JPH0630634B2 - 下塗り帯域に緩衝剤を使用するテオフィリン測定用分析要素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床化学に関し、そして生物学的流体中のテオ
フィリンの測定用乾式分析要素に関する。

〔従来の技術〕

テオフィリンは、喘息および肺性疾患の処置のためにし
ばしば投与される薬剤である。この薬剤をひどい副作用
を伴うことなく成功裏に使用するためには、テオフィリ
ンが使用の比較的狭い療法範囲（すあわち、１〜２mg／
dl）を有するので患者内のそれを頻繁に注意深くモニタ
ーしなければならない。

ヒト血清中のテオフィリン量を測定するために数多くの
技法が使用されてきた。これら技法の殆んどは重大な欠
点を有する。例えば、既知の分光光度法は、大量の試料
および広範囲にわたる前処理を要し、そして類似構造の
キサンチン類（例えば、カフェイン、およびテオブロミ
ン）による妨害を受ける。既知のガスクロマトグラフ法
は、より特異的であるが、誘導体化が必要であり時間が
かかる。

非放射性イムノアッセイは、迅速に結果を与えそして使
用が簡単であることから最も頻繁に使用されている。一
般的には、イムノアッセイ法により十分な感度が得られ
るものの、患者の腎臓の状態およびアッセイで使用され
る抗体の特異性に応じて非常に高い結果を示す可能性を
有することが最近見い出された。さらに、イムノアッセ
イは安定性が限定された一般に高価な試薬を使用するこ
とが必要である。

高性能液体クロマトグラフィー技法も知られている。こ
れらの技法は試験試料の前処理を行うか否かによって特
異性が異なる。アッセイの精度と特異性を改良するには
有機抽出工程が必要である。多くのクロマトグラフィー
的方法は、幾つかの通常の抗生物質を含む多数の物質に
より妨害を受ける可能性がある。他の短所にはアッセイ
を実施する上で高価な機器および専門的な技術スタッフ
の必要性が含まれる。

テオフィリンは、アルカリホスファターゼ活性に対する
その阻害作用を測定することにより定量できることが知
られている。しかしながら、この方法でヒトの生物学的
流体をアッセイする場合には、内因性アルカリホスファ
ターゼがアッセイに影響を及ぼす可能性があり、低い側
に不正確な結果を示す可能性がある。この課題を解決す
るには、アッセイに先立ってなんらかの方法で内因性ア
ルカリホスファターゼを失活または除去しなければなら
ない。

特開昭63-71198号公報には、アルカリホスファターゼに
関するアイソザイムとアッセイ期間を通じてpH９以下に
持続するための緩衝剤を有する要素が記載されている。
実質的にすべての緩衝剤は展開（前記公報では拡散）層
に配置されている。要素の下塗り層には全く緩衝剤を含
まない。

〔発明が解決しようとする課題〕 前記要素は、内因性アルカリホスファターゼが低減した
作用を示すテオフィリン用の簡便で迅速なアッセイを提
供するとはいえ、それが限定された範囲のものでありか
つ著しく偏った(bias)アルカリホスファターゼを有す
る。

〔課題を解決するための手段〕

前述の課題は、流体と接触する多孔質展開帯域、下塗り
帯域および少なくとも１個の追加の帯域を含んでなるテ
オフィリン測定用乾式分析要素であって、pH９以下でア
ルカリホスファターゼのアイソザイムに対する基質に作
用することができる前記アイソザイムおよび前記アイソ
ザイムに対する基質を含み、供給されたこれらのアイソ
ザイムと基質が前記要素の相違する帯域に存在し、かつ
前記下塗り帯域がポリビニルピロリドンおよび測定期間
を通じてpH９以下に持続することができる緩衝剤を含む
ことを特徴とする要素により改良される。

