JPS61292063A - 蛋白分析用一体型多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、全血、血漿、血清等の形態を含む血液、リン
パ液、唾液、髄液、膣液、尿、飲料水、酒類、河川水、
工場排水等の水性液体試料に含まれる蛋白質を分析する
乾式の一体型多層分析要素に関するものである。

〔従来の技術〕

近年、乾式の分析要素が盛んに開発されるようになシ、
その一形態として透明支持体上に試薬層を積層し、さら
にその上に展開層を積層した一体型多層分析要素が多数
提案されている。そして、ビウレット反応を利用した蛋
白質分析用についても特開昭５４−１０１３９８号公報
、特開昭５９−５１３り６号公報などに開示されている
。

特開昭５４　”　１０１３’９８号公報に開示されてい
るものは、例えばポリエチレンテレフタレートフィルム
を支持体に用いその上に硫酸銅、酒石酸及び水酸化リチ
ウムを含むアガロースよシなる試薬層並びに微結晶性セ
ルロース粒子及びポリビニルピロリドンよシなる展開層
を積層したものであった。

そして、この分析要素の特徴とするところは、実質的に
ナトリウムイオンを含まず、所定の高ＰＨを主成しうる
塩基とアルカリ保護性ポリマーを含む混合物を試薬層に
用いることによって保存安定性を確保したところにあっ
た。

また、特開昭５９−５１３５６号公報に開示されている
発明は上記の分析要素の発色性、保存性及び定量性を改
良したものであり、水溶性第二銅塩、銅キレート化剤に
加えてアルカリ金属の水酸化物もしくはアルカリ金属又
はアルカリ土類金属の塩から選ばれる少なくとも二秤取
」二のアルカリ性混合物を含有せしめたことを特徴とし
ていた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ビウレット反応はｐＨ１２を越えるような高ＰＨ域で呈
色反応が行なわれるので、蛋白分析用一体型多層分析要
素においてもこのような高ＰＨが形成されなければなら
ない。そして、この多層分析要素は製造後直ちに使用さ
れるとは限らないので相当期間にわたってこの高ＰＩ］
形成能を維持させる必要がある。そこで、蛋白分析用一
体型多層分析要素は一般に保存性に問題があった。また
、アルカリとしてリチウム化合物だけを含む系において
はリチウムイオンが共有結合性を多分にもつのでアルカ
リとしてリチウム化合物だけを含む層の塗布液は親水性
バインダーや他の親水性の層に対して抗水に似た現象を
生じて塗布しにくいことも大きな問題であった。

本発明の目的は保存性を改善して長期間にわたり安定し
て使用可能な蛋白分析用一体型多層分析要素を提供する
ことにある。

本発明の別の目的は蛋白分析用一体型多層分析要素にお
いて試薬層の塗布を容易にして作業負担を軽減するとと
もに不良品発生率の少なくする手段を提供することにあ
る。

本発明のさらに別の目的は発色濃度を高めて分析精度を
改善した蛋白分析用一体型多層分析要素を提供すること
にある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者はこのようガ目的を達成するべく鋭意研究を重
ねた結果、アルカリに水酸化リチウムを用いるとともに
銅キレート化剤として酒石酸と酒石酸ナトリウムとを併
用することによって前記目的を達成しうろことを見出し
て本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、少なくとも、水性試料を展開して
試薬層に供給する展開層と、呈色試薬組成物を含有する
試薬層と、光透過性で水不透過性の支持体とがこの順に
積層されかつ呈色試薬組成物として水溶性第二銅塩、銅
キレート化剤及びアルカリが試薬層に含まれている蛋白
分析用一体型多層分析要素において、前記アルカリが水
酸化リチウムであり、前記銅キレート化剤が酒石酸及び
酒石酸ナトリウムからなることを特徴とする蛋白分析用
一体型多層分析要素に関するものである。

展開層はその上側表面（透明支持体から遠い側の表面）
に点着供給された水性液体試料をその中に含有している
成分を実質的に偏在させること外しに横方向に拡げ単位
面積当シはぼ一定容量の割合で親水性ポリマーバインダ
ーを含む吸水性または水浸透性の試薬層に供給する作用
（展開作用またはメータリング作用）をする層でちる。

