JPH07114710B2 - カテコール、カテコール生成物質、またはカテコールの生成を触媒する酵素をアッセイするための分析要素 - Google Patents
カテコール、カテコール生成物質、またはカテコールの生成を触媒する酵素をアッセイするための分析要素Info
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- JPH07114710B2 JPH07114710B2 JP3163195A JP16319591A JPH07114710B2 JP H07114710 B2 JPH07114710 B2 JP H07114710B2 JP 3163195 A JP3163195 A JP 3163195A JP 16319591 A JP16319591 A JP 16319591A JP H07114710 B2 JPH07114710 B2 JP H07114710B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は臨床分析に関するもので
あり、特に、カテコール、カテコール生成物質、例えば
サリチレートおよびカテコールの生成を触媒する酵素を
アッセイするための方法ならびにその要素に関する。
あり、特に、カテコール、カテコール生成物質、例えば
サリチレートおよびカテコールの生成を触媒する酵素を
アッセイするための方法ならびにその要素に関する。
【０００２】
【従来の技術】カテコール生成物質（生物学的流体、例
えばヒト血清中のサリチレート）の測定は、診断上有意
義である。アセチルサリチル酸（アスピリン）は、鎮痛
薬としてならびに関節炎の抗炎症薬として使用される。
アセチルサリチル酸は治療効果を有するサリチル酸へ容
易に加水分解する。鎮痛薬としての治療濃度は20mg／dl
までである。関節炎に対する濃度は30mg／dlまでであ
る。より高いサリチレート濃度では、酸−塩基濃度の不
均衡による結果として、頭痛、耳鳴、潮紅および過呼吸
のような問題が生ずる。60mg／dlを越えるサリチレート
濃度は死に致らしめることができる。
えばヒト血清中のサリチレート）の測定は、診断上有意
義である。アセチルサリチル酸（アスピリン）は、鎮痛
薬としてならびに関節炎の抗炎症薬として使用される。
アセチルサリチル酸は治療効果を有するサリチル酸へ容
易に加水分解する。鎮痛薬としての治療濃度は20mg／dl
までである。関節炎に対する濃度は30mg／dlまでであ
る。より高いサリチレート濃度では、酸−塩基濃度の不
均衡による結果として、頭痛、耳鳴、潮紅および過呼吸
のような問題が生ずる。60mg／dlを越えるサリチレート
濃度は死に致らしめることができる。
【０００３】あるサリチレートアッセイ方法は、NADHか
ら NAD+ への転化を伴うサリチレートヒドロキシラーゼ
により触媒されるサリチレートからカテコールへの酵素
的転化を用いる。 340nmでの光学濃度の変化に反映され
るNADHの消失とサリチレートの濃度の間には、量的な相
関がある(YouおよびBittikofer, Clin. Chem., 30:154
9, 1984) 。
ら NAD+ への転化を伴うサリチレートヒドロキシラーゼ
により触媒されるサリチレートからカテコールへの酵素
的転化を用いる。 340nmでの光学濃度の変化に反映され
るNADHの消失とサリチレートの濃度の間には、量的な相
関がある(YouおよびBittikofer, Clin. Chem., 30:154
9, 1984) 。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】課題は、低いpHでNADH
が不安定であることおよびNADHの低い吸光係数により、
長時間保管される乾式フォーマットへ組み込むのに、こ
の方法は適当ではないことである。
が不安定であることおよびNADHの低い吸光係数により、
長時間保管される乾式フォーマットへ組み込むのに、こ
の方法は適当ではないことである。
【０００５】サリチレートの測定に用いる既存方法の他
の課題としては、NADH法の低感度、通常血清中に存在す
るフェノール系およびケト酸、塩化第二鉄に由来する妨
害、時間のかかる手順、サリチレートが結合したタンパ
ク質が測定不可能であること（遊離サリチレートのみイ
オン選択性電極で測定）、もしくは乾式フォーマットに
不適当であることが挙げられる。
の課題としては、NADH法の低感度、通常血清中に存在す
るフェノール系およびケト酸、塩化第二鉄に由来する妨
害、時間のかかる手順、サリチレートが結合したタンパ
ク質が測定不可能であること（遊離サリチレートのみイ
オン選択性電極で測定）、もしくは乾式フォーマットに
不適当であることが挙げられる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、カテコール、
カテコール生成物質（例えばサリチレート）、またはカ
テコール生成物質（酵素基質）からのカテコールの生成
を触媒する酵素をアッセイするための分析要素を提供す
る。上記要素は、チロシナーゼを含む１つの層およびNA
DHを含むもう１つの層ならびにこれらの層のいずれかに
含まれる無色状ロイコ染料を含んでなる。
カテコール生成物質（例えばサリチレート）、またはカ
テコール生成物質（酵素基質）からのカテコールの生成
を触媒する酵素をアッセイするための分析要素を提供す
る。上記要素は、チロシナーゼを含む１つの層およびNA
DHを含むもう１つの層ならびにこれらの層のいずれかに