本発明は、前述の特開昭63-71198号公報で特許請求さ
れ、記載されているアッセイ要素の全ての利点を有する
テオフィリン用の簡便かつ迅速なアッセイを提供する。

これらの改良は、驚くべきことにその要素の下塗り帯域
に緩衝剤とポリビニルピロリドンを置くことにより達成
された。

本発明は、生物学的流体、特にヒトの生物学的流体中の
テオフィリンの測定に関する。本明細書で使用する「測
定」とは、試験試料中のテオフィリン量の定量的または
定性的測定をいう。特に本発明は、内因性アルカリホス
ファターゼ酵素産生物（例えば、肝臓、腸、胎盤または
骨）のいずれかのアルカリホスファターゼ（すなわち、
天然酵素）を含むヒトの生物学的流体中のテオフィリン
を測定するために使用することができる。例えば、本発
明は血清、全血、血漿、髄液、喀痰、胆汁、唾液および
その他の生物学的流体をアッセイするために有利に使用
することができる。また、本発明を使用してヒトの骨格
筋、腎臓、胎盤、心臓、腸、肺または他の組織のような
組織の流動性調製物をアッセイすることも可能である。
本発明の実施に際して使用される好ましい生物学的流体
は、ヒト血清および全血である。

本発明の実施においては、検出可能な反応生成物を生ず
る各種の基質に作用し得る酵素、アルカリホスファター
ゼ活性を阻害することによりテオフィリンを測定可能で
ある。例えば、次の代表的な式は、典型的な基質（ｐ−
ニトロフェニルホスフェート）を使用するアルカリホス
ファターゼ作用による検出可能な色素の生成を示す： 次に、その色素を適当な分光光度的検出装置を用いて比
色的に検出することができる。最終反応物中に存在する
テオフィリン量は、測定される色素量に逆比例する。

本発明は、pH９以下、好ましくはpH７〜９で実施され
る。特開昭61-170400号公報に記載されるように、ヒト
の液体中の内因性アルカリホスファターゼはpH９以下で
活性が減少する。しかしながら、pH９以下の環境下で失
活しないアルカリホスファターゼの他のアイソザイム
は、テオフィリンの存在を表示するアッセイに使用する
こともできる。所期の性質（すなわち、pH９以下で活性
が測定可能）を有するいずれかの適当な起源に由来する
全てのアイソザイムが、本発明を実施するに際して利用
可能である。特に有用なアイソザイムとしては、ウシ起
源（例えば畜牛または子牛の肝臓のような組織または器
官）より得られるものが挙げられる。各種他の起源（例
えば、微生物、鳥類および非ヒト哺乳類源）に由来する
アイソザイムも有用である。本発明の実施に際して利用
し得るであろうアイソザイムを見い出すことは、臨床化
学分野の当業者の技術水準内に十分入る。

本発明を実施する上で、１種以上の各種アルカリホスフ
ァターゼ基質を使用することができる。この基質は、前
記アイソザイムとの酵素反応により直接検出可能な変化
が生ずるようなものでなければならない。例えば、基質
は１種以上の検出可能な反応生成物、例えば色原体、螢
光助剤、放射性標識種および他の適当な検出可能生成物
が転化される。アッセイを介して測定される検出可能な
変化は、前述のような検出可能な生成物の出現もしくは
消失、またはある検出可能な生成物の他のものへの変化
であってもよい。また一方、検出可能な変化は、基質に
対するアイソザイムの作用により開始される一連の反応
を介してもたらされるものであってもよい。例えば、基
質にアルカリホスファターゼが作用して、他の酵素また
は１種以上の反応に使用される試薬を放出し、次いで検
出可能な生成物を生成することもできる。検出可能な生
成物は、直接測定可能であるか、または測定のために何
等かの物理的分離もしくは処理を要してもよい。