さらに展開層は水性液体試料中の分析を阻害する非溶解
性物質（例、全血試料中の赤血球等）を濾過除去する作
用をもする層である。展開層は特開昭５５−１６４３５
６号、特開昭５７−６６３５９号、特開昭ｒ　へ） ５７−１４８２５０号、特公昭５３−２１６７７号（Ｕ
、８゜３９９２１５８号）、特開昭５５−９０８５９号
、特開昭５６−２４５７６号、特開昭５７−９４６５８
号に記載されたものが好ましいが、特開昭５５−１６４
３５６号、特開昭５７−Ｍ３５９号及び特開昭５７−１
４８２５０に記載されたものがとくに好ましい。

試薬層は呈色試薬組成物が含有される層であって少なく
ともビウレット試薬である水溶性第二銅塩、銅キレート
化剤及びアルカリを親水性ポリマーバインダーに分散さ
せた層である。親水性ポリマーバインダーには、澱粉、
ヒドロキシエチルセルロースの如キセルロース誘導体、
アクリル酸、アクリルアミド、Ｎ−ビニルぎロリドンの
よウナエチレン性不飽和単量体がら々るバインダーがあ
５８−７７６６４号： るが、特開昭　　　　　　　　　　　°に示されている
アクリルアミド−Ｎ−ビニルピロリドン共重合体（重量
比５０１５０）がとくに奸才しい、試薬層の厚さは乾燥
状態で約３μｍから約５０μ兜、好ましくは約５尾から
約３０１ｉ／ｒｎ、の範囲であシ、この試薬層は実質的
に透明であることが好ましい。この試薬層には固体微粒
子を加えて微多孔性構造体層とすることができる。ここ
でいう微多孔性構造体層とは微多孔性微粒子または非多
孔性微粒子と微粒子間を接着して微多孔性連続空隙構造
を保持する親水性ポリマーバインダーからなる構造物の
層である。微多孔性試薬層に用いられる微多孔性微粒子
または非多孔性微粒子の例として微結晶性セルロース、
セルロース微粉末または微粒子等のセルロース微粒子、
シリカ、珪藻土等の二酸化珪素化合物の微粒子、沸石等
の珪酸塩の微粒子、ポリマーミクロビーズ、ガラスミク
ロビーズ、諸種のセラミックスビーズ等があげられる。

親水性バインダーとして前記の親水性ポリマーバインダ
ーと同じもののなかから適宜に選択して用いることがで
きるほか特願昭５８−２１１７１等に開示の親水性構成
繰返し単位を約２チ以上含有するコポリマーの水性ラテ
ックス等を用いることができる。微多孔性試薬層の乾燥
層厚は約７μｍから約５０μｍ、好ましくは約１０！ｂ
ＷＬから約３０１ｊ／ｎＬの範囲である。

光透過性水不透過性支持体としては前述の特許明細書等
に開示の多層分析要素に用いられているような水不透過
性の透明支持体を用いることができる。その具体例とし
てはポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールＡの
ポリカルブネート、ポリスチレン、セルロースエステル
（例、セルロースジアセテート、セルローストリアセテ
ート、セルロースアセテートプロピオネート等）等のポ
リマーからなる厚さ約５０ＩＪ４ｎから約１霞、好まし
くは約８０μｍから約３００１ＩＩｒｎの範囲の透明支
持体を用いることができる。支持体の表面には必要によ
シ前記の諸特許明細書等によシ公知の下塗層または接着
層を設けて支持体の上に設けられる吸水層または試薬層
等との接着を強固にすることができる。支持体の観察側
の一側面は、その目的に応じて任意に加工することは可
能である。次に上記の支持体上に本発明に係る前記試薬
層を設ける場合、直接被覆することもできるが、場合に
よっては光透過性の下塗多層を使用して試薬層と支持体
との間の接着性を高めることは効果的である。

本発明の分析要素は種々の異なる配置のうち、任意の一
つをとることが可能である。更に本発明の試薬層と各種
の機能層、試薬含有層、及び部材、例えば米国特許第３
，９９２，１５８号記載の試薬層、反射層、下塗多層、
米国特許第４，０４２，３３５号記載の放射線ブロッキ
ング層、米国特許第４，０６６．４０３号記載のバリヤ
一層、米国特許第４，１４４，３０６号記載のレジスト
レーション層、米国特許第４，１６６，０９３号記載の
マイグレーション阻止層、米国特許第４．１２７，４９
９号記載のシンチレーション層、特開昭５５−９０８５
９号記載の清掃層及び米国特許第４．１１０．０７９号
記載の破壊性ポンド状部材等を任意に組合わせて、本発
明の目的に合わせた分析素子を構成する事が可能である
。

