NO172084B - Monoklonalt antistoff, anvendelse derav samt reagenssystem for immunologisk bestemmelse av fritt protein s og c4bp-protein s kompleks - Google Patents
Monoklonalt antistoff, anvendelse derav samt reagenssystem for immunologisk bestemmelse av fritt protein s og c4bp-protein s kompleks Download PDFInfo
- Publication number
- NO172084B NO172084B NO875215A NO875215A NO172084B NO 172084 B NO172084 B NO 172084B NO 875215 A NO875215 A NO 875215A NO 875215 A NO875215 A NO 875215A NO 172084 B NO172084 B NO 172084B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- protein
- monoclonal antibody
- human
- antibody
- human protein
- Prior art date
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 12
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 5
- 102100037080 C4b-binding protein beta chain Human genes 0.000 title 1
- 101000740689 Homo sapiens C4b-binding protein beta chain Proteins 0.000 title 1
- 101000577630 Homo sapiens Vitamin K-dependent protein S Proteins 0.000 claims description 98
- 102000052932 human PROS1 Human genes 0.000 claims description 97
- 229940099815 human protein s Drugs 0.000 claims description 97
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 80
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 claims description 50
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 claims description 49
- 102100037084 C4b-binding protein alpha chain Human genes 0.000 claims description 33
- 101710159767 C4b-binding protein alpha chain Proteins 0.000 claims description 32
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 27
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 20
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- 102000006912 Complement C4b-Binding Protein Human genes 0.000 claims description 15
- 108010047548 Complement C4b-Binding Protein Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 5
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 claims description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 101000740685 Homo sapiens C4b-binding protein alpha chain Proteins 0.000 description 21
- 102000052964 human C4BPA Human genes 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 16
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 13
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 13
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 6
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 6
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 6
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- -1 carboxylamino Chemical group 0.000 description 4
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 4
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 2
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Natural products OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 2
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 2
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical class CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 5-aminoisoindole-1,3-dione Chemical compound NC1=CC=C2C(=O)NC(=O)C2=C1 PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010004053 Bacterial toxaemia Diseases 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 240000006829 Ficus sundaica Species 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 206010051292 Protein S Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000013222 Toxemia Diseases 0.000 description 1
- 108091005605 Vitamin K-dependent proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L barium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ba+2] WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N iodine-125 Chemical compound [125I] ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 208000009928 nephrosis Diseases 0.000 description 1
- 231100001027 nephrosis Toxicity 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001173 tumoral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse omhandler monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro for bestemmelse av fritt humant protein S eller et kompleks av humant protein S og humant komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp) i en assayprøve. Mere spesielt omhandler oppfinnelsen immunologisk bestemmelse av fritt humant protein S eller ovennevnte kompleks i en assayprøve ved "Sandwich" metoden ved å bruke et nytt spesifikt monoklo-nalt antistoff som binder til fritt humant protein S eller tidligere nevnte kompleks samt et nytt antistoff som kan brukes i denne metode, et reagenssystem brukt i denne metode og anvendelsen av det nye monoklonale antistoff ved separasjon og gjenvinning av fritt humant protein S.
Protein S, lik protein C, er et vitamin K-avhengig protein. Det ble først isolert av Discipio et al. fra kveg og mennesker i 1977 (se Discipio, R.G., Hermodson, M.A., Yates, S. G. og Davie, E. M.: Biochemistry, 16, 696-706, 1977).
Protein S er et enkeltkjedet glykoprotein med en molekylvekt på 69 000 (humant) som er tilstede i en mengde på ca. 10 mg per liter i en normal human plasmaprøve. Dets struktur er meget lik den til andre vitamin K-avhengige faktorer og har ca. 10 gammakarboksyglutaminsyre (Gla) enheter ved NH2 ter-minalen. Protein S eksisterer i to former i blodet. En er fritt protein S som virker som en kofaktor til aktivert protein C. Den andre er et kompleks av protein S og komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp) hvor protein S er ikke-kovalent bundet til høymolekylært C4b-bindende pro-tein (C4bp), en kontrollfaktor i et komplementsystem (komplekset vil enkelte ganger bli forkortet "C4bp-protein
S kompleks"). Forholdet mellom fritt protein S og C4bp proteinkompleks er ca. 1:1.
Viktigheten av funksjonen av protein S i C4bp protein S komplekset er at det har en meget sterk affinitet for en negativt ladet overflate av et fosfolipid (Nelsestuen, G.L., Kisiel, W. og Discipio, R. G: Biochemistry, 17: 2134-2138, 1978). Det er antatt at når en celle skades eller aktiveres, binder Gla-domenet i protein S til fosfolipidet i nærvær av Ca<2+>, og C4bp binder ytterligere til protein S for å danne et kompleks hvorved protein S utfører sin funksjon (Dahlback, K.B: Semin. Thromb. Haemostas., 10, 139-148, 1984).
Nylige studier har vist at protein S spiller en meget viktig rolle i mekanismen for å kontrollere koaguleringen og fibri-nolysesystemet til protein C, og dets fysiologiske signifi-kans i relasjon til trombose har vakt interesse. Det har blitt rapportert at medfødt mangel på protein S kunne være en årsak til trombose (Comp. P. C., Nixon, R. R., Cooper, N. R. og Esmon, C. T. : J. Clin. Invest. , 7_4: 2082-2088, 1984).
Dersom det er mulig å utarbeide virkningsmekanismen til protein S og måle mengdene av antigen og aktiviteten til protein S i blodet, ville det være av meget stor viktighet i områdene basal medisin og klinisk medisin.
På den annen side har monoklonale antistoff nylig kommet til utstrakt bruk for analyse av funksjoner og strukturer av antigenproteiner eller for immunoassays (EIA, RIA) pga. for-delene at de er spesifikke kun til en enkel epitop, og monoklonale antistoffer med samme spesifisitet kan bli dannet stabilt. Spesielt for funksjonell og molekylær analyse av antigenproteiner vil dette være en passende metode for å oppdage et antistoff som gjenkjenner et sete som er inn-volvert i funksjonen av antigenproteinene eller deres spesielle strukturelle seter.
Konvensjonelle metoder for bestemmelse av protein S innebefatter f.eks Laurellmetoden som bruker et antiserum til protein C og RIA (radioimmunoassay) og EIA (enzym immuno-assay) innbefattende bruken av polyklonale antistoff. Disse metoder tillater imidlertid bare måling av den totale mengde fritt protein S og dets kompleks med C4bp. De tidligere metoder har de ulemper at animalske antisera med en fast aktivitet er ekstremt vanskelig å holde stabilt i store mengder, og serumets aktivitet må korrigeres ved å bruke en standard. Det har også den defekt at en lang tidsperiode er krevet for immunodiffusjon. I henhold til sistnevnte metoder må antistoffene renses fra antisera og stabile antistoffer er vanskelige å erholde.
Oppfinnerne merket seg at protein S danner et kompleks med komplement kofaktor C4b-bindende protein, C4bp, og tenkte at, dersom et monoklonalt antistoff som binder selektivt bare til fritt protein S og et monoklonalt antistoff som binder selektivt kun til C4bp protein S komplekset kan erholdes, ville det være mulig å utføre selektiv immunologisk bestemmelse av fritt protein S og C4bp protein S kompleks enkelt og nøyaktig uten ulempene forbundet med tidligere teknikk. Utstrakte undersøkelser basert på denne antagelse har nå ført til den suksessrike dannelse av spesifikke monoklonale antistoffer.
Oppfinnelsen omfatter således det for in vitro anvendbare monklonale antistoff som er angit i krav l's karakteriserende del samt det for in vitro anvendbare mpnoklonale antistoff ifølge den karakteriserende delen av krav 2.