本発明の態様では、アッセイが酵素反応の検出可能な生
成物として色原体または螢光助剤を供給する。一般に、
このような反応で利用される基質は、酵素反応により基
質分子から開裂されるリン酸基を有する。このような基
質としては、有機モノリン酸エステル、有機ジリン酸エ
ステルまたはそれらの塩が挙げられる。特に有用な基質
の例には、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、フェノー
ルフタレインモノホスフェート、フェノールフタレイン
ジホスフェート、チモールフタレインモノホスフェー
ト、インドキシルホスフェート、フェニルホスフェー
ト、α−ナフトールホスフェート、β−ナフトールホス
フェート、α−グリセロールホスフェート、ｏ−メチル
フルオレセインホスフェート、ｏ−カルボキシフェニル
ホスフェート、それらのアルカリ金属塩ならびに、例え
ば米国特許第3,425,912号明細書およびヨーロッパ特許
公開第61,731号公報において当該技術分野で既知の他の
ものが含まれる。好ましい基質は、ｐ−ニトロフェニル
ホスフェートおよび４−（４−ニトロ−２−メチルスル
ホニルフエニルアゾ）ナフトール−１−ホスフェートで
ある。

アイソザイムと基質は、液体試験試料と接触されるま
で、要素の別々の帯域に分離し続けねばならない。要素
中のアイソザイムおよび基質量は、広範に変えることが
できる。一般に、要素は、アイソザイムを少なくとも10
I.U.／m²含む。ある態様では、アイソザイムが少なくと
も100I.U.／m²の塗布量、好ましくは125〜200I.U.／m²
の塗布量で存在する。この態様は本出願人の出願である
特開昭63-79600号公報に記載され、特許請求されてい
る。本明細書の記載に関して、「I.U.」は、アイソザイム
に対する標準的なpHおよび温度条件下で、１分当たり基
質１マイクロモルの転化を触媒するのに必要とされるア
イソザイム活性量を有するものを1I.U.と定義した。

酵素に対する基質は、一般に１〜５ｇ／m²、好ましくは
２〜４ｇ／m²の量で存在する。当業者の常識の範囲内の
量で他の添加剤を要素に組み込んでもよい。

本アッセイは、pH９以下、好ましくはpH７〜９で実施さ
れる。本発明の実施に際しては、アッセイ期間を通じて
pHを９以下に持続し得るものであればいかなる適当な緩
衝剤または緩衝剤混合物をも使用することができる。特
に有用な緩衝剤としては、当該技術分野で標準とされる
多くの窒素含有有機緩衝剤〔例えば、Goodら、Biochem,
5(2),1966,467〜477頁、参照〕が挙げられる。限定さ
れるものではないが、代表的な緩衝剤としては、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノエタン・塩酸、グリシルグ
リシル、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−メチル−２
−アミノエタンスルホン酸、およびＮ−２−ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸からな
る群から選ばれるものが挙げられる。最初に記載した緩
衝剤が最も好ましい。

緩衝剤はまた、本発明の展開帯域または１個以上の他の
帯域、ならびに下塗り帯域に配置することもできる。反
応混合物のpHを所期のpH９以下に持続するために、個々
の緩衝剤に応じて適切な量で下塗り帯域に緩衝剤を存在
させる。これらの緩衝剤量は、当業者により容易に決定
することができるが、一般に最低１ｇ／m²、好ましくは
最低2.5ｇ／m²である。

場合により、他の任意の試薬を要素に添加してもよい。
例えば、金属イオン活性化物質は、アイソザイムを活性
化するために添加することができる。このような活性化
物質は、遊離または塩形（例えば、アスパラギン酸塩、
酢酸塩、塩化物または硫酸化物）で入手できる２価のカ
チオン、例えばMg⁺⁺，Co⁺⁺，Mn⁺⁺，Ca⁺⁺，Zn⁺⁺，Sr⁺⁺お
よびFe⁺⁺を含む。また、試験試料中の内因性アルカリホ
スファターゼ水準が異常に高い場合には、酵素活性阻害
剤を使用してもよい。利用可能な阻害剤としては、フェ
ニルアラニンおよびテトラミゾール(tetramisole)が挙
げられる。このような阻害剤は一定の非ヒトアルカリホ
スファターゼアイソザイム活性に影響を及ぼさないもの
が有利である。

