket (EIA, RIA), kan fritt humant protein S og C4bp-protein S kompleks i oppløsning (f.eks. humant plasma) bli undersøkt.

Eksempel 4

Måling av dissosiasjonskonstanter (KD):

Et renset monoklonalt antistoff ble merket med <125>i (jod-125) ved å bruke Immunobeads (et produkt fra Bio-Rad Co.).

Renset protein S og C4bp-protein S kompleks i en konsentrasjon på 1 ug/ml ble satt til en 96 brønners mikrotiterplate (Titertek laget av Flow Lab. Co,) i en mengde på 50 pl pr. brønn og adsorbert ved 4°C over natten. 10 mM fosfatbuffer (pH 7,2) inneholdende 1% BSA og 0,125 M NaCl ble tilsatt i en mengde på 100 pl/brønn. Platene ble så oppbevart ved romtemperatur i 2 timer og derpå vasket 2 ganger (100 Ml/brønn) med 10 mM fosfatbuffer (pH 7,2) inneholdende 0,05% Tween 20 (vaskeoppløsning) . Det ■1-2^ I-merkede monoklonale antistoff fortynnet til forskjellige konsentrasjoner (0,01-5 jjg/ml) ble tilsatt brønnene til platen og inkubert ved 37"C i 2 timer. Platen ble så vasket 3 ganger med ovenfor nevnte vaskeoppløsning (100 pl/brønn).

Brønnen ble skåret ut fra platen og plassert i plast forsøksrør. <125>I-radioaktiviteten ble målt med en gamma-teller (radioaktivitet bundet til det faste antigen: B i cpm). På samme tid ble radioaktiviteten til den fortynnede oppløsning av <125>I-merket monoklonalt antistoffoppløsning tilsatt brønnene målt (den totale tilsatte radioaktivitet: t i cpm). Konsentrasjonen til det tilsatte monoklonale antistoff ble avsatt på abcisseaksen, og forholdet mellom T-B (radioaktiviteten ikke bundet til det faste antigen: F i cpm) og B på ordinataksen. Fra Scatchardkurven ble dissosiasjonskonstanten (KD) regnet ut. Resultatene er oppsummert i tabell 3.

Eksempel 5

Måling av isoelektriske punkter av rensede monoklonale antistoffer.

Hvert av de rensede monoklonale antistoffer (2B9F12, 2B9C10, 2E12C7) i en mengde på 10 pg ble underkastet agarose isoelektrisk fokusering ved 4 *C under en pH gradient på 3,5 til 9,0. Etter isoelektrisk fokusering i 2 timer ble antistoff-proteinet i agarosegelen immobilisert og farget med CBB. Fotografiet av disse elektroforeser ble tatt og er vist i fig. 3. Fra beliggenheten av de elektroforetiske bånd av de monoklonale antistoffer ble de isoelektriske punkter av antistoffene målt ved å bruke en standard isoelektrisk punktmarkør samtidig underkastet elektroforese. Disse var en pH på 6,2 - 6,8 for 2B9F12, en pH på 6,2 - 6,8 for 2B9C10 og en pH på 5,6 - 6,2 for 2E12C7.

Eksempel 6

(1) Fiksering av et antistoff til et uløselig bæremiddel

En tørr gel (0,5 g) av cyanogen bromidaktivert Sepharose 4B (laget av Pharmacia Fine Cheicals, Inc.) ble svellet og vasket med 100 ml av 1 mM HC1 og derpå ytterligere vasket med en koblingsbuffer (0,1 M NaHC03) inneholdende 0,5 M NaCl, pH 8,3) på et G3 glassfilter. Koblingsbufferen ble fjernet ved sug, og umiddelbart etter ble gelen suspendert i 2 ml av en koblingsbufferoppløsning (3 mg/ml) for et monoklonalt antistoff (2B9F12). Suspensjonen ble forsik-tig ristet over natten ved 4°C. Gelen ble så overført til 1 M etanolamin-HCl (pH 8,0, 2ml) og ristet ved romtemperatur i 2 timer for å blokkere de gjenværende aktive grupper. Etter blokkeringen ble den antistoffbundne Sepharosegel vasket på et glassfilter med 0,1 M acetatbuffer (pH 4,0) inneholdende 0,5 M NaCl og 0,1 M boratbuffer (pH 8,0) inneholdende 0,5 M NaCl alternerende. Når absorbansen av filtratet ved 280 nm sank under 0,01, ble den ekvilibrert med 0,05 M Tris/HCl (pH 7,4) inneholdende 1 nM benzamidin, og fylt i en kolonne. Affinitetskromatografi ble utført på det fremstilte antihumane PS monoklonale antistoff (2B9F12)-bundne Sepharose 4B-kolonne.

