JPH04210599A - 体液中の二酸化炭素の定量アッセイのための方法及び要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明は臨床化学に関する。より
詳細には、本発明は体液、例えば血清中の二酸化炭素定
−量アッセイ方法およびそのための要素に関する。

【従来の技術】かなりの量の二酸化炭素がヒＩ−を初め
とする哺乳類では発生している。一般的に、発生する非
常に少量のＣＯ２が利用されているにすぎず、残りは廃
物であり排泄されねばならない。このような排泄の一手
段としては、体液、例えば血流を介するものが挙げられ
る。血流中の二酸化炭素濃度は体調に深い係りがある。 従って、血液または他の体液における二酸化炭素含量の
測定は、正確で適確な国家診断にとって重要な手段とな
る。体液に適用される場合の二酸化炭素含量の語は、次
の平衡式

【１】 ％式％ に従う重炭酸塩イオン、炭酸および溶解した二酸化炭素
の総和を意味する。米国特許第３，９７４，０３７号明
細書は、体液における二酸化炭素の数種の酵素的測定方
法を公表する。これらは、下記（１）、　　（２）、　
　（３）または（４）のいずれかの反応を伴うアッセイ
を含み、それぞれで発生するオキサロアセテートは下記
の反応によって測定されている。

【化２】 ＰＥＰカルボキシラーゼ （１）ホスホエノールビルベー）＋ｌＩＣ０ｓ−オキサ
ロアセテー）＋Ｐｉ ここでＰＥＰカルボキシラーゼはホスホエノールビルビ
　　※

【化３】ン酸カルボキシラーゼであり、Ｐｉは無
機リンである。　※ピルベート （２）　　ＡＴＰ＋ピルベート＋ａＣＯ，−オキサロア
セテート力ルポキシラーゼ ＋ＡＤＰ＋Ｐｉ （３）ホスホエノールピルベート＋ＨＣＯ３−＋＾ｎＰ ＢＰ カルボキシキナ−ぞ オキサロアセテート４−＾ＴＰ 上式中、ＡＤＰはアデノシンジホスフェートを表し、Ａ
ＴＰはアデノシントリホスフェートを表す。　（３）で
示される反応では、ＡＤＰを使用される起源に応じて別
のヌクレオチドジホスフェート類で置き代えてＰＥＰカ
ルボキシキナーゼに適合させることができる。二酸化炭
素★（４）ホスホエノールピルベート＋ｔｔｃｏｓ★に
対するさらに可能な酵素的アッセイとしては、ホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ピロホスフェー
ト）と無機リンを使用する次の反応が挙げられる。

【化４】 十Ｐｌ オキサロアセテート十ＰＰｉ カルボキシキナーゼ（ピロホスフェート）上式中、 ＰＰｉは無機のピロホスフェートを表す。　　　☆　☆

【化５】■躍 （５）オキサロアセテー）＋ＮＡＤＩ＋　Ｉｆ”　　−
マレ−）＋ＮＡＤ”上式中、ＭＤＨはリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼを表し、ＮＡＤＨは還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドを表し、ＮＡＤはそれの酸化型を表
す。反応（１）。 （２）、　　（３）または（４）のそれぞれが反応（５
）と組み合わされた場合、一定ｐＨに維持しつつＮＡＤ
Ｈの濃度変化を測定することによってＣＯ２またはＨＣ
Ｏ３−などのいずれかにより二酸化炭素含量の目安とす
る。 このアッセイは、所定量の体液試料、一般に血清もしく
は血漿のような体液と共に　（１）と（５）、　（２）
と（５）、（３）と（５）または（４）と（５）で必要
とされる試薬類のすべてを混合することによって行われ
ている。体液試料がいずれかの血液を含む場合には、し
ばしば溶血、すなわち赤血球または赤血球細胞の破裂を
起こす。従って、溶血工程がヘモグロビンや炭酸脱水酵
素（カルボニックアンヒドロラーゼ）を初めとする赤血
球中のすべての内容物を体液内へ放出することになる。 そのため、ヘモグロビンの測定は溶血程度の目安となり
、しかも体液内へ放出される炭酸脱水酵素の相対的な鷹
の指標となる。炭酸脱水酵素は、次の反応

【化６】 ｒ　＋ａｃｏ、−３ｃｏ、　＋Ｈ，０ を触媒するので、それは体液におけるＨＣＯ３−とＣＯ
２の平衡を変動可能な範囲までシフ１へする。反応（１
）〜（４）により溶血試料を用いる総二酸化炭素の酵素
的測定方法は、非溶血試料と対比すると総ＣＯ２のアッ
セイに偏差をもたらす。米国特許第３，９７４，０３７
号は、そこに記載される酵素的アッセイ方法の精度は試
験溶液に炭酸脱水酵素を添加することによって向上でき
ることを教示する。