さらに、リン酸エステル基質が使用される場合には、酵
素反応速度を高めるため要素に１種以上のリン酸受容体
を含めることが好ましい。有用なリン酸受容体には、ア
ミノアルコールまたはその誘導体、あるいは特に利用可
能なアミノアルコールを有するアミン類が含まれる。こ
のような化合物の例は、当該技術分野で周知である。

グリセリンまたは他の保湿剤を要素の１個以上の帯域に
添加して要素のカールを減少させることもできる。

要素は、下塗り帯域、多孔質展開帯域を含む少なくとも
３種の帯域に分割され、アイソザイムと基質は別個の帯
域に組み込まれる。これらの帯域は分離層または単一層
の限定分画であることができる。それらは同一または種
々の材料からなり、積層化または他の標準的技法により
一体化されていてもよい。

要素のそれぞれの帯域は、自立性、すなわちそれらの保
全性を維持するのに十分な強度の材料から構成すること
ができる。好ましくは、これらの帯域は支持体上に保持
される。このような支持体は、いずれかの適当な寸法安
定性を有し、好ましくは波長200〜900nmの電磁波線を透
過する透明（すなわち、輻射線透過性）物質である。特
定要素用として具体的に選ぶ支持体は、意図する検出様
式（反射または透過分光分析法）に適合しなければなら
ない。利用し得る支持体材料としては、紙、金属ホイ
ル、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、
セルロースエステルおよび当該技術分野で既知の他のも
のが挙げられる。

下塗り帯域は、イソプロピルアルコール、緩衝剤〔例え
ば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・HCl〕
およびポリビニルピロリドンを混練器に添加し、室温で
72時間混練して調製する。これは緩衝剤とポリビニルピ
ロリドンのみを含む。

多孔質展開帯域は、いずれかの適当な繊維性もしくは非
繊維性材料またはそれら両者の混合物から調製すること
ができる。この帯域の排除容積および平均細孔サイズ
は、使用目的に応じて変えることができる。例えば、高
分子量物質を含有する全血または他の液体試料をアッセ
イする場合は、その排除容積および平均細孔サイズは血
清または尿がアッセイされるものより一般的に大きい。

有用な展開帯域は、米国特許第4,292,272号明細書に記
載されるように適当なバインダー材料と混合するか、ま
たは織布に織った繊維性材料を使用して調製することが
できる。別法として、好ましくは、米国特許第3,992,15
8号、同4,258,001号および同4,430,436号明細書ならび
に特開昭57−101760号公報に記載されるようなポリマー
組成物（例えば、ブラッシングポリマー）または特殊な
材料から展開帯域は調製される。展開帯域は、等方性の
多孔質（多孔度が、連続空隙または粒子間、繊維間もし
くはポリマーストランド間の細孔からもたらされる帯域
における各方向で同一であることを意味する）であるこ
とが好ましい。

最も好ましくは、多孔質展開帯域は前記米国特許第3,99
2,158号明細書に記載されるようなブラッシングポリマ
ーと同様に調製される。

本発明の要素は、前述のように３種の必須帯域を有す
る。良好な効果を上げるために要素へ含ませ得る他の帯
域は、当該技術分野で知られているものと同様な試薬帯
域または記録帯域である。要素は、限定されるものでは
ないが、追加の展開帯域、輻射線遮断または輻射線濾過
帯域、もう一つの下塗り帯域または障害帯域を含む他の
帯域を有することもできる。好ましくは、すべての下塗
り帯域は２つの必須帯域間に配置される。下塗り帯域
は、アッセイに先立ってアイソザイムと基質が相互作用
しないことを確実にするのに役立つ。要素中の全ての帯
域は、一般に流体と相互に接触する〔液体、試薬および
反応生成物（例えば、発色色素）が隣接帯域の重なった
領域間を通過または輸送することができることを意味す
る〕。好ましくは、２種以上の帯域が単一層に存在する
としても、前記帯域は個別に塗布された層である。前述
の引例のほかにも、例えば米国特許第4,042,335号、同
4,132,528号および同4,144,306号明細書にも適当な要素
成分が記載されている。

