JPH05207893A - プラスミン−抗プラスミン複合体に対するモノクローナル抗体、その製造方法およびその使用 - Google Patents
プラスミン−抗プラスミン複合体に対するモノクローナル抗体、その製造方法およびその使用Info
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- JPH05207893A JPH05207893A JP4122421A JP12242192A JPH05207893A JP H05207893 A JPH05207893 A JP H05207893A JP 4122421 A JP4122421 A JP 4122421A JP 12242192 A JP12242192 A JP 12242192A JP H05207893 A JPH05207893 A JP H05207893A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、プラスミン−抗プラスミン複合体
に対して特異的親和性を有し、これらの複合体の個々の
遊離成分に対しては親和性を全く示さないかまたは極め
て低い親和性しか示さないプラスミン−抗プラスミン複
合体に対する単一特異性モノクローナル抗体およびそれ
らのフラグメント、ならびにこれらの抗体または抗体フ
ラグメントの補助によって同定および／または単離され
る抗原に関する。 【効果】 これらの抗体、抗体フラグメントおよび抗原
は、診断補助剤、活性物質または活性物質の担体として
使用できる。
に対して特異的親和性を有し、これらの複合体の個々の
遊離成分に対しては親和性を全く示さないかまたは極め
て低い親和性しか示さないプラスミン−抗プラスミン複
合体に対する単一特異性モノクローナル抗体およびそれ
らのフラグメント、ならびにこれらの抗体または抗体フ
ラグメントの補助によって同定および／または単離され
る抗原に関する。 【効果】 これらの抗体、抗体フラグメントおよび抗原
は、診断補助剤、活性物質または活性物質の担体として
使用できる。
Description
【０００１】本発明は、プラスミン−抗プラスミン（Ｐ
ｌ−ＡＰ）複合体に対して特異的親和性を有し、この複
合体の個々の遊離成分に対しては親和性を全く示さない
かまたは極めて低い親和性しか示さないモノクローナル
抗体（ＭＡｂ）およびそのフラグメント、診断補助剤、
活性物質または活性物質担体としてのその使用、ならび
にこのような抗体を産生するハイブリドーマ細胞系に関
する。
ｌ−ＡＰ）複合体に対して特異的親和性を有し、この複
合体の個々の遊離成分に対しては親和性を全く示さない
かまたは極めて低い親和性しか示さないモノクローナル
抗体（ＭＡｂ）およびそのフラグメント、診断補助剤、
活性物質または活性物質担体としてのその使用、ならび
にこのような抗体を産生するハイブリドーマ細胞系に関
する。
【０００２】プラスミノーゲン、プラスミノーゲンアク
ティベーターおよびそのインヒビターからなる繊維素溶
解系は、とくに血餅の解体に重要な役割を果たしてい
る。カスケード様の活性化連鎖の最終生成物はセリンプ
ロテアーゼ、プラスミンであり、これは不溶性の繊維素
塊を可溶性の繊維素分解生成物に切断することができ
て、したがって、過剰の血栓の形成を防止する。プラス
ミンの作用は、プロテアーゼインヒビター、α２−抗プ
ラスミンによって調整される。これは、プラスミンと反
応して共有結合型の酵素−インヒビター複合体を形成
し、その結果、プラスミンを不活性化するものである。
この複合体の血漿中における濃度は、繊維素溶解系の活
性化の程度に関する情報を提供し、したがってこの系の
障害の発見に適している。
ティベーターおよびそのインヒビターからなる繊維素溶
解系は、とくに血餅の解体に重要な役割を果たしてい
る。カスケード様の活性化連鎖の最終生成物はセリンプ
ロテアーゼ、プラスミンであり、これは不溶性の繊維素
塊を可溶性の繊維素分解生成物に切断することができ
て、したがって、過剰の血栓の形成を防止する。プラス
ミンの作用は、プロテアーゼインヒビター、α２−抗プ
ラスミンによって調整される。これは、プラスミンと反
応して共有結合型の酵素−インヒビター複合体を形成
し、その結果、プラスミンを不活性化するものである。
この複合体の血漿中における濃度は、繊維素溶解系の活
性化の程度に関する情報を提供し、したがってこの系の
障害の発見に適している。
【０００３】この複合体の濃度のサンドイッチＥＬＩＳ
Ａによる定量は既に知られている。被覆抗体としてα２
−抗プラスミン機能に対する第一の（「捕捉」）抗体
と、一方、プラスミンに対する第二の酵素標識抗体とを
使用して、捕捉抗体に結合した上記複合体を検出する方
法がある（Harpel, PC: J. Clin. Invest. 68: 46-55,1
981; Holvoet, P ら：Thromb. Haemostas. 56: 124-12
7, 1986）。プラスミン−α２−抗プラスミン複合体を
定量する他の方法として、プラスミノーゲンに対する固
定化モノクローナル捕捉抗体とα２−抗プラスミンに対
するペルオキシダーゼ標識検出抗体を使用する方法も報
告されている（Mimuro ら: Blood 69: 446-453, 198
7）。
Ａによる定量は既に知られている。被覆抗体としてα２
−抗プラスミン機能に対する第一の（「捕捉」）抗体
と、一方、プラスミンに対する第二の酵素標識抗体とを
使用して、捕捉抗体に結合した上記複合体を検出する方
法がある（Harpel, PC: J. Clin. Invest. 68: 46-55,1
981; Holvoet, P ら：Thromb. Haemostas. 56: 124-12
7, 1986）。プラスミン−α２−抗プラスミン複合体を
定量する他の方法として、プラスミノーゲンに対する固
定化モノクローナル捕捉抗体とα２−抗プラスミンに対
するペルオキシダーゼ標識検出抗体を使用する方法も報
告されている（Mimuro ら: Blood 69: 446-453, 198
7）。
【０００４】上述のアッセイ系には、酵素−インヒビタ
ー複合体が、通常サンプル中に大過剰に存在する遊離の
インヒビターまたはプロ酵素と、捕捉抗体に対する結合
において競合するという欠点がある。その結果、結合
