JPH02283298A - 分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、クレアチン及び／又はクレアチニンを測定す
るための多層分析素子の改良に関する。

〔従来の技術〕

蛋白質代謝の中間体及び最終生成物の分析は、臨床化学
、特に腎臓機能の診断において重要である。この代謝生
成物には、クレアチニン又はクレアチンが含まれる。

クレアチニンの酵素分析は、それぞれクレアチニン及び
クレアチンに特異的である酵素並びに下記反応経路 （１）クレアチニン＋水；＝クレアチン（２）クレアチ
ン＋水−尿素＋サルコシンを使用して開発されてきた。

最初の反応は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ（別名
　クレアチニナーゼ）が触媒作用をし、第二の反応は、
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（別名　クレアチナー
ゼ）が触媒作用をする。

しかしながら、被験物質中にクレアチンアミジノヒドロ
ラーゼにより触媒されるクレアチン又はＮ−エチルグリ
シン等を含む場合、一体型の分析素子においては、正誤
差を与えるため正確なりレアチニン測定が困難であった
。

そのため特開昭６３−３０５２５４号公報では酵素クレ
アチニンアミドヒドロラーゼ２００〜１２００１、Ｕ、
／ｍ”　、酵素クレアチンアミジノヒドロラーゼ３５０
００〜６５０００　Ｉ　、　　Ｕ、　−／ｍ２及び酵素
サルコシンオキシダーゼ２０００〜３５００　Ｉ　。

Ｕ、／ｍ’並びに過酸化水素及び過酸化性物質の存在下
に検出し得る染料を生成し得るロイコ染料を含有する吸
収性キャリアー物質を含んでなり、該クレアチンアミジ
ノヒドロラーゼが該ロイコ染料に実質的に不活性である
ような状態で存在し、該クレアチニンアミドヒドロラー
ゼが速度限定量で存在し、前記３種のすべての酵素がｐ
Ｈ約６．５〜６．９で存在する、クレアチニン又はクレ
アチンの分析のだめの分析素子によって前記問題点を克
服している。

その実施例としては、多孔性展開層（拡散層）とは異な
る試薬層を２つ設け、多孔性展開層に近い試薬層にクレ
アチンアミジノヒドロラーゼを、支持体に近い方の試薬
層にクレアチニンアミドヒドロラーゼやその他の酵素を
含有させている。また、２つの層は実質的に接している
状態にあり、共にバインダーとしてゼラチンを用いてい
る例のみが記載されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、前記の方法では、クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼを染料に対し実質的に不活性な状態にさせるため、
試薬層を２層設けなければならない。層を１つ増すこと
は分析素子製造において実質的に難易度が増し、手間が
かかる上、ゼラチンのような親水性バインダーの層を重
ねているため、２層間の成分の干渉が性能に影響を与え
ないように配慮しなければならないという手間も生じる
。

また試薬層に含有される試薬は、親水性溶媒又は水に溶
けうる看以下に限定されるため、分析素子の製造設計上
町らかに制約が生じる。具体的には、被験物質中の内因
性クレアチンを早く反応させるよう、大量のクレアチン
アミジノヒドロラーゼを含有させるために、より多量の
親水性バインダーが必要になる。

本発明の目的は上記の問題点が改善され、被験物質中の
内因性クレアチン等の影響が軽減されたクレアチニンの
測定又はクレアチンの測定が可能である、簡便な一体型
の分析素子を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は分析素子に関する発明で
あって、支持体上に少なくとも１層の試薬層、及びその
上方に少なくとも１層の多孔性展開層を有するクレアチ
ン及び／又はクレアチニン測定用の分析素子において、
該多孔性展開層がクレアチンアミジノヒドロラーゼを含
有していることを特徴とする。