本発明の好ましい態様は、順番に流体と接触する、本明
細書に記載したアイソザイムを含有する層、輻射線遮断
層、緩衝剤とポリビニルピロリドンを含有する下塗り層
およびアイソザイムに対する基質とさらに緩衝剤を含む
多孔質展開層を支持体上に有する支持体からなる要素で
ある。アイソザイム層は多孔質展開層であってもよい
が、好ましくは、１種以上の親水性バインダー（例え
ば、ゼラチン、ビニルピロリドンポリマーまたはアクリ
ルアミドポリマー）、界面活性剤、媒染剤および他の添
加剤を含有する試薬層または記録層である。下塗り層
は、当業者に既知の１種以上の下塗り材料（例えばビニ
ルピロリドンポリマー、アクリルアミドポリマーおよび
当該技術分野で既知の他のもの）を含むことができる。
輻射線遮断層は、一般に、当該技術分野で知られている
１種以上のバインダー、界面活性剤および反射材料を含
む。

場合により、この好ましい態様の要素は、また、要素の
最外層に、一般に、第一多孔質展開層と隣接する第二多
孔質展開層を含んでいてもよい。第二多孔質展開層は、
アイソザイム基質を含有する第一多孔質展開層中のもの
と同一または相異する材料から構成することができる。
例えば、緩衝剤を含有する第一展開層は、前述の米国特
許第3,992,158号明細書に従って調製されるブラッシン
グポリマーを含むことができ、第二展開層は前述したよ
うな粒状材料から構成されていてもよい。この第二展開
層は、必要により緩衝剤を含んでいてもよい。

本発明に従い、アッセイ方法に応じた多種多様な要素を
調製することができる。要素は、いずれかの好ましい幅
を有する延伸テープ、シート、スライドまたはチップを
含む各種の形状に構成することができる。

本発明のアッセイは、手動であってもまたは自動的であ
ってもよい。一般に、乾式要素を使用するに際し、テオ
フィリン測定は供給ロール、チップパケットまたは他の
供給源から要素を取り出し、それを試験される液体試料
（例えば、200μｌ未満）と物理的に接触させることに
より行われる。このような接触は、いずれかの適当な手
段、例えば要素を試料中に軽く浸すかまたは浸漬するこ
とによるか、あるいは好ましくは適当な分注器を用いて
試料の液滴を手または機械により要素にスポットするこ
とにより遂行することができる。

試料を適用した後、要素をコンディショニング（例え
ば、インキュベーションまたは加熱）して試験結果の入
手を早めるか加速することが好ましいであろう。

次に、要素中に存在するアルカリホスファターゼは、試
料中のテオフィリンにより阻害されないアルカリホスフ
ァターゼ量に応じた速度で基質の反応を促進する。反応
生成物の形成に帰因する検出可能な変化（例えば、色素
生成）速度は、反射または透過分光光度測定用の適当な
機器を使用して定量可能である。適当な分光光度測定機
器および操作は当該技術分野で知られている。他の適当
な検出手段には、螢光分光光度法、ラジオメトリーまた
は酵素標識法が含まれる。テオフィリン量は、測定され
た反応速度に逆比例する。

例えば、基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを
使用する場合には、非阻害酵素反応生成物ｐ−ニトロフ
ェノールが標準的な分光光度計を使用して400nmで測定
できる。次に、着色の変化速度は基質の反応速度に直接
関連し、次いで試料中のテオフィリン濃度に間接的に関
連する。

〔実施例〕本発明の要素は、次の形式および成分を含有
するように調製した。

対照要素は、緩衝剤濃度およびアルカリホスファターゼ
アイソザイムを展開層中に緩衝剤と一緒に含めたこと以
外は前記ヨーロッパ特許出願第87301497.5号明細書に記
載されるものと同一である。