I henhold til et aspekt av foreliggende oppfinnelse anvendes det monoklonale antistoff angitt i krav 1 for immunologisk bestemmelse av fritt humant protein S i en prøve, og dette omfatter å omsette et primært antistoff festet til et oppløselig fast bæremiddel og et merket sekundært antistoff i kontakt med prøven hvor det primære og sekundære antistoff har egenskapen å binde til forskjellige epitoper av fritt humant protein S, og ett av de primære og sekundære antistoff er et monoklonalt antistoff med egenskapen ikke å binde til et kompleks av det humane protein S og humant komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp), men spesifikt å binde til det fri humane protein S.
I henhold til et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse anvendes det monoklonale antistoff angitt i krav 2 for immunologisk bestemmelse av et kompleks av humant protein S og humant komplement kofaktor 4b-bindende protein (C4bp) i en prøve, og dette omfatter å sette et primært antistoff festet til et uløselig fast bæremiddel og et merket sekundært antistoff i kontakt med prøven, hvor ett av det primære og sekundære antistoff er et monoklonalt antistoff med egenskapen ikke å binde til fritt humant protein S og humant komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp), men å binde spesifikt til nevnte kompleks og hvor det andre er et antistoff med egenskapen å binde til det humane komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp).
Metoden med immunologisk bestemmelse av et spesifikt antigen i en assayprøve ved å bruke et primært antistoff festet til et uløselig fast bæremiddel og et merket sekundært antistoff er kalt "Sandwich-metoden" og er f.eks. beskrevet i Wide "Radioimmunoassay Methods" 199-206 (1970).
Anvendelsen av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er særpreget ved at, basert på prinsippet ved Sandwich-metoden, et av fritt humant protein S og C4bp protein S kompleks i en prøve bestemmes selektivt: a) et monoklonalt antistoff med egenskapen ikke å binde til C4bp protein S kompleks, men som spesifikt binder til fritt humant protein S (vil refereres til som "monoklonalt antistoff A" for letthets skyld i foreliggende beskrivelse).
b) et monoklonalt antistoff med egenskapen ikke å binde til fritt humant protein S og C4bp, men som spesifikt binder
til C4bp-protein S kompleks (vil refereres til som "monoklo-nalt antistoff B" for letthet skyld i foreliggende beskrivelse) .
Disse monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen tillater måling av fritt humant protein S eller C4bp-protein S kompleks i en assayprøve (f.eks.plasma) med konstant og god nøyaktighet uten variasjon i kvaliteten av reagenser. I henhold til anvendelsen av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fritt humant protein S og C4bp-protein S kompleks måles direkte, og nøyaktige målinger innenfor korte tidsperioder kan bli utført uten noen innvirkning fra fremmede materialer i prøven.
In vitro-anvendelsen av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse tillater således diagnose av trombosetUstandene med kreft som basissykdom, nephrosis, osv. og nøyaktig bestemmelse av den fibrinolytiske tilstand av toxemia i graviditet og den fibrinolytiske tilstand hos pasienter som har undergått kirurgisk operasjon, og som tidligere i det store og hele har vært umulig. Dette fremskaffer store fordeler i medisinen.
Oppfinnelsen vil bli beskrevet i større detalj.
1) Bestemmelse av fritt humant protein S i en prøve ved å bruke monoklonalt antistoff A;
I fremgangsmåten ved immunologisk bestemmelse av fritt humant protein S i en assayprøve i henhold til foreliggende oppfinnelse blir et (primært antistoff) av de to antistoff festet til et uløselig bæremiddel og det andre (sekundært antistoff) blir brukt i merket tilstand. Det monoklonale antistoff kan bli brukt som primært antistoff festet til det uløselige faste bæremiddel eller som merket sekundært antistoff. I hvert tilfelle har det i hovedsak ingen effekt på resultatene ved bestemmelse av humant protein S.
Antistoffene brukt i kombinasjon med det monoklonale antistoff A kan være ethvert monoklonalt eller polyklonalt antistoff som gjenkjenner en epitop av humant protein S som er forskjellig fra den gjenkjent av det monoklonale antistoff A og binder til dette. Generelt er det imidlertid passende å bruke et monoklonalt antistoff som gjenkjenner og binder til en epitop av fritt humant protein S som er forskjellig fra det gjenkjent av det monoklonale antistoff A, og som er dannet fra et hybridom erholdt som et biprodukt under av-skjermingen av et hybridom som danner det monoklonale antistoff A.
Det primære antistoff kan festes til den uløselige faste bærer ved i for seg kjente metoder. F.eks festes en oppløs-ning av det primære antistoff og det uoppløslige faste bæremiddel i kontakt med hverandre og oppbevares hvorved antistoffet absorberes fysisk på bæremidlet. Det er også mulig å kombinere de funksjonelle grupper til antistoffet, såsom en karboksylamino eller hydroksylgruppe kjemisk med det uløs-lige faste bæremiddel. Fortrinnsvis er overflaten til bæremidlet til hvilket det primære antistoffet har blitt festet belagt med en passende substans såsom bovin serumalbumin for å unngå ikke-spesifikk kombinasjon med det sekundære antistoff eller prøven.
Eksempler^ på det uløselige faste bæremiddel brukt for å fiksere det primære antistoff innebefatter polymere materialer så som polystyren, polyetylen, polypropylen, poly-estere, polyakrylnitril, fluorinneholdende resiner, nitrocellulose, fornettet dekstran, polysakkarider og agarose, uorganiske materialer såsom glass og metall og kombinasjoner av disse. Det faste bæremiddel kan være i forskjellig form, f.eks i form av et brett, kuler, fiber, partikkel, kjede, skive, stav, beger, celle eller forsøks-rør. Spesielle eksempler på det uløselige faste bæremiddel er plastbegere, plastkjeder, glasskjeder og metallpartikler.
Det sekundære antistoff merkes med radioisotoper, enzymer eller luminisente substanser. Eksempler på radioisotoper er 125I, 131I, 14C og <3>H. Eksempler på enzymene er alkalisk fosfase, peroksydase og beta-D-galaktosidase. Eksempler på luminisent substans er fluorescin, isotiocyanat og tetra-metyl rodamin isotiocyanat. Disse er kun illustratoriske og andre merkestoff brukt i immunologiske assays kan også bli brukt. Kombinasjonen av merkesubstanser med det sekundære antistoff, kan utføres på i og for seg kjente måter, f.eks ved metodene beskrevet i G.S. David; Biochem. Biophys. Res. Commun., 48, 464-471, (1972), M. Imagawa et al., Anal. Lett., 16, 1509-1523 (1983) og M. Nishioka et al., Cancer Res., 32, 162-166 (1972).
Det fikserte primære antistoff og det merkede sekundære antistoff blir så bragt i kontakt med en assayprøve for bestemmelse av humant protein S ved en totrinnsmetode omfattende å sette prøven først i kontakt med det fikserte primære antistoff og så med det merkede sekundære antistoff, eller ved en entrinnsmetode omfattende å sette prøven i kontakt med det sekundære antistoff samtidig med det primære antistoff. Entrinnsmetoden er fordelaktig i forhold til totrinnsmetoden fordi den tillater en enklere og raskere bestemmelse av humant protein S.