含まれる無色状ロイコ染料を含んでなる。
【０００７】本発明は、カテコール生成物質、例えば、
サリチレートを包含するカテコールまたはカテコールの
生成を触媒する酵素の比色的定量アッセイ方法を提供す
る。上記方法は、 ａ）カテコール、カテコール生成物質（例えば、サリチ
レート）またはカテコールの生成を触媒する酵素を含む
ことが推測される試料を用意すること； ｂ）この試料を、NADH、チロシナーゼおよび無色ロイコ
染料と混合すること； ｉ）ｂ）の混合物を、酵素、例えば、サリチレートヒド
ロキシラーゼ（カテコール生成物質からのカテコールへ
の変換を触媒するのに選ばれる）と混合すること；また
は ii）ｂ）の混合物を、カテコールを生成する酵素基質と
混合すること；そして ｃ）試料中に存在する、カテコール、カテコール生成物
質（例えば、サリチレート）、または酵素基質からのカ
テコールの生成を触媒する酵素の量を比色的に測定する
こと； を含んでなる。
サリチレートを包含するカテコールまたはカテコールの
生成を触媒する酵素の比色的定量アッセイ方法を提供す
る。上記方法は、 ａ）カテコール、カテコール生成物質（例えば、サリチ
レート）またはカテコールの生成を触媒する酵素を含む
ことが推測される試料を用意すること； ｂ）この試料を、NADH、チロシナーゼおよび無色ロイコ
染料と混合すること； ｉ）ｂ）の混合物を、酵素、例えば、サリチレートヒド
ロキシラーゼ（カテコール生成物質からのカテコールへ
の変換を触媒するのに選ばれる）と混合すること；また
は ii）ｂ）の混合物を、カテコールを生成する酵素基質と
混合すること；そして ｃ）試料中に存在する、カテコール、カテコール生成物
質（例えば、サリチレート）、または酵素基質からのカ
テコールの生成を触媒する酵素の量を比色的に測定する
こと； を含んでなる。
【０００８】上記アッセイがそのようなカテコール生成
物質に向けられる場合、NADHを含まない層は、NADHを用
いる反応でカテコールの生成を触媒するように選択され
る酵素を含む。また、アッセイの目的が特定の酵素であ
る場合には、上記要素は特定の酵素に対する基質を含
む。サリチレートヒドロキシラーゼの基質、サリチレー
トのアッセイには、サリチレートヒドロキシラーゼを要
素中へ包含することが、本発明のこの観点の好ましい態
様である。
物質に向けられる場合、NADHを含まない層は、NADHを用
いる反応でカテコールの生成を触媒するように選択され
る酵素を含む。また、アッセイの目的が特定の酵素であ
る場合には、上記要素は特定の酵素に対する基質を含
む。サリチレートヒドロキシラーゼの基質、サリチレー
トのアッセイには、サリチレートヒドロキシラーゼを要
素中へ包含することが、本発明のこの観点の好ましい態
様である。
【０００９】さらに、本発明は、サリチレートを定量的
にアッセイするために用いられる、少なくとも２つの層
を有する支持体を含んでなる乾式多層分析要素であっ
て、 ａ）１つの層がNADHを含むこと、および ｂ）もう１つの層がチロシナーゼおよび無色状ロイコ染
料を含むこと、 を特徴とする、乾式多層分析要素も提供する。また、ア
ッセイしようとする試料にサリチレートヒドロキシラー
ゼを添加する工程を省略することによりアッセイが実施
される場合、この要素はサリチレートヒドロキシラーゼ
を含む。
にアッセイするために用いられる、少なくとも２つの層
を有する支持体を含んでなる乾式多層分析要素であっ
て、 ａ）１つの層がNADHを含むこと、および ｂ）もう１つの層がチロシナーゼおよび無色状ロイコ染
料を含むこと、 を特徴とする、乾式多層分析要素も提供する。また、ア
ッセイしようとする試料にサリチレートヒドロキシラー
ゼを添加する工程を省略することによりアッセイが実施
される場合、この要素はサリチレートヒドロキシラーゼ
を含む。
【００１０】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
は、サリチレート、カテコールおよび他のカテコール生
成物質をアッセイする方法およびその分析要素を提供す
る。上記方法および要素は一連の酵素的変換（転化）に
基づいている。関係する化学反応はサリチレートを用い
て具体的に説明される。しかしながらこの一連の反応は
カテコールの分析に対する本明細書の教示に、それらの
反応に使用されるいずれか他のカテコール生成物質およ
び酵素触媒を容易に適用できることがすべての分析化学
者に明らかであろう。
は、サリチレート、カテコールおよび他のカテコール生
成物質をアッセイする方法およびその分析要素を提供す
る。上記方法および要素は一連の酵素的変換（転化）に
基づいている。関係する化学反応はサリチレートを用い
て具体的に説明される。しかしながらこの一連の反応は
カテコールの分析に対する本明細書の教示に、それらの
反応に使用されるいずれか他のカテコール生成物質およ
び酵素触媒を容易に適用できることがすべての分析化学
者に明らかであろう。
【００１１】NADHの存在下で、サリチレートヒドロキシ
ラーゼはサリチレートをピロカテコールへ転化し（反応
式１）、ピロカテコールはチロシナーゼの存在下で酸素
によりＯ−キノンへ酸化される（反応式２）。次いで、
Ｏ−キノンは適当なロイコ染料の酸化により、または顕
色剤およびカプリング剤の酸化的カプリングにより色素
を生じることで定量的に測定される（反応式３）。
ラーゼはサリチレートをピロカテコールへ転化し（反応
式１）、ピロカテコールはチロシナーゼの存在下で酸素
によりＯ−キノンへ酸化される（反応式２）。次いで、