クレアチニンの測定における前述の問題点を改善する簡
便な方法は、クレアチンアミジノヒドロラーゼを多孔性
展開層に含有させることにより達成される。

本発明の分析は下記の一連の反応（１）〜（４）によっ
て行われる。

（１）クレアチニン＋水←−−クレアチン（２）クレア
チン＋水−尿素＋サルコシン（３）サルコシン＋酸素十
水−クリシン＋ホルムアルデヒド＋過酸化水素 （４）過酸化水素子色素前駆体− 検出可能の色素 これらの反応は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ク
レアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンオキシダー
ゼ及び過酸化性物質によってそれぞれ触媒される。

クレアチニンアミドヒドロラーゼ及びクレアチンアミジ
ノヒドロラーゼは、多数の供給源から市場で得られる。

種々の微生物資源から単離された各酵素の若干の種類が
文献に知られている。３７℃で６．５の至適ｐＨを有す
るクレアチニンアミドヒドロラーゼ及び３７℃で７．７
の至適ｐＨを有するクレアチンアミジノヒドロラーゼ（
両者共、フラボバクテリウムの菌株から得られる）が好
ましい。

サルコシンオキシダーゼも多数の供給源から得られる。

例えば、特開昭５５−３４００１号、同５６−９２７９
０号、同６１−１６２１７４号各公報に記載されている
。本発明の実施には任意の供給源からのサルコシンオキ
シダーゼが有用である。

過酸化性物質はペルオキシダーゼを含む。本発明に有用
なペルオキシダーゼは植物又は微生物由来である。

本発明に有用な色素前駆体は過酸化水素及び過酸化性物
質の存在で酸化されて検出可能な化合物群（１種又は２
種以上の化合物の組合せ）から選べる。例えば、特開昭
５９−４６８５４号公報に記載されている４−アミノア
ンチピリンとその誘導体、特開昭６２−２５７４００号
公報に記載されているロイコ色素、特開昭６３−１２７
１５８号公報に記載されている化合物の組合せなどが挙
げられる。

本発明の分析素子はまた、種々の製造又は操作上の有利
性のために分析素子中に、一般に含まれる一種又はそれ
以上の他の添加物を含有することができる。このような
添加物には、界面活性剤、イオンキレート化剤、緩衝剤
、溶剤、硬化剤、抗酸化剤、カプラー溶剤、及び類似物
が含まれる。

界面活性剤は非イオン性、イオン性を問わず含有するこ
とができるが、非イオン性界面活性剤は有機溶媒にも水
にも良く溶解することから有用な塗布助剤であると共に
、生物学的流体試料を該多孔性展開層上に点着した際の
展開速度の向上に有効なものである。

上記界面活性剤として有用なものの例としては、トリト
ンＸ−１００（オクチルフエノキシポリエトシエタノー
ル、ロームアンドハース社製）サーファクタントＬＯＧ
（ｐ−ノニルフェノキシポリグリシドール、オリーン社
製）　アルカノールＸＣ（ジイソプロピルナフチルスル
ホン酸ナトリウム、デュポン社製）　　トリイソプロピ
ルナフタレンスルホン酸ナトリウム、フルオロテンサイ
ドＦＴ−２４８（パーフルオロオクチルスルホン酸テト
ラエチルアンモニウム塩、バイエル社製）　フロラード
ＦＣ−１７０Ｃ（パーフルオロアルキルポリオキシエチ
レンエタノール、ミネソタ・マイニング・アンド・マニ
ファクチャリング社製）等、種々の非イオン性及びイオ
ン性界面活性剤を挙げることができる。

特に多孔性展開層に含まれる界面活性剤としては非イオ
ン系界面活性剤が好ましく、特に次式〔１〕： Ｒ−０−（［：Ｈ２−ＣＨ２−０−）　、Ｈ・・・　Ｃ
Ｉ］（式中Ｒは炭素数１〜９のアルキル基で置換された
フェニル基又は、炭素数１〜２０のアルキル基を示し、
ｎは１〜７０の整数値を示す）で表される非イオン系界
面活性剤を分析素子にした場合５〜２０ｇ／ｍ２含んで
いるものが本発明において好ましい。