本発明の一体型多層分析要素に含有させる必須の試薬は
水溶性第二銅塩、銅キレート化剤及びアルカリである。

第二銅塩としては、塩化銅、臭化銅、酢酸銅、硝酸銅、
硫酸銅等の水溶性の有機、無機の第二銅塩が用いられる
が、定量分析の信頼性を保証する純度を保持しうる硫酸
銅が好ましい。その使用量は一般に分析すべき蛋白質Ｉ
Ｉに対し水溶性第二銅塩約０．５〜１０ｇである。そし
て、本発明の一体型多層分析要素においては、アルカリ
に水酸化リチウムを用いるとともに銅キレート化剤とし
て酒石酸及び酒石酸ナトリウムを用いたところに特徴が
ある。

銅キレート化剤の量すなわち酒石酸及び酒石酸す）　Ｉ
Ｊウムの量の和は水溶性第二銅塩の０．５〜２倍モル程
度、通常０．７〜１．３倍モル程度である。

酒石酸ナトリウムは水酸化リチウムの３〜５０重量％程
度、好ましくは５〜３０重量係程度である、水酸化リチ
ウムは測定時に試薬層をＰＨ１２以上にしうる量が必要
である。

又、本発明の多層分析要素に付加的に用いられる添加剤
として例えば保恒剤、緩衝剤、界面活性剤等、種々の添
加剤も所望に応じて添加する事ができる。

特に界面活性剤は流体試料を本発明の分析要素に適用し
た際の浸透速度の調節等有効に用いる事ができる。

使用可能な界面活性剤としては、イオン性（アニオン性
またはカチオン性）、非イオン性を問わず界面活性剤を
使用する事が可能であるが、好ましくは非イオン性界面
活性剤が有効である。非イオン性界面活性剤の例として
は、例えば２，５−ジ−ｔ−ブチルフェノキシポリエチ
レングリコール、ｐ−オクチルフェノキシポリエチレン
グリコール、ｐ−インノニルフェノキシポリエチレング
リコール等のアルキル置換フェノールのポリアルキレン
グリコール誘導体、高級脂肪酸のポリアルキレングリコ
ールエステルなどが挙げられる。これらの界面活性剤は
流体試料の試薬層への浸透速度を調節し、同時に好まし
からざる「クロマトグラフィ現象」発生を抑制する効果
を有する。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるが、塗設液の重量に対して１０重量パーセント
乃至０．００５０５重量パーセントましくは６重量パー
セント乃至０．０５重量パーセント用いることができる
。

本発明の一体型多層分析要素は一般の一体型多層分析要
素について知られている製法に従って製造することがで
きる。上記試薬は写真業界で公知であるオイルプロテク
ト分散法、直接分散法等の分散法及び溶解等によシ、親
水性ポリマーバインダーに含有させる事が出来る。

上記の種々の層は、従来写真工業において公知のスライ
ドホッパー塗布法、押出し塗布法、浸漬塗布法等を随時
用いる事で任意の膜厚の層を塗布する事が可能である。

本発明の分析素子を用いて検出可能な変化として分析結
果を得たのち、反射スペクトロフォトメトリー測定によ
シ測定される。このようにして得られた測定値は、あら
かじめ作製しておいた検量線に当てはめる事で、未知被
検物質の量を決定することができる。

以上のように構成された本発明の分析要素は、展開層か
ら流体試料を供給した後、試薬層での分析反応を透明支
持体側から観察する事によシ目的を達成できる。

本発明の分析要素に適用される流体試料の量は任意に定
めることができるが、好ましくは約５０μｌから約５μ
ノであシ、更に好ましくは約２０μノから約５μノであ
る。通常約１０μノの流体試料を適用するのが好ましい
。