アッセイの速度範囲(rate range)およびアルカリホスフ
ァターゼの偏差(bias)は、各要素上に各種濃度（40μｇ
／mlまで）のテオフィリン含有血清をスポットし、次い
でレートアナライザー(rate analyzer)を使用して７分
経過後の反射濃度を測定することにより評価した。結果
を第１表に示す。大きい範囲は、テオフィリン測定にお
ける優れた感度を示す。本発明の要素は、対照要素に対
して統計的に有意な範囲の増大を示した。

試験 展開層（ＳＬ）から下塗り層へのトリス〔トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン〕(Tris)の輸送 Trisを展開層に含めたものに比べ下塗り層に含めたもの
の利点： 増大範囲−ＳＬに代え下塗り層をTrisで塗布する場合に
は、３種の層（第Ｉ表）のＰＶＰ濃度に応じて塗布範囲
を５から10％に増大させた。下塗り層中のＰＶＰ濃度が
100mg／ft²に減少したとき、塗布範囲は対照塗布の５％
まで減少する。ＰＶＰの濃度が300mg／ft²に増大したと
き、塗布範囲は対照を10％陵駕することになる。

アルカリホスファターゼ偏差−一対の液体にテオフィリ
ン18.5ｇ／mlを加え、さらにその液体の１つにアルカリ
ホスファターゼ1000Ｕ／mlを加えた。これらの液体を、
下塗り層中にTrisおよび各濃度のＰＶＡを有するテオフ
ィリン塗布物上にスポットした場合には、ＰＶＰ量の減
少につれてアルカリホスファターゼ偏差が減少した（第
Ｉ表）。最大減少率（４３％）は、下塗り層にPVP 100m
g／ft²とTris 500mg／ft²を含む塗布により観察され
た。

保存性の改良 すべての塗布物を、15％かまたは50％に調節した湿度下
で25℃に２週間持続した。予測されるテオフィリン濃度
の平均偏差を、26℃に持続した類似の塗布物に対する前
記塗布物の応答の比較により決定した。一般に、展開層
にのみTrisを有する対照塗布物に比べ、各温度−湿度の
組み合わせに関して、下塗り層のTris濃度を固定してＰ
ＶＰ濃度を減少させるとその減少に伴って偏差は減少す
る。さらに、偏差は低い湿度（15％）水準で一層低くな
った。下塗り層中にTrisとＰＶＰを有する塗布物は、対
照の塗布物に比較して、すべての湿度水準でも最も低い
偏差値を有していた（第IIおよびIII表）。

〔発明の効果〕 本発明の要素は、著しく改良された範囲、アルカリホス
ファターゼ偏差および安定性を有する。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】流体と接触する多孔質展開帯域、下塗り帯
   域および少なくとも１個の追加の帯域を含んでなるテオ
   フィリン測定用乾式分析要素であって、pH９以下でアル
   カリホスファターゼのアイソザイムに対する基質に作用
   することができる前記アイソザイムおよび前記アイソザ
   イムに対する基質を含み、供給されたこれらのアイソザ
   イムと基質が前記要素の相違する帯域に存在し、かつ前
   記下塗り帯域がポリビニルピロリドンおよび測定期間を
   通じて、pH９以下に持続することができる緩衝剤を含む
   ことを特徴とする要素。
2. 【請求項２】順番に流体と接触する、 （ａ）緩衝剤およびpH９以下で基質に作用することがで
   きるアルカリホスファターゼのアイソザイムに対する基
   質を含む多孔質展開層、 （ｂ）下塗り層、 （ｃ）pH９以下でアルカリホスファターゼのアイソザイ
   ムに対する基質に作用することができる前記アイソザイ
   ムを含む試薬層、ならびに （ｄ）輻射線遮断層を支持体上に有する支持体を含んで
   なり、前記下塗り層がポリビニルピロリドンおよび測定
   期間を通じてpH９以下に持続することができる緩衝剤を
   含むことを特徴とするテオフィリン測定用分析要素。