JPS61170400A - 酵素阻害によるテオフイリンの分析用分析素子，組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床化学及びヒト生体液（又はヒトの生物学的
流体、以下同じ）のテオフィリンの分析に関する。更に
詳しくは、本発明は、ヒト生体液中のテオフィリン分析
用の乾式分析素子、分析用組成物及び分析方法に関する
。

〔従来技術〕

テオフィリンはぜん息（ａ＠ｔｈｅｍａ）及び肺の疾病
（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｄｉｓ＠ａｓｅｓ）などの治療
にしばしば投与されている薬である。この薬を重大な副
作用を起すことなく継続的に投薬するためには、テオフ
ィリンの治療使用範囲は比較的狭い、即ち１〜２号−で
あるので、頻繁に注意深く患者をチェツクする必要があ
る。

ヒト血清中のテオフィリンの量を分析するのに多くの技
術が知られている。しかしながら、これらの技術のほと
んどは重大な欠陥を有している。

例えば、公知の分光光度分析方法は多量のサンプルや過
度な前処理を必要とし、更にカフェインやテオプロミン
のような類似構造のキサンチン類の妨害を受けやすいと
いう欠点がある。公知のガスクロマトグラフ法は一層特
殊であるが、関連設備を必要としかつ分析に時間がかか
るという問題がある。

非アイソトープ免疫分析技術は、迅速に結果が得られ簡
便であるので、最も頻繁に使用されている。免疫分析は
一般に十分な感度を与えるが、最近患者の腎臓の状態や
分析に使用する抗体の特異性などによシ非常に高い結果
を生ずることが知見された。更に免疫分析は一般に高価
でしかも安定性に限界のある試薬の使用を必要とする問
題がある。

高性能を液体クロマトグラフィー技術も知られている。

この技術は試験試料の前処理によって特異性が変動する
。有機抽出工程が分析の精度及び特異性を改良するのに
必要である。多くのクロマトグラフ法は共通の抗生物質
を含む多くの物質による妨害作用を受けやすい。別の欠
点は高価な機器や分析操作のために特殊技術を有するス
タッフを必要とすることである。

テオフィリンはそのアルカリホスファターゼ活性の阻害
効果を測定することによって分析できることが知られて
いる。しかしながら、この方法でヒト生体液を分析する
と、内因−の（又は生体由来の）アルカリホスファター
ゼが分析に影響して分析結果を高い側にもたらしてその
精度を悪くすることが知られている。従って、この問題
を避けるために、分析に先立って、内因性のアルカリホ
スファターゼを何らかの方法で破壊又は除去しなければ
ならない。

１３、Ｖｉｎ＊を及びり、Ｚｉｚｉａｎの文献［Ｃ１１
ｎ、Ｃｈｅｍ。

２５：８，１３７０〜１３７２頁（１９７９））には、
ヒト血清のテオフィリン分析が記載されており、この方
法によれば、テオフィリンの実際の分析に先立って７０
０ホルム／イソプロパツールを用いて血清サンプルから
薬剤を抽出して、未知量の内因性アルカリホスファター
ゼからテオフィリンを分離している。テオフィリンの量
は、ｐＨ９，４で、テオフィリンの存在によって生ずる
ウシのアルカリホスファターゼ活性の阻害量を測定する
ことによって実施している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記したテオフィリン分析法は。

いくつかの重大な欠点がある。この分析は溶液分析に限
定される。更に、この分析は、薬剤の実際の分析前に、
内因性のアルカリホスファターゼを４テオフイリンから
分離するための多段抽出工程のために遅く、時間がかか
る。

従って、内因性のアルカリホスファターゼによりて影響
されずに、しかも面倒な前処理又は抽出技術を必要とす
ることのない、テオフィリンの簡単で迅速な分析方法に
対するニーズが依然としである。

〔問題点を解決する丸めの手段〕

本発明は、ヒト生体液中のテオフィリン分析用の乾式分
析素子でもって公知のテオフィリン分析の問題を克服し
、この乾式分析素子は、ｐＨ９以下でアルカリホスファ
ターゼの同位酵素（ｔｓｏｓｎｚｙｍ＊）に対する基質
に作用することができるアルカリホスファターゼの同位
酵素を含む第一のゾーン及び前記酵素に対する基質を含
む第二のゾーンを含んで成る。