Ｏ−キノンは適当なロイコ染料の酸化により、または顕
色剤およびカプリング剤の酸化的カプリングにより色素
を生じることで定量的に測定される（反応式３）。
【００１２】
【化１】
【００１３】カテコールのアッセイ要素の様式において
は、上記アッセイは、要素上への試料の簡単なスポット
により実施される。カテコール生成物質、例えばサリチ
レートをアッセイするための様式においては、酵素を要
素中に含んでもよく、または分析される試料に添加して
もよい。酵素をアッセイするための様式においては、酵
素基質を試料または要素に添加してもよい。上記アッセ
イは、動物もしくはヒトの、しかし好ましくはヒトの生
物学的流体において、定性的にも定量的にも実施でき
る。限定されるものではないが、このような流体として
は、全血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、脊髄液、
痰および汗など、ならびに便分泌物が挙げられる。ま
た、ヒトの組織もしくは動物の組織、例えば骨格筋、心
臓、腎臓、肺、脳、骨髄および皮膚などの流体調製物も
アッセイすることができる。
は、上記アッセイは、要素上への試料の簡単なスポット
により実施される。カテコール生成物質、例えばサリチ
レートをアッセイするための様式においては、酵素を要
素中に含んでもよく、または分析される試料に添加して
もよい。酵素をアッセイするための様式においては、酵
素基質を試料または要素に添加してもよい。上記アッセ
イは、動物もしくはヒトの、しかし好ましくはヒトの生
物学的流体において、定性的にも定量的にも実施でき
る。限定されるものではないが、このような流体として
は、全血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、脊髄液、
痰および汗など、ならびに便分泌物が挙げられる。ま
た、ヒトの組織もしくは動物の組織、例えば骨格筋、心
臓、腎臓、肺、脳、骨髄および皮膚などの流体調製物も
アッセイすることができる。
【００１４】サリチレート以外のカテコール生成物質の
具体例は既知である。例えば、Ｏ−ヒドロキシフェニル
ホスフェートはアルカリ性ホスファターゼもしくは酸性
ホスファターゼにより加水分解されてカテコールにな
る。チロシンＯ−ホスフェートは前立腺の酸性ホスファ
ターゼにより加水分解されうる。これらの加水分解によ
り、各々、Ｏ−ヒドロキシフェニルホスフェートおよび
チロシンを含む試料を定量的にアッセイできる。実際
に、酸性ホスファターゼは単一工程でアッセイできる。
具体例は既知である。例えば、Ｏ−ヒドロキシフェニル
ホスフェートはアルカリ性ホスファターゼもしくは酸性
ホスファターゼにより加水分解されてカテコールにな
る。チロシンＯ−ホスフェートは前立腺の酸性ホスファ
ターゼにより加水分解されうる。これらの加水分解によ
り、各々、Ｏ−ヒドロキシフェニルホスフェートおよび
チロシンを含む試料を定量的にアッセイできる。実際
に、酸性ホスファターゼは単一工程でアッセイできる。
【００１５】上記方法および要素で使用される種々の試
薬は市販されている。また、チロシナーゼも市販されて
いる。
薬は市販されている。また、チロシナーゼも市販されて
いる。
【００１６】無色から測定可能な色へ変化するロイコ染
料はいずれも本発明で有用であろう。このような染料と
しては、トリアリールイミダゾール化合物およびトリア
リールメタン化合物が挙げられる。Ｏ−キノンおよびＯ
−キノン生成物質、例えばカテコールおよびサリチレー
トを検出するのに有用な色素を同定する方法は、米国特
許第 4,089,747号明細書に公表されている。また、有用
なロイコ染料が後者の特許に開示されている。従って、
目的の試験および実施容易な試験に使用する上で、本発
明に対して有用な物質として選択できるロイコ染料は、
分析技術分野で周知である。特に有用な染料はトリアリ
ールイミダゾール類、トリアリールメタン類および還元
型インドフェノール類である。
料はいずれも本発明で有用であろう。このような染料と
しては、トリアリールイミダゾール化合物およびトリア
リールメタン化合物が挙げられる。Ｏ−キノンおよびＯ
−キノン生成物質、例えばカテコールおよびサリチレー
トを検出するのに有用な色素を同定する方法は、米国特
許第 4,089,747号明細書に公表されている。また、有用
なロイコ染料が後者の特許に開示されている。従って、
目的の試験および実施容易な試験に使用する上で、本発
明に対して有用な物質として選択できるロイコ染料は、
分析技術分野で周知である。特に有用な染料はトリアリ
ールイミダゾール類、トリアリールメタン類および還元
型インドフェノール類である。
【００１７】本発明の要素類は、いずれか所望の幅の延
伸テープ類、シート類、スライド類もしくはチップ類を
含む、種々の形の形状でありうる。
伸テープ類、シート類、スライド類もしくはチップ類を
含む、種々の形の形状でありうる。
【００１８】要素は手動または自動化されたアッセイ技
術で使用できる。一般的に、要素の使用に際し、供給ロ
ール、チップパケットもしくは他の供給源から要素を取
り、そして要素を試験する液体（例えば、 200μｌま
で）試料と物理的に接触せしめることにより、上記試料
と試薬類が要素内で混合されて連続的に相互作用する結
果、アッセイが行われる。このような接触は、いずれか
の適当な方法、例えば、要素を試料中へ浸漬するかまた
は浸すことにより、また好ましくは、手動もしくは機械
により適当な分配手段で一滴の試料を要素にスポットす
ることにより達成できる。