し、したがって定量に利用される複合体の量は、サンプ
ル中のその複合体の成分の濃度に依存することになる。
これまで報告されている方法はすべて、アッセイに使用
するサンプルの高度な希釈によって、この問題を解決し
ている。これにより、必然的に、アッセイの感度のかな
りの低下が起こっている（表２も参照）。
ー複合体が、通常サンプル中に大過剰に存在する遊離の
インヒビターまたはプロ酵素と、捕捉抗体に対する結合
において競合するという欠点がある。その結果、結合
し、したがって定量に利用される複合体の量は、サンプ
ル中のその複合体の成分の濃度に依存することになる。
これまで報告されている方法はすべて、アッセイに使用
するサンプルの高度な希釈によって、この問題を解決し
ている。これにより、必然的に、アッセイの感度のかな
りの低下が起こっている（表２も参照）。
【０００５】モノクローナル抗体の一般的な製造方法
は、１９７５年以来（Koehler & Milstein: Nature 25
6: 495, 1975）知られてはいるが、必要な性質、すなわ
ち選択的にＰｌ−ＡＰ複合体を認識する性質を有する抗
体の製造には、なお著しい困難がある。この種類の抗体
の特異的な診断方法における、または治療剤としての利
用可能性にとって重要な点は、複合体を形成していない
状態でのプラスミノーゲンまたは抗プラスミンに対する
親和性が低いかまたは、可能であれば、その親和性を欠
くことである。
は、１９７５年以来（Koehler & Milstein: Nature 25
6: 495, 1975）知られてはいるが、必要な性質、すなわ
ち選択的にＰｌ−ＡＰ複合体を認識する性質を有する抗
体の製造には、なお著しい困難がある。この種類の抗体
の特異的な診断方法における、または治療剤としての利
用可能性にとって重要な点は、複合体を形成していない
状態でのプラスミノーゲンまたは抗プラスミンに対する
親和性が低いかまたは、可能であれば、その親和性を欠
くことである。
【０００６】したがって、本発明の目的は、プラスミン
−抗プラスミン複合体に対する特異的な親和性を選択的
に有するが、その個々の成分または前駆体プラスミノー
ゲンおよび複合体を形成していない状態の抗プラスミン
に対しては親和性を全く示さないかまたは極めて低い親
和性しか示さない、単一特異性抗体を提供することにあ
る。
−抗プラスミン複合体に対する特異的な親和性を選択的
に有するが、その個々の成分または前駆体プラスミノー
ゲンおよび複合体を形成していない状態の抗プラスミン
に対しては親和性を全く示さないかまたは極めて低い親
和性しか示さない、単一特異性抗体を提供することにあ
る。
【０００７】本発明は、驚くべきことに、プラスミンと
の複合体からアンモニアを用いて遊離させたプラスミン
での、およびα２−抗プラスミンでの両免疫処置によっ
て、所望の特異性を有する抗体が得られることを発見
し、完成された。
の複合体からアンモニアを用いて遊離させたプラスミン
での、およびα２−抗プラスミンでの両免疫処置によっ
て、所望の特異性を有する抗体が得られることを発見
し、完成された。
【０００８】すなわち、本発明は、プラスミン−抗プラ
スミン複合体に対して高い特異的親和性を有し、その個
々の遊離成分に対しては親和性を全く示さないかまたは
極めて低い親和性しか示さないプラスミン−抗プラスミ
ン複合体に対する単一特異性抗体に関する。
スミン複合体に対して高い特異的親和性を有し、その個
々の遊離成分に対しては親和性を全く示さないかまたは
極めて低い親和性しか示さないプラスミン−抗プラスミ
ン複合体に対する単一特異性抗体に関する。
【０００９】ハイブリドーマ細胞系ＢＷ ＰＡＰ６によ
って産生される上述の単一特異性抗体が、この場合特に
好ましい。
って産生される上述の単一特異性抗体が、この場合特に
好ましい。
【００１０】本発明はさらに、標準抗体ＢＭＡ ＰＡＰ
６によって結合される抗原に結合する、上述の単一特異
性抗体に関する。
６によって結合される抗原に結合する、上述の単一特異
性抗体に関する。
【００１１】ＭＡｂ ＢＭＡ ＰＡＰ６が特に好ましい。
【００１２】本発明はさらに、上述の抗体の一つによっ
て結合される抗原に関する。
て結合される抗原に関する。
【００１３】本発明はさらに、上述のモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞系に関する。
体を産生するハイブリドーマ細胞系に関する。
【００１４】この場合とくに好ましいものは、ＭＡｂ
ＢＭＡ ＰＡＰ６を産生するハイブリドーマ細胞系であ
る。
ＢＭＡ ＰＡＰ６を産生するハイブリドーマ細胞系であ
る。
【００１５】ハイブリドーマ細胞系ＢＷ ＰＡＰ６はと
くに好ましい。
くに好ましい。
【００１６】本発明はまた、上述の抗体の診断のための
使用に関する。
使用に関する。
【００１７】本発明はさらに、上述の少なくとも一つの
抗体を特異性結合パートナーとして使用する、プラスミ
ン−抗プラスミン複合体の検出による診断方法に関す
る。
抗体を特異性結合パートナーとして使用する、プラスミ
ン−抗プラスミン複合体の検出による診断方法に関す
る。
【００１８】この場合好ましい方法は、特異的結合パー
トナーの少なくとも一つは検出可能な標識を付して提供
される上述の方法である。
トナーの少なくとも一つは検出可能な標識を付して提供
される上述の方法である。
【００１９】この種類の診断方法では、標識はたとえば
酵素であり、他の特異的結合パートナーは直接的または
間接的に固相に結合される方法がとくに好ましい。
酵素であり、他の特異的結合パートナーは直接的または
間接的に固相に結合される方法がとくに好ましい。
【００２０】プラスミン−抗プラスミン複合体の語は、
本発明に関しては、本発明の抗体によって検出できるす
べてのプラスミン−抗プラスミン複合体を意味する。
本発明に関しては、本発明の抗体によって検出できるす
べてのプラスミン−抗プラスミン複合体を意味する。
【００２１】本発明の抗体は、たとえば、サンプル中の
遊離プラスミノーゲンおよびα２−抗プラスミンの濃度
とは無関係に、非希釈血漿サンプル中のＰｌ−ＡＰ複合
体濃度を定量的測定できるアッセイの構築を可能にす
る。本発明の抗体はポリまたはモノクローナルのいずれ
であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。本