本発明に従ったヒト生体液中のテオフィリン分析用の分
析組成物は、ｐＨ９以下でアルカリホスファターゼの同
位酵素に対する基質に作用することができるアルカリホ
スファターゼの同位酵素、前記同位酵素に対する基質、
及び組成物をｐＨ９以下に保持する緩衝剤を含んで成る
。

更に、本発明に従ったヒト生体液中のテオフィリン分析
方法は、（ＡＪｐＨ９以下においてアルカリホスファタ
ーゼの同位酵素に対する基質に作用することができる前
記同位酵素及び同位酵素用基質の両方とヒト生体液の試
料とを一９以下で物理的に　゛接触せしめ、そしてω）
検知可能な変化を測定する工程を含んで成る。

〔実施態様の説明〕

本発明は、ヒト生体液中のテオフィリンの分析に関する
。特に本発明は、内因性アルカリホスファターゼ（即ち
、自然に存在している酵素）をその任意の酵素形態で（
例えば肝臓、腸、胎盤、骨における）含む、ヒト生体液
中のテオフィリンを分析するのに使用することができる
。例えば、本発明はヒト血清、冷血、血しょう、を髄液
、痰、胆汁、唾液などの分析に有利に使用することがで
きる。また、ヒトの骨格筋、腎臓、胎盤、心臓、腸、肺
又はその他の組織のようなヒトの組織の流体試料を分析
するのに本発明を使用することもできる。本発明の実施
に使用される好ましい生体液はヒトの血清及び全血であ
る。分析流体は希釈してもよいし、そのまま希釈しなく
てもよい。

本発明の実施に際し、テオフィリンは、多くの基質に作
用して検知可能な反応生成物を生ずることができる酵素
、アルカリホスファターゼの活性を阻害することによっ
て測定される。例えば、次の代表的反応は典型的な基質
、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いたアルカリホ
スファターゼの作用による検知可能な色素の生成を示す
。

ｐ−二トロフェノール（色素）＋ホスフェートこの生成
色素は次に適当な分光光度検知装置で比色的に検出する
ことができる。基質及び酵素と接触した試験サンプル中
に存在するテオフィリンの量は測定した色素の量に逆比
例する。

本発明はｐＨ９以下、好ましくはＰ）［７〜９で実施す
る。本発明者はヒトの流体中の内因性アルカリホスファ
ターゼがｐＨ９以下で実質的な活性を呈さないことを見
出した。従って、試験サンプル中のアルカリホスファタ
ーゼのヒト同位酵素の存在は一９以下で実施するテオフ
ィリンの分析に悪影響を及はさない。しかしながら、ｐ
Ｈ９以下の環境中で不活性化されないアルカリホスファ
ターゼの同位酵素用基質に使用してテオフィリンの存在
を示すことができる。所望の性質、即ちｐＨ９以下で測
定できる活性を有する、任意の適当な入手源からの同位
酵素が本発明の実施に有用である。特に有用な同位酵素
はウシ源から得られるもの、例えば、牛、子牛などの組
織及び機関（例えば肝臓）から得られるものである。そ
の他の種々の入手源１例えば微生物、鳥類及びヒト以外
の哺乳動物から得られる同位酵素も有用である。なお、
本発明の実施に有用な同位酵素を見つけることは、十分
、臨床化学の作業者の技術範囲内である。このことは、
同位酵素とその基質を混合してｐＨ９以下での酵素反応
によって検知可能な変化が生ずるか否か（例えば色素が
形成されるか否か）を見ることによって実施することが
できる。