術で使用できる。一般的に、要素の使用に際し、供給ロ
ール、チップパケットもしくは他の供給源から要素を取
り、そして要素を試験する液体（例えば、 200μｌま
で）試料と物理的に接触せしめることにより、上記試料
と試薬類が要素内で混合されて連続的に相互作用する結
果、アッセイが行われる。このような接触は、いずれか
の適当な方法、例えば、要素を試料中へ浸漬するかまた
は浸すことにより、また好ましくは、手動もしくは機械
により適当な分配手段で一滴の試料を要素にスポットす
ることにより達成できる。
【００１９】試料の塗布後、発色を促進するためにその
要素は５分間以内インキュベーションされる。インキュ
ベーションとは、本発明者らは色調測定を行う前５分間
以内、試薬類を相互に接触した状態に維持することを単
に意味する。
要素は５分間以内インキュベーションされる。インキュ
ベーションとは、本発明者らは色調測定を行う前５分間
以内、試薬類を相互に接触した状態に維持することを単
に意味する。
【００２０】本発明の乾式分析要素は多層である。少な
くとも一層は、機能が当該技術分野で既知であるような
展開能を有する。これらの層には、本発明の方法で使用
される試薬類を含む。試薬類は、２つの異なる層にもし
くは２つの異なる区画に存在する。NADHは、どちらの区
画もしくは層にでも存在できるロイコ染料を除いて、他
の試薬類から隔てた区画もしくは層に存在する。前述の
層のすべてが支持体上に塗布される。一般に、これらの
層は流体中で相互に接触しており、これは、流体、試薬
および反応生成物（例えば、着色色素）が、隣接区画の
重なった層の間を通過ならびに輸送できることを意味す
る。換言すれば、要素を水性流体と接触せしめる場合、
本発明の分析組成物のすべての試薬類が前述のように連
続的に混合され、そして組成物のように要素中を容易に
移動できる。各層が分離しているか、または２つ以上の
区画が要素の単一層中で別々の領域にあってもよい。ま
た、上述に言及したものの他に、適当な要素成分は、例
えば、米国特許第 4,042,335号、同 4,132,528号および
同 4,144,306号明細書にも記載されている。
くとも一層は、機能が当該技術分野で既知であるような
展開能を有する。これらの層には、本発明の方法で使用
される試薬類を含む。試薬類は、２つの異なる層にもし
くは２つの異なる区画に存在する。NADHは、どちらの区
画もしくは層にでも存在できるロイコ染料を除いて、他
の試薬類から隔てた区画もしくは層に存在する。前述の
層のすべてが支持体上に塗布される。一般に、これらの
層は流体中で相互に接触しており、これは、流体、試薬
および反応生成物（例えば、着色色素）が、隣接区画の
重なった層の間を通過ならびに輸送できることを意味す
る。換言すれば、要素を水性流体と接触せしめる場合、
本発明の分析組成物のすべての試薬類が前述のように連
続的に混合され、そして組成物のように要素中を容易に
移動できる。各層が分離しているか、または２つ以上の
区画が要素の単一層中で別々の領域にあってもよい。ま
た、上述に言及したものの他に、適当な要素成分は、例
えば、米国特許第 4,042,335号、同 4,132,528号および
同 4,144,306号明細書にも記載されている。
【００２１】有用な展開層は、米国特許第 4,292,272号
明細書に記載されるような適当なバインダー物質と混合
したまたは織物として織られた繊維物質、ポリマー組成
物もしくは粒状物質、米国特許第 3,992,158号明細書に
公表されるようなブラッシングポリマー、米国特許第
4,258,001号および同 4,430,436号明細書ならびに特開
昭57(1982)−101760号公報に記載されるようなバインデ
ィング接着剤と結合されているかもしくは結合されてい
ないビーズを用いて製造できる。特に有用な展開層は、
硫酸バリウムもしくは二酸化チタンを含んでなる。一般
に試料を直接展開層に塗布するので、展開層は等方性の
多孔質であることが望ましく、これは、粒子間、繊維間
もしくはポリマー鎖間の相互に連結した空間もしくは空
隙により生ずる細孔が、層の各方向で同一であることを
意味する。
明細書に記載されるような適当なバインダー物質と混合
したまたは織物として織られた繊維物質、ポリマー組成
物もしくは粒状物質、米国特許第 3,992,158号明細書に
公表されるようなブラッシングポリマー、米国特許第
4,258,001号および同 4,430,436号明細書ならびに特開
昭57(1982)−101760号公報に記載されるようなバインデ
ィング接着剤と結合されているかもしくは結合されてい
ないビーズを用いて製造できる。特に有用な展開層は、
硫酸バリウムもしくは二酸化チタンを含んでなる。一般
に試料を直接展開層に塗布するので、展開層は等方性の
多孔質であることが望ましく、これは、粒子間、繊維間
もしくはポリマー鎖間の相互に連結した空間もしくは空
隙により生ずる細孔が、層の各方向で同一であることを
意味する。
【００２２】それぞれの層は、透明な支持体、例えばポ
リエチレンテレフタレート上に塗布できる。他の支持体
は、当該技術分野において周知である。また、本発明の
要素は、一般に種々の製造上もしくは操作上有利に要素
へ添加される１種以上の別の添加剤を含むこともでき
る。このような添加剤としては、界面活性剤、緩衝剤、
溶剤、硬化剤および当該技術分野に既知の他の物質が挙
げられる。
リエチレンテレフタレート上に塗布できる。他の支持体
は、当該技術分野において周知である。また、本発明の
要素は、一般に種々の製造上もしくは操作上有利に要素
