JPH0646896A - 前立腺酸性ホスファターゼの検出用の乾式分析要素および検出方法 - Google Patents
前立腺酸性ホスファターゼの検出用の乾式分析要素および検出方法Info
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- JPH0646896A JPH0646896A JP5115512A JP11551293A JPH0646896A JP H0646896 A JPH0646896 A JP H0646896A JP 5115512 A JP5115512 A JP 5115512A JP 11551293 A JP11551293 A JP 11551293A JP H0646896 A JPH0646896 A JP H0646896A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/30—Naphthol derivatives, e.g. alpha-naphthyl-esters, i.e. alpha-NE, beta-naphthyl-esters, i.e. beta-NE
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- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/70—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases the product, e.g. phenol, naphthol being diazotised in situ, e.g. with Fast Red
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は 3〜6.5 のpHでの前立腺酸性ホスフ
ァターゼのアッセイ用の乾式分析要素を提供することを
目的とする。 【構成】 本発明の要素は単一多孔質展開区画または多
層構造であることができる。該要素の内部に、フェノー
ル反応生成物を生じる分析物のための比較的非吸湿性の
芳香族リン酸エステル基質がある。この反応生成物が、
同じく該要素中にあるジアゾニウムまたはテトラゾリウ
ム塩と反応して検出用の発色団を生成する。該要素中の
緩衝剤が該要素をアッセイの間適切なpHに維持する。
ァターゼのアッセイ用の乾式分析要素を提供することを
目的とする。 【構成】 本発明の要素は単一多孔質展開区画または多
層構造であることができる。該要素の内部に、フェノー
ル反応生成物を生じる分析物のための比較的非吸湿性の
芳香族リン酸エステル基質がある。この反応生成物が、
同じく該要素中にあるジアゾニウムまたはテトラゾリウ
ム塩と反応して検出用の発色団を生成する。該要素中の
緩衝剤が該要素をアッセイの間適切なpHに維持する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は臨床化学に関する。より
詳細には、水性被検体、例えば生物学的流体中の前立腺
酸性ホスファターゼの検出用の乾式分析要素および検出
方法に関する。
詳細には、水性被検体、例えば生物学的流体中の前立腺
酸性ホスファターゼの検出用の乾式分析要素および検出
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）
は、オルトリン酸モノエステルホスホヒドロラーゼ、酸
性最適、E.C. 3.1.3.2. としても知られており、そして
前立腺中に通常見つかる100,000 ダルトンの分子量の糖
タンパク質である。それは精液の主成分である。それは
血清中にも低レベルで存在し、通常は人体中の様々な組
織により与えられる酵素の混合物である。
は、オルトリン酸モノエステルホスホヒドロラーゼ、酸
性最適、E.C. 3.1.3.2. としても知られており、そして
前立腺中に通常見つかる100,000 ダルトンの分子量の糖
タンパク質である。それは精液の主成分である。それは
血清中にも低レベルで存在し、通常は人体中の様々な組
織により与えられる酵素の混合物である。
【０００３】ＰＡＰについてのアッセイは、前立腺の転
移癌または前立腺肥大が存在すると血清酸性ホスファタ
ーゼ活性が増加した状態になることが発見されてから、
数十年前に重要になり始めた。よって、体液中のＰＡＰ
の量の測定は、そのような病気の診断およびそれらの進
行または緩解の観察に利用することができる。免疫学的
および非免疫学的技術並びに種々の酵素基質および色素
を使った様々な分光光度アッセイが開発されている。典
型的には、発色団（例えば色素）の生成の量または速度
からＰＡＰが評価される。発色団は、酸性環境における
例えばジアゾニウム色素とリン酸モノエステルの酵素的
加水分解から生じるフェノールとのカップリング生成物
である。
移癌または前立腺肥大が存在すると血清酸性ホスファタ
ーゼ活性が増加した状態になることが発見されてから、
数十年前に重要になり始めた。よって、体液中のＰＡＰ
の量の測定は、そのような病気の診断およびそれらの進
行または緩解の観察に利用することができる。免疫学的
および非免疫学的技術並びに種々の酵素基質および色素
を使った様々な分光光度アッセイが開発されている。典
型的には、発色団（例えば色素）の生成の量または速度
からＰＡＰが評価される。発色団は、酸性環境における
例えばジアゾニウム色素とリン酸モノエステルの酵素的
加水分解から生じるフェノールとのカップリング生成物
である。
【０００４】代表的な初期のＰＡＰアッセイは米国特許