本発明の実施に際しては種々のアルカリホスファターゼ
基質の一種もしくはそれ以上を使用することができる。

使用する基質は前記同位酵素との反応によって、直接検
知可能な変化を生ずるもの、例えば色原体（又は色素原
）、蛍光Ｗ（ｆｌｕｏｒｏｇｓｎ）＃ラジオアイソトー
プでラベルされた化学種などのような１穐又はそれ以上
の検知可能な反応生成物に転化するものでなければなら
ない。分析中に測定する検知可能な変化は、前記したよ
うな検知可能な生成物の出現又は消失とすることができ
、また成る検知可能な物から別の検知可能な生成物の変
化であってもよい。或いは、検知可能な変化は、同位酵
素の基質に対する作用によって開始される一連の反応に
よってもたらされるものとすることもできる。例えば、
アルカリホスファターゼ同位酵素は基質に作用して別の
酵素又は反応試薬を生成し、これらを次の別の一種又は
それ以上の反応に使用して検知可能な生成物を生成する
ことができる。検知可能な生成物は直接測定してもよい
し、又は測定のために物理的分離や処理を必要としても
よい。

本発明の好ましい態様では１分析によって酵素反応の検
知可能な生成物として色素原又は蛍光原が生成する。一
般的に言えば、このような反応に有用な基質は酵素反応
の間に基質分子から開裂されるホスフェート基を有する
。このような基質はリン酸又はその塩の有機モノ又はジ
エステルを含む。特に有用な基質の例は、ｐ−ニトロフ
ェニルホスフェート、フェノールフタレインモノホスフ
ェート、フェノールフタレインジホスフェート、チモー
ルフタレインモノホスフェート、インドキシルホスフェ
ート、フェニルホスフェート、α−ナフトールホスフェ
ート、β−ナフトールホスフェート、α−グリセロール
ホスフェート５ｏ−１チルフルオレセインホスフエート
、Ｏ−カルがキシフェニルホスフェート、これらのアル
カリ金属塩並びに業界公知のもの（例えば米国特許第３
４２５９１２号及び欧州特許出願第６１７３１号参照）
である。好ましい基質はｐ−＝）ロフェニルホスフェー
ト及び４−（Ａ−ニトロ−２−メチルスルホニルフェニ
ルアゾ）ナフトール−１−ホスフェートである。

本発明に従ったテオフィリン分析は溶液又は乾式分析素
子を用いて実施することができる。いずれの場合にも、
同位酵素及び基質は液体試験サンプルと接触するまで別
々に保持しなければならない。

溶液分析においては、同位酵素及び基質は一般に適当な
容器（例えば、試験管、（）　１７皿、ビーカー、キュ
ベツトなど）中で液状試験サンプルと混合される。生成
反応混液は所望なら適当な温度で成る時間インキ、ベー
トすることができる。次に反応混液を、必要なら一般的
な検出装置及び手順を用いて得られ喪検知可能な変化を
測定して評価することができる。何の変化も生じない場
合には、試験サンプル中のテオフィリンの存在によって
ホスファターゼ活性は阻害されない。しかしながら、変
化が生じた場合には得られた変化量は液体サンプル中の
テオフィリンの量と相関する。反応混液はｐｉ（９以下
、好ましくはｐＨ７〜９に緩衝させる。本発明の実施に
際しては、分析中に系の声ｔ−９以下に保持することの
できる任意の適当な緩衝剤又はその混合物を用いること
ができる。本発明において使用される代表的な緩衝剤（
もつとも本発明をこれらに限定するものでないことはい
うまでもな、いか）はトリス（ヒドロキクメチル）アミ
ノエタン・ＨＣｔ、グリシルグリシン、Ｎ−）リス（ヒ
ドロキシメチル）−メチル−２−アミノエタンスルホン
酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸及びその他の業界で公知のもの（例え
ば、ＧｏｏｄらのＢｉｏｃｈｏｍ。

５Ｃ２）、４６７〜４７７頁、１９６６年参照）である
。

或いは、分析に必要な反応試薬は別のソースから得るこ
とができ、そして−緒にして分析用組成物とすることが
できる。

本発明を溶液分析として実施する場合には、試薬量は使
用する基質に依って変動させることができる。しかしな
がら、一般にはアルカリホスファターゼ同位酵素は５０
〜５０００１．Ｕ、／ｌ、好ましくは２５０〜２５００
１．Ｕ、／ｌである。同位酵素用基質は一般に１〜１０
０ミリモル濃度、好ましくは１０〜５０ミリモル濃度の
量で存在する。緩衝剤は、使用する緩衝剤に依りて、反
応混液の声を所望の９以下に保持するのに適当な量で使
用する。

