JP4157748B2

JP4157748B2 - 酵素標識抗体の保存方法

Info

Publication number: JP4157748B2
Application number: JP2002291320A
Authority: JP
Inventors: 正明寺嶋; 修瀬志本
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2002-10-03
Filing date: 2002-10-03
Publication date: 2008-10-01
Anticipated expiration: 2022-10-03
Also published as: JP2004125666A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素標識抗体の保存方法及びこれに用いる保存用緩衝液に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液や尿などの体液に含まれる生体成分、薬物等の分析は、病態の診断や治療経過の判定に非常に有用であり、臨床検査の分野で重要な役割を果たしている。このような微量成分（リガンド）の分析方法として、酵素免疫分析方法（エンザイムイムノアッセイ）がある。例えば被検物（リガンド）に対する抗体を酵素で標識し、この酵素標識抗体と抗原（リガンド）との結合による酵素活性の低下を検出して、被検物（リガンド）の量を分析する。予め既知量の抗原と反応させて検量線を作成し、この検量線から抗原量を求めることが出来る。ここで使用する酵素標識抗体の活性が不安定なものであれば、分析ごとに検量線を作成する必要がある。
【０００３】
酵素標識抗体などの試薬の保存安定性に優れる分析方法として、いわゆる乾式分析方法がある。いわゆる湿式法（又は溶液法）とは、使用する試薬をまず水性溶媒に溶解して試薬溶液を作り、この試薬溶液を分析試料に加えて生じた呈色反応生成物を比色計で測定するものである。これに対して乾式法は、試薬組成物を乾燥状態で含有させた試験片、分析スライド、分析テープなどの乾式分析要素に、水性試料を直接点着して、要素内で生じた呈色又は変色をそのまま比色測定するものであり、試薬溶液を用いる湿式法に較べ、操作の簡便性、分析の迅速性に優れている。また試薬は準乾燥状態に置かれるので、要素内の酵素標識抗体の活性も安定している。このため、各製造ロットごとに検量線を作成すれば、分析ごとに改めて検量線を作成する必要がない。
【０００４】
しかし、乾式法においても、酵素標識抗体は一度これを作成した後、各ロットの分析要素を製造するまでの間溶液状態で保存される。この保存が長期に及ぶと標識酵素の活性が大きく低下するという問題があった。分析要素の試薬として用いる酵素標識抗体は、その製造前の保存時に酵素活性値の変動が少なく安定して保存できることが望ましい。
【０００５】
従来の保存方法では、標識酵素の活性測定時にばかり注目し、活性測定に適した条件を必要により多少修正したものを保存用緩衝液としていた。その際、酵素活性の長期にわたる安定性については考慮されていなかった。例えば、標識酵素としてアミラーゼを使用する場合には、緩衝液として燐酸緩衝液、トリス緩衝液、グリセロ燐酸緩衝液などを使用し、ｐＨも活性測定時の特性（指摘ｐＨ）にあわせ通常ｐＨ７．０付近で設定していた。またアミラーゼ固有の特性から安定化剤、賦活剤として塩化カルシウム、塩化ナトリウムが添加されていた。従来使用されていたアミラーゼ保存用緩衝液の組成は、アミラーゼの活性化・安定化剤として１０ｍＭ塩化カルシウム、アミラーゼ安定化剤として生理的食塩濃度、すなわち０．８５％の塩化ナトリウム、カルシウムと難溶性の塩を作らない緩衝剤として２０ｍＭグリセロ燐酸（ｐＨ７．０）を含有するものであった。しかし、後記する実施例で説明するように、４℃での冷蔵３ヶ月でアミラーゼ活性は１０％以上低下する。乾式法に用いる分析要素に含有させるためには、酵素標識抗体を合成後３ヶ月という比較的短い期間内で、分析要素製造に使用しなければならないという制約があった。分析要素の材料として用いる酵素標識抗体は、少なくとも１年ぐらいの長期間は安定的に保存できることが望ましい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は以上のような事情に鑑みなされたものであり、安定して長期保存することができる酵素標識抗体の保存方法を提供することが第１の目的とする。また、酵素標識抗体の保存用緩衝液を提供することを第２の目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、保存用緩衝液の各種組成を実験計画法により検討して、標識酵素の活性を損なうことなく安定的に長期保存することができる保存用緩衝液を見出し、本発明を完成したものである。
【０００８】
即ち、本発明によれば、酵素標識抗体を、グッドの暖衝剤と塩化カルシウムと塩化ナトリウムとを含有する緩衝液中で保存することを特徴とする酵素標識抗体の保存方法が提供される。
本発明の別の側面によれば、グッドの緩衝剤と塩化カルシウムと塩化ナトリウムとを含有することを特徴とする酵素標識抗体の保存用緩衝液が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるグッドの緩衝剤は両性イオン緩衝剤であり、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン）、及びＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）から選ばれた少なくとも１つの緩衝剤を用いることができる。この中ではＰＩＰＥＳ緩衝剤が好ましい。好ましくは、緩衝液のｐＨを、６．０〜６．５の範囲とする。
【００１０】
緩衝液中の塩化カルシウム濃度は、好ましくは５〜１５ｍＭの範囲、より好ましくは１０ｍＭである。緩衝液中の塩化ナトリウム濃度は、生理食塩水濃度以上であり、好ましくは０．８５〜１．７％の範囲、より好ましくは約１．７％である。最も好ましい緩衝液の組成は、２０ｍＭＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ塩化カルシウム、１．７％塩化ナトリウムである。
【００１１】
また緩衝液には、保存容器壁に酵素標識抗体が非特異的吸着するのを防止するため、ＢＳＡやブロックエース（雪印乳業（株）製、大日本製薬（株）販売）などのブロッキング剤を添加してもよい。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００１２】