第 3,002,893号明細書に記載されている。Babson他によ
りAm. J. Clin. Pathol., 32, 88-91 頁(1959)に記載さ
れた別のアッセイは、ブランクを実施する必要性、速度
論的結果を欠くこと、および乾式アッセイを組み立てる
際の難しさといった多数の欠点を有する。
第 3,002,893号明細書に記載されている。Babson他によ
りAm. J. Clin. Pathol., 32, 88-91 頁(1959)に記載さ
れた別のアッセイは、ブランクを実施する必要性、速度
論的結果を欠くこと、および乾式アッセイを組み立てる
際の難しさといった多数の欠点を有する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】様々なリン酸エステル
基質を使った他のアッセイが開発されているが、低感
度、試薬の不安定性または分析物に対する非特異性に悩
んでいる。最も困難な課題は、乾式要素中の、使用前に
長期間貯蔵される種々の試薬の不安定性である。例え
ば、ＰＡＰ基質のナトリウム塩は一定期間の間貯蔵する
と不安定である。
基質を使った他のアッセイが開発されているが、低感
度、試薬の不安定性または分析物に対する非特異性に悩
んでいる。最も困難な課題は、乾式要素中の、使用前に
長期間貯蔵される種々の試薬の不安定性である。例え
ば、ＰＡＰ基質のナトリウム塩は一定期間の間貯蔵する
と不安定である。
【０００６】多数の重要な利点を提供するであろう乾式
分析要素において実施することができるＰＡＰについて
のアッセイを提供することは非常に望ましい。しかしな
がら、この結果を達成するためには、多数の技術的課題
（前述）を解決することが必要である。
分析要素において実施することができるＰＡＰについて
のアッセイを提供することは非常に望ましい。しかしな
がら、この結果を達成するためには、多数の技術的課題
（前述）を解決することが必要である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】既知のアッセイに関する
上述の課題は、水性被検体中の前立腺酸ホスファターゼ
の測定に有用な分析要素であって、(a) 基質として前立
腺酸性ホスファターゼと反応してフェノール反応生成物
を生成する比較的非吸湿性の芳香族リン酸エステルおよ
び(b) 前記フェノール反応生成物と反応して発色団を提
供することができるジアゾニウムまたはテトラゾリウム
塩を含有する多孔質展開区画を含んで成り、水性被検体
と接触した時に該要素を 3〜6.5 のpHに維持する緩衝剤
を更に含んで成る前記分析要素、を使って解決された。
上述の課題は、水性被検体中の前立腺酸ホスファターゼ
の測定に有用な分析要素であって、(a) 基質として前立
腺酸性ホスファターゼと反応してフェノール反応生成物
を生成する比較的非吸湿性の芳香族リン酸エステルおよ
び(b) 前記フェノール反応生成物と反応して発色団を提
供することができるジアゾニウムまたはテトラゾリウム
塩を含有する多孔質展開区画を含んで成り、水性被検体
と接触した時に該要素を 3〜6.5 のpHに維持する緩衝剤
を更に含んで成る前記分析要素、を使って解決された。
【０００８】また本発明は、前立腺酸性ホスファターゼ
の測定方法であって、 Ａ）前立腺酸性ホスファターゼを含むと思われる水性被
検体を上述の分析要素と接触せしめる工程、並びに Ｂ）前記被検体中の前立腺酸性ホスファターゼの存在の
指標として発色団の生成を検出する工程を含んで成る方
法を提供する。
の測定方法であって、 Ａ）前立腺酸性ホスファターゼを含むと思われる水性被
検体を上述の分析要素と接触せしめる工程、並びに Ｂ）前記被検体中の前立腺酸性ホスファターゼの存在の
指標として発色団の生成を検出する工程を含んで成る方
法を提供する。
【０００９】
【具体的な態様】本発明は、ＰＡＰの測定（即ち存在、
量またはその両方の検出）に関する。特に、本発明は、
ＰＡＰを含むと疑われる任意の水性流体、特に生物学的
流体（血清、尿、精液、リンパ液、血漿、全血および脳
脊髄液を包含するがそれに限定されない）をアッセイす
るのに利用することができる。組織の流体調製物、例え
ば前立腺の調製物をアッセイすることも可能である。好
ましくは、本発明を用いてヒトの血清または血漿がアッ
セイされる。
量またはその両方の検出）に関する。特に、本発明は、
ＰＡＰを含むと疑われる任意の水性流体、特に生物学的
流体（血清、尿、精液、リンパ液、血漿、全血および脳
脊髄液を包含するがそれに限定されない）をアッセイす
るのに利用することができる。組織の流体調製物、例え
ば前立腺の調製物をアッセイすることも可能である。好
ましくは、本発明を用いてヒトの血清または血漿がアッ
セイされる。
【００１０】最も広い態様によれば、本発明の乾式要素
は、流体浸透性であって且つＰＡＰの検出に必要な全試
薬を含有する多孔質展開区画（または展開層）を有す
る。任意材料は別の任意（更に好ましい）区画中に存在
することができる。該要素は試験ストリップ、試験スラ
イドまたは診断装置として知られる。
は、流体浸透性であって且つＰＡＰの検出に必要な全試
薬を含有する多孔質展開区画（または展開層）を有す
る。任意材料は別の任意（更に好ましい）区画中に存在
することができる。該要素は試験ストリップ、試験スラ
イドまたは診断装置として知られる。
【００１１】多孔質展開区画は、例えば、米国特許第
4,292,272号, 同第 3,992,158号, 同第 4,258,001号,
同第 4,430,436号明細書および関連米国特許、並びに日