技術分野の熟練者によく知られた方法で精製されたポリ
クローナル抗体の使用も可能である。
遊離プラスミノーゲンおよびα２−抗プラスミンの濃度
とは無関係に、非希釈血漿サンプル中のＰｌ−ＡＰ複合
体濃度を定量的測定できるアッセイの構築を可能にす
る。本発明の抗体はポリまたはモノクローナルのいずれ
であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。本
技術分野の熟練者によく知られた方法で精製されたポリ
クローナル抗体の使用も可能である。
【００２２】本発明の意味での抗体には、抗体の、本技
術分野の熟練者にはそれ自体よく知られている免疫活性
フラグメントも包含される。この場合好ましいフラグメ
ントはＦ(ａｂ′)2フラグメントである。
術分野の熟練者にはそれ自体よく知られている免疫活性
フラグメントも包含される。この場合好ましいフラグメ
ントはＦ(ａｂ′)2フラグメントである。
【００２３】本発明の意味での好ましい抗体は、ＢＭＡ
ＰＡＰ６であり、これはハイブリドーマ細胞系ＢＷ Ｐ
ＡＰ６によって産生される。このハイブリドーマ細胞系
は、１９９１年２月２１日付で、Deutsche Sammlung Mi
kroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM）に、ＤＳ
Ｍ ＡＣＣ２００４号として寄託された。
ＰＡＰ６であり、これはハイブリドーマ細胞系ＢＷ Ｐ
ＡＰ６によって産生される。このハイブリドーマ細胞系
は、１９９１年２月２１日付で、Deutsche Sammlung Mi
kroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM）に、ＤＳ
Ｍ ＡＣＣ２００４号として寄託された。
【００２４】この細胞系は、たとえば本技術分野の熟練
者にはよく知られている方法により（たとえば、Monocl
onal Antibodies, Kennett, R.: McKearn, t. & Bechto
l, K. 編, Plenum Press, 1980およびそれに含まれた文
献参照）、マウス骨髄腫細胞系と、予めＰｌ−ＡＰ複合
体からアンモニア、好ましくは０.１〜１％（v／v）を
用いて遊離させたプラスミンまたはα２−抗プラスミン
で免疫処置したマウスからの脾臓細胞とのハイブリダイ
ゼーションによって得られた。融合には様々のげっ歯類
（マウス）骨髄腫細胞系が使用できる。これらの細胞系
の一部はMelchers, F.; Potter, M. & Warner, N. 編;
Current Topics in Microbiology and Immunology, 第8
1巻, Springer Verlag(1978)に記載されている。ハイブ
リダイゼーションは通常、融合促進剤としてポリエチレ
ングリコールの存在下に行われるが、他の融合促進剤た
とえばセンダイウイルスも使用できる。脾臓細胞と骨髄
腫細胞の比は様々に変動させることができるが、通常は
２〜１０：１の比が用いられる。融合後、細胞を既知の
方法で培養し、所望の性質をもつ抗体の存在について細
胞上清をアッセイする。このためには、たとえば、抗−
マウスＩｇＧ（ウサギから）でコーティングしたマイク
ロタイタープレートを細胞上清とインキュベートする酵
素イムノアッセイを使用することができる。
者にはよく知られている方法により（たとえば、Monocl
onal Antibodies, Kennett, R.: McKearn, t. & Bechto
l, K. 編, Plenum Press, 1980およびそれに含まれた文
献参照）、マウス骨髄腫細胞系と、予めＰｌ−ＡＰ複合
体からアンモニア、好ましくは０.１〜１％（v／v）を
用いて遊離させたプラスミンまたはα２−抗プラスミン
で免疫処置したマウスからの脾臓細胞とのハイブリダイ
ゼーションによって得られた。融合には様々のげっ歯類
（マウス）骨髄腫細胞系が使用できる。これらの細胞系
の一部はMelchers, F.; Potter, M. & Warner, N. 編;
Current Topics in Microbiology and Immunology, 第8
1巻, Springer Verlag(1978)に記載されている。ハイブ
リダイゼーションは通常、融合促進剤としてポリエチレ
ングリコールの存在下に行われるが、他の融合促進剤た
とえばセンダイウイルスも使用できる。脾臓細胞と骨髄
腫細胞の比は様々に変動させることができるが、通常は
２〜１０：１の比が用いられる。融合後、細胞を既知の
方法で培養し、所望の性質をもつ抗体の存在について細
胞上清をアッセイする。このためには、たとえば、抗−
マウスＩｇＧ（ウサギから）でコーティングしたマイク
ロタイタープレートを細胞上清とインキュベートする酵
素イムノアッセイを使用することができる。
【００２５】この次に、ａ) 標準ヒト血漿、およびｂ)
Ｐｌ−ＡＰ複合体に富んだ血漿とインキュベートする。
さらに次のインキュベーション工程では、プラスミンお
よび抗プラスミンに対するペルオキシダーゼ標識抗体の
混合物を加え、ついで結合したペルオキシダーゼ活性を
測定する。必要に応じて、インキュベーション工程の間
に洗浄工程を行うこともできる。b)とは反応するがa)と
は反応しない細胞上清が所望の性質を有する抗体を含有
し、相当する細胞培養液をその後のクローニングに使用
する。
Ｐｌ−ＡＰ複合体に富んだ血漿とインキュベートする。
さらに次のインキュベーション工程では、プラスミンお
よび抗プラスミンに対するペルオキシダーゼ標識抗体の
混合物を加え、ついで結合したペルオキシダーゼ活性を
測定する。必要に応じて、インキュベーション工程の間
に洗浄工程を行うこともできる。b)とは反応するがa)と
は反応しない細胞上清が所望の性質を有する抗体を含有
し、相当する細胞培養液をその後のクローニングに使用
する。
【００２６】本発明によれば、大量の所望の抗体は、た
とえば、in vitro（細胞培養）またはin vivo（腹水）
の培養によって得ることができる。この方法で得られた
抗体は、それらの免疫グロブリンクラスおよびサブクラ
スによって、またたとえばそれらの電気泳動挙動によっ
て特性づけることができる。