【実施例】
実施例１：酵素標識抗体の合成
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）α−アミラーゼ５ｍｇをｐＨ６．３の０．１Ｍグリセロ燐酸１ｍＬに溶かしＮ−（γ−マレイミドブチリロキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）２ｍｇ／ｍＬのＤＭＦ溶液１００ｍＬを加えて室温で、１時間反応させた。この反応液をセファデックスＧ−２５カラムにアプライして、ｐＨ６．３の０．１Ｍグリセロ燐酸を流して素通り分画を分取、Ｎ−（γ−マレイミドブチリロキシ）アミド化アミラーゼ（ＧＭＢＳ化アミラーゼ）を得た。
【００１３】
抗ＣＲＰ・マウスＩｇＧ１０ｍｇ（０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５））２ｍＬにパパイン３００μｇを加え、３７℃で１８時間撹拌した。０．１ＮのＮａOＨを加えてｐＨを６．０に調節したこの反応液を予め０．１Ｍ燐酸緩衝１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６．３）で緩衝化したＡｃＡ−４４ゲルカラムにアプライし、上記の燐酸緩衝液で溶出した。分子量約１０万付近に溶出されたピーク部分を集めて１ｍＬに濃縮し、目的の抗ＣＲＰ・マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）₂を得た。
【００１４】
調製した抗ＣＲＰ・マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）₂６ｍｇを含む０．１Ｍ燐酸緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡ含有、ｐＨ６．０）１ｍＬに、１０ｍｇ／ｍＬの２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μＬを加え、３７℃で９０分間撹拌した。この反応液を予め０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．３）で緩衝化したセファデックスＧ−２５カラムでゲル濾過して未反応の２−メルカプトエチルアミンを除去し、ＨＳ−Ｆａｂ’を得た。これにＧＭＢＳ化α−アミラーゼ２ｍｇを加え、３７℃で９０分間反応させた。次にこの反応液を０．１Ｍ酢酸緩衝５ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ７．０）で緩衝化したＡｃＡ−３４カラムでゲル濾過して分子量２０万以上の分画を集め、これを濃縮して目的の酵素標識抗体（α−アミラーゼ−抗ＣＲＰ・マウスＩｇＧＦａｂ’結合物）を得た。
【００１５】
実施例２：アミラーゼ活性分析用乾式分析要素の作製
ゼラチン下塗層が設けられている厚さ１８０μｍの無色透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）シート（支持体）上に下記の被覆量になるように架橋剤含有試薬溶液を塗布し、乾燥して試薬層を設けた。
アルカリ処理ゼラチン１４．５ｇ／ｍ²
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール０．２ｇ／ｍ²
（オキシエチレン単位平均９〜１０含有）
グルコースオキシダーゼ５０００ＩＵ／ｍ²
ペルオキシダーゼ１５０００ＩＵ／ｍ²
グルコアミラーゼ５０００ＩＵ／ｍ²
２−（４−ヒドロキシ−３，５−ギメトキシフェニル−４−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−フェネチルイミダゾール（ロイコ色素）酢酸塩０．３８ｇ／ｍ²
ビス［（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］メタン０．１ｇ／ｍ²
【００１６】
この試薬層の上に下記の被覆量になるように接着層水溶液を塗布し、乾燥して設けた。
アルカリ処理ゼラチン１４．５ｇ／ｍ²
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール０．２ｇ／ｍ²
（オキシエチレン単位平均９〜１０含有）
【００１７】
ついで接着層の表面に下記の被覆量になるように下記の試薬含有水溶液を塗布してゼラチン層を膨潤させ、その上に５０デニール相当のＰＥＴ紡績糸３６ゲージ編みした厚さ約２５０μｍのトリコット編物布地をほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層を設けた。
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール０．２ｇ／ｍ²
（オキシエチレン単位平均９〜１０含有）
ビス［（ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］メタン０．１ｇ／ｍ²
【００１８】
次に展開層の上から下記の被覆量になるように基質含有水溶液を塗布し、乾燥して展開層に基質含有試薬を含浸させ、これを基質層とし、アミラーゼ分析用乾式多層分析要素を調製した。
メガファックＦ１４２Ｄ（大日本インキ製）０．１ｇ／ｍ²
（フッ素界面活性剤）
（オキシエチレン単位平均１０含有）
カルボキシルメチル化澱粉４ｇ／ｍ²
マンニトール２ｇ／ｍ²
アミラーゼ阻害剤１００万Ｕ／ｍ²
（富士レビオ製アミラーゼ阻害剤“Ｉ−１００１Ｃ”：特開昭６１−７４５８７）
【００１９】
この分析要素を一辺１５ｍｍの正方形のチップに裁断し、特開昭５７−６３４５２に記載のスライド枠に収めてアミラーゼ分析スライドを作製した。なおここで使用したアミラーゼ阻害剤“Ｉ−１００１Ｃ”は、検体中に含まれることがある同種のアミラーゼに対する阻害剤であって、標識酵素として使用している枯草菌α−アミラーゼの酵素活性は阻害しないものである（特開平０５−１２２１１２、同５−２３２１１２参照）。
【００２０】
実施例３：酵素標識抗体の保存溶液の調製
ＧＰ（グリセロ燐酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）の緩衝剤を用いて、下記の組成の緩衝溶液（保存溶媒）を調製した。なお、いずれの緩衝溶液にもブロッキング剤としてブロックエース（雪印乳業（株）製、大日本製薬（株）販売）を５％となるように含有させた。
【００２１】
【表１】