本国特開昭57-101760 に記載されたような区画に使われ
る既知の材料のいずれかを使って調製される。
4,292,272号, 同第 3,992,158号, 同第 4,258,001号,
同第 4,430,436号明細書および関連米国特許、並びに日
本国特開昭57-101760 に記載されたような区画に使われ
る既知の材料のいずれかを使って調製される。
【００１２】好ましくは、該要素は、アッセイに必要な
１または複数の試薬を含有し得る少なくとも１つの別の
区画を有する。そのような区画は、当業界ではしばしば
試薬区画または表示区画として知られているが、所望に
より第二の多孔質展開区画または別の区画の上に置かれ
た印刷層を含むこともできる。
１または複数の試薬を含有し得る少なくとも１つの別の
区画を有する。そのような区画は、当業界ではしばしば
試薬区画または表示区画として知られているが、所望に
より第二の多孔質展開区画または別の区画の上に置かれ
た印刷層を含むこともできる。
【００１３】本発明のアッセイは、 3〜6.5 のpHにおい
て次の反応順序で実施される： (a) 被検体中のＰＡＰを要素中の非吸湿性芳香族リン酸
エステル基質と反応せしめてフェノール反応生成物を提
供し、そして(b) 前記フェノール反応生成物をジアゾニ
ウムまたはテトラゾリウム塩とカップリング（または反
応）せしめて検出可能な発色団を提供する。最適化され
たアッセイでは、工程(a) が該アッセイの律速工程とな
るように工程(a) で使用する試薬の量および条件が調整
される。
て次の反応順序で実施される： (a) 被検体中のＰＡＰを要素中の非吸湿性芳香族リン酸
エステル基質と反応せしめてフェノール反応生成物を提
供し、そして(b) 前記フェノール反応生成物をジアゾニ
ウムまたはテトラゾリウム塩とカップリング（または反
応）せしめて検出可能な発色団を提供する。最適化され
たアッセイでは、工程(a) が該アッセイの律速工程とな
るように工程(a) で使用する試薬の量および条件が調整
される。
【００１４】分析物のための基質は比較的非吸湿性であ
る。該基質は特にナトリウムまたはカリウムカチオンを
有する基質よりも吸湿性が低い。該基質はまた、アッセ
イに使用するpHにおいて少なくとも部分的に水溶性であ
る。
る。該基質は特にナトリウムまたはカリウムカチオンを
有する基質よりも吸湿性が低い。該基質はまた、アッセ
イに使用するpHにおいて少なくとも部分的に水溶性であ
る。
【００１５】該基質は、芳香環上にリン酸基を含み、前
記リン酸基がＰＡＰにより開裂されると、生成するフェ
ノール反応生成物の環上にヒドロキシ基を残す。フェノ
ールとは、後述の基質のいずれかから誘導される（置換
または無置換の）任意のアリール水酸化物を意味する。
好ましくは、該基質は、アリールリン酸エステルの非吸
湿性塩である。そのようなアリールリン酸エステルとし
ては、ｐ−ニトロフェニルリン酸、フェノールフタレイ
ン一リン酸、フェノールフタレイン二リン酸、チモール
フタレイン一リン酸、インドキシルリン酸、フェニルリ
ン酸、α−ナフチルリン酸、β−ナフチルリン酸、β−
グリセロールリン酸、ｏ−カルボキシフェニルリン酸、
ｏ−メチルフルオレセインリン酸、４−（４−ニトロ−
２−メチルスルホニルフェニルアゾ）ナフトール−１−
リン酸、および当業者にとって容易に明らかあろう他の
もの、例えば米国特許第 4,983,512号明細書に記載され
たものが挙げられるが、それらに限定されない。好まし
くは、アリールリン酸エステルはナフチルリン酸エステ
ルであり、α−ナフチルリン酸エステルが最も好まし
い。
記リン酸基がＰＡＰにより開裂されると、生成するフェ
ノール反応生成物の環上にヒドロキシ基を残す。フェノ
ールとは、後述の基質のいずれかから誘導される（置換
または無置換の）任意のアリール水酸化物を意味する。
好ましくは、該基質は、アリールリン酸エステルの非吸
湿性塩である。そのようなアリールリン酸エステルとし
ては、ｐ−ニトロフェニルリン酸、フェノールフタレイ
ン一リン酸、フェノールフタレイン二リン酸、チモール
フタレイン一リン酸、インドキシルリン酸、フェニルリ
ン酸、α−ナフチルリン酸、β−ナフチルリン酸、β−
グリセロールリン酸、ｏ−カルボキシフェニルリン酸、
ｏ−メチルフルオレセインリン酸、４−（４−ニトロ−
２−メチルスルホニルフェニルアゾ）ナフトール−１−
リン酸、および当業者にとって容易に明らかあろう他の
もの、例えば米国特許第 4,983,512号明細書に記載され
たものが挙げられるが、それらに限定されない。好まし
くは、アリールリン酸エステルはナフチルリン酸エステ
ルであり、α−ナフチルリン酸エステルが最も好まし
い。
【００１６】アリールリン酸エステルは、比較的非吸湿
性の塩の形で使用される。通常、そのような塩は１また
は複数の二価カチオン、例えばアルカリ土類カチオン
（例えばマグネシウムおよびカルシウムカチオン）を有
する。好ましくはカルシウム塩が使われ、ヘミカルシウ
ム塩が最も好ましい。記載のカチオンは、ナトリウムイ
オンよりも低吸湿性であることにより、そして水分子を
吸収できるために、リン酸エステルを安定化し、それに
よって反応するリン酸エステルの部分を比較的水との接
触から保護すると考えられる。従って該基質はより加水
分解されにくい。
性の塩の形で使用される。通常、そのような塩は１また
は複数の二価カチオン、例えばアルカリ土類カチオン
（例えばマグネシウムおよびカルシウムカチオン）を有
する。好ましくはカルシウム塩が使われ、ヘミカルシウ
ム塩が最も好ましい。記載のカチオンは、ナトリウムイ