とえば、in vitro（細胞培養）またはin vivo（腹水）
の培養によって得ることができる。この方法で得られた
抗体は、それらの免疫グロブリンクラスおよびサブクラ
スによって、またたとえばそれらの電気泳動挙動によっ
て特性づけることができる。
【００２７】抗体は好ましくは、本技術分野の熟練者に
はそれ自体よく知られている不均一または均一免疫学的
測定方法での診断に使用される。粒子増大比濁法が均一
法には好ましい。不均一イムノアッセイにおいては、固
相結合サンドイッチアッセイが好ましく、この場合、固
相は、好ましくはポリスチレンチューブ、マイクロタイ
タープレート、ラテックス粒子、磁性化可能粒子または
シート様固相である。マイクロタイタープレートが固相
として用いられた固相結合サンドイッチアッセイがとく
に好ましい。
はそれ自体よく知られている不均一または均一免疫学的
測定方法での診断に使用される。粒子増大比濁法が均一
法には好ましい。不均一イムノアッセイにおいては、固
相結合サンドイッチアッセイが好ましく、この場合、固
相は、好ましくはポリスチレンチューブ、マイクロタイ
タープレート、ラテックス粒子、磁性化可能粒子または
シート様固相である。マイクロタイタープレートが固相
として用いられた固相結合サンドイッチアッセイがとく
に好ましい。
【００２８】本発明による抗体少なくとも一つを特異的
結合パートナーとして使用したプラスミン−抗プラスミ
ン複合体を検出する診断方法も同様に好ましい。
結合パートナーとして使用したプラスミン−抗プラスミ
ン複合体を検出する診断方法も同様に好ましい。
【００２９】第二の特異的結合パートナーは他の抗体ま
たは抗体フラグメント、レクチンまたは受容体とするこ
とができる。この場合、第二の特異的結合パートナー
は、第一の特異的結合パートナーによって認識されるエ
ピトープ以外のエピトープを認識する本発明のモノクロ
ーナル抗体である方法が好ましい。これにより、一工程
アッセイの構築が可能になる。
たは抗体フラグメント、レクチンまたは受容体とするこ
とができる。この場合、第二の特異的結合パートナー
は、第一の特異的結合パートナーによって認識されるエ
ピトープ以外のエピトープを認識する本発明のモノクロ
ーナル抗体である方法が好ましい。これにより、一工程
アッセイの構築が可能になる。
【００３０】結合反応に続いて、捕捉抗体に結合した複
合体を液体上清から除去する洗浄工程を行えば、第二の
特異的結合パートナーとして、複合体の個々の成分の一
方に対する抗体も使用できる。これはポリクロナール抗
体であってもよい。
合体を液体上清から除去する洗浄工程を行えば、第二の
特異的結合パートナーとして、複合体の個々の成分の一
方に対する抗体も使用できる。これはポリクロナール抗
体であってもよい。
【００３１】特異的結合パートナーの一つには、検出お
よび定量のための標識を保持させることができる。この
標識は、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく知られて
いて、たとえば発色体、発蛍光体、化学発光体、酵素、
放射性同位元素、または着色もしくは非着色粒子とする
ことができる。抗体被覆固相の製造に好ましい方法は、
本技術分野の熟練者にはそれ自体よく知られている方法
で直接的または間接的に、たとえば固相にカップリング
した抗体またはビオチン−アビジン橋を介して、非標識
特異的結合パートナーに結合させる方法である。
よび定量のための標識を保持させることができる。この
標識は、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく知られて
いて、たとえば発色体、発蛍光体、化学発光体、酵素、
放射性同位元素、または着色もしくは非着色粒子とする
ことができる。抗体被覆固相の製造に好ましい方法は、
本技術分野の熟練者にはそれ自体よく知られている方法
で直接的または間接的に、たとえば固相にカップリング
した抗体またはビオチン−アビジン橋を介して、非標識
特異的結合パートナーに結合させる方法である。
【００３２】特異的抗体を用いてタンパク質を検出する
ために採用されるバイオセンサーは、本技術分野の熟練
者にはそれ自体よく知られている。本発明による抗体
も、このようなバイオセンサーに採用できる。
ために採用されるバイオセンサーは、本技術分野の熟練
者にはそれ自体よく知られている。本発明による抗体
も、このようなバイオセンサーに採用できる。
【００３３】本発明の抗体はまた、たとえば、本技術分
野の熟練者にはよく知られている方法で放射標識して、
イムノシンチグラフィーに使用できる。
野の熟練者にはよく知られている方法で放射標識して、
イムノシンチグラフィーに使用できる。
【００３４】実施例に記載する実施態様はとくに好まし
い。
い。
【００３５】実施例および特許請求の範囲は本発明の開
示の役を果たすものである。
示の役を果たすものである。
【００３６】以下の実施例は本発明を説明するものであ
るが、いかなる意味においても本発明を限定するもので
はない。
るが、いかなる意味においても本発明を限定するもので
はない。
【００３７】実施例１ 工程１：プラスミン不活性化α２−抗プラスミンの調製 ２.３ｇのα２−抗プラスミン（Biopoolから）を緩衝液
Ａ（０.１mol／リットル ＫＨ2ＰＯ4 、０.１５mol／リ
ットル ＮａＣｌ）中に取り、プラスミン−Fractogel
（２４mgのプラスミン − Kabiから − を４mlのCNBr-F
ractogelR にカップリング）上に負荷し、２５℃で１時
間インキュベートしてＰｌ−ＡＰ複合体を形成させた。
ゲルを４０mlの緩衝液Ａで洗浄した。次に、ゲルを０.
２５％アンモニアで洗浄して、酵素とインヒビターの間
の、求核性試薬に不安定な連結を加水分解した。アンモ
ニア溶出液のタンパク質含有分画は１.３mgのプラスミ
ン不活性化α２−抗プラスミンを含有した。
Ａ（０.１mol／リットル ＫＨ2ＰＯ4 、０.１５mol／リ
ットル ＮａＣｌ）中に取り、プラスミン−Fractogel
（２４mgのプラスミン − Kabiから − を４mlのCNBr-F
ractogelR にカップリング）上に負荷し、２５℃で１時
間インキュベートしてＰｌ−ＡＰ複合体を形成させた。
ゲルを４０mlの緩衝液Ａで洗浄した。次に、ゲルを０.