I totrinnsmetoden blir det fikserte primære antistoff og prøven satt i kontakt med hverandre og omsatt ved en gitt temperatur over en gitt tidsperiode. I løpet av denne tid kombinerer det fikserte primære antistoff seg med det humane protein S i prøven. Etter vask med en egnet vaskeopp-løsning settes reaksjonsproduktet i kontakt og omsettes med en oppløsning (f.eks en vandig oppløsning) av det merkede sekundære antistoff ved en gitt temperatur en gitt tidsperiode. Reaksjonsproduktet vaskes med en passende vaske-oppløsning og mengden merket substans som er tilstede på det uløselige faste bæremiddel må holdes. Mengden av humant protein S i prøven kan bestemmes ved å sammenligne mengden av merket substans med en kalibreringskurve tegnet ved å bruke en assayprøve som inneholder humant protein S i en kjent konsentrasjon.
I entrinnsmetoden blir det fikserte primære antistoff satt i kontakt og omsatt med assayprøven og det merkede sekundære antistoff samtidig, fortrinnsvis med en blanding av prøven og det merkede sekundære antistoff ved en gitt temperatur over en gitt tidsperiode. Produktet blir så vasket med en egnet vaskeoppløsning og mengden merket substans som er tilstede på det uløselige faste bæremiddel, måles som beskrevet ovenfor. Som et resultat kan mengden av humant protein S i prøven bli bestemt. I henhold til metodene beskrevet ovenfor kan mengden av humant protein S i assayprøven måles lett og med god reproduserbarhet og stor nøyaktighet. Humant plasma, humant serium og en supernatant fra en cellekultur er eksempler på prøver som kan undersøkes ved ovenfor nevnte metoder.
For utføring av ovenfor nevnte metoder gir foreliggende oppfinnelse et reagenssystem ifølge krav 6 som omfatter det primære antistoff fiksert til det uløselige faste bæremiddel og det merkede sekundære antistoff. En kit kan bli dannet fra dette reagenssystem og forskjellige hjelpemidler for å bruke reagenssystemet effektivt og enkelt. Eksempler på hjelpemidler innbefatter oppløsningsmidler for å oppløse det faste sekundære antistoff, vaskemidler for å vaske det uløselige bæremiddel, substrater for å måle enzymaktiviteten til enzymer som kan bli brukt som merkesubstanser for det sekundære antistoff og reaksjonsstoppere for disse som nor-malt blir brukt i reagenskit for immunologisk assay. 2) Bestemmelse av et humant C4bp- protein S kompleks i en assayprøve ved å bruke det monoklonale antistoff B. Anvendelse av et monoklonalt antistoff for immunologisk bestemmelse av humant C4bp-protein S kompleks i en assay-prøve i henhold til foreliggende oppfinnelse og reagenssystemet brukt for dette, kan være lik metoden for reagenssystemet beskrevet i punkt 1 ovenfor, bortsett fra at i reagenssystemet blir det monoklonale antistoff B brukt istedenfor det monoklonale antistoff A, samt et monoklonalt eller polyklonalt antistoff som er i stand til å gjenkjenne og binde til C4bp blir brukt istedenfor det monoklonale eller polyklonale antistoff som gjenkjenner og binder til et epitop av humant protein S forskjellig fra det som gjen-kjennes av det monoklonale antistoff A. Gjentagelse av metodebeskrivelsen vil følgelig bli utelatt. 3) Monoklonale antistoff A og B oa fremstilling derav. De monoklonale antistoff A eller B kan erholdes ved å eta-blere en hybridom cellelinje som er i stand til å danne slike antistoff og derpå dyrke hybridomet.
Hybridomet som er i stand til å danne det monoklonale antistoff A eller B kan dannes ved en teknikk kjent som Kohler og Milstein metoden (Kohler og Milstein, Nature, 256. 495-497, 1975). Spesielt blir et pattedyr, f.eks en mus, immunisert med fritt humant protein S og antistoff produserende celler, f.eks. miltceller fra dette dyr, fuseres med myelomceller. De fuserte celler skjermes ved kloning for fuserte celler som er istand til å danne det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen. F.eks blir de fuserte celler som dannes, systematisk skjermet for et antistoff som reagerer med fritt humant protein S eller C4bp-protein S kompleks fiksert til mikrotiterplater.
Det monoklonale antistoff A eller B kan erholdes fra produktet fremskaffet av dette hybridom. Det resulterende monoklonale antistoff virker monospesifikt på epitopen av fritt humant protein S eller C4bp-protein S kompleks.
Det monoklonale antistoff A eller B og fremgangsmåten for å danne dette vil nå bli beskrevet i større detaljer.
a) Isolering og rensing av et antigen.
Fritt humant protein S brukt som et antigen isoleres i ren
form fra en human plasmaprøve ved metoden til BaJaj et al.
[BaJaj S.P., Rapaport S. I., Maki S.L., Brown S. F.: Prep. Biochem., 13, 191, (1983)].
b) Immunisering av pattedyr med fritt humant protein S. Det er ingen spesiell begrensning på dyrene som skal immuni-seres, og forskjellige pattedyr så som mus, rotter, marsvin, kaniner, sauer og geiter, hunder og katter kan bli brukt. På grunn av letthet ved behandling blir Balb/c hannmus vanligvis brukt. Mus fra andre stammer kan også brukes. Immuni-seringen bør være planlagt og konsentrasjonen av fritt humant protein S som skal brukes ved immunisering bør være valgt ut slik at tilstrekkelige mengder antigenstimulerte lymfosytter kan bli dannet. F.eks blir en mus immunisert intraperitonealt flere ganger med en liten mengde fritt humant protein S med visse intervaller, og antigenet blir videre tilført intravenøst flere ganger for å øke titere til antistoffet. Flere dager etter den endelige immunisering blir antistoffproduserende celler f.eks. lymfocytter, fortrinnsvis miltceller, tatt ut fra det immuniserte dyr. Den følgende beskrivelse er gitt med hensyn til bruken av miltceller som antistoff-produserende celler, men det er underforstått at andre antistoff-produserende celler isolert fra immuniserte dyr like godt kan bli brukt for cellefusjonen.
c) Cellefusion.
Milten blir tatt ut aseptisk fra det immuniserte dyr og en
miltcellesuspensjon fremstilles fra dette. Miltcellene blir så fusert med myelomceller tatt fra en egnet cellelinje i et fusjonsmedium i nærvær av en passende fusjonspromotor. Myelomcellene brukt til fusjon kan erholdes fra ethvert pattedyr, men generelt er de som stammer fra samme type dyr som det immuniserte dyr foretrukket. Det foretrukkede bland-ingsforhold mellom miltceller og myelomceller er generelt i området fra ca. 20:1 til ca. 2:1, fortrinnsvis fra 10:1 til 2:1. Vanligvis er bruken av 0,5 til 1,5 ml av fusjonsmediet pr. ca. IO<8> miltceller egnet. Egnede fusjonsmedier er f.eks fysiologisk saltvann, bufret vann, et serumfritt medium hvorav hvert inneholder fusjonspromotoren i en konsentrasjon på 30 - 70%.
Mange myelomceller som er egnet for cellefusjonen, er kjente. I eksemplene som blir gitt nedenfor, P3-X63-Ag8-Ul celler (som skal forkortes som P3-U1) [(se D.E. Yelton et al.: Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1
(1978)]. De er en 8-azaguanin-resistent cellelinje. De mangler hypoxantin-guanin fosforibosyl transferase og over-lever følgelig ikke i HAT medium (inneholdende hypoxantin, aminopterin og tymidin). Videre, siden denne cellelinje er av en ikke-utskillende type som ikke skiller ut et antistoff i seg selv, er den egnet for dannelsen av hybridomet påtenkt ved foreliggende oppfinnelse. Andre myelomceller kan også bli brukt. Eksempler innebefatter P3-NSl-l-Ag4-l, NSl-Ag4/l, P3-X63-Ag8, (MPCH-45, 6. TG1.7), SP2/0-Agl4, FO, X-63Ag8-6.5.3, 210.RCY3.Agl.2.3, S194/5XXO.BU.1, SKO.007, og CM15006TG-A12.