オンよりも低吸湿性であることにより、そして水分子を
吸収できるために、リン酸エステルを安定化し、それに
よって反応するリン酸エステルの部分を比較的水との接
触から保護すると考えられる。従って該基質はより加水
分解されにくい。
【００１７】本発明の実施に有用なジアゾニウム及びテ
トラゾリウム塩は、 3〜6.5 の範囲のpHにおいて該基質
に対するＰＡＰの作用によって生じるフェノール反応生
成物と反応して発色団を生じることのできるものでなけ
ればならない。ジアゾニウム塩は、一般にジアゾニウム
基を有する化合物の有機塩である。芳香族ジアゾニウム
塩が好ましい。
トラゾリウム塩は、 3〜6.5 の範囲のpHにおいて該基質
に対するＰＡＰの作用によって生じるフェノール反応生
成物と反応して発色団を生じることのできるものでなけ
ればならない。ジアゾニウム塩は、一般にジアゾニウム
基を有する化合物の有機塩である。芳香族ジアゾニウム
塩が好ましい。
【００１８】特に有用なジアゾニウム塩としては、次の
構造を有するものが挙げられるが、それに限定されな
い：
構造を有するものが挙げられるが、それに限定されな
い：
【化１】
【００１９】上式中、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 およびＲ4 は独
立的に、水素、ハロ（例えばクロロ、ブロモまたはヨー
ド）、炭素原子数１〜12のアルキル（例えばメチル、エ
チル、イソプロピル、ｔ−ブチル、 sec−ブチル、ｎ−
ブチル、ペンチル、オクチル、イソノニルおよびドデシ
ル）、ニトロ、シアノ、炭素原子数１〜６のアルコキシ
（例えばメトキシ、エトキシ、ペントキシ、イソプロポ
キシ、ｔ−ブトキシおよびヘキソキシ）、芳香環中の炭
素原子数が６〜10のアリールオキシ（上記で定義したよ
うなアルコキシまたはアルキルで置換されたアリールオ
キシを包含する）（例えばフェノキシ、ナフトキシ、ト
リルオキシおよびｐ−ニトロフェノキシ）、炭素原子数
６〜10のアリール（例えばフェニル、ナフチル、ｐ−メ
チルフェニル、ｍ−エトキシフェニル、ｐ−シアノフェ
ニルおよびｏ−メトキシフェニル）、炭素原子数１〜12
のアシル（例えばアセチル、プロピオニル、ベンゾイル
およびブチリル）、および非置換のまたは置換されたカ
ルバモイルまたはスルファモイル（例えばカルバモイ
ル、スルファモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイルお
よびＮ，Ｎ−ジエチルスルファモイル）である。好まし
くは、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3およびＲ4 は独立的に、水素、
メチル、クロロ、Ｎ，Ｎ−ジエチルスルファモイル、ニ
トロまたはメトキシである。
立的に、水素、ハロ（例えばクロロ、ブロモまたはヨー
ド）、炭素原子数１〜12のアルキル（例えばメチル、エ
チル、イソプロピル、ｔ−ブチル、 sec−ブチル、ｎ−
ブチル、ペンチル、オクチル、イソノニルおよびドデシ
ル）、ニトロ、シアノ、炭素原子数１〜６のアルコキシ
（例えばメトキシ、エトキシ、ペントキシ、イソプロポ
キシ、ｔ−ブトキシおよびヘキソキシ）、芳香環中の炭
素原子数が６〜10のアリールオキシ（上記で定義したよ
うなアルコキシまたはアルキルで置換されたアリールオ
キシを包含する）（例えばフェノキシ、ナフトキシ、ト
リルオキシおよびｐ−ニトロフェノキシ）、炭素原子数
６〜10のアリール（例えばフェニル、ナフチル、ｐ−メ
チルフェニル、ｍ−エトキシフェニル、ｐ−シアノフェ
ニルおよびｏ−メトキシフェニル）、炭素原子数１〜12
のアシル（例えばアセチル、プロピオニル、ベンゾイル
およびブチリル）、および非置換のまたは置換されたカ
ルバモイルまたはスルファモイル（例えばカルバモイ
ル、スルファモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイルお
よびＮ，Ｎ−ジエチルスルファモイル）である。好まし
くは、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3およびＲ4 は独立的に、水素、
メチル、クロロ、Ｎ，Ｎ−ジエチルスルファモイル、ニ
トロまたはメトキシである。
【００２０】加えて、環上の隣接位置にあるそれらの任
意の２つの基が一緒になって、６〜10員の縮合芳香環系
（複素環式または炭素環式縮合芳香環を包含する）を表
すことができる。そのような環は、環構造中に炭素、窒
素、酸素または硫黄原子を含むことができる。好ましく
は、この形式で６〜10員の炭素環系が形成される。
意の２つの基が一緒になって、６〜10員の縮合芳香環系
（複素環式または炭素環式縮合芳香環を包含する）を表
すことができる。そのような環は、環構造中に炭素、窒
素、酸素または硫黄原子を含むことができる。好ましく
は、この形式で６〜10員の炭素環系が形成される。
【００２１】Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 およびＲ4 はいずれも、
ジアゾニウム塩を提供するためにアッセイで使用するジ
アゾ化反応を妨害したり、アゾ色素の生成を行うために
アッセイで使用するカップリング反応を妨害したりし得
る基ではないことは理解されよう。
ジアゾニウム塩を提供するためにアッセイで使用するジ
アゾ化反応を妨害したり、アゾ色素の生成を行うために
アッセイで使用するカップリング反応を妨害したりし得
る基ではないことは理解されよう。
