JPS63305254A - クレアチニン又はクレアチンの分析用要素及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は臨床化学に関する。

〔先行技術］ 蛋白質代謝の中間体及び最終生成物の分析は、臨床化学
、特に腎臓機能の診断に於いて重要である。この代謝生
成物には、クレアチニン又はクレアチンが含まれる。

クレアチニンの酵素分析は、それぞれクレアチニン及び
クレアチンに特異的である酵素並びに下記反応経路 （１）　　タレアチニンモ水；：ヨクレアチン（２）　
　クレアチン＋水−−−→尿素士サルコシンを使用して
開発されてきた。最初の反応は、クレアチニンアミドヒ
ドロラーゼが触媒作用をし、第二の反応は、クレアチン
アミジノヒドロラーゼが触媒作用をする。

特開昭６２−２５７４００号公報には、クレアチニン若
しくはクレアチン又は両者を分析するための分析要素が
開示されている。該要素には、クレアチニンアミドヒド
ロラーゼ５０〜２．５００１．Ｕ、／ｍ、クレアチンア
ミジノヒドロラーゼ５，０００〜５０，０００１．Ｕ。

／ｌイ、サルコシンオキシダーゼ５００〜１０．０００
１．［Ｉ。

／ポ並びに過酸化水素及び過酸化性物質（ｐｅｒｏｘｉ
ｄａ−Ｌｉｖｅ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ）の存在下に検出
し得る染料を生成し得るロイコ染料が含有されている。

クレアチンアミジノヒドロラーゼは、ロイコ染料に実質
的に不活性であるような状態で存在する。クレアチニン
アミドヒドロラーゼは、速度限定’Ｉｔ　（ｒａｔｅｌ
ｉｍｉｔｉｎｇ　ａｍｏｕｎｔ）で存在している。染料
の形成量を測定する際に、分析の間の特定時点で、クレ
アチニン若しくはクレアチン又は両者は、同一要素で分
析できる。

［発明が解決すべき課題］ 上記要素の市販の態様には、クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ２６，９１０１Ｕ、／ｎｆ、ザル７Ｊシンオキシ
ダーゼ１，７２２１．Ｕ、／ｒｒｒ及びクレアチニンア
ミドヒドロラーゼ（ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ　ａｍｉｄｏ
ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）２０２１．Ｕ。

／　ｒｒｆが含有されている。この要素を使用すること
は、該要素が、患者からの試料がリドカインで処理され
るクレアチニン分析に於ける大きな臨床的に受は入れら
れない不正確さを示すことを表している。リドカイン（
多分、Ｎ−エチルグリシン）の代謝物質が該分析で干渉
していると信じられる。

〔課題を解決するための手段〕

特開昭６２−２５７４００号公報に記載された分析要素
で遭遇する問題点は、酵素クレアチニンアミドヒドロラ
ーゼ２００〜１，２００１．ｔ１．／ｒｒｒ、酵素クレ
アチンアミジノヒドロラーゼ３５，０００〜６５，００
０１．Ｕ、／イ及び酵素ザルコシンオキシダーゼ２，０
００〜３，５００１．１１゜／　ｎｒ並びに過酸化水素
及び過酸化性物質の存在下に検出し得る染料を生成し得
る１コイコ染料を含有する吸収性キャリヤー物質を含ん
でなり、該クレアチンアミジノヒドロラーゼが８亥ロイ
コ染料に実質的に不活性であるような状態で存在し、該
クレアチニンアミドヒドロラーゼが速度限定量で存在し
、前記３種の全ての酵素がｐＨ約６．５〜６．９で存在
する、クレアチニン又はクレアチンの分析のための分析
要素によって実質的に克服される。