Polyetylenglykol med en gjennomsnittlig molekylvekt på f.eks 1000 - 4000 kan fordelaktig bli brukt som fusjonpromotor. Det kan også bli brukt andre fusjonspromotorer kjent i faget så som Sendai virus. I de følgende eksempler ble polyetylenglykol med en gjennomsnittlig molekylvekt på 1540 brukt.
d) Påvisning av fuserte celler.
En blanding av de fuserte celler, ikke-fuserte miltceller og
ikke-fuserte myelomceller fortynnes i et separat beger (så som en mikrotiterplate) med et selektivt medium hvori de ikke-fuserte myelomceller ikke kan overleve og dyrkes i en tilstrekkelig tidsperiode for å tillate de ikke-fuserte celler å dø (ca. 1 uke). Kulturmediet kan være et som er tilsatt en droge som 8-azaguanin og hvor de ikke-fuserte myelomceller ikke kan overleve, f.eks. det tidligere nevnte HAT medium. I det selektive medium dør de ikke-fuserte myelomceller. Siden de ikke-fuserte miltceller er ikke-tumorale, dør de etter en viss tidsperiode (ca. 1 uke). På den annen side kan de fuserte celler overleve i det selektive medium fordi de har både den tumorbærende natur til de opprinnelige myelomceller og naturen til de opprinnelige miltceller. e) Bestemmelse av et antistoff mot fritt humant protein S i hver brønn.
Etter at hybridomcellene blir påvist som angitt ovenfor, blir supernatanten til kulturvæsken samlet opp og skjermet for et antistoff mot fritt humant protein S eller C4bp-protein S kompleks ved enzymtilknyttet immunosorbent assay [(se f.eks. A. H. W. M. Schuurs og B. K. Van Weemen: Clin. Chim. Acta, 81, 1-40 (1977)]. f) Klonin<g> av hybridomer som er istand til å produsere antistoff A eller B.
Hybridomet som er istand til å produsere det ønskede antistoff, kan klones ved en passende metode såsom en begrensende fortynningsmetode på to forskjellige måter. I en metode dyrkes hybridomet i et passende medium i en gitt tidsperiode, og det dannende monoklonale antistoff av hybridomet kan erholdes fra supernatanten av kulturvæsken. I den andre kan hybridomet injiseres intraperitonealt i en syngenisk mus. Etter en viss tidsperiode kan det monoklonale antistoff A eller B dannet av hybridomet erholdes fra blod og bukvæske fra vertsdyret.
g) Egenskaper til de monoklonale antistoff A og B.
Det monoklonale antistoff A dannet som angitt ovenfor, har
et isoelektrisk punkt i området mellom en pH på 6,2 og 6,8 og binder selektivt kun til fritt humant protein S. Klassen til dets H-kjeder er ^ jL, og klassen til dets L-kjeder er K. Dets dissosiasjonskonstant (KD) målt ved metoden til Frankel og Gerhard [(Frankel, M. E., Gerhard, W.: Mol. Immunol. 16, 107 (1979)], er 0,5 til 1,5 x 10~<9>M med hensyn til fritt protein S, men kan ikke bli målt med hensyn til C4bp-protein S kompleks fordi det i hovedsak ikke binder seg til dette kompleks.
Det monoklonale antistoff B har et isoelektrisk punkt i området mellom en pH på 5,6 og 6,2 og binder selektivt kun til C4bp-protein S kompleks (dvs. binder ikke i vesentlig grad til fritt protein S eller C4bp). Klassen til dets H-kjeder er ^ 2b' 0<3 klassen til dets L-kjeder er K . Dissosiasjonskonstanten (KD) til det monoklonale antistoff B målt ved metoden til Frankel og Gerhard er 4,0 til 6,0 x 10~<8>M med hensyn til fritt protein S og 1,0 til 2,0 x 10~<9>M med hensyn til C4bp protein S kompleks. Dets dissosiasjonskonstant med hensyn til C4bp kan ikke bli målt, fordi det binder ikke i vesentlig grad til C4bp (dissosiasjonskonstanten med hensyn til fritt protein S kan ikke bli målt ved EIA metoden fordi det ligger utenfor påvisningsgrensen).
Litwiller et al. ^) og Malm et al. <2>) rapporterte separat monoklonale antistoff til humant protein S spesifikke for en Ca<2+->stabilisert epitop t<1>) R.D. Litwiller, R. J. Henny, J. A. Katzmann, R. S. Miller, og K. G. Mann: Blood, vol. 67, No. 6, pp. 1583-1590 (1986); <2>) J. Malm, U.Persson og B. Dahlback: European Journal of Biochemistry, vol. 165, s. 36-45 (1987]. Epitopene for disse monoklonale antistoff er lokalisert i Gla regionen til protein S i en nært beliggende trombin-sensitiv region. Disse monoklonale antistoff gjenkjenner både fritt protein S og C4bp-protein S kompleks. Foreliggende oppfinnelse fremskaffer de monoklonale antistoffer A og B. Det monoklonale antistoff A gjenkjenner kun fritt protein S og binder ikke til C4bp protein S kompleks, mens det monoklonale antistoff B gjenkjenner C4bp-protein S kompleks spesifikt. Dette faktum viser at de monoklonale antistoffer A og B er forskjellige og karakteristiske fra de monoklonale antistoffer til Litwiller et al. og Malm et al.
Det monoklonale antistoff A i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan også brukes til separasjon eller gjenvinning av fritt humant protein S fra en væske innholdende det fri humane protein S, fordi det har funksjonen å spesifikt binde til epitopen av det fri humane protein S.
I henhold til ennå et aspekt av foreliggende oppfinnelse er det således fremskaffet en selektiv adsorbent for fritt humant protein S omfattende et uløselig fast bæremiddel og det monoklonale antistoff A fiksert på dette, og som kan brukes for å separere og gjenvinne fritt humant protein S fra en væske innholdende fritt humant protein S ved å bringe væsken inneholdende fritt humant protein S i kontakt med den selektive adsorbent for å forårsake at fritt humant protein S blir adsorbert på asorbenten og separere adsorbenten fra væsken, og om nød-vendig desorbere fritt humant protein S fra adsorbenten og gjenvinne dette.
Generelt kalles kromatografi basert på anvendelsen av den biologiske affinitet til en adsorbent for separasjon og opprensing av et biologisk stoff, for affinitetskromatografi [Ichiro Chihata, Tetsuya Tosa and Yushi Matsuo, Experi-mental and Applied Affinity Chromatography" (Japansk pub-likasjon) , Kodansha Co. Ltd.].
Uttrykkene "affinitet", "ligand", "uløselig fast bæremiddel" og "adsorbent" som brukt heri, bør være underforstått og ha følgende betydninger
Affinitet: spesifik affinitet mellom to stoffer,
ligand: et stoff med affinitet for et stoff som skal adsorberes eller renses,
uløselig fast bæremiddel: et fast støttemiddel som er uløselig i vann (bortsett fra liganden),
adsorbent: det uløselige faste bæremiddel til hvilket liganden er fiksert.
I det følgende vil den selektive adsorbent for humant protein S og metoden for å separere eller gjenvinne humant protein S fra en væske inneholdende det human protein S og som er fremskaffet av foreliggende oppfinnelse, bli beskrevet i detalj.