【００２２】上記に記載した塩において、Ｘ- は任意の
適当なアニオン、例えばハロゲン化物（例えば塩化物、
臭化物、フッ化物およびヨウ化物）イオン、テトラフル
オロホウ酸イオン、クロロ亜鉛酸イオン、ヘミ塩化亜鉛
イオン、硝酸イオン、過塩素酸イオン、ｐ−トルエンス
ルホン酸イオン、および当業者に容易に明らかである他
のイオンである。
適当なアニオン、例えばハロゲン化物（例えば塩化物、
臭化物、フッ化物およびヨウ化物）イオン、テトラフル
オロホウ酸イオン、クロロ亜鉛酸イオン、ヘミ塩化亜鉛
イオン、硝酸イオン、過塩素酸イオン、ｐ−トルエンス
ルホン酸イオン、および当業者に容易に明らかである他
のイオンである。
【００２３】代表的な有用なジアゾニウム塩としては、
Ｎ′，Ｎ′−ジエチル−４−メトキシメタニルアミドジ
アゾニウム塩（ファーストレッドＩＴＲ塩として知られ
る）、４−クロロ−２−メチルベンゼンジアゾニム塩
（ファーストレッドＴＲ塩として知られる）、ジアゾ化
２−メトキシ−５−クロロアニリン（ファーストレッド
ＲＣ塩として知られる）およびジアゾ化５−ニトロ−２
−アミノ−１−メトキシベンゼン（ファーストレッドＢ
として知られる）が挙げられるが、それらに限定されな
い。ファーストレッドＴＲ塩が最も好ましい。
Ｎ′，Ｎ′−ジエチル−４−メトキシメタニルアミドジ
アゾニウム塩（ファーストレッドＩＴＲ塩として知られ
る）、４−クロロ−２−メチルベンゼンジアゾニム塩
（ファーストレッドＴＲ塩として知られる）、ジアゾ化
２−メトキシ−５−クロロアニリン（ファーストレッド
ＲＣ塩として知られる）およびジアゾ化５−ニトロ−２
−アミノ−１−メトキシベンゼン（ファーストレッドＢ
として知られる）が挙げられるが、それらに限定されな
い。ファーストレッドＴＲ塩が最も好ましい。
【００２４】テトラゾリウム塩は、有機部分が通常は様
々な位置にアリール置換基を有する１個または２個のテ
トラゾール環を含む有機塩である。２個のテトラゾール
環を有するテトラゾリウム塩は、２つのパラ位にテトラ
ゾール環を有するジフェニル環を提供するようにカップ
リングさせることができる。
々な位置にアリール置換基を有する１個または２個のテ
トラゾール環を含む有機塩である。２個のテトラゾール
環を有するテトラゾリウム塩は、２つのパラ位にテトラ
ゾール環を有するジフェニル環を提供するようにカップ
リングさせることができる。
【００２５】上述した比較的非吸湿性の芳香族リン酸エ
ステル基質およびジアゾニウムまたはテトラゾリウム塩
は、任意の適当な場所において本発明の要素中に含める
ことができる。最も単純な態様では、それらは単一区画
要素の多孔質展開区画（または層）中に含まれる。複数
の区画または層を含む他の態様では、記載の試薬を１ま
たは複数の区画中に一緒にまたは別々に配置させること
ができる。好ましくは、それらは多層要素の同一層中に
存在する。
ステル基質およびジアゾニウムまたはテトラゾリウム塩
は、任意の適当な場所において本発明の要素中に含める
ことができる。最も単純な態様では、それらは単一区画
要素の多孔質展開区画（または層）中に含まれる。複数
の区画または層を含む他の態様では、記載の試薬を１ま
たは複数の区画中に一緒にまたは別々に配置させること
ができる。好ましくは、それらは多層要素の同一層中に
存在する。
【００２６】本発明の要素は、該要素をアッセイ中 3〜
6.5 のpHに維持する１または複数の緩衝剤も含む。有用
な緩衝剤は当業界で周知であり、例えば、クエン酸塩、
酢酸塩、コハク酸塩、フタル酸塩、グルタル酸塩および
Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸塩、並びに対応
する遊離酸が挙げられる。緩衝剤は、好ましくは基質を
含む区画とは異なる、該要素の１または複数の区画のい
ずれかに置かれる。該要素は好ましくは4.5 〜6 のpHに
緩衝化される。
6.5 のpHに維持する１または複数の緩衝剤も含む。有用
な緩衝剤は当業界で周知であり、例えば、クエン酸塩、
酢酸塩、コハク酸塩、フタル酸塩、グルタル酸塩および
Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸塩、並びに対応
する遊離酸が挙げられる。緩衝剤は、好ましくは基質を
含む区画とは異なる、該要素の１または複数の区画のい
ずれかに置かれる。該要素は好ましくは4.5 〜6 のpHに
緩衝化される。
【００２７】該要素が分析物の酵素反応および色素の生
成を増加させる１または複数の促進剤を含むことも好ま
しい〔Saini 他、J. Biol. Chem., 256(20), 10453-104
55頁, 1981およびBuchwald他、J. Biol. Chem., 259
(4), 2208-2213 頁, 1984を参照のこと〕。そのような
化合物は、一般に３〜８個の炭素原子を有する直鎖また
は分枝鎖ジオールである。それらとしては、１，４−ブ
タンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，２−プ
ロパンジオール、グリセロール、２，３−ブタンジオー
ル、１，６−ヘキサンジオール、１，５−ヘキサンジオ
ールおよび当業者にとって容易に明らかな他のものが挙
げられるが、それらに限定されない。それらの促進剤
は、好ましくは基質を含む区画とは異なる区画中に存在
する。最も好ましくは、促進剤と緩衝剤が同じ区画中に
存在する。
成を増加させる１または複数の促進剤を含むことも好ま
しい〔Saini 他、J. Biol. Chem., 256(20), 10453-104