これらの緩衝剤量は臨床化学の当業者によって容易に決
定することができるものであるが、一般には０．２モル
濃度未満である。

所望なら、別の任意の試薬を反応混液に添加することも
で龜る。例えば、同位酵素の活性化のために金属イオン
活性化剤を添加することができる。

そのような活性化剤としては、遊離又は塩の型（例えば
アメ／４ラギン酸塩、酢酸塩、塩化物、硫酸塩など）　
テ１Ｍｇ”＠　Ｃｏ＋＋ｅ　Ｍａ＋＋＊　Ｃａ”　＠　
Ｚｎ”　＠８ｒ”　、　Ｆｅ”などの二価カチオンをあ
けることができる。或いは、試験サンプル中の内因性ア
ルカリホスファターゼのレベルが異常に高い場合には酵
素活性抑制剤又は阻害剤を使用することができる。有用
な抑制剤としてはフェニルアラニンやテトラアミソール
をあげることができる。このような抑制剤は、有利なこ
とＫ、ヒト以外のアルカリホスファターゼ同位酵素の活
性に影響を及ｔ”ｚさない。

更に、ホスフェート基質を使用する場合には、−ｍ又は
それ以上のホスフェート受容体を反応混液中に含ませて
酵素反応速夏を増大させるのが好ましい。かかる化合物
は、当業界において、それが基質から開裂し念ホスフェ
ート部分の受容体として作用すると共に、緩衝剤として
作用するので、リン酸基転移可能な緩衝剤としても知ら
れている。

有用なホスフェート受容体としてはアミノアルコール及
びその誘導体、又は脂肪族アミンをあげることができ、
特にアミノアルコールが有用である。

このような化合物の具体例は当業界において周知である
。

本発明の方法は乾式分析素子を用いて実施することもで
き、この素子は吸収性担持物質１例えば戸通用の紙やス
トリップのよう外自己支持性吸収性又は吸収剤物質の薄
いシートに前記した緩衝剤、同位酵素及び基質を含ませ
て成る。この素子（又は要素）は二つのゾーン（又は帯
域）に分けられ同位酵素と基質とはそれぞれ別々のゾー
ンに組み入れられる。このような素子は業界においてテ
ストストリッｆ（試験片）、診断素子、浸漬スティック
、診断薬剤として知られているものである。

乾式分析素子に使用する場合には１反応試薬は、浸染、
吸収、浸漬、塗布又はその他の適当な技術によって適当
な吸収性担持物質中に含ませることが出来る。有用な吸
収性物質は、水又は血清もしくは全血のような生体液に
曝した場合に、不溶性でその構造的一体性を保持するも
のである。有用な素子は紙、多孔性の粒状構造体、多孔
性ポリマーフィルム、セルロース、木材、ガラス繊ｍ、
織布及び非織布（合成及び非合成）などから製造するこ
とができる。かかる素子を製造するのに有用な材料及び
方法は、例えば米国特許第３０９２４６５号、同第３８
０２８４２号、同第３９１５６４７号、同第３９１７４
５３号、同案３９３６３５７号、同第４２４８８２９号
、同第４２５５３８４号、同第４２７０９２０号及び同
第４３１２８３４号並びに英国特許第２０５２０５７号
に例示されているように業界において周知のことである
。前記した２つのゾーンは重ね合せた別の層とすること
ができ、また単一層中に限定された区域とすることもで
きる。これらは、同−又は異なった材料から構成するこ
とができ、積層又はその他の適当な技術によって一体化
することができる。

本発明の乾式分析素子の少なくとも一つの必須のゾーン
は、好ましくは吸収性担持物質として作用する多孔性の
散布又は拡布ゾーンとする。このゾーンは自己支持性（
即ちその一体性又は自立性を保持するのに十分な硬質材
料から成るもの）とすることができるが、別の非孔性支
持体上に担持させるのが好ましい。かかる支持体は寸法
的に安定で、好ましくは２００ｎｍと９００ｎｍの間の
波長の電磁放射を透過する透明（即ち放射線又は輻射線
透過性）材料とすることができる。

前記多孔性拡布ゾーンは、任意の適当な繊維状又は非繊
維状材料又はこれら一方もしくは両方の混合材料から製
造することができる。このゾーンの空隙容積及び平均孔
寸法は使用目的によって変えることができる。