Det monoklonalee antistoff A til humant protein S eller til dets Fab region-inneholdende fragment i henhold til foreliggende oppfinnelse er kjemisk bundet som en ligand til et passende uløselig bæremiddel (f.eks. sefarose), og bæremidlet blir så pakket i en kolonne. Kolonnen ekvilibreres med passende buffer (f.eks. 50 mM Tris buffer, pH 7,4, 0,15 M NaCl). En væske inneholdende humant protein S som skal behandles (såsom en human plasma- eller serumprøve), til-settes til den resulterende adsorbent for å adsorbere humant protein S på adsorbenten. Urenheter blir så fjernet fra adsorbenten med en passende vaskeoppløsning (f.eks. 50 mM Tris buffer, pH 7,4, 0,15 M NaCl). Derpå blir mengden av humant protein S i en fraksjon som har passert gjennom kolonnen ("gjennompassasje-fraksjonen") og en fraksjon som har blitt vasket ut fra kolonnen ("vasket fraksjon") målt. Fra de målte verdier kan graden av separasjon av humant protein S fra prøvevæsken regnes ut.
Forskjellige stoffer kan brukes som uløselig fast bæremiddel brukt i den selektive adsorbent ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis er denne laget av f.eks. agarose, polyakrylamid, cellulose, dekstran, maleinsyrepolymer eller en blanding derav. Det uløselige faste bæremiddel kan være i forskjellige former, f.eks. i form av et pulver, granuler, pelle-ter, kuler, film eller fiber.
Fiksering av det monoklonale antistoff eller dets fragment til det uløselige faste bæremiddel utføres generelt ved kjemisk binding av dette til bæremidlet. For eksempel kan det utføres ved å aktivere Sepharose ved virkningen av CNBr og fiksere antistoffet til dette [R. Axén et al.: Nature, 214/ 1302-1304 (1967)].
Når adsorbenten med det humane protein S adsorbert derpå ved kontakt med væsken inneholdende humant protein S separeres fra væsken, kan det humane protein S som er tilstede i væsken bli fjernet. Dersom humant plasma eller serum blir brukt som væske, kan humant plasma eller serum i hovedsak fritt for humant protein S, erholdes. Slikt humant protein S-fritt humant plasma eller serum kan fordelaktig brukes
f.eks. i plasma- eller serumskifteterapi.
Adsorbenten med humant protein S adsorbert derpå og sepa-rert fra assayvæsken kan bli underkastet en desorbsjons-behandling for å eluere humant protein S fra adsorbenten og gjenvinne dette. Det gjenvundne humane protein S kan brukes f.eks. som et supplement i arvelig protein S-defisi-enslidelse og leverlidelser, eller som hemostat. Desorbsjonsbehandlingen kan utføres ved å behandle adsorbenten med humant protein S adsorbert derpå med en eluent. En vandig oppløsning av natriumtiocyanat med en pH på 2,5 - 12,5, fortrinnsvis 4,0 - 9,0, kan fordelaktig brukes som eluent. Andre eksempler på eluent som kan brukes, innbefatter en vandig oppløsning av glycerol, en vandig oppløsning av glycin, en vandig oppløsning av propionsyre, en vandig oppløsing av etylenglykol og en vandig oppløsning av guanidin.
Konsentrasjonen av natriumtiocyanat i den vandige natrium-tiocyanatoppløsning er fordelaktig 0,5 M til 6 M, fortrinnsvis 2M til 4 M. For pH-justering kan den vandige oppløsning innbefatte passende pH-justerende midler, f.eks. hydrok-syder, såsom natriumhydroksyd eller kaliumhydroksyd, salt såsom Tris salter, fosfatsalter eller Veronalsalt, syrer såsom saltsyre, salpetersyre, eddiksyre, sitronsyre og oksalsyre, aminer såsom etanolamin, ammoniakk eller urea. Desorbsjonsbehandlingen utføres ved en temperatur over frysepunktet, men ikke overskridende 37°C, fortrinnsvis ved 2-10°C. Desorbsjonsbehandlingen utføres ved en kolonne-metode, en satsvis metode osv. Tiden som kreves for eluering er ønskverdig kort, men kan vare opptil ca. 2 døgn.
Fra eluatet inneholdende det eluerte humane protein S kan det humane protein S separeres og renses ved i og for seg kjente metoder, f.eks. ved dialyse, konsentrasjon eller væskekromatografi.
Som angitt ovenfor, har det monoklonale antistoff A eller dets Fab-regioninneholdende fragment funksjnen å spesifikt blokkere det C4bp-bindende sete til humant protein S, dvs. det sete til humant protein S som binder C4b-bindende protein (C4bp). Humant protein S eksisterer i plasma i to former.
En er det fri protein S og den andre er C4bp proteinkom-plekset. Kun det fri protein S virker som en kofaktor ved inaktiveringen av koaguleringsfaktorene Va og VIII ved aktivert protein C, som er en vitamin K-avhengig serin protease. Funksjonen til disse kofaktorer tapes når pro-tein S binder seg til C4b-bindende protein. Når det monoklonale antistoff A i henhold til foreliggende oppfinnelse binder seg til protein S kan C4b-bindende protein (C4bp) ikke binde seg til protein S monoklonalt antistoff-immunokomplekset, men immunokomplekset virker som en kofaktor overfor aktivert protein C.
Kort beskrivelse av de medfølgende tegninger
Fig. 1 viser bindingsstyrken av de monoklonalee antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse til humant protein S. Fig. 2 viser bindingsstyrken av de monoklonale antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse overfor C4bp-protein S komplekset. Fig. 3 viser de isoelektriske punkter av de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen. Fig. 4 er en kalibreringskurve som viser relasjonen mellom konsentrasjonen av humant protein S og forandringene i absorbans. Fig. 5 er en kalibreringskurve som viser relasjonen mellom mengden av det humane C4bp-protein S kompleks og forandringer i absorbans. Fig. 6 viser de faktisk målte mengder av humant protein S og
humant C4bp-protein S kompleks i plasmaprøver tatt fra menneskelige pasienter.
De følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse i større detalj. I disse eksempler er protein S enkelte ganger forkortet som "PS".
Eksempel 1
To Balb/C hunmus (4 uker gamle) ble immunisert 4 ganger med renset humant PS med 14 dagers intervaller. I den første immunisering ble 50 \ ig av humant PS oppløst i PBS og blandet med en lik mengde fullstendig Freund's tilsetning og den resulterende emulsjon ble tilført intraperitonealt (0,5 mg pr. mus) . I andre og tredje immunisering ble 50 >ig humant PS blandet på lignende måte med Freund's ufullstendige tilsetning og tilført intraperitonealt. I den endelige immunisering ble 30 jjg av humant PS i PBS tilført direkte gjennom halevenen. Tre dager etter den endelige immunisering ble miltceller fra de immuniserte mus brukt i cellefusjonen.
Miltcellene til de immuniserte mus og myelomceller (P3U1) fra mus av samme stamme ble blandet i et forhold på fra ca. 5:1 til ca. 7:1 og fusert i samsvar med metoden til Kohler og Milstein i nærvær av 50% etylenglykol 1540 (et produkt fra Wako Pure Chemicals Co., Ltd.). De fuserte celler ble suspendert i 10% FCS-RPM1-1640 medium, slik at cellekonsen-trasjonen var 1 x IO<6> celler/ml. Suspensjonen ble helt opp i en 95 brønners mikroplate (laget av Coster Company) i en mengde på 100 mikroliter pr. brønn.
De fuserte celler ble dyrket i en C02 inkubator (5% C02, 37°C). Mediet ble erstattet med et medium inneholdende hypoxantin, aminopterin og tymidin (HAT medium), og cellene ble dyrket i HAT-mediet. Hybridomer beståene av miltceller og myelomceller ble isolert ved skjerming.