［操作の方法］ 本発明は水性液体中のクレアチニン又はクレアチンの分
析（定性的又は定置的測定）に関する。

特に、本発明は動物又は人の生物学的液体を分析するた
めに使用できる。このような液体には、全血、血漿、血
清、リンパ液、胆汁、尿、を髄液、唾液、汗及び便分泌
物のような類似物が含まれるが、これらに限定されるも
のではない。骨筋肉、心臓、腎臓、肺臓、脳、骨髄、皮
膚及び類似物のような人又は動物組織の液体標本を分析
することも可能である。好ましくは、人の血清又は尿が
本発明で分析できる。

広範囲にわたる試験で、本発明は、種々の酵素の量が先
行技術により同様の要素に於いて使用のために開示され
た広範囲の量で注意深く選択された改良された分析要素
を提供する。

この要素は、前記先行技術の項に記載した二つの酵素反
応（１）及び（２）を促進するクレアチニンアミドヒド
ロラーゼ及びクレアチンアミジノヒドロラーゼを含有す
る。しかしながら、クレアチニンアミドヒドロラーゼは
速度限定けで存在し、そのために一度内因的な（ｅｎｄ
ｏｇｅｎｏｕｓ　）クレアチンが完全に反応すると、染
料形成の速度は全部クレアチニンの存在に依存する。し
かしながら、分析中に早期に染料形成の量を測定するこ
とによって、クレアチンもまたこの要素で正確に測定で
きる。バックグラウンドは試薬を互いに干渉しないよう
な状態で要素中に置くことにより最小化する。特に、ク
レアチンアミジノヒドロラーゼは実質的にロイコ染料に
不活性であるような状態で存在する。

最も簡単な要素は、分析に必要な試薬を含有する濾紙又
は濾紙片のような吸収性キャリヤー物質、例えば、自己
支持性吸収性又は吸水性物質から成り得る。該要素は、
キャリヤー物質の個々の帯域に含有された試薬で、２個
又は３個以上の別々の帯域に分割され得る。このような
要素は、試験片、診断要素、浸漬棒、診断剤及び類似物
として当該技術で公知である。

有用な吸収性キャリヤー物質は、尿または血清のごとき
水または生理学的液体に曝した出き、不溶性でその元の
構造を維持する。有用な要素は、紙、多孔性粒状構造体
、多孔性ポリマーフィルム、セルロース、ガラス繊維、
織布及び不織布（３成及び非合成）並びに類似物から調
製できる。この様な要素を作るための有用な材料及び方
法は、当該技術に於いて、良く知られている。

好ましくは、本発明の乾式分析要素は多孔性展開域を有
する。この帯域は自己支持性（即ら、その元の形を維持
するために充分に堅い物質からなる）であるが、好まし
くはそれは別の非孔性支持体の上に置かれている。この
ような支持体は適当な寸法安定性であり、好ましくは、
非孔性で、２００〜９００ｎｒａの間の波長の電磁放射
線を透過し得る透明（即ち放射線透過性）物質である。

特定の要素のための支持体の選択は、検出しようとする
態様（透過又は反射分光測光）に適合させるべきである
。有用な支持体は、紙、金属箔、ポリスチレン、ポリエ
ステル〔例えば、ポリ（エチレンテレフタレート）］、
ポリカーボネートまたはセルロースエステル（例えば、
セルロースアセテート）から調製される。

多孔性展開域は、米国特許第４．２９２，２７２号、同
第３，９９２．１５８号、同第４，２５８，００１号、
同第４，４３０，４３６号、及び特開昭５７−１０１７
６０号公報に記載されたような適当な繊維性若しくは非
繊維性物質又はそれら若しくは両者の混合物から調製さ
れる。展開域は、粒子、繊維、ポリマーストランド等の
間の相互連結した空間又は孔に起因する多孔度が帯域中
の各方向で同じであることを意味する、等方的多孔性で
あることが望ましい。