有用な拡布ゾーンは、米国特許第４２９２２７２号に記
載のようく、繊維材料を用いて、適当な結合剤物質と混
合するか、又は布帛に織って製造することができる。或
いは、そして好ましくは、拡布ゾーンは、例えば米国特
許第３９９２１５８号及び同第４２５８００１号、西独
ＯＬＳ第３１５０１０２号及び日本特許公報５７−１０
１７６０号に記載のように、結合接着剤を使用して又は
使用せずに一緒に結合したビーズのような粒状物質、又
は例えばプラッシュ（ｂｌｕｓｈ　）ポリｉ−のような
ポリマー組成物から製造することができる。

本発明の素子は二つの必須ゾーンを有し、その少なくと
も一方は好ましくは多孔性の拡布ゾーンである。他の必
須のゾーンは、当業界において知られているように、反
応試薬ゾーン又は記録ゾーンとすることができる。本発
明の素子は、上記二つの必須ゾーンに加えて、これらに
限定するわけではないが別の拡布ゾーン、輻射遮断又は
フィルターゾーン、下塗（ｓｕｂｂｉｎｇ）ゾーン、バ
リヤーゾーンなどのような別のゾーンを有することがで
きる。好ましくは、前記二つの必須ゾーンの間に下塗層
を設けて分析をするまで反応試薬を別個に保持するのを
補助することができる。これらのゾーンは一般には互い
に流体接触するように配置される。即ち、流体、反応試
薬及び反応生成物（例えばカラー色素）は隣接ゾーンの
重ね合さった領域の間を通過又は移動することができる
ようにされている。前述の引用文献のほかに、適当な素
子成分は１例えば米国特許第４０４２３３５号、同第４
１３２５２８号及び同第４１４４３０６号などに記載さ
れている。

本発明の好ましい態様は、支持体及びその上にこの順で
しかも流体接触状態で配置された前述の同位酵素を含む
第一の層、放射線遮断層、下塗層、そして同位酵素用の
基質を含む多孔性拡布層から成る素子である。第一の層
も多孔性拡布層とすることができるが、好ましくはそれ
は一種もしくはそれ以上の親水性バインダー（例えばゼ
ラチン、ビニルピロリドンポリマー、アクリルアミドポ
リマーなど）、界面活性剤、媒染剤、及びその他の補助
剤を含む試薬層又は記録層である。

この好ましい素子は、場合によっては、第二の多孔性拡
布層を含むこともでき、この層は第一の多孔性拡布層の
材料と同−又は異なった材料から構成して素子の最外層
とすることができる。例えば、第一の拡布層は米国特許
第３９９２１５８号に従りて製造したツラッシュポリマ
ーから構成し、そして第二の拡布層は前述の粒状材料か
ら構成することができる。

本発明の素子は、前述の一種又はそれ以上の緩衝剤を含
み、この緩衝剤は素子を分析に使用する時に素子中の反
応環境の−を９以下に保持する。

また、素子が前述の一種又はそれ以上の金属活性化剤及
びホスフェート受容体を含むのも好ましい。

本発明の素子においては、同位酵素及び基質の量は広範
囲に変動させることができる。一般には、本発明の素子
は１０〜５０　Ｉ−Ｕ−７ｍ”　、好ましくは２０〜４
０１．Ｕ、％−の同位酵素を含む。同位酵素の基質は一
般に１〜５９７ｍ”　、好ましくは２〜４１／Ａ−の量
で存在する。緩衝剤は、分析を行わんとする−及び試験
サンプルの容積などに依って変動するが一般には比較的
少量存在する。しかし、−が７〜９でサンプル容積が１
〜１００μＬの場合には緩衝剤の量は一般には０．１〜
０．７　ｉ／ｌｐ−である。素子中に含ませるその他の
任意的な補助剤は臨床化学の当業者の常識内の量で配合
することができる。この明細書の開示において、Ｉ　、
Ｕ、は同位酵素活性の国際単位で１国際単位（１，Ｕ、
）は当該同位酵素の標準−及び温度条件で１分間当シに
基質１マイクロモルの転化を触媒するのに必要な同位酵
素活性量として定義される。