Antistoffene i supernatanten av kulturvæsken fra hybridomet ble påvist ved ELISA metoden ved å bruke mikrotiterplater belagt med antigen humant PS. Alkalisk fosfatasekonjugert kanin anti-muse IgG antistoff ble brukt som et andre antistoff og bindingsegenskapene til antistoffene overfor det antigene PS ble undersøkt. Blant 494 brønner totalt hvori de fuserte celler hadde blitt satt ut, ble dannelsen av kolonier observert i 437 brønner. Av disse var 94 brønner positive i antistoffproduksjon og viste den egenskap å binde til PS-antigenet.
I 4 brønner av de positive brønner ble kloning utført to ganger ved den begrensende fortynningsmetode og 6 kloner ble erholdt. De erholdte kloner ble suspendert i 90% FCS-10% DMSO og lagret i flytende nitrogen.
Monoklonale antistoffer dannet av disse kloner ble dyrket i bukhulen til Balb/C-mus og renset fra bukvannet til musene ved å bruke en protein A-Sepharose 4B kolonne.
Eksempel 2
De rensede monoklonale antistoffers egenskaper
Klonene renset fra bukvannet til musene ble undersøkt for IgG-klasser og bindeegenskaper overfor humant protein S
(PS) .
De spesielle klasser av muse monoklonale antistoffer ble besstemt ved Ouchterlonymetoden ved å bruke anti-muse antisera spesifikke for de individuelle klasser. Resultatene er vist i tabell 2.
Bindingsegenskapene til antiistoffene overfor humant protein S ble vurdert ved å reagere humant protein S festet til mikrotiterplater med de monoklonale antistoffer fortynnet til egnet konsentrasjon og å påvise reaksjonsproduktene ved å bruke alkalisk fosfatasekonjugert geite anti-muse IgG. Bindingsstyrkene til de 6 monoklonale antistoffer overfor humant protein S er: 2B9F12=2B9C10 > 3C3G8 > 3C4G4 > 2B9G2 » 2E12C7.
Resultatene er vist i fig. l.
Eksempel 3
Reaktivitet med humant C4b-bindende protein og protein S kompleks (C4bp-PS kompleks): Tre rensede monoklonale antistoffer (2B9F12, 2B9C10, 2E12C7) og geite anti-PS antistoff ble belagt på mikrotiterplater i en konsentrasjon på 10 jjg/ml og blokkert med 1% BSA. Derpå ble C4bp-protein S komplekset fortynnet til en egnet konsentrasjon, tilsatt og reagert med det monoklonale antistoff. Derpå ble alkalisk fosfatasekonjugert anti-C4pb antistoff tilsatt og bindingsegenskapene til de tre monoklonale antistoffer overfor C4bp-protein S komplekset ble påvist.
Monoklonalt antistoff 2E12C7 hadde meget svak binding til fritt protein S, men viste en høy grad av spesifik binding til C4bp-protein S komplekset. På den annen side viste 2B9F12 ingen binding til C4bp-protein S komplekset. Resultatene er vist i figur 2.
På denne måte, ved å bruke forskjellige antistoffer i det immunologiske forsøket (EIA, RIA), kan fritt humant protein S og C4bp-protein S kompleks i oppløsning (f.eks. humant plasma) bli undersøkt.
Eksempel 4
Måling av dissosiasjonskonstanter (KD):
Et renset monoklonalt antistoff ble merket med <125>i (jod-125) ved å bruke Immunobeads (et produkt fra Bio-Rad Co.).
Renset protein S og C4bp-protein S kompleks i en konsentrasjon på 1 ug/ml ble satt til en 96 brønners mikrotiterplate (Titertek laget av Flow Lab. Co,) i en mengde på 50 pl pr. brønn og adsorbert ved 4°C over natten. 10 mM fosfatbuffer (pH 7,2) inneholdende 1% BSA og 0,125 M NaCl ble tilsatt i en mengde på 100 pl/brønn. Platene ble så oppbevart ved romtemperatur i 2 timer og derpå vasket 2 ganger (100 Ml/brønn) med 10 mM fosfatbuffer (pH 7,2) inneholdende 0,05% Tween 20 (vaskeoppløsning) . Det ■1-2^ I-merkede monoklonale antistoff fortynnet til forskjellige konsentrasjoner (0,01-5 jjg/ml) ble tilsatt brønnene til platen og inkubert ved 37"C i 2 timer. Platen ble så vasket 3 ganger med ovenfor nevnte vaskeoppløsning (100 pl/brønn).
Brønnen ble skåret ut fra platen og plassert i plast forsøksrør. <125>I-radioaktiviteten ble målt med en gamma-teller (radioaktivitet bundet til det faste antigen: B i cpm). På samme tid ble radioaktiviteten til den fortynnede oppløsning av <125>I-merket monoklonalt antistoffoppløsning tilsatt brønnene målt (den totale tilsatte radioaktivitet: t i cpm). Konsentrasjonen til det tilsatte monoklonale antistoff ble avsatt på abcisseaksen, og forholdet mellom T-B (radioaktiviteten ikke bundet til det faste antigen: F i cpm) og B på ordinataksen. Fra Scatchardkurven ble dissosiasjonskonstanten (KD) regnet ut. Resultatene er oppsummert i tabell 3.
Eksempel 5
Måling av isoelektriske punkter av rensede monoklonale antistoffer.
Hvert av de rensede monoklonale antistoffer (2B9F12, 2B9C10, 2E12C7) i en mengde på 10 pg ble underkastet agarose isoelektrisk fokusering ved 4 *C under en pH gradient på 3,5 til 9,0. Etter isoelektrisk fokusering i 2 timer ble antistoff-proteinet i agarosegelen immobilisert og farget med CBB. Fotografiet av disse elektroforeser ble tatt og er vist i fig. 3. Fra beliggenheten av de elektroforetiske bånd av de monoklonale antistoffer ble de isoelektriske punkter av antistoffene målt ved å bruke en standard isoelektrisk punktmarkør samtidig underkastet elektroforese. Disse var en pH på 6,2 - 6,8 for 2B9F12, en pH på 6,2 - 6,8 for 2B9C10 og en pH på 5,6 - 6,2 for 2E12C7.
Eksempel 6
(1) Fiksering av et antistoff til et uløselig bæremiddel
En tørr gel (0,5 g) av cyanogen bromidaktivert Sepharose 4B (laget av Pharmacia Fine Cheicals, Inc.) ble svellet og vasket med 100 ml av 1 mM HC1 og derpå ytterligere vasket med en koblingsbuffer (0,1 M NaHC03) inneholdende 0,5 M NaCl, pH 8,3) på et G3 glassfilter. Koblingsbufferen ble fjernet ved sug, og umiddelbart etter ble gelen suspendert i 2 ml av en koblingsbufferoppløsning (3 mg/ml) for et monoklonalt antistoff (2B9F12). Suspensjonen ble forsik-tig ristet over natten ved 4°C. Gelen ble så overført til 1 M etanolamin-HCl (pH 8,0, 2ml) og ristet ved romtemperatur i 2 timer for å blokkere de gjenværende aktive grupper. Etter blokkeringen ble den antistoffbundne Sepharosegel vasket på et glassfilter med 0,1 M acetatbuffer (pH 4,0) inneholdende 0,5 M NaCl og 0,1 M boratbuffer (pH 8,0) inneholdende 0,5 M NaCl alternerende. Når absorbansen av filtratet ved 280 nm sank under 0,01, ble den ekvilibrert med 0,05 M Tris/HCl (pH 7,4) inneholdende 1 nM benzamidin, og fylt i en kolonne. Affinitetskromatografi ble utført på det fremstilte antihumane PS monoklonale antistoff (2B9F12)-bundne Sepharose 4B-kolonne.