へ添加される１種以上の別の添加剤を含むこともでき
る。このような添加剤としては、界面活性剤、緩衝剤、
溶剤、硬化剤および当該技術分野に既知の他の物質が挙
げられる。
【００２３】アッセイ方法および分析要素についての具
体的な態様を以下に列挙する。 １．ａ）カテコールまたはカテコール生成物質を含むこ
とが推測される試料を用意し、 ｂ）前記試料をNADH、チロシナーゼ、および無色状ロイ
コ染料と混合し、そして ｃ）比色的測定により、試料中に存在するカテコールの
量を測定すること、 を含んでなる、カテコールまたはカテコール生成物質の
比色的定量アッセイ方法。
体的な態様を以下に列挙する。 １．ａ）カテコールまたはカテコール生成物質を含むこ
とが推測される試料を用意し、 ｂ）前記試料をNADH、チロシナーゼ、および無色状ロイ
コ染料と混合し、そして ｃ）比色的測定により、試料中に存在するカテコールの
量を測定すること、 を含んでなる、カテコールまたはカテコール生成物質の
比色的定量アッセイ方法。
【００２４】２．上記アッセイが、カテコール生成物質
に対するものであって、工程ｂ）が、カテコール生成物
質のカテコールへの変換を触媒するように選択された酵
素を含んでなり、そして工程ｃ）が、カテコール生成物
質の比色的測定である具体的な態様１に記載の方法。
に対するものであって、工程ｂ）が、カテコール生成物
質のカテコールへの変換を触媒するように選択された酵
素を含んでなり、そして工程ｃ）が、カテコール生成物
質の比色的測定である具体的な態様１に記載の方法。
【００２５】３．前記カテコール生成物質が、ｏ−ヒド
ロキシフェニルホスフェートもしくはチロシンｏ−ホス
フェートからなる群より選ばれる具体的な態様２に記載
の方法。
ロキシフェニルホスフェートもしくはチロシンｏ−ホス
フェートからなる群より選ばれる具体的な態様２に記載
の方法。
【００２６】４．ａ）サリチレートを含むことが推測さ
れる試料を用意し、 ｂ）前記試料をNADH、サリチレートヒドロキシラーゼ、
チロシナーゼおよび無色状ロイコ染料と混合し、そして ｃ）比色的測定により試料中に存在するサリチレートの
量を測定すること、 を含んでなるサリチレートの比色的定量アッセイ方法。
れる試料を用意し、 ｂ）前記試料をNADH、サリチレートヒドロキシラーゼ、
チロシナーゼおよび無色状ロイコ染料と混合し、そして ｃ）比色的測定により試料中に存在するサリチレートの
量を測定すること、 を含んでなるサリチレートの比色的定量アッセイ方法。
【００２７】５．列挙された化学薬品のそれぞれが、 ａ）NADHおよびサリチレートヒドロキシラーゼ、 ｂ）チロシナーゼ、次いで ｃ）無色状ロイコ染料、 の順序で試料へ添加される具体的な態様４に記載の方
法。
法。
【００２８】６．工程ｂ）の列挙された化学薬品が、 ａ）１〜2.０mM／ml NADH、 ｂ）20〜300 Ｕ／mlサリチレートヒドロキシラーゼ、 ｃ）50〜1000Ｕ／mlチロシナーゼ、および ｄ）0.２〜10μｇ／ml無色状ロイコ染料、 の濃度で試料と混合される具体的な態様４もしくは５に
記載の方法。
記載の方法。
【００２９】７．NADHおよびサリチレートヒドロキシラ
ーゼが、１：１の割合で試料と混合される具体的な態様
４もしくは５に記載の方法。
ーゼが、１：１の割合で試料と混合される具体的な態様
４もしくは５に記載の方法。
【００３０】８．前記無色ロイコ染料が、トリアリール
イミダゾール類、還元型トリアリールメタン類および還
元型インドフェノール類からなる群より選ばれる具体的
な態様４もしくは５に記載の方法。
イミダゾール類、還元型トリアリールメタン類および還
元型インドフェノール類からなる群より選ばれる具体的
な態様４もしくは５に記載の方法。
【００３１】９. 前記無色ロイコ染料が、２−（４−ヒ
ドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビ
ス−（４−ジメチルアミノフェニル）イミダゾールであ
る具体的な態様４もしくは５に記載の方法。
ドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビ
ス−（４−ジメチルアミノフェニル）イミダゾールであ
る具体的な態様４もしくは５に記載の方法。
【００３２】10. 上記アッセイが、pH６〜8.5 の範囲内
で実施される具体的な態様４もしくは５に記載の方法。
で実施される具体的な態様４もしくは５に記載の方法。
【００３３】11. サリチレートを定量的にアッセイする
ために用いられる、少なくとも２つの層を有する支持体
を含んでなる乾式多層分析要素であって、 ａ）１つの層がNADHを含むこと、および ｂ）もう１つの層がチロシナーゼおよび無色状ロイコ染
料を含むこと、 を特徴とする、乾式多層分析要素。
ために用いられる、少なくとも２つの層を有する支持体
を含んでなる乾式多層分析要素であって、 ａ）１つの層がNADHを含むこと、および ｂ）もう１つの層がチロシナーゼおよび無色状ロイコ染
料を含むこと、 を特徴とする、乾式多層分析要素。
【００３４】12. 前記ｂ）のもう１つの層がさらにサリ
チレートヒドロキシラーゼを含む、具体的な態様11に記
載の乾式多層分析要素。
チレートヒドロキシラーゼを含む、具体的な態様11に記
載の乾式多層分析要素。
【００３５】13. 前記アッセイが、カテコール生成物質
からのカテコールの生成を触媒する酵素に向けられ、工
程ｂ）で酵素に対する酵素基質を混合物と混合し、そし
て工程ｃ）で比色的に酵素の活性を測定する具体的な態