多孔性展開層に含有される前記非イオン系界面活性剤と
して有用なものの例としてはトリトンＸ　−１００及び
Ｂｒ１ｊ　　（アルキルポリオキシエチレンエーテル）
等が挙げられる。

用いつる緩衝剤としては、日本化学全編「化学便覧　基
ＩｉＩ編」　〔東京、丸善（株）　　１９６６年発行］
　１３１２〜１３２０頁、Ｒ，Ｍ、Ｃ，ダウソン（Ｒ，
Ｍ、　Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ）ほか編［データ　７オア　バ
イオケミカル　リサーチ（Ｄａｔａ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　Ｊ第２版（オッ
クスフォードアット　ザ　クレンドン　プレス、１９６
９年発行）第４７６〜５０８頁、バイオケミストリー（
Ｄｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ）第５巻、第４６７頁（１
９６６年）　アナリティ力ル　バイオケミストリー（Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第
１０４巻、第３００〜３１０頁（１９８０年）等に記載
のｐａｌ緩衝剤系がある。

ｐＨ５，５〜９．０の範囲のｐＨ緩衝剤の具体例として
、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔トリス（
Ｔｒｉｓ）　〕を含む緩衝剤；リン酸塩を含む緩衝剤；
ホウ酸塩を含む緩衝剤；クエン酸又はクエン酸塩を含む
緩衝剤；グリシンを含むＩ液剤；Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒ
ドロキシエチル）グリシン〔ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）　
］　　；　Ｎ　−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ
’　−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸（ＨＥ
ＰＰＳ）Ｎａ塩又はに塩等；Ｎ−２−ヒドロキシエチル
ベピラジンーＮ′−３−スルホン酸（ＥＰＰＳ）Ｎａ塩
又はに塩等；Ｎ−［：）リス（ヒドロキシメチル）メチ
ル〕−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）Ｎａ
塩又はに塩等；Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）Ｎａ塩又は
に塩等；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−
アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）Ｎａ塩又はに塩等；
及びこれらのいずれかと必要により組合せられる酸、ア
ルカリ又は塩がある。好ましい緩衝剤の具体例として、
リン酸二水素カリウム−リン酸水素二ナトリウム；トリ
スーホウ酸ナトリウム；トリスクエン酸；クエン酸−リ
ン酸二水素ナトリウム；ビシン、ＨＥＰＰＳ　；ＨＥＰ
ＰＳナトリウム塩、ＨＥＰＥＳカリウム塩；　ＥＰＰＳ
；ＥＰＰＳナトリウム塩；ＴＡＰＳ　；ＴＡＰＳナトリ
ウム塩；ＴＥＳ　；ＴＥＳナトリウム塩；ＴＥＳカリウ
ム塩等がある。

ｐ＋緩衝剤は酵素が含有されている層に存在するのが好
ましいので、一般的には酵素を含有する多孔性展開層又
は試薬層にｐＨ緩衝剤を含有させるのが好ましい。一方
で低分子蛍のｐＨ緩衡剤は点着された水性液体試料の媒
体である水の浸透に従って層間を移動しうるので、酵素
と発色試薬組成物が含まれるすべての層にｐＨ緩衝剤が
含有される必要はなく、例えば親水性層又は吸水層だけ
にｐＨ５衝剤を含有させてもよい。

また、本発明において添加剤としてＥＤＴＡ・２Ｎａ塩
を試薬層に添加してもよい。

本発明の実施においてクレアチンアミジノヒドロラーゼ
を多孔性展開層に含有させることは多くの方法により達
成できる。

例えば、多孔性展開層を形成する方法として塗布を用い
る場合は、塗布液の溶媒に溶解する（溶媒が水の場合等
）ことが一般的である。溶媒に対する試薬の溶解度が適
当でない場合は、不溶のまま溶媒中に分散させても良い
。