(2) Adsorpsjon av protein S på antistoffr-bundet Sepharose 4B og eluering derav
Til 100 ml plasma ble det tilsatt 8 ml IM BaCl2-oppløsning, og blandingen ble omrørt ved 4 °C i 1 time. Utfellingen ble samlet ved sentrifugeseparering og vasket med 0,1 M NaCl inneholdende 5 mM BaCl2 og 5 mM benzamidin. Utfellingen ble oppløst i 15 ml 0,2M EDTA (pH 7,4) inneholdende 5 mM benzamidin for å erholde en bariumadsorbert fraksjon. Den bariumadsorberte fraksjon ble dialysert mot 0,05 M Tris/BCl (pH 7,4) inneholdende 1 Mm benzamidin og 1 M NaCl og påført den antistoff 2B9F12-bundne kolonne ekvilibrert med 0,05 M Tris/HCl (pH 7,4) inneholdende 1 mM benzamidin. Kolonnen ble vasket med 0,05 M/Tris/HCl (pH 7,4) inneholdende 1 nM benzamidin og 1 M NaCl and eluert med 3 M NaSCN (pH 7,0) oppløsning. En enkelt topp inneholdende PS ble erholdt. Gjenvinningsgraden var ca. 75,4%.
Eksempel 7
Måling av humant protein S
Det monoklonale antistoff erholdt i eksempel 1 (2B9F12) til humant protein S ble belagt på en mikrotiterplate i en konsentrasjon på 15 pg/ml. Platen ble blokkert med fosfatbuffer (PBS) inneholdende 1% bovint serum albumin (BSA) og derpå vasket tre ganger med en vaskeoppløsning (0,5% BSA-PBS inneholdende 0,5% Tween). Deretter ble renset protein S og en plasmaprøve tatt fra en human pasient fortynnet til egnet konsentrsjon med PBS og omsatt ved 37"C i 2 timer med det monoklonale antistoff, adsorbert på den faste fase av platen. Platen ble vasket 3 ganger med vaskeoppløsning og derpå ble en oppløsning av et peroksydase-merket monoklonalt antistoff (2B9C10) overfor humant protein S tilsatt. Platen ble inkubert ved 37°C i 2 timer og vasket med vaskeoppløsningen tre ganger. Derpå ble en substrat (ABTS)-oppløsning tilsatt, og forandringer i absorbans pr. minutt ( 415 nm/min.) ble målt i en ELISA ANALYZER (ETY-96 laget av Toyo Sokki Co. Ltd.). Konsentra-sjonene av renset protein S og forandringene i absorbans ble tegnet ned for å trekke en kalibreringskurve. Kalibreringskurven er vist i fig. 4. Konsentrasjonen av protein S og absorbansen var i et rettlinjet forhold opp til ca. 50 ng/ml. Dersom denne kalibreringskurve brukes, kan mengden av humant protein S regnes ut nøyaktig med høy følsomhet.
Mengden av protein S i plasmaprøver fra humane pasienter ble regnet ut ved å bruke denne kalibreringskurve og resultatene er vist i fig. 6. I fig. 6 er mengden av protein S i en plasmaprøve tatt fra en normal, frisk pasient angitt som 100%.
Eksempel 8
Måling av humant C4bp-protein S kompleks.
Det monoklonale antistoff (2E12C7) overfor humant protein S, som bandt seg spesifikt til det humane C4bp-protein S kompleks ble belagt i en konsentrasjon på 20 pg/ml på en mikrotiterplate. Platen ble blokkert med fosfatbuffer (PBS) inneholdende 1% bovint serum albumin (BSA) og derpå vasket tre ganger med en vaskeoppløsning (0,5% BSA-PBS inneholdende 0,05% Tween 20).
En plasmaprøve tatt fra en normal, frisk person og en plasmaprøve tatt fra pasienter ble fortynnet til passende konsentrasjoner med PBS, og hver omsatt ved 37°C i 2 timer med det monoklonale antistoff adsorbert på den faste fase av platen. Platen ble vasket tre ganger med vaskeoppløs-ningen og omsatt med en oppløsning av et alkalisk fosfatase-merket polyklonalt antistoff overfor humant C4b-bindende protein (C4bp) ved 37°C i 2 timer. Platen ble så vasket tre ganger med vaskeoppløsningen, og en substratoppløsning (1 mg/ml) ble tilsatt. Forandringene i absorbans pr. minutt (A A405 nm/min) ble målt på en ELIZA ANALYZER (ETY-96, laget av Toyo Sokki Co., Ltd.). Plasmaen fra en frisk person ble fortynnet og mengden av det humane C4bp-protein S kompleks i plasma og forandringene i absorbans ble tegnet ned for å trekke en kalbreringskurve. Kalibreringskurven er vist i fig. 5. Konsentrasjonen av det humane C4bp-protein S kompleks i plasma fra den friske personen og forandringene i absorbans var i et rettlinjet forhold. Bruken av denne kalibreringskurve tillot nøyaktig utregning av mengden av humant C4bp-protein S med høy følsomhet.
Mengden av humant C4bp-protein S kompleks i plasmaprøvende fra humane pasienter ble regnet ut ved å bruke denne kalibreringskurve, og resultatene er vist i fig. 6. I fig. 6 er mengden av humant C4bp-protein S kompleks i plasma fra den friske person angitt som 100%.
Det observeres at forskjellige sykdommer kan diagnostiseres ved å bestemme mengdene av fritt protein S og C4bp-protein S kompleks i humant plasma ved å bruke monoklonale antistoffer overfor humant protein S.
Claims (8)
1. Monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro, karakterisert ved at det ikke binder til et kompleks av humant protein S og human komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp), men som binder spesifikt til fritt humant protein S, at det har et isoelektrisk punkt i området mellom pH 6,2 og 6,8, samt at det har H-kjeder i klasse T]_ og L-kjeder i klasse K.
2. Monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro, karakterisert ved at det ikke binder til fritt humant protein S og human komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp), men som spesifikt binder til et kompleks av humant protein S og human komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp), at det har et isoelektrisk punkt i området mellom pH 5,6 og 6,2, samt at det har H-kjeder i klasse T2b°9 L-kjeder i klasse K.
3. Anvendelse av et eventuelt merket monoklonalt antistoff ifølge krav l i prøver for påvisning av fritt protein S, spesielt i forbindelse med et eventuelt merket andre antistoff, hvor et av antistoffene fortrinnsvis kan være bundet til et uoppløselig fast bæremiddel, hvor markøren fortrinnsvis kan være et enzym, en luminescent substans eller en radioisotop, samt hvor de to antistoffene binder til forskjellige epitoper av fritt humant protein S.
4. Anvendelse av et eventuelt merket monoklonalt antistoff ifølge krav 2 i prøver for bestemmelse av et kompleks av humant protein S og human komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp), spesielt i forbindelse med et eventuelt merket andre antistoff, hvor markøren fortrinnsvis kan være et enzym, en luminescent substans eller en radioisotop, samt hvor et av antistoffene fortrinnsvis kan være bundet til et uoppløselig fast bæremiddel.