本発明に従えば、分析方法に依って、いろいろの異なり
た素子を製造することができる。素子は、例えば所望の
幅の長いテープ、シート、スライド又はチップなどの様
々な塁に形成することができる。

本発明の分析は手動又は自動のいずれともすることがで
きる。一般には、乾式素子を用いる場合には、テオフィ
リン分析は素子を供給ロール、チップパケット又はその
他の供給源から素子を取シ出し、それを試験すべき液体
サンプル（例えば１〜１００μｔ）と物理的に接触させ
ることによって実施する。この接触は、任意の適当な方
法、例えば素子をサンプル中に浸漬したシ、或いは好ま
しくは素子に適当な分配手段でサンプルの一滴を手又は
機械でスポットとして適用することによって行なうこと
ができる。

サンプルの適用後、素子はインキュベーション、加熱な
どの任意のコンディショニングを施す。これはテスト結
果を迅速に又は容易に得るのに好ましい。

次に、素子中に存在するアルカリホスファターゼが、サ
ンプル中のテオフィリンによって阻害されないアルカリ
ホスファターゼの存在量に基づく速度で基質の反応を触
媒する。反応生成物の生成に基づく検知可能な変化（例
えば色素生成）速度は、反射又は透過分光測光用の適当
な装置を備えたゾーンを通過させることによって定量す
ることができる。適当な分光測光装置及び方法は当業界
において周知のものである。別の適当な測定手段として
蛍光分光分析、放射線分析、酵素ラベル法などを用いる
こともできる。テオフィリンの量は測定反応速度に逆比
例する。

例えば、ｐ−二トロフェニルホスフェートを基質として
使用した場合には、非阻害酵素反応はｐ−ニトロフェノ
ールを生成し、これは汎用の分光光度計を用いて４００
ｎｍで測定することができる。

定量可能な変化速度（例えば色変化速度）は基質反応の
速度に直接関連し、そしてサンプル中のテオフィリンの
濃度に間接に関連する。

本発明の詳細な説明する以下の例においては、以下の材
料を使用した。

ウシ（ｂｅｅｆ　）肝臓アルカリホスファターゼ同位酵
Ｘ、ｐ−二トロフェニルホスフェート及ヒトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン・ＨＣ１ＭＩｋ衝剤（シグ
マクミカル社、米国ミズリー州セントルイス）、ニスタ
ン（ＥＳＴＡＮＥ　）　（ビー・エフ・グツドリッチ社
、米国オハイオ州クリープランド、ポリウレタン樹脂）
、トリトン（Ｔｒｌｔｏｎ　）　Ｘ　−１０２、Ｘ−２
００及びＸ−４０５界面活性剤（ロームアンドハース社
、米国ペンシルヴアニア州フイブデルフィア）並びにそ
の他の材料（イーストマンオルガニックケミカル社、　
米ｈ＝ニーヨーク州ロチェスター又は公知の原料から公
知の方法で製造）。

例１ テオフィリン検量線の調製 以下の例において使用する検量線を以下のようにして作
成した。

５０−の貯留ヒト血清にテオフィリン２．２５■を加え
ることによって４．５　ｑ／、ｇテオフィリン貯留溶液
を作ることＫよって検量サンプルを作成した。

この溶液を貯留ヒト血清によって連続的に希釈してテオ
フィリン濃度が２．２５．１．１２５．０．５６及び０
．２８　勢省（溶液）の最終検量溶液を得た。

１ＯＭセルに酢酸マグネシウム１ｗｔ（最終濃度１Ｏモ
ル濃度）、蒸留水５００μｔ、各検量離液５００μｔ、
ウシ肝臓アルカリホスファターゼ１００μｔ（最終濃度
１０００１．Ｕ、／ｌ）及びトリス（ヒドロキシメチル
）アミノエタン・ＨＣｔ緩衝剤（０，１モ＃濃度、ｐＨ
８）中のｐ−ニトロフェニルホスフェート１ｗｔ（最終
濃度１６ミリモル濃度）を加えた。対照サンプルは緩衝
剤のみを含むものであった。