【００２２】
実施例１で調製した酵素標識抗体の溶液０．１ｍＬを、表１の各緩衝溶液で１０ｍＬに希釈し、これを保存溶液とした。この保存溶液中の酵素標識抗体の希釈倍率１００倍（＝１０ｍＬ／０．０１ｍＬ）倍に設定した理由は後記する。
【００２３】
実施例４：アッセイ時の溶媒効果
実施例１で調製した酵素標識抗体の検量線は以下のように作成した。酵素標識抗体に各保存溶液を加えて１００倍に希釈する。上記希釈液に各保存溶液を加えて２５、８０、１００、１２０、１５０の倍率で希釈する。その１０μＬを、実施例２で作製したアミラーゼ分析スライドに点着する。スライドを３７℃に保って、ＰＥＴ支持体側から６５０ｎｍの反射光学濃度を測定した。点着から１分後および４分後の反射光学濃度の差（△ＯＤ_1-4）を求める。反射光学濃度の差を横軸に、希釈率を縦軸にとりこれを検量線とした。
【００２４】
緩衝液Ｎｏ．１の場合の検量線を図１に示す。縦軸の希釈率は、希釈倍数の逆数である。この検量線において、光学的な測定精度上の理由から△ＯＤ_1-4が０．２〜０．３の範囲で安定なデータを与える。そこで、この安定領域の△ＯＤ_1-4を与える保存溶液中の酵素標識抗体の希釈倍率として、１００倍の値を採用し、前記したように他の各種緩衝液による保存溶液の酵素標識抗体の希釈倍率も１００倍に設定した。
【００２５】
上記理由から、本実施例においては、△ＯＤ_1-4が０．２３０となる希釈率の逆数（希釈倍率）を比活性とした。（表２）。
【００２６】
【表２】