5. Anvendelse av monoklonalt antistoff ifølge krav 1 ved separasjon eller gjenvinning ved separasjon eller gjenvinning av fritt humant protein S fra en væske såsom humant plasma eller serum, hvor væsken bringes i kontakt med det monoklonale antistoffet festet til et uoppløselig bæremiddel, og hvor det frie humane protein S adsorberes på bære-middelet, hvorpå bæremidlet eventuelt adskilles fra væsken og det humane protein S desorberes fra bæremidlet, eksem-pelvis ved å bruke en vandig oppløsning av natriumtiocyanat med pH på 4,0 - 9,0.
6. Reagenssystem for immunologisk bestemmelse av fritt humant protein S i en prøve, omfattende et primært antistoff festet til et uoppløselig fast bæremiddel samt et sekundært antistoff, hvor det primære og sekundære antistoff har egenskapen å binde seg til forskjellige epitoper av fritt humant protein S,
karakterisert ved at et av det primære og sekundære antistoff er det monoklonale antistoff som er angitt i krav 1.
7. Reagenssystem for immunologisk bestemmelse av et kompleks av humant protein S og et human komplement kofaktor C4b-bindende protein (C4bp) i en prøve, omfattende et primært antistoff festet til et uoppløselig fast bæremiddel, samt et sekundært antistoff,
karakterisert ved at et av det primære og sekundære antistoff er det monoklonale antistoff som er angitt i krav 2.
8. Selektiv adsorbent for fritt humant protein S, omfattende et uoppløselig bæremiddel, karakterisert ved at det ytterligere omfatter det monoklonale antistoff som er angitt i krav 1 festet til dette bæremiddel, og hvor det uoppløselige bæremiddel fortrinnsvis er valgt fra gruppen omfattende agarose, polyakrylamid, cellulose, dekstran, maleinsyrepolymer og bland-inger derav.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61296766A JPH0759600B2 (ja) | 1986-12-15 | 1986-12-15 | ヒト・プロテインsに対するモノクローナル抗体 |
JP61298881A JPH07117534B2 (ja) | 1986-12-17 | 1986-12-17 | ヒトプロテインsに対するモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキット |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO875215D0 NO875215D0 (no) | 1987-12-14 |
NO875215L NO875215L (no) | 1988-06-16 |
NO172084B true NO172084B (no) | 1993-02-22 |
NO172084C NO172084C (no) | 1993-06-02 |
Family
ID=26560838
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO875215A NO172084C (no) | 1986-12-15 | 1987-12-14 | Monoklonalt antistoff, anvendelse derav samt reagenssystem for immunologisk bestemmelse av fritt protein s og c4bp-protein s kompleks |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0271810B1 (no) |
DE (1) | DE3789284T2 (no) |
DK (1) | DK654787A (no) |
NO (1) | NO172084C (no) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0315447A3 (en) * | 1987-11-06 | 1990-07-18 | Teijin Limited | Method of immunological measurement of human protein s and reagent and kit therefor |
IL88831A0 (en) * | 1988-12-29 | 1989-07-31 | Yeda Res & Dev | Blood assay |
US5321123A (en) * | 1991-07-02 | 1994-06-14 | The Scripps Research Institute | Protein S polypeptides and anti-peptide antibodies that inhibit protein S binding to C4B binding protein, diagnostic systems and therapeutic methods |
DK0972781T3 (da) * | 1991-07-02 | 2007-03-05 | Scripps Research Inst | Protein S-polypeptider og anvendelser deraf |
US6379975B1 (en) | 1996-11-27 | 2002-04-30 | T.A.C. Thrombosis And Coagulation Aktiebolag | Methods and reagents for determining protein S |
SE9604378D0 (sv) * | 1996-11-27 | 1996-11-27 | Tac Ab | Methods and reagents for determining protein S |
WO2002050543A2 (en) * | 2000-12-19 | 2002-06-27 | Instrumentation Laboratory Co. | Free analyte detection system |
CN114839387A (zh) * | 2022-07-02 | 2022-08-02 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 一种游离蛋白s测定试剂盒及其制备方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL185309C (nl) * | 1980-07-28 | 1990-03-01 | Akzo Nv | Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van twee of meer monoklonale antilichamen alsmede immuunreagens. |
US4642284A (en) * | 1983-06-13 | 1987-02-10 | Scripps Clinic And Research Foundation | Method and system for detection of complement pathway activation |
-
1987
- 1987-12-08 DE DE19873789284 patent/DE3789284T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-12-08 EP EP87118183A patent/EP0271810B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-14 DK DK654787A patent/DK654787A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-12-14 NO NO875215A patent/NO172084C/no unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0271810B1 (en) | 1994-03-09 |
EP0271810A2 (en) | 1988-06-22 |
NO875215D0 (no) | 1987-12-14 |
NO875215L (no) | 1988-06-16 |
DE3789284T2 (de) | 1994-07-14 |
NO172084C (no) | 1993-06-02 |
DE3789284D1 (de) | 1994-04-14 |
EP0271810A3 (en) | 1991-03-20 |
DK654787D0 (da) | 1987-12-14 |
DK654787A (da) | 1988-06-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4902614A (en) | Monoclonal antibody to human protein C | |
JPH0772200B2 (ja) | 人フィブリンiiのnh2 末端フラグメントに対するモノクロナール抗体 | |
JPH0636741B2 (ja) | ヒト・プロテインcの分離方法 | |
EP1007570B1 (en) | Monospecific antibody reactive with fibrinogen and fibrinopeptide b | |
NO172084B (no) | Monoklonalt antistoff, anvendelse derav samt reagenssystem for immunologisk bestemmelse av fritt protein s og c4bp-protein s kompleks | |
NO171169B (no) | Monoklonale antistoffer eller fragmenter derav, spesifikke for alfa2-plasmininhibitor | |
JP2012082210A (ja) | Adamts13活性検定用抗体及び活性検定方法 | |
US5187067A (en) | Immunological determination of free human protein S and C4bp-protein S complex | |
KR960002740B1 (ko) | 안티-트롬빈-결합물질 모노클로날 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 모노클로날 항체를 이용한 트롬빈-결합물질의 정제법 및 측정법 | |
JPH09176199A (ja) | 抗ファクターXa・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用 | |
US5679583A (en) | Monoclonal antibodies for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids | |
JPH05284994A (ja) | 抗ヒトpivka−ii抗体、ハイブリドーマおよび免疫学的測定方法 | |
JPH0644876B2 (ja) | 抗トロンビン・アンチトロンビン3複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン3複合体の精製方法 | |
EP0205046B1 (en) | Monoclonal antibody to human protein c | |
IE881290L (en) | Monoclonal antibodies for the selective immunological¹determination of intact procollagen peptide (Type III) and¹procollagen (Type III) in body fluids | |
JPH02276591A (ja) | Anpのc端側を認識するモノクローナル抗体 | |
JP2518602B2 (ja) | ヒトプロテインsに対するモノクロ―ナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキット | |
EP0169549B1 (en) | Immunological determination of human plasmin/alpha2-plasmin inhibitor | |
JP4612922B2 (ja) | 新規のモノクローナル抗体並びにe−Dモノマー、e−Dダイマー、及びe−DD/E複合体の免疫学的分析方法 | |
JPH05207893A (ja) | プラスミン−抗プラスミン複合体に対するモノクローナル抗体、その製造方法およびその使用 | |
JPH07117534B2 (ja) | ヒトプロテインsに対するモノクローナル抗体を用いた免疫学的測定試薬及びキット | |
JPH06113830A (ja) | ヒトヘモグロビンの特異的検出法 | |
NO173340B (no) | Humant protein c antistoff | |
WO1991008303A1 (en) | Antibody against human double-stranded tissue plasminogen activator | |
JPH03200066A (ja) | 活性化ヒトプロテインcの測定方法 |