55頁, 1981およびBuchwald他、J. Biol. Chem., 259
(4), 2208-2213 頁, 1984を参照のこと〕。そのような
化合物は、一般に３〜８個の炭素原子を有する直鎖また
は分枝鎖ジオールである。それらとしては、１，４−ブ
タンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，２−プ
ロパンジオール、グリセロール、２，３−ブタンジオー
ル、１，６−ヘキサンジオール、１，５−ヘキサンジオ
ールおよび当業者にとって容易に明らかな他のものが挙
げられるが、それらに限定されない。それらの促進剤
は、好ましくは基質を含む区画とは異なる区画中に存在
する。最も好ましくは、促進剤と緩衝剤が同じ区画中に
存在する。
【００２８】本発明の要素に含まれる試薬の量は、当業
者の技量の範囲内で周知である。より詳しくは、芳香族
リン酸エステル基質は通常0.005 〜5 g/m2の範囲内の量
（乾量）であり、0.05〜1 g/m2の量が好ましい。ジアゾ
ニウムまたはテトラゾリウム塩は通常0.005 〜5 g/m2の
範囲内の量（乾量）で存在し、0.05〜3 g/m2の量が好ま
しい。使用する時には、促進剤は通常0.05〜10 g/m2 の
量（乾量）で存在し、0.5 〜6 g/m2の量が好ましい。
者の技量の範囲内で周知である。より詳しくは、芳香族
リン酸エステル基質は通常0.005 〜5 g/m2の範囲内の量
（乾量）であり、0.05〜1 g/m2の量が好ましい。ジアゾ
ニウムまたはテトラゾリウム塩は通常0.005 〜5 g/m2の
範囲内の量（乾量）で存在し、0.05〜3 g/m2の量が好ま
しい。使用する時には、促進剤は通常0.05〜10 g/m2 の
量（乾量）で存在し、0.5 〜6 g/m2の量が好ましい。
【００２９】好ましい態様では、本発明の多層分析要素
は、下記の順序でおよび流体接触状態で、上述したよう
な適当な緩衝剤を含有する試薬層、および上述したよう
な芳香族リン酸エステル基質とジアゾニウムまたはテト
ラゾリウム塩を含有する多孔質展開層を上に担持する非
孔質の透明支持体を含んで成る。
は、下記の順序でおよび流体接触状態で、上述したよう
な適当な緩衝剤を含有する試薬層、および上述したよう
な芳香族リン酸エステル基質とジアゾニウムまたはテト
ラゾリウム塩を含有する多孔質展開層を上に担持する非
孔質の透明支持体を含んで成る。
【００３０】より一層好ましい態様では、試薬層と多孔
質展開層が親水性下層、例えばゼラチンまたは他のコロ
イド状バインダー材料、ビニルピロリドン、アクリルア
ミドもしくはＮ−アルキル置換アクリルアミドポリマー
（例えばＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマー）ま
たは当業界で周知の他の材料から調製した層、により隔
てられる。
質展開層が親水性下層、例えばゼラチンまたは他のコロ
イド状バインダー材料、ビニルピロリドン、アクリルア
ミドもしくはＮ−アルキル置換アクリルアミドポリマー
（例えばＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマー）ま
たは当業界で周知の他の材料から調製した層、により隔
てられる。
【００３１】本発明のアッセイは、手動または自動であ
ることができる。一般に、該要素は、それを周囲条件下
で（他の温度を使うこともできる）前立腺酸性ホスファ
ターゼを含む疑いのある試験被検体（例えば 1〜200 μ
l ）と物理的に接触せしめることにより使用される。被
検体と試薬は該要素の１または複数の区画の中で混合さ
れた状態になり、反応して色素を提供する。
ることができる。一般に、該要素は、それを周囲条件下
で（他の温度を使うこともできる）前立腺酸性ホスファ
ターゼを含む疑いのある試験被検体（例えば 1〜200 μ
l ）と物理的に接触せしめることにより使用される。被
検体と試薬は該要素の１または複数の区画の中で混合さ
れた状態になり、反応して色素を提供する。
【００３２】被検体の塗布後、該要素は、試験結果の獲
得を速めるかまたは他の方法で促進することが望ましい
任意のコンディショニング、例えばインキュベーショ
ン、加熱または他のものに暴露される。
得を速めるかまたは他の方法で促進することが望ましい
任意のコンディショニング、例えばインキュベーショ
ン、加熱または他のものに暴露される。
【００３３】通常５分以内、好ましくは３分以内に、該
要素中に生成された発色団の１回目の分光光度測定が行
われる。ＰＡＰは或る期間に渡り反応する酵素であるた
め、通常は数分後に２回目の測定を行って速度応答を提
供する。発色団生成は、試験試料中の分析物の活性と存
在の指標として、適当な反射または透過分光光度装置お
よび手順を使って測定することができる。
要素中に生成された発色団の１回目の分光光度測定が行
われる。ＰＡＰは或る期間に渡り反応する酵素であるた
め、通常は数分後に２回目の測定を行って速度応答を提
供する。発色団生成は、試験試料中の分析物の活性と存
在の指標として、適当な反射または透過分光光度装置お
よび手順を使って測定することができる。
【００３４】発色団は、使用する反応体に依存して通常
350 〜800 nmの範囲内の波長で測定され、400 〜650 nm
の波長での測定が好ましい。より高波長、例えば550 〜
650nm（最も好ましくは600 nm）での測定は、ビリルビ
ンからの干渉を回避する。
350 〜800 nmの範囲内の波長で測定され、400 〜650 nm