分散に関する種々の方法については、新実験化学講座、
第１８巻、「界面とコロイド」　（丸善株式会社、日本
化学全編、昭和５２年発行）第３４０〜３５５頁に記載
されている方法を用いることができる。

また、溶媒を用いるか否かに係わらず、前記の多孔性展
開層構成材料にあらかじめクレアチンアミジノヒドロラ
ーゼを物理的、化学的に吸着させるか、あるいは、多孔
性展開層構成材料の一部として単に混合しておいても良
い。上述した方法のうち、分散あるいは混合する方法に
おいては、クレアチンアミジノヒドロラーゼの多孔性展
開層への含有可能な量は限定されない。

好ましくは、ベンゼン、トルエン、キシレン、エーテル
、ヘキサン及びその誘導体等の常温で液体である有機溶
媒に非イオン系界面活性剤、素材及びクレアチンアミジ
ノヒドロラーゼを添加し、サンドスターラー　ホモジナ
イザー、超音波ホモジナイザー等により分散させ、分散
液を塗布乾燥し、多孔性展開層を形成する方法が良い。

酵素を有機溶媒に浸すことは、一般に酵素活性を低下さ
せるという事実からすると、酵素を有機溶媒中に分散さ
せることは驚くべきことである。

但し、実用上の点で酵素が有機溶媒と接触してから塗布
乾燥させるまでの時間は有機溶媒の種類により異なるが
１０時間以内であることが好ましい。

本発明の乾式分析素子の多孔性展開層は自己支持性（す
なわち、その元の形を維持するために十分に堅い物質か
らなる）であるが、好ましくはそれは別の非孔性支持体
の上に置かれている。このような支持体は適当な寸法安
定性であり、好ましくは、非孔性で、２００〜９００ｎ
ｍの間の波長の電磁放射線を透過し得る透明（すなわち
放射線透過性）物質である。特定の分析素子のための支
持体の選択は、検出しようとする態様（透過又は反射分
光測光）に適合させるべきである。有用な支持体は、紙
、金属箔、ポリスチレン、ポリエステル〔例えば、ポリ
（エチレンテレフタレート）〕、ポリカーボネート又は
セルロースエステル（例えば、セルロースアセテート）
から調製される。

本発明の多孔性展開層は、米国特許第４２９２２７２号
、同第３９９２１５８号、同第４２５８００１号、同第
４４３０４３６号各明細書及び特開昭５７−１０１７８
０号公報に記載されたような適当な繊維若しくは非繊維
性物質又はそれら若しくは両者の混合物又は、特公昭６
１−６１３４７号公報に記載されたような織吻から調製
される。

本発明の分析素子には、所望に応じて種々の機能の層及
び層構成をとることが可能である。

例えば、米国特許第３９９２１５８号明細書記載の試薬
層、反射層、下塗り層、米国特許第４０４２３３５号明
細書記載の放射線ブロッキング層、米国特許第４０６６
４０３号明細書記載のバリヤー層、米国特許第４１４４
３０６号明細書記載のレジストレーション層、米国特許
第４１６６０９３号明細書記載のマイグレーション阻止
層、米国特許第４１’　２７４９９号明細書記載のシン
チレーション層、特開昭５５−９０８５９号公報記載の
スカベンジャー層及び米国特許第４１１００７９号明細
書記載の破壊性ボッド状部材等を任意に組合せて本発明
の目的に合せた多層分析素子を構成することが可能であ
る。

上記の種々の層は、従来写真工業において公知のスライ
ドホッパー塗布法、押出し塗布法、浸漬塗布法等を随時
用いることで任意の膜厚の層を塗布することが可能であ
る。

また層構成としては、例えば特開昭５１−４０１９１号
（特公昭５８−１８６２８号）公報、米国特許第４１１
００７９号明細書、特開昭５８−１３１５６５号公報等
に記載されている層構成を任意に選択することが可能で
ある。