該要素は、２個又は３個以上の別々の帯域を同一層内又
は重ねて有することができ、その少なくとも一つは多孔
性展開域であることが好ましい。

他の帯域は、当該技術分野で公知の試薬域又は記録域、
追加の展開域、放射線遮蔽域又はフィルター域、下塗域
、バリヤー域等である。これらの帯域は一般に、互いに
液接触、即ち、一般に、液体、試薬及び反応生成物（例
えば、着色染料）が隣接する層の重なりあった領域間を
通過又は移動できる状態にある。好ましくは、これらの
帯域は別々に被覆又は重ねられた層である。

本発明の分析は下記の一連の反応（］）〜（４）によっ
て行われる。

（１）　　クレアチニン＋水←−−クレアチン（２）　
　クレアチン＋水　　　　　尿素＋ザルコシン（３）　
　　ザ；シコシン　土酸ｘ＋水−一−−−）グリシン十
本ルムフルテヒト＋過酸化水素 （４）過酸化水素　　　−−→検出可能な染料子ロイコ
染料 これらの反応はそれぞれ、タレアチニンアミドヒドロラ
ーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオ
キシダーゼ及び過酸化性物質により触媒作用を受ける。

ここに記載した酵素は、本発明の実施に於いて、純粋な
形態で、発酵溶液として又は酵素の不純な抽出物として
、個々に又は集合させて使用することができる。

タレアチニンアミドヒドロラーゼ及びクレアチンアミジ
ノヒドロラーゼは、多くの供給者から商業的に入手する
ことができる。種々の微生物源から分離される各酵素の
いくつかの種は、米国特許第３，８０６，４１６−号及
び米国特許第４，０３９，３８４号に記載されている。

どの種も本発明の実施に使用できる。

クレアチニンアミドヒドロラーゼ及びクレアチンアミジ
ノヒドロラーゼは両方ともフラボバクテリウム（Ｆｌａ
ｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌株から得られ、米国特許
第４，０３９，３８４号に記載されており、有用である
。

ザルコシンオキシダーゼも、多くの供給者から商業的に
入手できる。バチルス１重からのザルコシンオキシダー
ゼが本発明の実施でを用である。

本発明で有用な過酸化性物質にはパーオキシダーゼが含
まれる。パーオキシダーゼは、過酸化水素が他の物質を
酸化する反応に触媒作用をする酵素である。パーオキシ
ダーゼは、一般に鉄ポルフィリンを含有する共役（ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅｄ）蛋白質である。

パーオキシダーゼは、セイヨウワサビ、じゃがいも、イ
チジク樹液及びカブ、ミルク及び白血球中に存在する。

それはまた微生物中にも存在し、発酵によって製造する
こともできる。ある種の合成パーオキシダーゼも知られ
ている。パーオキシダーゼは好ましい過酸化性物質であ
るが、酵素でな０他の物質もまた有用である。これらの
多くのものは商業的に入手できる。

本発明で有用なロイコ染料はイミダゾールロイコ染料で
あり、これはロイコ形では一般に無色であるが、過酸化
水素及び過酸化性物質の存在下に酸化されて検出できる
着色した染料になる。有用なロイコ染料には、米国特許
第４，０８９，７４７号、ヨーロッパ特許出願筒１２２
，６４１号及び特開昭５８　（１９８３）−０４５５５
７号公報に記載されたもののようなジー及びトリアリー
ルイミダゾールが含まれる。

特に有用なイミダゾールロイコ染料は、例えば、２−（
３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，
５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）イミダゾール
、２−　（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−
４，５−ジ（ｐ−ジメチルアミノフェニル）−１Ｈ−イ
ミダゾール、２−（３−エトキシ−４−ヒドロキシフェ
ニル）−４゜５−ビス（ｐ−ジメチルアミノフェニル）
　−１Ｈ−イミダゾール、２−（４−ヒドロキシ−３，
５ジメトキシフエニル）−４−［４−（ジメチルアミノ
）フェニル］　−５−（２−フリル）イミダゾール、２
−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−
４，５−ジ（２−フリル）イミダゾール、２−（３，５
−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−［４−
（ジメチルアミノ）フェニル１−５−フェネチル−イミ
ダゾール及び２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキ
シフェニル）−４−［４−（ジメチルアミノ）フェニル
１−５−ベンジルイミダゾールなどの米国特許第４，０
８９，７４７号に記載されたトリアリールイミダゾール
類である。