２５％アンモニアで洗浄して、酵素とインヒビターの間
の、求核性試薬に不安定な連結を加水分解した。アンモ
ニア溶出液のタンパク質含有分画は１.３mgのプラスミ
ン不活性化α２−抗プラスミンを含有した。
【００３８】工程２：Ｐｌ−ＡＰに対するモノクローナ
ル抗体の製造および精製 ２.１．抗体産生細胞の取得 完全フロインドアジュバント中５０μｇのプラスミンの
乳化液を皮下に注射してＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫処置
した（日１）。日２８および５６にはそれぞれ、不完全
フロインドアジュバント中に乳化した５０μｇのプラス
ミンを同様に皮下注射した。ついで日９２に、０.５ml
の生理食塩水中１００μｇのプラスミンを腹腔内に注射
した。日９５に、脾臓を摘出した後、機械的崩壊により
リンパ球を得た。リンパ球は、プラスミン不活性化α２
−抗プラスミン（工程１の記載に従い製造）で免疫処置
した動物からも同様にして得られた。
ル抗体の製造および精製 ２.１．抗体産生細胞の取得 完全フロインドアジュバント中５０μｇのプラスミンの
乳化液を皮下に注射してＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫処置
した（日１）。日２８および５６にはそれぞれ、不完全
フロインドアジュバント中に乳化した５０μｇのプラス
ミンを同様に皮下注射した。ついで日９２に、０.５ml
の生理食塩水中１００μｇのプラスミンを腹腔内に注射
した。日９５に、脾臓を摘出した後、機械的崩壊により
リンパ球を得た。リンパ球は、プラスミン不活性化α２
−抗プラスミン（工程１の記載に従い製造）で免疫処置
した動物からも同様にして得られた。
【００３９】２.２．リンパ球の骨髄腫細胞との融合 ハイブリドーマ細胞は標準方法（Koehler & Milstein,
Nature 256: 495-497,1975）によって得られた。すなわ
ち、骨髄腫細胞系ＳＰ２／０−Ａｇ１４を、１０％ウシ
胎児血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコ改良イーグル培地
（ＤＭＥＭ）中で培養した。マウスからの脾臓細胞（約
１０８リンパ球）を５×１０７骨髄腫細胞と混合し、無
血清ＤＭＥＭで洗浄し、遠心分離した。上清を完全に除
去した後、ＤＭＥＭ中５０％濃度のポリエチレングリコ
ール４０００溶液０.５mlを細胞ペレットに１分を要し
て滴下した。懸濁液を３７℃で９０秒間インキュベート
し、ついで５分間を要して７.５mlのＤＭＥＭを添加し
て希釈した。室温で１０分間インキュベートした後、混
合物をＤＭＥＭで４０mlとし、細胞を遠心分離した。上
清を吸引除去し、ついで細胞を２０％ＦＣＳ含有ＤＭＥ
Ｍに再懸濁し、６個のマイクロタイタープレート上でイ
ンキュベートした（各孔あたり２００μｌ）。ハイブリ
ドーマ細胞はヒポキサンチン１３.６ng／ml、アミノプ
テリン０.１８mg／ml、チミジン３.９mg／ml（ＨＡＴ培
地）の添加により選択された。使用した培地は３〜４日
の間隔で新鮮な培地に置換し、１０日後にＨＴ培地で置
換した。
Nature 256: 495-497,1975）によって得られた。すなわ
ち、骨髄腫細胞系ＳＰ２／０−Ａｇ１４を、１０％ウシ
胎児血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコ改良イーグル培地
（ＤＭＥＭ）中で培養した。マウスからの脾臓細胞（約
１０８リンパ球）を５×１０７骨髄腫細胞と混合し、無
血清ＤＭＥＭで洗浄し、遠心分離した。上清を完全に除
去した後、ＤＭＥＭ中５０％濃度のポリエチレングリコ
ール４０００溶液０.５mlを細胞ペレットに１分を要し
て滴下した。懸濁液を３７℃で９０秒間インキュベート
し、ついで５分間を要して７.５mlのＤＭＥＭを添加し
て希釈した。室温で１０分間インキュベートした後、混
合物をＤＭＥＭで４０mlとし、細胞を遠心分離した。上
清を吸引除去し、ついで細胞を２０％ＦＣＳ含有ＤＭＥ
Ｍに再懸濁し、６個のマイクロタイタープレート上でイ
ンキュベートした（各孔あたり２００μｌ）。ハイブリ
ドーマ細胞はヒポキサンチン１３.６ng／ml、アミノプ
テリン０.１８mg／ml、チミジン３.９mg／ml（ＨＡＴ培
地）の添加により選択された。使用した培地は３〜４日
の間隔で新鮮な培地に置換し、１０日後にＨＴ培地で置
換した。
【００４０】２.３．Ｐｌ−ＡＰ抗体のアッセイ 融合１４日後、細胞培養上清をＰｌ−ＡＰ複合体に対す
る抗体について、酵素イムノアッセイで検定した。ポリ
スチレンマイクロアッセイプレートを、０.１mol／リッ
トルのＮａＨＣＯ3、pH９.６中３μｇ／mlウサギ抗−マ
ウスＩｇＧとインキュベートした（２４時間、４℃）。
次に細胞培養上清を適用し（２時間、３７℃）、続いて
標準ヒト血漿（１：２に希釈）とインキュベートした。
ついでプラスミノーゲンおよびα２−抗プラスミンに対
するウサギからのペルオキシダーゼ−標識抗体（各１μ
ｇ／ml）の混合物とインキュベートした（２時間、３７
℃）。使用した基質は、０.１mol／リットル クエン
酸、０.１mol／リットル Ｎａ 2ＨＰＯ4，pH４.５中、
０.１％（重量／容量）２,２′−アジノジ(３−エチル
ベンゾチアゾリン−６−スルホネート）および０.０１
２％（容量／容量）過酸化水素の溶液であった。３７℃
で３０分間インキュベートした後、４０５nmにおける吸
収を測定した。洗浄は各インキュベーション工程の間