【００２７】
表２から、溶媒Ｎｏ．６がもっとも高いアミラーゼ活性を示すことが分かる。ここでは、さらに実験計画法により溶媒中の各因子の最適な組合せを検討した。例えば表３の（１）は緩衝剤の要因効果を調べたものであり、緩衝剤ＧＰを用いた溶媒Ｎｏ．１，２，３での活性比の値の平均値、緩衝剤ＰＩＰＥＳを用いた溶媒Ｎｏ．４，５，６での活性比の値の平均値、緩衝剤ＭＥＳを用いた溶媒Ｎｏ．７，８，９での活性比の値の平均値を比較したものである。同様に表３の（２）、（３）、（４）はそれぞれ、ｐＨ、ＣａＣｌ₂、ＮａＣｌの要因効果を示す。
【００２８】
【表３】

【００２９】
以上から、酵素標識抗体のアッセイ時に、最も高い活性比を示す溶媒組成は、２０ｍＭＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．０，１０ｍＭＣａＣｌ₂、０％ＮａＣｌであった。この組成比の緩衝液を以下の実施例のアッセイ時に用いた。
【００３０】
実施例５：加速試験による保存安定性試験
実施例１で調製した酵素標識抗体を各保存溶液に１：１００の割合で溶解した。酵素標識抗体を溶解した各保存溶液について、段落番号００２３に示す方法でアミラーゼ分析スライドを用いて検量線を作成した。各検量線から△ＯＤ_1-4が０．２３０になる希釈率を求め、その逆数を０日目における比活性とした。４℃、２５℃、４５℃の温度条件下、８日間経時した後、再び上記希釈率を求め、その逆数を経時後の比活性とした。０日目における比活性に対する経時後の比活性の割合を残存活性比として求めた。結果を表４に示す。
【００３１】
【表４】

【００３２】
各要因による経時保存安定性への効果を検討した。結果を表５に示す。表５にまとめた結果は、表４における各要因（緩衝剤の種類、ｐＨなど）ごとに各要因を含むデータの平均値を示したものである。
【００３３】
【表５】