本発明の要素はまた、種々の製造又は操作上の有利性の
ために要素中に、一般に含まれる１種又はそれ以上の他
の添加物を含有することができる。

このような添加物には、界面活性剤、イオンキレート化
剤、緩衝剤、溶剤、硬化剤、抗酸化剤、カプラー溶剤及
び類似物が含まれる。

クレアチニンアミドヒドロラーゼが要素中に速度限定量
で存在することは重要である。これはクレアチンアミジ
ノヒドロラーゼの里に対するこの酵素の１１が、上記反
応（１）の進行方向を速度調節するような量であること
を意味する。クレアチニンアミドヒドロラーゼの特定量
は、熟練した臨床化学者により容易に決定できる。一般
に、その量は２００〜１，２００！、［１，／ｒｒｆが
好ましい。クレアチンアミジノヒドロラーゼは、速度限
定量でないようなどのような量でも存在し得る。換言す
れば、上記反応（２）は分析中に調節されるべきではな
い。この酵素の特定量は、熟練した臨床化学者により容
易に決定できる。

本明細書に於いて、Ｉ、Ｕ、は、１ｒ、Ｕ、が該酵素の
ための標準ｐＮ及び温度条件下で、１分間当り基質１ミ
クロモルの添加を触媒作用するに必要な酵素活性の量で
あると定義される、酵素活性の国際単位を表す。本発明
で使用される好ましい酵素調製のために、これらの標準
条件は、クレアチニンアミドヒドロラーゼについて３０
’Ｃ及びｐＨ８，０、クレアチンアミジノヒドロラーゼ
について３７°Ｃ及びρＩＩ　７．４、ザルコシンオキ
シダーゼについて３７°Ｃ及びｐＨ　７．４、そして、
パーオキシダーゼについて２５°Ｃ及びｐＨ　７．０で
ある。

分析で有用な他の試薬は、熟練した臨床化学者により容
易に決定される適当な量で存在する。代表的な量を下記
実施例に示す。

クレアチンアミジノヒドロラーゼ及びロイコ染料が、該
酵素が該染料に実質的に不活性であるような状態で存在
することが、本発明の実施に於いて重要である。これは
二つの試薬が、該酵素が該ロイコ染料に不利な影響を与
えないような状態で要素中に含有されることを意味する
。これは多くの方法により達成することができる。例え
ば、酵素をロイコ染料が不純物によって影響を受けない
ような高純度の形で使用し得る。しかしながら、更に実
際的には、酵素は高純度の形で得ることができない。こ
のような場合に、酵素及び染料の何れか又は両者をカプ
セルに入れるか、または分析を行うまで要素中で互いに
分離させておくことができる。好ましくは、酵素及びロ
イコ染料を要素の異なった帯域又は層に入れておき、分
析のときまで混合しないようにする。

〔実施態様］ 分析の方法に応じて、種々の異なった要素を、本発明に
よって製造できる。要素は所望の幅の長いテープ、シー
ト、スライド又はチップを含む、種々の形に形成できる
。

本発明の分析は、手動または自動で実施出来る。

−Ｉｆｕに、乾式要素を使用する際に、タレアデニン又
はクレアチンの分析は供給ロール、チップ包みまたは他
の源から要素を取り出し、それを試験すべき液体のサン
プル（例えば、１〜２００μｌ）と物理的に接触させて
行い、そしてサンプルと要素中の試薬とを混合させる。

この接触は適当な方法、例えば、要素をサンプル中に浸
漬するか、または好ましくは、手または機械により、サ
ンプル滴を適当な分配手段で要素に滴注することによっ
て行うことができる。