各検量サンプルに対し、一般的なキャリー（Ｃａｒｙ　
）　２１９分光光度計を用いて３７℃及び４２０、５　
ｎｍで５分関数試料について経時的な吸光度の変化を測
定した。吸光度の測定値は各サンプル（りいて平均した
。吸光度及び阻害率−の結果を以下の表Ｉに示した。チ
阻害率とテオフィリン濃度との標準検量曲線を作成した
。

表Ｉ Ｏ，２８０，１３５５，６ ０，５６０，１２５１２，６ ０，１２５０，１１９１６，８ ２，２５０，１００３０，１ ４，５０，０８３４２，０ 例２ 例１の方法を用いてヒト血清サンプル１０点のテオフィ
リン分析を行なった。推定テオフィリン濃度は例１で得
られた検量線から得られたものである。結果は表■に示
した通シである。

表■ サンプル　　（Ａ０２，５画）　　　　　　　　　　（
ダ／−）０（対照）　　　０．１４３　　　　　０　　
　　　　０１　　０．１１６　１８．９　　１．３２　
　０．１４５　　０　　０ ３　　０．１２３　１４　　０．８２ ４　　０．１４２　　０　　０．０５ ５　　０．１２０　１６．１　　１．０７６　　０．１
２２　１４．７　　０．９７７　　０．１２３　１４．
０　　０．９２８　　０．１１７　１８．２　　１．２
５９　　０．１０１　２９．４　　２．２０１０　　０
．１１０　２３．１　　１．６２この１０個のサンプル
は２個麿の別の分析研究所へ送ってテオフィリンの対比
分析を依頼した。

第一の研究所（１）では市販のシバ社（５ｙｖａ　Ｃｏ
ｒｐ−ｍ米国カリフォルニア州）臂ロアルト）　＋７）
　ＥＭＩＴ　免疫法を用いてサンプルの分析を行なった
。第二の研究所値）では７　Ｎ　ｙトラポラトリー（Ａ
ｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏ、。

米国イリノイ州シカゴ）から市販の蛍光偏光免疫法を用
いてサンプルの分析を行なった。結果は以下の表■に示
す通シであり九。

表■ サンプル（Ｖａ）　　　　　　（ＷＩ９／ｄｔ）　　　
　（１ｊ９／ｄｔ）１．１．４　　　１．３　　１．３ ２　　０．２２　　０．２　　０ ３　　０．８９　　０．８２　　０．８２４　　　　２
．２６　　　　　２．３　　　　　０．０５＊５　　１
．０９　　１．０６　　１．０７６　　０．９８　　０
．９５　　０．９７７　　０．９４　　０．８７　　０
．９２８　　１．６０　　１，５７　　１．２５９　　
２．９７　　２．７８　　２．２０１０　　１．９２　
　１．８０　　１．６２本発明は標準的テオフィリン分
析に十分匹敵するものであった。サンプル４のＣｏ）印
のものはサンプルを入手した患者に特有の別の健康因子
によって影響されたものと思われる。

例３ 分析素子によるテオフィリン分析 以下のフォーマットと組成を有する分析素子を用いてヒ
ト血清サンプルのテオフィリンを分析す、６０ＫＪ”Ｉ
ｌｌ／’＝７’Ｃ・　　　　　　　　　　　　　以下余
白〜 各サンプルのテオフィリン濃度はサンプル１０μを容積
を素子の多孔性拡布層上に滴下することによって求めた
。３７℃でのインキュベージ、ン中に酵素活性の速度を
一般的な臨床化学アナライデーを用いて４０２．５ｎｍ
で生成色素の吸光度を測定して求めた。得られた結果を
市販のテオフィリン分析法（アゲブト法）による結果と
対比して表■に示した。表■の結果から明らかなように
、両者の相関関係は極めて良好であった。

表■ 推定テオフィリン濃度（〜／−） 本発明法　　　アゲブト法 ５．６５　　　　　４・３ ７．８７　　　　　７．５ ８．２５　　　　　９．６ １１．５５　　　　　１１．０ １４．５７　　　　　１４．２ １５．８２　　　　　１５．８ １６．０７　　　　　１７．０ ２０．３　　　　　２０．７ ２０．５　　　　　２４ 統計的相関データ：スロープ０．８６．インターセプト
１．４．相関因子（ｒ）０．９３００例４（比較例） 本例は分析ｔ−９よシ大きい声値で実施した場合のテオ
フィリン分析に及ぼす内因性アルカリホスファターゼの
悪影響を例示する。比較のために本　、発明の分析を一
９未満で実施した。