様１に記載の方法。
からのカテコールの生成を触媒する酵素に向けられ、工
程ｂ）で酵素に対する酵素基質を混合物と混合し、そし
て工程ｃ）で比色的に酵素の活性を測定する具体的な態
様１に記載の方法。
【００３６】
【実施例】以下の例は本発明の改良された特徴を明らか
に立証するものである。下記の例で用いられる界面活性
剤、TX−100 、TX−405 、10Ｇ、アルカノール（Alkano
l)ＸＣおよびゾニル（Zonyl)ＦＳＮおよび酵素、チロシ
ナーゼならびに他の化学薬品は、すべて市販されてい
る。トリトン(Triton)Ｘ−100(TX−100)およびトリトン
(Triton)Ｘ−405(TX−405)はロームアンドハス、(Rohm
and Haas) から市販され；ペルオキシダーゼおよびチロ
シナーゼは、シグマ(Sigma) から市販されている。使用
したロイコ染料は、２−（４−ヒドロキシ−４，５−ジ
メトキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジメチルアミ
ノフェニル）イミダゾールであった。特にことわらない
限り、すべての他の物質は、イーストマン コダック
カンパニー(Eastman Kodak Company) で調製されたか、
またはそこから得られたものである。
に立証するものである。下記の例で用いられる界面活性
剤、TX−100 、TX−405 、10Ｇ、アルカノール（Alkano
l)ＸＣおよびゾニル（Zonyl)ＦＳＮおよび酵素、チロシ
ナーゼならびに他の化学薬品は、すべて市販されてい
る。トリトン(Triton)Ｘ−100(TX−100)およびトリトン
(Triton)Ｘ−405(TX−405)はロームアンドハス、(Rohm
and Haas) から市販され；ペルオキシダーゼおよびチロ
シナーゼは、シグマ(Sigma) から市販されている。使用
したロイコ染料は、２−（４−ヒドロキシ−４，５−ジ
メトキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジメチルアミ
ノフェニル）イミダゾールであった。特にことわらない
限り、すべての他の物質は、イーストマン コダック
カンパニー(Eastman Kodak Company) で調製されたか、
またはそこから得られたものである。
【００３７】例１：本発明の要素上のサリチレート濃度
の測定 本例で使用した要素は下記の配置および試薬含有量を有
した。
の測定 本例で使用した要素は下記の配置および試薬含有量を有
した。
【００３８】
【表１】
【００３９】１，２，４，６および10mM／リットルのサ
リチル酸ならびにNADHを含む一連の個別溶液を、容量比
１：１で組み合わせた。得られたものは、表Ａに示され
る0.５，1.０, 2.０，3.０および5.０mM／mlのサリチル
酸ならびにNADHを含む一連の試験溶液であった。カラム
Ａに記載された溶液を、各々 100Ｕ／mlのサリチレート
ヒドロキシラーゼを含む溶液1.０mlと組み合わせた。得
られた溶液を、各々前述の配置および試薬含有量を有す
る個別の乾式分析要素上にスポットした。670nm におけ
る各々の溶液の反射率濃度を表Ａに示す。
リチル酸ならびにNADHを含む一連の個別溶液を、容量比
１：１で組み合わせた。得られたものは、表Ａに示され
る0.５，1.０, 2.０，3.０および5.０mM／mlのサリチル
酸ならびにNADHを含む一連の試験溶液であった。カラム
Ａに記載された溶液を、各々 100Ｕ／mlのサリチレート
ヒドロキシラーゼを含む溶液1.０mlと組み合わせた。得
られた溶液を、各々前述の配置および試薬含有量を有す
る個別の乾式分析要素上にスポットした。670nm におけ
る各々の溶液の反射率濃度を表Ａに示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】上記反射率濃度は、本発明の方法および要
素が、水性流体中のサリチレートをアッセイするのに非
常に適することを示す。この同一の要素を用いて実施さ
れる他の例は、要素が、カテコール生成物質を包含す
る、カテコールをアッセイするのにすべて非常に適する
ことを示す。
素が、水性流体中のサリチレートをアッセイするのに非
常に適することを示す。この同一の要素を用いて実施さ
れる他の例は、要素が、カテコール生成物質を包含す
る、カテコールをアッセイするのにすべて非常に適する
ことを示す。
【００４２】例２：本発明の方法を具体化する別の要素
の実施態様を下記に示す。
の実施態様を下記に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】一連の溶液を0.２，1.４，2.９, 4.３，5.
８および7.２mM／リットルのサリチル酸（ナトリウム
塩）を含有するように調製した。溶液を、各々前述の配
置および試薬含有量を有する個別の乾式分析要素上にス
ポットした。 670nmでの各溶液の反射率濃度を表Ｂに示
す。
８および7.２mM／リットルのサリチル酸（ナトリウム
塩）を含有するように調製した。溶液を、各々前述の配
置および試薬含有量を有する個別の乾式分析要素上にス
ポットした。 670nmでの各溶液の反射率濃度を表Ｂに示
す。
【００４５】
【表４】
【００４６】再度、反射率濃度は本発明の方法および要
素が水性流体中のサリチレートをアッセイするのに非常
に適することを示す。
素が水性流体中のサリチレートをアッセイするのに非常
に適することを示す。
【００４７】
【発明の効果】色素の測定が行われるので、本発明の方