サンプルを施した後、要素を、試験結果を得るのを速め
たり容易にするために望ましいインキュベーション、加
熱又は類似手段のような条件下にさらす。

ついで染料形成の速度を、適当な反射又は透過分光光度
装置及び方法で測定する。一般に、クレアチン分析のた
めに、染料測定はクレアチニンの実質的転化の前、即ち
、サンプル−要素接触後まもなく、例えば、サンプル−
要素接触後約１分以内に行う。この測定は、要素中のク
レアチニンアミドヒドロラーゼの速度限定量がこの時点
でクレアチニンをクレアチンに実質的に転化しないため
に、内因的なりレアチンを測定する。

クレアチニン分析のために、実質的に全ての内因的クレ
アチンが酵素的に反応生成物に転化した後に、少なくと
も２回の染料測定を行う。一般に、最初の測定はサンプ
ル−要素接触の４分後に行う。

他の測定は、その後、染料形成の速度、そしてこれから
クレアチニンの量を分析するために行う。

この一連の測定は、クレアチニン及びクレアチンの何れ
か又は両者を測定するために本発明の要素を使用するこ
とを可能にする。

前記のように、Ｎ−エチルグリシンであると信じられる
リドカインの代謝物質は、ときには、前記米国特許出願
の商業的態様がクレアチニンを分析するために使用され
るとき臨床的に受は入れられない不正確さを生しる。Ｎ
−エチルグリシンが干渉物質であるとの確信は、既知量
のＮ−エチルグリシンを含有する患者のサンプルで同様
の不正確さが観察されることによって支持される。

特に有用な態様に於いて、本発明は、その上に次の順で
、 酵素ザルコシンオキシダーゼ２．０００〜３，５００１
．Ｕ。

／ポ、酵素クレアチニンアミドヒドロラーゼ２００〜１
，２００１．Ｕ、／ｒｒｒ、過酸化性物質並びに該過酸
化性物質及び過酸化水素の存在下に検出し得る染料を生
成し得るイミダゾールロイコ染料を含有する第一試薬層
、 酵素クレアチンアミジノヒドロラーゼ３５．０００〜６
５．０ＯＯ１，Ｕ、／ｌｒｆを含有する第二試薬層、並
びに、クレアチニンアミドヒドロラーゼが第一試薬層内
に速度限定量で存在し、そして、前記３種の全ての酵素
が要素中にｐＨ６，５〜６．９で存在する多孔性展開層 を有する支持体からなる、クレアチニン又はクレアチン
の分析のための多層分析要素を提供する。

本発明はまた、 Ａ：過酸化性物質の存在下で、クレアチニン又はクレア
チンを含有すると思われる液体の試料を、酵素クレアチ
ニンアミドヒドロラーゼ２００〜１　、２００１、Ｕ、
／ｎ（、酵素クレアチンアミジノヒドロラーゼ３５．０
００〜６５，０ＯＯ１，Ｕ、／ボ及び酵素ザルコシンオ
キシダーゼ２，０００〜３，５００１．［１，／ｒｒｆ
並びに過酸化水素及び該過酸化性物質の存在下に検出し
得る染料を生成し得るロイコ染料を含有する吸収性キャ
リヤー物質からなり、 該タレアチンアミジノヒＦロラーゼが該ロイコ染料に実
質的に不活性であるような状態で存在し、該クレアチニ
ンアミドヒドロラーゼが速度限定量で存在し、前記３種
の全ての酵素がｐＨ約６．５〜６．９で要素中に存在す
る分析要素と接触させる工程並びに、 Ｂ：クレアチニン又はクレアチンの存在の結果として形
成される検出できる染料を測定する工程からなるクレア
チニン又はクレアチンの分析方法を提供する。