に、０.０１mol／リットル Ｎａ2ＨＰＯ4、０.０１mol
／リットル ＮａＨ2ＰＯ4，pH７.２，０.１５mol／リッ
トル ＮａＣｌ，０.０５％ Tween20（PBS／Tween）で行
った。すべての試薬は２％ウシ血清アルブミン含有PBS
／Tweenで希釈した。平行して、同じ細胞培養上清で、
標準ヒト血漿の代わりに高含量のＰｌ−ＡＰ複合体を含
む血漿（標準ヒト血漿の固定化ウロキナーゼとのインキ
ュベーションにより取得）を使用し、酵素イムノアッセ
イを実施した。Ｐｌ−ＡＰ複合体とは反応（Ｐｌ−ＡＰ
含有血漿と反応）するが、血漿中の遊離プラスミノーゲ
ンまたはα２−抗プラスミンは認識しない（標準ヒト血
漿とは反応しない）抗体は、Ｐｌ−ＡＰ複合体のＥＬＩ
ＳＡに特に適している。
る抗体について、酵素イムノアッセイで検定した。ポリ
スチレンマイクロアッセイプレートを、０.１mol／リッ
トルのＮａＨＣＯ3、pH９.６中３μｇ／mlウサギ抗−マ
ウスＩｇＧとインキュベートした（２４時間、４℃）。
次に細胞培養上清を適用し（２時間、３７℃）、続いて
標準ヒト血漿（１：２に希釈）とインキュベートした。
ついでプラスミノーゲンおよびα２−抗プラスミンに対
するウサギからのペルオキシダーゼ−標識抗体（各１μ
ｇ／ml）の混合物とインキュベートした（２時間、３７
℃）。使用した基質は、０.１mol／リットル クエン
酸、０.１mol／リットル Ｎａ 2ＨＰＯ4，pH４.５中、
０.１％（重量／容量）２,２′−アジノジ(３−エチル
ベンゾチアゾリン−６−スルホネート）および０.０１
２％（容量／容量）過酸化水素の溶液であった。３７℃
で３０分間インキュベートした後、４０５nmにおける吸
収を測定した。洗浄は各インキュベーション工程の間
に、０.０１mol／リットル Ｎａ2ＨＰＯ4、０.０１mol
／リットル ＮａＨ2ＰＯ4，pH７.２，０.１５mol／リッ
トル ＮａＣｌ，０.０５％ Tween20（PBS／Tween）で行
った。すべての試薬は２％ウシ血清アルブミン含有PBS
／Tweenで希釈した。平行して、同じ細胞培養上清で、
標準ヒト血漿の代わりに高含量のＰｌ−ＡＰ複合体を含
む血漿（標準ヒト血漿の固定化ウロキナーゼとのインキ
ュベーションにより取得）を使用し、酵素イムノアッセ
イを実施した。Ｐｌ−ＡＰ複合体とは反応（Ｐｌ−ＡＰ
含有血漿と反応）するが、血漿中の遊離プラスミノーゲ
ンまたはα２−抗プラスミンは認識しない（標準ヒト血
漿とは反応しない）抗体は、Ｐｌ−ＡＰ複合体のＥＬＩ
ＳＡに特に適している。
【００４１】２.４．抗体産生細胞系のクローニング 上清がＰｌ−ＡＰ特異的抗体のアッセイで陽性反応を示
した細胞を、限界希釈法によってクローン化した。この
ためには、２０％ＦＣＳおよび５％ヒト内皮培養上清
（Costar）含有ＤＭＥＭ中約６０個の細胞を細胞培養プ
レートの９６の孔部に分配した。各クローンを顕微鏡で
確認し、上述のようにして抗体の産生について検定し
た。クローニングは２回反復した。
した細胞を、限界希釈法によってクローン化した。この
ためには、２０％ＦＣＳおよび５％ヒト内皮培養上清
（Costar）含有ＤＭＥＭ中約６０個の細胞を細胞培養プ
レートの９６の孔部に分配した。各クローンを顕微鏡で
確認し、上述のようにして抗体の産生について検定し
た。クローニングは２回反復した。
【００４２】２.５．モノクローナル抗体の精製 クローン細胞系を抗体産生用の回転瓶に移し、イスコブ
の改良ダルベッコ培地中で培養した。細胞上清を遠心分
離によって集め、限外濾過によって約１０分の１に濃縮
した。濃縮物をプロテインＡ−Sepharose・ＣＬ−４ｂ
（Pharmacia）上に負荷し、結合したＩｇＧを０.２mol
／リットル グリシン塩酸塩，pH３.０で溶出した。タン
パク質含有分画を０.１mol／リットル クエン酸，pH６.
５に対して透析し、限外濾過によって約５mg／mlに濃縮
した。
の改良ダルベッコ培地中で培養した。細胞上清を遠心分
離によって集め、限外濾過によって約１０分の１に濃縮
した。濃縮物をプロテインＡ−Sepharose・ＣＬ−４ｂ
（Pharmacia）上に負荷し、結合したＩｇＧを０.２mol
／リットル グリシン塩酸塩，pH３.０で溶出した。タン
パク質含有分画を０.１mol／リットル クエン酸，pH６.
５に対して透析し、限外濾過によって約５mg／mlに濃縮
した。
【００４３】工程３：精製抗体に関するアッセイ ３.１．抗体被覆ポリスチレンマイクロタイタープレー
トの製造 工程2.5.で得られたＰｌ−ＡＰ特異的抗体を、リン酸ナ
トリウム緩衝液（０.０１mol／リットル，pH６.８）で
濃度５μｇ／mlに希釈し、マイクロタイタープレート上
に吸着によって固定化させた。ウエルあたり１５０μｌ
の抗体溶液を２０℃で２０時間インキュベートし、つい
で液体を吸引除去し、プレートを気密密閉して４℃で保
存した。
トの製造 工程2.5.で得られたＰｌ−ＡＰ特異的抗体を、リン酸ナ
トリウム緩衝液（０.０１mol／リットル，pH６.８）で
濃度５μｇ／mlに希釈し、マイクロタイタープレート上
に吸着によって固定化させた。ウエルあたり１５０μｌ
の抗体溶液を２０℃で２０時間インキュベートし、つい
で液体を吸引除去し、プレートを気密密閉して４℃で保
存した。
【００４４】３.２．酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）の操作 検定すべきサンプルをインキュベーション緩衝液（０.