【００３４】
表５より、各緩衝剤による保存安定性に対する効果は、
４℃での経時保存では、ＧＰ＜ＰＩＰＥＳ＜ＭＥＳの順で
２５℃での経時保存では、ＧＰ＜ＭＥＳ＜ＰＩＰＥＳの順、
４５℃経時保存では、ＧＰ＜ＭＥＳ＜ＰＩＰＥＳの順、
であった。従って、これら緩衝剤の中では、ＰＩＰＥＳが長期保存にもっとも適していることが分かった。
【００３５】
ｐＨについては、どの保存温度においても、ｐＨ６が最も優れていた。塩化カルシウムについては、４℃保存では濃度２０ｍＭとした場合が優れていたが、２５℃、４５℃保存では濃度１０ｍＭとする方が優れていた。加速試験の結果から長期保存には、１０ｍＭＣａＣｌ₂とするのがよいことが分かった。塩化ナトリウムについては、いずれの保存温度においてもこれを含有させた方が残存活性が大きくなり、保存溶液中の濃度を１．７％ＮａＣｌとした場合の残存活性が大きくなった。
【００３６】
以上の結果から、酵素標識抗体の長期保存には、２０ｍＭＰＩＰＥＳ，ｐＨ６．０，１０ｍＭＣａＣｌ₂，１．７％ＮａＣｌの組成の緩衝液が優れていることが推定できた。
【００３７】
実施例６：最適組成緩衝液による長期保存安定性
実施例１の酵素標識抗体を、実施例５で求めた最適組成緩衝液（２０ｍＭＰＩＰＥＳ，ｐＨ６．０，１０ｍＭＣａＣｌ₂，１．７％ＮａＣｌ）に溶解し蛋白濃度１．４ｍｇ／ｍＬ（Ａ₂₈₀≒２．３０、アミラーゼ活性で約１８，０００Ｕ／Ｌ）の保存溶液を調製した。比較例として従来から保存用緩衝液として使用されている２０ｍＭグリセロ燐酸、１０ｍＭＣａＣｌ₂、０．８５％ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で、酵素標識抗体を同濃度で調整し、比較例の保存溶液とした。これらを４℃にて長期保存した。
【００３８】
経時保存後のアミラーゼ活性は、不溶性青色澱粉を基質として用いる溶液法により行った。ネオ・アミラーゼテスト「第一」（第一化学薬品製）の錠剤２４錠（１錠当たり、４５ｍｇ不溶性青色澱粉、３ｍｇＢＳＡ含有）を、９６ｍＬの５０ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で懸濁し青色澱粉懸濁液を調製した。経時保存後の各保存溶液を、実施例４で求めた組成のアッセイ用緩衝液（２０ｍＭＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．０，１０ｍＭＣａＣｌ₂、０％ＮａＣｌ）で９００倍希釈し、この希釈液１００μＬを１００μＬの１０ｍｇ／ｍＬＢＳＡ溶液（１００ｍＭＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０）に加えた。これに青色澱粉懸濁液２ｍＬを加え、３７℃で１時間反応させた。１ｍＬの０．５ＭＮａ₂ＣＯ₃緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて反応を停止させ、これを３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を得た。酵素反応により上清中に可溶化した青色色素量を６２０ｎｍにおける吸光度測定により測定した。既知濃度のアミラーゼ溶液を用いて予め作成した検量線より各保存溶液中のアミラーゼ活性を求め、経時保存前の保存溶液のアミラーゼ活性に対する活性比（％）を求めた。
【００３９】
図２に示すように、従来の緩衝液を用いた比較例の保存溶液では、４０日保存により残存活性は８０％まで低下し、以降の保存には耐えられなかった。これに対し実施例の保存溶液では、最長５１５日間の保存後も約１００％の残存活性を示し、優れた保存安定性を有することが示された。
【００４０】
【発明の効果】
以上のよう本発明では、酵素標識抗体をグッドの緩衝剤と塩化カルシウムと塩化ナトリウムとを含有する緩衝液中で保存する。特に好ましい緩衝液組成は、２０ｍＭＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ塩化カルシウム、１．７％塩化ナトリウムである。溶液状態でも標識酵素の活性をきわめて安定な状態に置くことができ、長期保存に適する。通常の溶液法に使用する試薬として酵素標識抗体を保存する場合にも適する。乾式分析要素に含有させる酵素標識抗体としてこれを一度製造後、分析要素製造時までの長期保存させる場合にも適し、この場合には分析要素の製造ロットごとの分析値のばらつきを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４において、保存用緩衝液Ｎｏ．１をアッセイ用緩衝液として用いた場合の検量線を示す図である。
【図２】実施例６における長期経時保存した場合の各保存溶液中の残存活性を示す図である。

Claims

アミラーゼ標識抗体を、グッドの暖衝剤と塩化カルシウムと塩化ナトリウムとを含有する緩衝液中で保存することを特徴とするアミラーゼ標識抗体の保存方法において、
前記グッドの緩衝剤は、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）又は２−モルホリノエタンスルホン酸であり、前記緩衝液のｐＨは６．０〜６．５であり、
前記緩衝液中の塩化カルシウム濃度が５〜１５ｍＭの範囲にあり、
前記緩衝液中の塩化ナトリウム濃度が０．８５〜１．７％の範囲にある、保存方法。
前記緩衝液中の塩化カルシウム濃度が１０ｍＭである請求項１に記載の保存方法。
前記緩衝液中の塩化ナトリウム濃度が１．７％である請求項１に記載の保存方法。
前記グッドの緩衝剤は、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）である請求項１〜３に記載の保存方法。
グッドの緩衝剤と塩化カルシウムと塩化ナトリウムとを含有することを特徴とするアミラーゼ標識抗体の保存用緩衝液において、
前記グッドの緩衝剤は、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）又は２−モルホリノエタンスルホン酸であり、前記緩衝液のｐＨは６．０〜６．５であり、
前記緩衝液中の塩化カルシウム濃度が５〜１５ｍＭの範囲にあり、
前記緩衝液中の塩化ナトリウム濃度が０．８５〜１．７％の範囲にある、緩衝液。
塩化カルシウム濃度が１０ｍＭである請求項５に記載の緩衝液。
塩化ナトリウム濃度が１．７％である請求項５に記載の緩衝液。
前記グッドの緩衝剤は、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）である請求項５〜７に記載の緩衝液。
２０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ’−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ塩化カルシウム、１．７％塩化ナトリウムを含有することを特徴とする請求項５記載の緩衝液。