下記例１は、本発明の要素のｐＨが、酵素ザルコシンオ
キシダーゼの活性に対する干渉物質としてのＮ−エチル
グリシンの影響をどのように減少させるかを示している
。

貫土 種々のｐＨでの別々の分析を、基質ザルコシン及びＮ−
エチルグリシンへのサルコシンオキシダーゼ活性につい
て、１分当りの吸光度に於ける速度変化（ΔＡ／分）を
測定するために行った。分析ドナー（４−アミノアンチ
ピリン）の酸化に起因する発色団の生成速度は、４８０
ｎｍで分光光学的に測定する。

下記のデータが得られた。　　　　　以下余白理想的に
は、ザルコシンでの速度は高くあるべきであり、Ｎ−エ
チルグリシンの速度は零であるべきである。従って、Ｎ
−エチルグリシンの速度のザルコシンの速度に対する比
が低ければ低いほどよい。

第１表は、Ｎ−エチルグリシン／ザルコシン比がｐＨが
低いとき著しく減少することを示している。

これは、ザルコシンオキシダーゼが低いｐＨでより一層
特別の酵素として機能していることを示している。６．
５〜６．９のｐＨが、全ての酵素の成果を最適にしバラ
ンスさせるために本発明の要素のために選択された。

本発明の実施を示す下記の実施例で、使用された物質は
次のようにして得られた。

ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００及びＸ−４５０界面活性剤：
　　Ｒｏｈｍ　　ａｎｄ　　１ｌａｓｓ（Ｐｈｉｌａｄ
ｅｌｐｈｉａ。

Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）ＢＲＩＪ
　７８界面活性剤：　ＩＣＩ　Ａｍｅｒｉｃａｓ（Ｗｉ
ｌｍｉｎｇｔｏｎ。

Ｄｅｌａｗａｒｅ、　　［１，５，＾、）ＥＳＴＡＮＥ
　　ポリウレタン樹脂：　Ｂ、Ｆ、にｏｏｄｒｉｃｈ（
Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　　０ｈｉｏ、Ｕ、Ｓ、＾、）Ａ
ＬＫＡＮＯＬ　ＸＣ界面活性剤：　Ｄｕ　Ｐｏｎｔ（Ｗ
ｉｌｍｉｎｇｔｏｎ。

Ｄｅｌａｗａｒｅ、　　Ｕ、Ｓ、八、）クレアチニンア
ミドヒドロラーゼ 及びクレアチンアミジノヒトロラーセ　：　　５ｅｉｓ
ｈｉｎ　　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（日本）ザル
コシンオキシダーゼ：東洋醸造■（日本）パーオキシダ
ーゼ：　Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｅｌ
ｋｈａｒｔ、Ｉｎｄｉａｎａ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）Ｎ−ト
リス−（ヒトミキシメチル）メチル−２−７ミノメタン
スルネン酸緩衝剤：　　Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ（Ｓｔ、　　Ｌｏｕｉｓ、　　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、
　　Ｕ、Ｓ、八、）そして残りものは、Ｅａｓｔｍａｎ
　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、
　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｕ、Ｓ、八、）から得るか、又
は、標’＜９方法及び容易に入手できる出発物質を使用
して製造した。