の波長での測定が好ましい。より高波長、例えば550 〜
650nm（最も好ましくは600 nm）での測定は、ビリルビ
ンからの干渉を回避する。
【００３５】本明細書中で使用する時、I.U.は酵素活性
の国際単位を表し、そして標準pHおよび温度条件下で１
分間あたり１μモルの基質から生成物への変換を触媒す
るのに要求される酵素活性の量として定義される。ＰＡ
Ｐについては、標準条件は37℃の温度および5.4 のpHで
ある。
の国際単位を表し、そして標準pHおよび温度条件下で１
分間あたり１μモルの基質から生成物への変換を触媒す
るのに要求される酵素活性の量として定義される。ＰＡ
Ｐについては、標準条件は37℃の温度および5.4 のpHで
ある。
【００３６】
実施例１：前立腺酸性ホスファターゼの測定用の多層分
析要素および比較要素 下記に挙げる要素は、既知の方法と溶剤を使って各層の
材料を塗布用分散液中に配合し、それらを標準的な塗布
装置と方法を使って指摘の順序で塗布することにより調
製した。本発明の要素を、試薬（特に非吸湿性芳香族リ
ン酸エステル基質）の貯蔵安定性について、吸湿性芳香
族リン酸エステル基質を使った本発明以外の要素と比較
した。
析要素および比較要素 下記に挙げる要素は、既知の方法と溶剤を使って各層の
材料を塗布用分散液中に配合し、それらを標準的な塗布
装置と方法を使って指摘の順序で塗布することにより調
製した。本発明の要素を、試薬（特に非吸湿性芳香族リ
ン酸エステル基質）の貯蔵安定性について、吸湿性芳香
族リン酸エステル基質を使った本発明以外の要素と比較
した。
【００３７】
【表１】
【００３８】同じ付着量で（0.4 g/m2）展開層に存在す
る次の基質を有する比較要素を同様に調製した： 比較要素Ａ：α−ナフチルリン酸の二ナトリウム塩、 比較要素Ｂ：α−ナフチルリン酸の一ナトリウム塩、お
よび 比較要素Ｃ：α−ナフチルリン酸。
る次の基質を有する比較要素を同様に調製した： 比較要素Ａ：α−ナフチルリン酸の二ナトリウム塩、 比較要素Ｂ：α−ナフチルリン酸の一ナトリウム塩、お
よび 比較要素Ｃ：α−ナフチルリン酸。
【００３９】ＰＡＰ（47 I.U./リットル）を含む緩衝液
（20mMクエン酸、pH 5.1）の試料（10μl ）を各要素に
塗布し、そして反射分光光度法により色素形成の速度を
測定した。次いで各要素を21℃の温度および相対湿度15
％に１週間維持し、再試験した。その２回の試験の結果
を比較し、室温貯蔵せずに使用した要素と比較した％で
表示されるものとして試薬安定性の減少の量を示した。
（20mMクエン酸、pH 5.1）の試料（10μl ）を各要素に
塗布し、そして反射分光光度法により色素形成の速度を
測定した。次いで各要素を21℃の温度および相対湿度15
％に１週間維持し、再試験した。その２回の試験の結果
を比較し、室温貯蔵せずに使用した要素と比較した％で
表示されるものとして試薬安定性の減少の量を示した。
【００４０】
【表２】
【００４１】実施例２：前立腺酸性ホスファターゼの測
定 実施例１の要素を使って、様々な濃度においてそして数
日間の貯蔵後に前立腺酸性ホスファターゼを検出した。
１セットの実験では、個々の要素を、13 I.U./リットル
の分析物を含む試料と接触させ、そして下記に記載のコ
ンディショニング後に常用の反射分光光度計を使って生
じた色素形成速度を600 nmで測定し、速度応答を決定し
た。
定 実施例１の要素を使って、様々な濃度においてそして数
日間の貯蔵後に前立腺酸性ホスファターゼを検出した。
１セットの実験では、個々の要素を、13 I.U./リットル
の分析物を含む試料と接触させ、そして下記に記載のコ
ンディショニング後に常用の反射分光光度計を使って生
じた色素形成速度を600 nmで測定し、速度応答を決定し
た。
【００４２】
【表３】
【００４３】それらのデータは、本発明の要素が使用場
所で典型的に認められる条件での貯蔵後に非常に安定で
あることを示す。
所で典型的に認められる条件での貯蔵後に非常に安定で
あることを示す。
【００４４】未知量の前立腺酸性ホスファターゼを検出
するために実施例１のものと同様な多数の要素を使って
別セットの実験を実施した。分析物に応答して生成され
た色素シグナル（ＤR ，反射率密度）を測定し、そして
予想値と比較して該アッセイの精度を決定した。結果を
下表に示す。
するために実施例１のものと同様な多数の要素を使って
別セットの実験を実施した。分析物に応答して生成され
た色素シグナル（ＤR ，反射率密度）を測定し、そして
予想値と比較して該アッセイの精度を決定した。結果を
下表に示す。
【００４５】
【表４】
【００４６】実施例３：好ましい要素 次の層配置と成分を有する本発明の好ましい要素を調製
した。
した。
【００４７】
【表５】
【００４８】実施例４：異なる場所にジアゾニウム塩を
有する要素の比較 この実施例は、本発明の分析要素の性能と、ジアゾニウ
ム塩が多孔質展開層以外の層に置かれている本発明の範
囲外の要素の性能とを比較する。
有する要素の比較 この実施例は、本発明の分析要素の性能と、ジアゾニウ
ム塩が多孔質展開層以外の層に置かれている本発明の範
囲外の要素の性能とを比較する。
【００４９】ＰＡＰの測定において実施例１の要素の性
能とファーストレッドＴＲ塩が試薬層に置かれた類似の
要素の性能とを比較した。実施例１に記載の手順および
装置を使って幾つかのＰＡＰ濃度において色素形成を評
価した。結果を下表に与える。製造直後と21℃および相
対湿度15％で４週間貯蔵後の第二の時点（「老化後」と
表示）に速度応答を測定した。
能とファーストレッドＴＲ塩が試薬層に置かれた類似の