法および要素はNADHの消失を測定することに付随する課
題を取り除く。従って、 340nmでのNADHの不安定性およ
び低い吸光度係数は、アッセイ制限要因としては取り除
かれる。さらに、上述した多くの他の課題は改良または
完全に取り除かれる。
法および要素はNADHの消失を測定することに付随する課
題を取り除く。従って、 340nmでのNADHの不安定性およ
び低い吸光度係数は、アッセイ制限要因としては取り除
かれる。さらに、上述した多くの他の課題は改良または
完全に取り除かれる。
Claims (5)
- 【請求項１】 チロシナーゼを含む１つの層およびNADH
を含むもう１つの層ならびにこれらの層のいずれかに含
まれる無色状ロイコ染料を含んでなることを特徴とす
る、カテコール、カテコール生成物質、またはカテコー
ルの生成を触媒する酵素をアッセイするための分析要
素。 - 【請求項２】 サリチレートを定量的にアッセイするた
めに用いられる、少なくとも２つの層を有する支持体を
含んでなる乾式多層分析要素であって、 ａ）１つの層がNADHを含むこと、および ｂ）もう１つの層がチロシナーゼおよび無色状ロイコ染
料を含むこと、 を特徴とする、乾式多層分析要素。 - 【請求項３】 前記ｂ）のもう１つの層がさらにサリチ
レートヒドロキシラーゼを含む、請求項２に記載の乾式
多層分析要素。 - 【請求項４】 無色状ロイコ染料が、トリアリールイミ
ダゾール、還元型トリアリールメタン類および還元型イ
ンドフェノール類からなる群より選ばれる、前記請求項
のいずれか１項に記載の要素。 - 【請求項５】 無色状ロイコ染料が２（４−ジメチルア
ミノフェニル）イミダゾールである、請求項４に記載の
要素。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/548,395 US5320946A (en) | 1990-07-05 | 1990-07-05 | Method and element for assay of catechol and catechol generating substances |
| US548395 | 1990-07-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04252197A JPH04252197A (ja) | 1992-09-08 |
| JPH07114710B2 true JPH07114710B2 (ja) | 1995-12-13 |
Family
ID=24188682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3163195A Expired - Fee Related JPH07114710B2 (ja) | 1990-07-05 | 1991-07-04 | カテコール、カテコール生成物質、またはカテコールの生成を触媒する酵素をアッセイするための分析要素 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5320946A (ja) |
| EP (1) | EP0464934B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07114710B2 (ja) |
| AT (1) | ATE130042T1 (ja) |
| CA (1) | CA2026586A1 (ja) |
| DE (1) | DE69114376T2 (ja) |
| DK (1) | DK0464934T3 (ja) |
| ES (1) | ES2081422T3 (ja) |
| GR (1) | GR3018763T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5362630A (en) * | 1981-07-28 | 1994-11-08 | Duke University | Isolation of pseudomonas salicylate hydroxlase and its use for the identification and quantitation of salicylate in body fluids |
| US5474907A (en) * | 1994-03-25 | 1995-12-12 | Eastman Kodak Company | Multilayer analytical element for salicylate assay |
| US5496702A (en) * | 1994-09-01 | 1996-03-05 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Immunoassay elements having stable leuco dye coatings |
| US9797885B2 (en) * | 2013-11-08 | 2017-10-24 | SeeLeaf Inc. | Methods and articles for the detection of exposure to polyhydroxyaromatic skin irritants |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3992158A (en) * | 1973-08-16 | 1976-11-16 | Eastman Kodak Company | Integral analytical element |