ｒ１２：クレアチン１びクレアチニンのノ＼この実施例
は、クレアチニンの決定のための本発明の実施を示す。

この分析は、下記成分を有する要素で行った。

二酸化チタン　　　　　　　　　２０〜８０ｇ／　ｎイ
展　酢酸セルロース　　　　　　　　　２〜１０ｇ／ｒ
Ｉ′ｒ開　ＢＲＩＪ　７８界面活性剤　　　　０．３〜
１．５ｇ／ｎイ層　ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−４０５界面活性
剤　　　０．５〜５ｇ／ｎｆＥＳＴＡＮＩＥ樹脂　　　
　　　　　　　　１〜５ｇ／ｒ＋イ下　ポリ（Ｎ−イソ
プロピル　　　　０．１−１ｇ／ボ塗　　　　アクリル
アミド） 層 試　ゼラチン　　　　　　　　　　１〜２０ｇ／ポｉ　
　　Ｎ−）リス−（ヒドロキシメチル）メチル−２一層
　　アミノメタンスルネン酸緩衝剤　　　　　　　　　
　０．５　〜５ｇ／ボ（エチレンジニトリロ）テトラ酢
＃　　　　　　　　　　　０．１　〜　Ｉｇ／ｒｎ試　
　クレアチン７ミシノヒトロラーセ薬ｐＨ６，５〜６．
９．４０°ｃ　　３５，０００〜６５，０００１．Ｕ、
　／％層　　７スコルビン酸オキシダーセ　　　　１．
ｏｏｏ　　〜１０，０ＯＯ１，Ｕ、　　／１ｎＴＲＩＴ
ＯＮ　Ｘ−４０５界面活性剤　　　０．１〜２．５ｇ／
ｒｒ？ゼラチン（硬化）　　　　　　　　１〜２０ｇ／
ｎ（す゛ルコシンオキシダーセ ９１１６．５〜６．９．４０°Ｃ’　　　　　　　２，
０００〜３，５００Ｔ、Ｕ、／ボ記　　バーｔ＄ンｆ−
ｆ　　　　　　　　　　　　　　５００〜８０，０００
１．Ｌｌ、　　／　ｎ（録　　５．５−ツメチル−１，
３− ／　　　　　　　シクロヘキサンジオン　　　　　　　
　　　　　　０．Ｏ１〜　Ｉｇ／ｎ（試　　２．４ｌ−
ｎ−ペンチルフェノール　　　　　　　　　　　　０．
５〜５ｇ／ｒｄ薬　　クレアチニン７ミトヒトロラーセ
ｐ１１６．５〜６．９．４０°Ｃ２００〜１．２００１
．Ｕ、／ボ［Ｎ−）リス−（ヒドロキシメチル）メチル
ー−２−７ミノメタンスルネン　Ｍ　緩衝剤　　　　　
　　０．５〜５ｇ／ｒＴ′ｒ（エチレンジニトリＯ）テ
トラｆｈＭ　　　　　　　　　　　　０．１〜　ｌ　ｇ
／ｒｄＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００界面活性剤　　０．１
〜２．５ｇ／ボ＾ＬＫＡＮＯＬ　ＸＣ界面活性剤　　　
０．１〜２．５ｇ／ポ２．４−シーｎ−ペンチルフェノ
ール　　　　　　　　　　　　　　１〜５ｇ／ｒｌ（５
，５−シメデト１．３−シクｕヘキサンジオン　　　　
　０．０１〜１　　ｇ１０ｆ２−（３，５−ジメトキシ
−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−メチ
ル７ミノフエニル）イミダゾール　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０．１〜　Ｉｇ／ｎｆポリ
（エチレンテレフタレー））　　支＋寺体この要素は、
下記の方法でクレアチニンを分析するために使用した。

検量曲線は、適当なキャリブレータ−液体のサンプルｌ
Ｏμｌを別々の要素に施し、インキユヘートし、６７０
ｎｍで得られた染料を測定することによって、クレアチ
ニンについて作った。各サンプルを添加した後２３１秒
及び３００秒後に、反射濃度（ＤＲ）を読みとった。ク
レアチニンについての検量曲線は、各キャリブレーク−
サンプルについて３００秒でのそれぞれの読みから２３
１秒での読みを差し引き、１．２１７で割ることによっ
て得た。この曲線は、クレアチニンについて反応の動力
学的速度を測定するためのものである。

次いで、この検体の未知量を含有する３１の異なる患者
サンプルについて、クレアチニンを測定した。これらの
患者の多くは、高レベルのリドカイン治療中であること
が知られていた。各サンプルは、１）本発明の要素及び
２）米国特許出願８５４．４６０号に開示された要素の
前記商業的態様で測定した。