〔作　用〕

本発明の多層分析要素においては銅キレート化剤に酒石
酸と酒石酸ナトリウムを用いるとともにアルカリに水酸
化リチウムを用いることによって、発色濃度を高めかつ
保存性を良好にしている。そして、酒石酸ナトリウムを
併用することによって親水性を向上させて塗布性を改善
している。これによって積層状態を改善して保存性をさ
らに向上させているものと思われる。このような作用は
酒石酸ナトリウム塩特有のものであシ、カリウム塩ある
いはナトリウムカリウム塩（ロッシェル塩）ではかえっ
て悪化する。

〔実施例〕

実施例１ ビウレット試薬の安定性を試験するために厚さ１７０μ
ｍのポリエチレンテレフタレートフィルム（支持体）上
に本発明の試薬、比較例−１、比較例−２の試薬をアク
リルアミド−Ｎ−ビニルピロリドン共重合体を用い乾燥
後の厚さ４０μ情となるように塗布した。２５℃、６０
％ＲＨ、７日間のアルカリ残存率を１７１００Ｎ塩酸を
用いフェノールフタレインを指示薬として測定した。結
果は表に示す通シ本発明のサンプルの安定性が一番良好
であった。

実施例２ 実施例上で良好なアルカリ保存性を示した本発明例、比
較例−１のビウレット試薬塗布サンプルの上にそれぞれ
の最も好ましい態様で、すなわち本発明例ではポリエス
テル繊維紡績糸（１００番手）からなる厚さ１２０μｍ
の平織布地そして比較例−１では微結晶性セルロースを
１２０μ惧に塗布し分析要素を作成した。次に濃度の異
った牛アルブミン（ＢＳＡ）溶液１０μノを分析要素上
に点着し、３７℃で６分間インキュベーションした後中
心波長５４０　ｎｍで反射濃度を測定した。結果は表に
示すように、本発明の分析要素は比較例−１よυ高感度
であることが認められた。

実施例３ ニトロセルロール下塗シが施されている厚さ１８０１ｖ
ｒｒＬ無色透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）
フィルム上に、下記組成の塗布液を乾燥膜厚が４０μｍ
になるように塗布、乾燐し試薬層とした。

水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
６００μ情　　石　　酸　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１００　ｇ硫酸銅　５水塩　　　　　　　　　
　１５０　ｇ酒石酸ナトリウム　　　　　　　　　　　
　　１５９ＬｉＯＨ−Ｈ２Ｏ２０Ｏｆ！ アクリルアミドービ＝ルビロリドン（１：１）　　　　
　２ｏｏｏ　ｇ共重合物２０％水溶液 次に試薬層に水を湿し水として供給し、湿潤させたのち
、ポリエステル（ＰＥＴ）紡績糸製トリコット編（厚さ
２００μ情）を圧着ラミネートして展開層とした総蛋白
定量用一体型多層分析要素を完成させた。比較例として
試薬層中の酒石酸ナトリウムを添加しない以外は全て同
じ処方で比較サンプルとした。上記サンプルを１５＋ｍ
ｎＸ１５ｍの正方形のチップとしたのち特開昭５７−６
３４５２に開示のプラスチックマウントに収めて総蛋白
定量用化学分析スライドとした。ヒト血清を１０μノス
ライドの展開層上に点着し、３７℃６分間インキーベー
ションしたのち、中心波長５４０　ｎｍの測定光で反射
光学濃度を測定した。測定は１０回繰シ返した。次に濃
度を変えたヒトアルブミン溶液を１０μノ点着し同様の
方法で反射光学濃度を測定して検量線を作成した。

この検量線からヒト血清の発色反射光学濃度を質量変換
しバラツキを調べた。実施例の方が繰返し再現性がすぐ
れていることが明らかである。

〔発明の効果〕

本発明の一体型多層分析要素は保存性が良好で長期間に
わたって測定可能な状態を維持する。また、試薬層の塗
布が容易になって製造しやすく均−な性能の要素を製造
することができる。発色濃度が高いところから測定精度
及び感度が向上する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 少なくとも、水性試料を展開して試薬層に供給する展開
   層と、呈色試薬組成物を含有する試薬層と、光透過性で
   水不透過性の支持体とがこの順に積層されかつ呈色試薬
   組成物として水溶性第二銅塩、銅キレート化剤及びアル
   カリが試薬層に含まれている蛋白分析用一体型多層分析
   要素において、前記アルカリが水酸化リチウムであり、
   前記銅キレート化剤が酒石酸及び酒石酸ナトリウムから
   なることを特徴とする蛋白分析用一体型多層分析要素