| US4089747A (en) * | 1976-08-09 | 1978-05-16 | Eastman Kodak Company | Compositions for the detection of hydrogen peroxide |
| CA1095819A (en) * | 1977-01-14 | 1981-02-17 | Eastman Kodak Company | Element for analysis of liquids |
| US4110079A (en) * | 1977-06-09 | 1978-08-29 | Eastman Kodak Company | Analytical element for clinical analysis |
| JPS575519A (en) * | 1980-06-13 | 1982-01-12 | Toshiba Corp | Gas turbine plant using low calorific power gas |
| DE3046741A1 (de) * | 1980-12-11 | 1982-07-15 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Nachweis von nad(p)h oder salicylat |
| DE3332144A1 (de) * | 1982-09-06 | 1984-03-08 | Konishiroku Photo Industry Co., Ltd., Tokyo | Analytisches element |
| GB8508677D0 (en) * | 1985-04-03 | 1985-05-09 | Genetics Int Inc | Assay for salicylate |
| GB8728296D0 (en) * | 1987-12-03 | 1988-01-06 | Health Lab Service Board | Assay of sailicylates/reduced pyridine nucleotides |
| US5185249A (en) * | 1990-04-04 | 1993-02-09 | Eastman Kodak Company | Dry analytical element for assaying salicylate |
-
1990
- 1990-07-05 US US07/548,395 patent/US5320946A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-01 CA CA002026586A patent/CA2026586A1/en not_active Abandoned
-
1991
- 1991-06-28 DE DE69114376T patent/DE69114376T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-28 DK DK91201661.5T patent/DK0464934T3/da active
- 1991-06-28 AT AT91201661T patent/ATE130042T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-06-28 EP EP91201661A patent/EP0464934B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-28 ES ES91201661T patent/ES2081422T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-04 JP JP3163195A patent/JPH07114710B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-01-21 US US08/008,037 patent/US5506116A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-01-24 GR GR960400161T patent/GR3018763T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5506116A (en) | 1996-04-09 |
| EP0464934A1 (en) | 1992-01-08 |
| DE69114376T2 (de) | 1996-04-18 |
| DK0464934T3 (da) | 1996-01-22 |
| GR3018763T3 (en) | 1996-04-30 |
| JPH04252197A (ja) | 1992-09-08 |
| US5320946A (en) | 1994-06-14 |
| EP0464934B1 (en) | 1995-11-08 |
| DE69114376D1 (de) | 1995-12-14 |
| ES2081422T3 (es) | 1996-03-16 |
| CA2026586A1 (en) | 1992-01-06 |
| ATE130042T1 (de) | 1995-11-15 |
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