測定は試験液体のサンプルを要素に施し、適当な時間で
反射濃度を読みとり、適当な検量曲線からそれぞれの検
体の濃度を測定することによって行った。３１のサンプ
ルのそれぞれについて及び各要素について、参照方法の
結果に対して算出した不正確度をプロットした。第１図
は、市販要素についての参照に対する不正確度分布を示
す。第２図は、本発明の要素についての参照に対する不
正確度分布を示す。二つの図を比較することによって、
不正確度分布は本発明の要素についてよりも市販の要素
についての方が大きいことが示される。本発明の要素の
全体の不正確分布は、市販の要素の分布よりも図の零不
正確度線により近く集まっている。

〔発明の効果〕

本発明は、同一の分析要素でクレアチニン又はクレアチ
ンの何れか又は両者を迅速に且つ経済的に測定するため
の比較的簡単で自動化された手段を提供する。ｐ）Ｉは
ザルコシンオキシダーゼの活性へのりドカイン代謝物質
の特定の干渉を最小にするように調節される。そのため
に、別々の分析組成物又は要素が、異なった検体のため
に必要ではない。本発明の分析は迅速で、例えば、約５
分以内に検体の測定を可能にする。また、本発明で長い
空白工程を避けることもできる。そのために、特開昭５
８　（１９８３）　−００９６９９号公報に記載された
溶液分析に使用される複雑な装置は、本発明で避けられ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、参照方法に対し、先行技術の要素を使用して
リドカイン治療中の患者のクレアチニン分析に於ける不
正確度分布をプロットしたグラフである。 第２図は、参照方法に対し、本発明の要素を使用してリ
ドカイン治療中の患者のクレアチニン分析に於ける不正
確度分布をプロットしたグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酵素クレアチニンアミドヒドロラーゼ２００〜１，
   ２００Ｉ．Ｕ．／ｍ＾２、酵素クレアチンアミジノヒド
   ロラーゼ３５，０００〜６５，０００Ｉ．Ｕ．／ｍ＾２
   及び酵素サルコシンオキシダーゼ（ｓａｒｃｏｓｉｎｅ
   　ｏｘｉｄａｓｅ）２，０００〜３，５００Ｉ．Ｕ．／
   ｍ＾２並びに過酸化水素及び過酸化性物質の存在下に検
   出し得る染料を生成し得るロイコ染料を含有する吸収性
   キャリヤー物質からなり、該クレアチンアミジノヒドロ
   ラーゼが該ロイコ染料に実質的に不活性であるような状
   態で存在し、該クレアチニンアミドヒドロラーゼが速度
   限定量で存在し、前記３種の全ての酵素がｐＨ約６．５
   〜６．９で存在する、 クレアチニン又はクレアチンの測定用分析要素。 ２、Ａ：過酸化性物質の存在下に、クレアチニン又はク
   レアチンのいずれかを含有すると思われる液体の試料を
   、酵素クレアチニンアミドヒドロラーゼ２００〜１，２
   ００Ｉ．Ｕ．／ｍ＾２、酵素クレアチンアミジノヒドロ
   ラーゼ３５，０００〜６５，０００Ｉ．Ｕ．／ｍ＾２及
   び酵素ザルコシンオキシダーゼ２，０００〜３，５００
   Ｉ．Ｕ．／ｍ＾２、並びに過酸化水素及び前記過酸化性
   物質の存在下に検出し得る染料を生成し得るロイコ染料
   を含有する吸収性キャリヤー物質からなり、 該クレアチンアミジノヒドロラーゼが該ロイコ染料に実
   質的に不活性であるような状態で存在し、該クレアチニ
   ンアミドヒドロラーゼが速度限定量で存在し、前記３種
   の全ての酵素がｐＨ約６．５〜６．９で要素中に存在す
   る分析要素と接触させる工程並びに、 Ｂ：クレアチニン又はクレアチンの存在の結果として形
   成される検出できる染料を分析する工程を含んでなるク
   レアチニン又はクレアチンの分析方法。