(2) Adsorpsjon av protein S på antistoffr-bundet Sepharose 4B og eluering derav

Til 100 ml plasma ble det tilsatt 8 ml IM BaCl2-oppløsning, og blandingen ble omrørt ved 4 °C i 1 time. Utfellingen ble samlet ved sentrifugeseparering og vasket med 0,1 M NaCl inneholdende 5 mM BaCl2 og 5 mM benzamidin. Utfellingen ble oppløst i 15 ml 0,2M EDTA (pH 7,4) inneholdende 5 mM benzamidin for å erholde en bariumadsorbert fraksjon. Den bariumadsorberte fraksjon ble dialysert mot 0,05 M Tris/BCl (pH 7,4) inneholdende 1 Mm benzamidin og 1 M NaCl og påført den antistoff 2B9F12-bundne kolonne ekvilibrert med 0,05 M Tris/HCl (pH 7,4) inneholdende 1 mM benzamidin. Kolonnen ble vasket med 0,05 M/Tris/HCl (pH 7,4) inneholdende 1 nM benzamidin og 1 M NaCl and eluert med 3 M NaSCN (pH 7,0) oppløsning. En enkelt topp inneholdende PS ble erholdt. Gjenvinningsgraden var ca. 75,4%.

Eksempel 7

Måling av humant protein S

Det monoklonale antistoff erholdt i eksempel 1 (2B9F12) til humant protein S ble belagt på en mikrotiterplate i en konsentrasjon på 15 pg/ml. Platen ble blokkert med fosfatbuffer (PBS) inneholdende 1% bovint serum albumin (BSA) og derpå vasket tre ganger med en vaskeoppløsning (0,5% BSA-PBS inneholdende 0,5% Tween). Deretter ble renset protein S og en plasmaprøve tatt fra en human pasient fortynnet til egnet konsentrsjon med PBS og omsatt ved 37"C i 2 timer med det monoklonale antistoff, adsorbert på den faste fase av platen. Platen ble vasket 3 ganger med vaskeoppløsning og derpå ble en oppløsning av et peroksydase-merket monoklonalt antistoff (2B9C10) overfor humant protein S tilsatt. Platen ble inkubert ved 37°C i 2 timer og vasket med vaskeoppløsningen tre ganger. Derpå ble en substrat (ABTS)-oppløsning tilsatt, og forandringer i absorbans pr. minutt ( 415 nm/min.) ble målt i en ELISA ANALYZER (ETY-96 laget av Toyo Sokki Co. Ltd.). Konsentra-sjonene av renset protein S og forandringene i absorbans ble tegnet ned for å trekke en kalibreringskurve. Kalibreringskurven er vist i fig. 4. Konsentrasjonen av protein S og absorbansen var i et rettlinjet forhold opp til ca. 50 ng/ml. Dersom denne kalibreringskurve brukes, kan mengden av humant protein S regnes ut nøyaktig med høy følsomhet.

Mengden av protein S i plasmaprøver fra humane pasienter ble regnet ut ved å bruke denne kalibreringskurve og resultatene er vist i fig. 6. I fig. 6 er mengden av protein S i en plasmaprøve tatt fra en normal, frisk pasient angitt som 100%.

Eksempel 8

Måling av humant C4bp-protein S kompleks.

Det monoklonale antistoff (2E12C7) overfor humant protein S, som bandt seg spesifikt til det humane C4bp-protein S kompleks ble belagt i en konsentrasjon på 20 pg/ml på en mikrotiterplate. Platen ble blokkert med fosfatbuffer (PBS) inneholdende 1% bovint serum albumin (BSA) og derpå vasket tre ganger med en vaskeoppløsning (0,5% BSA-PBS inneholdende 0,05% Tween 20).

En plasmaprøve tatt fra en normal, frisk person og en plasmaprøve tatt fra pasienter ble fortynnet til passende konsentrasjoner med PBS, og hver omsatt ved 37°C i 2 timer med det monoklonale antistoff adsorbert på den faste fase av platen. Platen ble vasket tre ganger med vaskeoppløs-ningen og omsatt med en oppløsning av et alkalisk fosfatase-merket polyklonalt antistoff overfor humant C4b-bindende protein (C4bp) ved 37°C i 2 timer. Platen ble så vasket tre ganger med vaskeoppløsningen, og en substratoppløsning (1 mg/ml) ble tilsatt. Forandringene i absorbans pr. minutt (A A405 nm/min) ble målt på en ELIZA ANALYZER (ETY-96, laget av Toyo Sokki Co., Ltd.). Plasmaen fra en frisk person ble fortynnet og mengden av det humane C4bp-protein S kompleks i plasma og forandringene i absorbans ble tegnet ned for å trekke en kalbreringskurve. Kalibreringskurven er vist i fig. 5. Konsentrasjonen av det humane C4bp-protein S kompleks i plasma fra den friske personen og forandringene i absorbans var i et rettlinjet forhold. Bruken av denne kalibreringskurve tillot nøyaktig utregning av mengden av humant C4bp-protein S med høy følsomhet.