要素の性能とを比較した。実施例１に記載の手順および
装置を使って幾つかのＰＡＰ濃度において色素形成を評
価した。結果を下表に与える。製造直後と21℃および相
対湿度15％で４週間貯蔵後の第二の時点（「老化後」と
表示）に速度応答を測定した。
【００５０】
【表６】
【００５１】それらの結果は、促進剤と緩衝剤を含む親
水性試薬層にジアゾニウム塩を置くと該要素の貯蔵安定
性が低下することを指摘する。より疎水性の展開層にジ
アゾニウム塩を配置させると、該要素の貯蔵安定性が向
上する。
水性試薬層にジアゾニウム塩を置くと該要素の貯蔵安定
性が低下することを指摘する。より疎水性の展開層にジ
アゾニウム塩を配置させると、該要素の貯蔵安定性が向
上する。
【００５２】
【発明の効果】本発明は、酸性pHで比較的短時間におけ
る効率的且つ特異的な前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡ
Ｐ）の検出用の乾式分析要素を提供する。この要素中の
試薬は非常に安定であるため、活性や感度の低下を伴わ
ずに該要素を長期間貯蔵することができる。それらの利
点は、著しく水を吸収する訳ではない比較的非吸湿性の
芳香族リン酸エステルであるＰＡＰ基質を使うことによ
って達成される。好ましい態様では、アッセイで使用す
るジアゾニウムまたはテトラゾリウム塩と緩衝剤とは、
アッセイ前は該要素中に隔てられた状態で維持される。
これが貯蔵安定性を更に向上させる。
る効率的且つ特異的な前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡ
Ｐ）の検出用の乾式分析要素を提供する。この要素中の
試薬は非常に安定であるため、活性や感度の低下を伴わ
ずに該要素を長期間貯蔵することができる。それらの利
点は、著しく水を吸収する訳ではない比較的非吸湿性の
芳香族リン酸エステルであるＰＡＰ基質を使うことによ
って達成される。好ましい態様では、アッセイで使用す
るジアゾニウムまたはテトラゾリウム塩と緩衝剤とは、
アッセイ前は該要素中に隔てられた状態で維持される。
これが貯蔵安定性を更に向上させる。
Claims (2)
- 【請求項１】 水性被検体中の前立腺酸性ホスファター
ゼの測定に有用な分析要素であって、 (a) 基質として前立腺酸ホスファターゼと反応してフェ
ノール反応生成物を生成する比較的非吸湿性の芳香族リ
ン酸エステルおよび (b) 前記フェノール反応生成物と反応して発色団を提供
することができるジアゾニウムまたはテトラゾリウム塩
を含有する多孔質展開区画を含んで成り、 水性被検体と接触した時に該要素を 3〜6.5 のpHに維持
する緩衝剤を更に含んで成る前記分析要素。 - 【請求項２】 前立腺酸性ホスファターゼの測定方法で
あって、 Ａ）水性被検体を分析要素と接触せしめる工程であり、
ここで前記分析要素は(a) 基質として前立腺酸性ホスフ
ァターゼと反応してフェノール反応生成物を生成する比
較的非吸湿性の芳香族リン酸エステルおよび(b) 前記フ
ェノール反応生成物と反応して発色団を提供することが
できるジアゾニウムまたはテトラゾリウム塩を含有する
多孔質展開区画を含んで成り、 ここで該要素は水性被検体と接触した時に該要素を 3〜
6.5 のpHに維持する緩衝剤を更に含んで成りる工程、並
びに Ｂ）前記発色団の生成を検出する工程を含んで成る方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/886,263 US5981206A (en) | 1992-05-20 | 1992-05-20 | Dry analytical element and method for the detection of prostatic acid phosphatase |
| US886263 | 1992-05-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646896A true JPH0646896A (ja) | 1994-02-22 |
| JP2889788B2 JP2889788B2 (ja) | 1999-05-10 |
Family
ID=25388729
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5115512A Expired - Fee Related JP2889788B2 (ja) | 1992-05-20 | 1993-05-18 | 前立腺酸性ホスファターゼの検出用の乾式分析要素および検出方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5981206A (ja) |
| EP (1) | EP0574056B1 (ja) |
| JP (1) | JP2889788B2 (ja) |
| AT (1) | ATE176686T1 (ja) |
| DE (1) | DE69323447T2 (ja) |
| DK (1) | DK0574056T3 (ja) |
| SG (1) | SG55077A1 (ja) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN103406689A (zh) * | 2013-07-13 | 2013-11-27 | 北京工业大学 | 一种wc颗粒增强镍基mig耐磨堆焊药芯焊丝 |
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