１mol／リットル ＮａＣｌ，０.１mol／リットル トリ
ス，１％Tween20，０.１％ＮａＮ3，pH７.２）で１＋１
に希釈した。１００μｌを各ウエルに取り、３７℃で３
０分間インキュベートした。ついでインキュベーション
緩衝液を除去し、ウエルを２回、各回１５０μｌの洗浄
溶液（０.０２mol／リットル リン酸ナトリウム，０.０
５％Tween20，pH７.６）で洗浄した。ついで１００μｌ
のペルオキシダーゼ接合ウサギ抗−プラスミノーゲン抗
体を各ウエルに加え、３７℃で３０分間インキュベート
した。接合溶液を除去し、２回洗浄したのち、１００μ
ｌの基質溶液（過酸化水素；ｏ−フェニレンジアミン）
を加え、プレートを室温でインキュベートした。３０分
のインキュベーション後に、ペルオキシダーゼを０.１m
ol／リットルの硫酸で不活性化し、反応溶液の４９２nm
における吸光度を測定した。表１には、様々な濃度にお
けるＰｌ−ＡＰ複合体の吸収値（ＯＤ ４９２nm／３０
分）を示した。Ｐｌ−ＡＰネオアンチゲンに対するモノ
クローナル抗体（ＰＡＰ ６）およびα２−抗プラスミ
ンに対するモノクローナル抗体（ＡＰｌ ２）の両者を
被覆抗体として使用した。表１には吸光と測定が行われ
た濃度を示す。
Ａ）の操作 検定すべきサンプルをインキュベーション緩衝液（０.
１mol／リットル ＮａＣｌ，０.１mol／リットル トリ
ス，１％Tween20，０.１％ＮａＮ3，pH７.２）で１＋１
に希釈した。１００μｌを各ウエルに取り、３７℃で３
０分間インキュベートした。ついでインキュベーション
緩衝液を除去し、ウエルを２回、各回１５０μｌの洗浄
溶液（０.０２mol／リットル リン酸ナトリウム，０.０
５％Tween20，pH７.６）で洗浄した。ついで１００μｌ
のペルオキシダーゼ接合ウサギ抗−プラスミノーゲン抗
体を各ウエルに加え、３７℃で３０分間インキュベート
した。接合溶液を除去し、２回洗浄したのち、１００μ
ｌの基質溶液（過酸化水素；ｏ−フェニレンジアミン）
を加え、プレートを室温でインキュベートした。３０分
のインキュベーション後に、ペルオキシダーゼを０.１m
ol／リットルの硫酸で不活性化し、反応溶液の４９２nm
における吸光度を測定した。表１には、様々な濃度にお
けるＰｌ−ＡＰ複合体の吸収値（ＯＤ ４９２nm／３０
分）を示した。Ｐｌ−ＡＰネオアンチゲンに対するモノ
クローナル抗体（ＰＡＰ ６）およびα２−抗プラスミ
ンに対するモノクローナル抗体（ＡＰｌ ２）の両者を
被覆抗体として使用した。表１には吸光と測定が行われ
た濃度を示す。
【００４５】
【表１】 結果は、Ｐｌ−ＡＰ複合体の測定には被覆抗体として原
理的には、Ｐｌ−ＡＰネオアンチゲンに対する抗体およ
びα２−抗プラスミンに対する抗体の両者が使用できる
ことを示している。
理的には、Ｐｌ−ＡＰネオアンチゲンに対する抗体およ
びα２−抗プラスミンに対する抗体の両者が使用できる
ことを示している。
【００４６】３.３．血漿中のＰｌ−ＡＰ複合体の回収 血漿サンプル（正常血漿）に所定量のＰｌ−ＡＰ複合体
を加え、ＥＬＩＳＡによって測定した。ＰＡＰ ６およ
びＡＰｌ ２の両者をマイクロタイタープレートの被覆
抗体として使用した。吸収は表２に示す。
を加え、ＥＬＩＳＡによって測定した。ＰＡＰ ６およ
びＡＰｌ ２の両者をマイクロタイタープレートの被覆
抗体として使用した。吸収は表２に示す。
【００４７】
【表２】 結果は、Ｐｌ−ＡＰが１：２に希釈した血漿サンプル
中、Ｐｌ−ＡＰ複合体上のネオアンチゲンに対して産生
される捕捉抗体ＰＡＰ ６を用いて検出できるが、捕捉
抗体としてＡＰｌ ２（α２−抗プラスミンに対する抗
体）を用いると、遊離のα２−抗プラスミンおよびＰｌ
−ＡＰ複合体の競合のために、Ｐｌ−ＡＰが高濃度の場
合にしか見出せないことを明瞭に示している。
中、Ｐｌ−ＡＰ複合体上のネオアンチゲンに対して産生
される捕捉抗体ＰＡＰ ６を用いて検出できるが、捕捉
抗体としてＡＰｌ ２（α２−抗プラスミンに対する抗
体）を用いると、遊離のα２−抗プラスミンおよびＰｌ
−ＡＰ複合体の競合のために、Ｐｌ−ＡＰが高濃度の場
合にしか見出せないことを明瞭に示している。
【００４８】３.４．血漿中のＰｌ−ＡＰ複合体の検出 血漿をウロキナーゼと混合し、３７℃で１８０分間イン
キュベートした。様々な時間に血漿の一部を採取し、ア
プロチニンを添加して反応を停止させた。サンプルをＰ
ＢＳ／アプロチニンで１＋９９に希釈し、ＥＬＩＳＡで
検定した。モノクローナル抗体ＢＭＡ ＰＡＰ ６（Ｐｌ
−ＡＰネオアンチゲンに対する抗体）をマイクロタイタ
ープレートの被覆抗体として使用した。結果は表３に示
す。
キュベートした。様々な時間に血漿の一部を採取し、ア
プロチニンを添加して反応を停止させた。サンプルをＰ
ＢＳ／アプロチニンで１＋９９に希釈し、ＥＬＩＳＡで
検定した。モノクローナル抗体ＢＭＡ ＰＡＰ ６（Ｐｌ
−ＡＰネオアンチゲンに対する抗体）をマイクロタイタ
ープレートの被覆抗体として使用した。結果は表３に示
す。
【００４９】
【表３】 結果は、血漿中のＰｌ−ＡＰ複合体の濃度が、ウロキナ
ーゼによるプラスミノーゲンの活性化の過程で、時間と
ともに増大することを示している。
ーゼによるプラスミノーゲンの活性化の過程で、時間と
ともに増大することを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/564 Ｚ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 8413−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (12)
- 【請求項１】 プラスミン−抗プラスミン複合体に対し
て高い特異的親和性を有し、その個々の遊離成分または
その前駆体プラスミノーゲンおよび抗プラスミンに対し
ては親和性を全く示さないかまたは極めて低い親和性し
か示さないプラスミン−抗プラスミン複合体に対する単
一特異性抗体。 - 【請求項２】 ハイブリドーマ細胞系ＢＷ ＰＡＰ６に
よって産生される請求項１に記載の単一特異性抗体。 - 【請求項３】 標準抗体ＢＭＡ ＰＡＰ６によって結合
される抗原に結合する請求項１に記載の単一特異性抗
体。 - 【請求項４】 ＭＡｂ ＢＭＡ ＰＡＰ６である請求項１
に記載の単一特異性抗体。 - 【請求項５】 請求項１〜４の少なくとも一つに記載さ
れた単一特異性抗体によって結合される抗原。 - 【請求項６】 請求項１に記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞系。 - 【請求項７】 ＭＡｂ ＢＭＡ ＰＡＰ６を産生するハイ
ブリドーマ細胞系。 - 【請求項８】 ＢＷ ＰＡＰ６細胞系であるハイブリド
ーマ細胞系。 - 【請求項９】 請求項１に記載の抗体の診断のための使
用。 - 【請求項１０】 請求項１に記載の少なくとも一つの抗
体を特異的結合パートナーとして使用するプラスミン−
抗プラスミン複合体の検出による診断方法。 - 【請求項１１】 特異的結合パートナーの少なくとも一
つは検出可能な標識を付して提供される請求項１０に記
載の方法。 - 【請求項１２】 標識はたとえば、酵素であり、他の特
異的結合パートナーは直接的または間接的に固相に結合
される請求項１１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4115993A DE4115993A1 (de) | 1991-05-16 | 1991-05-16 | Monoklonale antikoerper gegen den plasmin-atiplasmin komplex, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung |
| DE4115993:4 | 1991-05-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05207893A true JPH05207893A (ja) | 1993-08-20 |
| JP3334904B2 JP3334904B2 (ja) | 2002-10-15 |
Family
ID=6431777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12242192A Expired - Fee Related JP3334904B2 (ja) | 1991-05-16 | 1992-05-15 | プラスミン−抗プラスミン複合体に対するモノクローナル抗体、その製造方法およびその使用 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5888753A (ja) |
| EP (1) | EP0513565B1 (ja) |
| JP (1) | JP3334904B2 (ja) |
| AT (1) | ATE144286T1 (ja) |
| AU (1) | AU664838B2 (ja) |
| CA (1) | CA2068764A1 (ja) |
| DE (2) | DE4115993A1 (ja) |
| DK (1) | DK0513565T3 (ja) |
| ES (1) | ES2093135T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010013525A1 (ja) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | 日東紡績株式会社 | 複合体の測定方法およびそれに用いるキット |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT398004B (de) * | 1992-04-14 | 1994-08-25 | Berbi Gmbh | Verfahren zur bestimmung von plasmin-alpha2- antiplasmin-komplexen unter verwendung eines komplexspezifischen monoklonalen antikörpers |
| CN116284415B (zh) * | 2022-12-29 | 2023-11-14 | 山东大学 | 一种纤溶酶-α2抗纤溶酶复合物单克隆抗体及其制备和应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL7511055A (nl) * | 1975-09-19 | 1977-03-22 | Leuven Res & Dev Vzw | Trombosetest. |
| BE896543A (fr) * | 1983-04-22 | 1983-08-16 | Wallone Region | Ensembles d'anticorps monoclonaux deriges contre les proteines humaines impliquees dans la coagulation et la fibrinolyse du sang |
| DK166627B1 (da) * | 1984-04-17 | 1993-06-21 | Teijin Ltd | Monoklont antistof, der er specifikt over for human-alfa-2-plasmininhibitor, fremgangsmaade til fremstilling af et hybridom, der producerer antistoffet, anvendelse af antistoffet til immunologisk analyse for human-alfa-2-plasmininhibitor og anvendelse af antistoffet til fraskillelse og udvinding af human-alfa-2-plasmininhibitor |
-
1991
- 1991-05-16 DE DE4115993A patent/DE4115993A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-04-22 DE DE59207362T patent/DE59207362D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-22 DK DK92106829.2T patent/DK0513565T3/da active
- 1992-04-22 EP EP92106829A patent/EP0513565B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-22 ES ES92106829T patent/ES2093135T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-22 AT AT92106829T patent/ATE144286T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-05-14 US US07/882,978 patent/US5888753A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-15 CA CA002068764A patent/CA2068764A1/en not_active Abandoned
- 1992-05-15 AU AU16264/92A patent/AU664838B2/en not_active Ceased
- 1992-05-15 JP JP12242192A patent/JP3334904B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010013525A1 (ja) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | 日東紡績株式会社 | 複合体の測定方法およびそれに用いるキット |
| US8900882B2 (en) | 2008-07-31 | 2014-12-02 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Method of assaying complex and kit to be used therefor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4115993A1 (de) | 1992-11-19 |
| AU664838B2 (en) | 1995-12-07 |
| DE59207362D1 (de) | 1996-11-21 |
| CA2068764A1 (en) | 1992-11-17 |
| DK0513565T3 (da) | 1997-03-24 |
| JP3334904B2 (ja) | 2002-10-15 |
| EP0513565A1 (de) | 1992-11-19 |
| ES2093135T3 (es) | 1996-12-16 |
| US5888753A (en) | 1999-03-30 |
| EP0513565B1 (de) | 1996-10-16 |
| AU1626492A (en) | 1992-11-19 |
| ATE144286T1 (de) | 1996-11-15 |
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