このようにして製造された分析素子は、分析方法に依存
して種々の形状にすることが可能である。例えば、所望
の幅のテープ、シート又はプラスチックマウントに装着
されたスライドを含む種々の形状にすることができる。

本発明の特に有用な形態において、クレアチニンアミド
ヒドロラーゼは多孔性展開層以外に含まれることが好ま
しく、クレアチンアミジノヒドロラーゼはクレアチニン
アミドヒドロラーゼ含有層には含まれないことが好まし
い。

また、クレアチンアミジノヒドロラーゼの量は２万５千
〜２０万Ｉ　Ｕ　／　ｍ　２　　クレアチニンアミドヒ
ドロラーゼの量はクレアチンアミジノヒドロラーゼに対
し１／２０００〜１／１５量であることが好ましい。更
にサルコシンオキダーゼは試薬層に含有されることが好
ましい。

〔実施例〕

以下本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ 透明な下塗り済み厚さ約１８０μｍのポリエチレンテレ
フタレート支持体上に、下記第１表に示す本発明の試薬
層及び比較の試薬層を第１試薬層、第２試薬層の順に設
け、次いで上記試薬層上にビニルピロリドン／酢酸ビニ
ル共重合体く重合比２：８）を１．８ｇ／ｍ２になるよ
うに接着層を設けた。更にその上に、下記第２表で示さ
れる本発明の展開層及び比較のだめの展開層を設け、下
記第３表に示すごとき本発明の分析素子及び比較の分析
素子を作成した。

実際に多孔性展開層を構成する作業は以下の通りに行っ
た。

トリトンＸ−１００、スチレン／グリシジルメタクリレ
ート共重合体をキシレン２８０ｇに溶解した後、ろ紙厚
材料用繊維及び酵素以外の他の試薬を添加しかくはんし
た。次いで、酵素を添加し、ホモジナイザーで分散して
、でき上がった分散液を接着層の上から塗布し、乾燥さ
せ、展開層を形成した。

本発明の分析素子（１〜５）及び比較分析素子（１，２
）に対してクレアチニン５．２ｍｇ／Ｊ、クレアチン０
．６ｍｇ／Ｊを含む試料（１）とクレアチニン５．２ｍ
ｇ／ｄｌ、クレアチン６．０ｍｇ／ｄ１．を含む試料（
２）とをそれぞれ滴下し３７℃でインキコベートした。

滴下後１５０秒後における５４６ｎｍにおける反射濃度
を対応する各々の素子のクレアチンの検量線を用いて交
接し、２１０秒後から４２０秒後までの５４６ｎｍにお
ける反射濃度変化を対応する各々の素子のクレチニンの
検量線を用いて変換して、それぞれの濃度を求めた。結
果を第４表に示した。

上記第４表から明らかなように、クレアチニン測定にお
ける被験物質の試料中の内因性クレアチンの影響につい
て本発明の分析素子は、比較分析素子と同等以上に影響
が少ない。

したがって、本発明を用いることにより、構成する層の
数を減らし、製造工程を簡略化しても内因性クレアチン
の影響が軽減されたクレアチニンの測定又はクレアチン
の測定が可能である簡便な分析素子が得られることが分
かる。

すなわち、第２表及び第３表から明らかなように、本発
明の分析素子は２層構成であるのに対して、比較分析素
子は３層構成であるから、比較分析素子は調製に時間と
費用を必要とする。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明によれば、分析素子の層構
成を簡略化できるため、製造工程上、コストダウンが計
れるという利点がある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、支持体上に少なくとも１層の試薬層、及びその上方
   に少なくとも１層の多孔性展開層を有するクレアチン及
   び／又はクレアチニン測定用の分析素子において、該多
   孔性展開層がクレアチンアミジノヒドロラーゼを含有し
   ていることを特徴とする分析素子。