Mengden av humant C4bp-protein S kompleks i plasmaprøvende fra humane pasienter ble regnet ut ved å bruke denne kalibreringskurve, og resultatene er vist i fig. 6. I fig. 6 er mengden av humant C4bp-protein S kompleks i plasma fra den friske person angitt som 100%.

Det observeres at forskjellige sykdommer kan diagnostiseres ved å bestemme mengdene av fritt protein S og C4bp-protein S kompleks i humant plasma ved å bruke monoklonale antistoffer overfor humant protein S.

Claims

1. Monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro, karakterisert ved at det ikke binder til et kompleks av humant protein S og human komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp), men som binder spesifikt til fritt humant protein S, at det har et isoelektrisk punkt i området mellom pH 6,2 og 6,8, samt at det har H-kjeder i klasse T]_ og L-kjeder i klasse K.

2. Monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro, karakterisert ved at det ikke binder til fritt humant protein S og human komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp), men som spesifikt binder til et kompleks av humant protein S og human komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp), at det har et isoelektrisk punkt i området mellom pH 5,6 og 6,2, samt at det har H-kjeder i klasse T2b°9 L-kjeder i klasse K.

3. Anvendelse av et eventuelt merket monoklonalt antistoff ifølge krav l i prøver for påvisning av fritt protein S, spesielt i forbindelse med et eventuelt merket andre antistoff, hvor et av antistoffene fortrinnsvis kan være bundet til et uoppløselig fast bæremiddel, hvor markøren fortrinnsvis kan være et enzym, en luminescent substans eller en radioisotop, samt hvor de to antistoffene binder til forskjellige epitoper av fritt humant protein S.

4. Anvendelse av et eventuelt merket monoklonalt antistoff ifølge krav 2 i prøver for bestemmelse av et kompleks av humant protein S og human komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp), spesielt i forbindelse med et eventuelt merket andre antistoff, hvor markøren fortrinnsvis kan være et enzym, en luminescent substans eller en radioisotop, samt hvor et av antistoffene fortrinnsvis kan være bundet til et uoppløselig fast bæremiddel.

5. Anvendelse av monoklonalt antistoff ifølge krav 1 ved separasjon eller gjenvinning ved separasjon eller gjenvinning av fritt humant protein S fra en væske såsom humant plasma eller serum, hvor væsken bringes i kontakt med det monoklonale antistoffet festet til et uoppløselig bæremiddel, og hvor det frie humane protein S adsorberes på bære-middelet, hvorpå bæremidlet eventuelt adskilles fra væsken og det humane protein S desorberes fra bæremidlet, eksem-pelvis ved å bruke en vandig oppløsning av natriumtiocyanat med pH på 4,0 - 9,0.

6. Reagenssystem for immunologisk bestemmelse av fritt humant protein S i en prøve, omfattende et primært antistoff festet til et uoppløselig fast bæremiddel samt et sekundært antistoff, hvor det primære og sekundære antistoff har egenskapen å binde seg til forskjellige epitoper av fritt humant protein S, karakterisert ved at et av det primære og sekundære antistoff er det monoklonale antistoff som er angitt i krav 1.

7. Reagenssystem for immunologisk bestemmelse av et kompleks av humant protein S og et human komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp) i en prøve, omfattende et primært antistoff festet til et uoppløselig fast bæremiddel, samt et sekundært antistoff, karakterisert ved at et av det primære og sekundære antistoff er det monoklonale antistoff som er angitt i krav 2.

8. Selektiv adsorbent for fritt humant protein S, omfattende et uoppløselig bæremiddel, karakterisert ved at det ytterligere omfatter det monoklonale antistoff som er angitt i krav 1 festet til dette bæremiddel, og hvor det uoppløselige bæremiddel fortrinnsvis er valgt fra gruppen omfattende agarose, polyakrylamid, cellulose, dekstran, maleinsyrepolymer og bland-inger derav.