前記例１で述べた分析方法を用いて比較テオフィリン分
析をｐＨ９，５（従来法）及び−８（本発明法）で実施
した。各試験溶液は以下の組成であった。

酢酸マグネシウム５００μｔ （最終濃度１０　モル濃度） ウシ肝臓アルカリホスファターゼ２００μＬ。

及び ｐ−ニトロフェニルホスフェート１− （最終濃度１６ミリモル濃度） ｐＨ８の試験溶液はトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
エタン、　Ｈｃｔ緩衝液１−（最終濃度０．１５モル濃
度）を含み、ｐＨ９，５の試験溶液はアデノシン−５／
−モノホスフェート緩衝液１ｍ（最終濃度０．１モル濃
度）を含むものであった。

０又は２０　＊／＊のテオフィリンを含む血清サンプル
（５００１ｔｔ）をいずれかの試験溶液を含むキエペッ
トに添加した。血清サンプルはＯ又は１０００１、Ｕ、
／Ａのヒトアルカリホスファターゼを含むものでありた
。内因性（即ちヒトの）アルカリホスファターゼ（ＡＬ
Ｐ　）による妨害量は表Ｖに光学濃度（０，Ｄ、）の−
変化で示した通りである。

表■の結果から明らかなようにｐＨ９，５では内因性ア
ルカリホスファターゼが著しい妨害を示したのに対し、
本発明では最小であった。

表Ｖ ０　０．６２０．６６　６１．３１．７４３４２０　０
．４８０．５０　４０．７６０．９８２９〔発明の効果
〕 本発明はテオフィリンによるアルカリホスファターゼ酵
素活性に及ぼす阻害効果を測定することによってテオフ
ィリンの分析に用いることができる。しかしながら、Ｗ
ｉｎｅｔらの酵素阻害分析とは違って、本発明は血清サ
ンプル中の内因性アルカリホスファターゼの影響ｔ−回
避した迅速で簡単な分析を提供し、サンプルの前処理や
分析前の内因性アルカリホスファターゼの除去のいずれ
かを用いる従来技術のような多段の面倒な方法による必
要がない。

これらの特長は従来技術で教えられている声よシ臨界的
に低い−でヒト生体液のテオフィリンを分析することに
よって達成される。本発明者は２９以下で内因性ホスフ
ァターゼを不活性化し得ることを見出した。従って、目
的の分析はｐＨ９以下で活性のアルカリホスファターゼ
の同位酵素を用いて実施される。本発明は分析の実施ま
で素子の別々のゾーンに同位酵素及びその基質を含ませ
た場合に、これらを含む乾式分析素子を用いて実施する
ことができる。本発明は、前処理や抽出工程を必要とし
ないので、迅速で簡単な分析方法のために設計された高
度に自動化された臨床化学装置に適用するのに容易に適
合化することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ｐＨ９以下でアルカリホスファターゼの同位酵素に
   対する基質に作用することができるアルカリホスファタ
   ーゼの同位酵素を含む第一のゾーン及び前記同位酵素に
   対する基質を含む第二のゾーンを含んで成るヒト生体液
   中のテオフィリン分析用の乾式分析素子。 ２、ｐＨ９以下でアルカリホスファターゼの同位酵素に
   対する基質に作用することができるアルカリホスファタ
   ーゼの同位酵素、前記同位酵素に対する基質、及び組成
   物をｐＨ９以下に保持する緩衝剤を含んで成るヒト生体
   液中のテオフィリンを分析する分析用組成物。 ３、（Ａ）ｐＨ９以下においてアルカリホスファターゼ
   の同位酵素に対する基質に作用することができる前記同
   位酵素及び同位酵素用基質の両方とヒト生体液の試料と
   をｐＨ９以下で物理的に接触せしめ、そして （Ｂ）検知可能な変化を測定する 工程を含んで成るヒト生体液中のテオフィリンを分析す
   る方法。