【発明が解決しようとする課題】逆に、本発明者らの研
究では、体液における炭酸脱水酵素（内因性または外来
）の存在が総ＣＯ２に対する酵素的アッセイに許容でき
ない不正確さをもたらすことがわかった。

【課題を解決するための手段】本発明は、アセタゾラミ
ドと体液を接触させる工程を含んでなる体液中の二酸化
炭素（ＣＯ２）の酵素的定量アッセイ方法を提供する。 本発明はまた、ａ）アセタゾラミドを含みそして湿潤時
にｐＨ９，０まで、好ましくはｐＨ７，０〜９．０を示
す展開層、ｂ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼおよびホスホエノールピルビン酸塩を含む試薬層、
ならびにＣ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼを含む記録層、を
含んでなる体液中のＣＯ２定量アッセイのための多層乾
式要素も提供する。前記要素および方法は、反応（５）
と組み合わされる酵素反応（１）、　　（２）、　　（
３）または（４）のいずれかをベースにする。前記要素
は前記方法を実施する際に使用される。体液試料が要素
に適用されたとき、アセタゾラミドがそれらと接触状態
になる。 以下、本発明を具体的に説明する。この発明のアッセイ
で使用される試薬類の量は、試験される体液試料中に普
通に見い出されるＣＯ２範囲との関連で平衡式（１）か
ら（５）の化学量論的な関係に基づいて当業者により容
易に決定される。アセタゾラミド量は、かなり溶血され
た体液で遭遇する可能性のある炭酸脱水酵素の阻害量よ
り過剰に存在させる。このような過剰量は、炭酸脱水酵
素に対するアセタゾラミドの阻害定数（Ｋｉ）から当業
者が容易に設定することができる。これらの範囲外にあ
る総二酸化炭素量や炭酸脱水酵素量は、分析化学者に既
知の化学量論的関係に基づく調整および他の調整、例え
ば試料の希釈または濃縮を行うことによって処理するこ
とができる。〜般的に、本発明者らはアセタゾラミドが
アッセイ溶液で最低０．１ミリモル／Ｌにて使用される
か、または乾式分析要素中で１０〜＋０００ｍｇ／ｍ”
の範囲内の含有率にて使用される場合に阻害剤として有
効になりうろことを見い出した。式（］、）、　　（３
）および（５）に示すような必須の酵素反応を行う上で
使用する試薬類のすべては市販されている。反応（２）
および（４）の酵素類は、例えば、大学の複数の研究室
から入手できる。溶液アッセイは、ヒトの血液のような
体液の所定量（適量）にとって選択された酵素化学反応
式で必要とされる適量に対する過剰量の各試薬を混合す
ることによって行うことができる。過剰量とは、本発明
者らは体液中の予測されるレベルの総二酸化炭素および
／または炭酸脱水酵素と反応するのに必要とされる予測
された化学量論量を越える試薬量を意味する。例えば、
平衡式（１）および（５）に従って行われる酵素的アッ
セイでは、初発ｐＨ（約６．５〜］、０．５）において
、過剰量のホスホエノールピルベート、ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ、りンゴ酸デヒドロゲナー
ゼ、ＮＡＤＨおよびアセタゾラミドが正確に測定された
（所定）鼠の体液試料と張合されるであろう。ＮＡＤＨ
の濃度変化は、２５℃と４５℃間の一定温度および、通
常６．５と１０．５の一定ｐＨにおける２９０と３８０
　ｎｍ間、好ましくは３４０ｎｍにおける光りの吸光度
の減少に正比例する。ＮＡＤ）−（濃度は、常用の分光
光度計を用いて当業者が容易に測定することができる。 ＮＡＤＨの濃度変化は、オキサロアセテ−１−の生成に
比例する。オキサロアセテ−１〜の生成はこの系におけ
る重炭酸塩濃度の関数である。従って、３４０ｎｍにお
ける吸光度変化を試料流体中に現在する重炭酸濃度の直
接的な測度として使用することができる。他の波長、例
えば３６６　ｎｍが上述の目的に使用できることも理解
しなければならない。 さらに、吸光度測定を行うことのできる波長に変化しう
るレドックス色素系と本発明の酵素系を組み合わせるこ
とができる。この発明によって提供される乾式多層試験
要素は、１つ以上の試薬帯または試薬層および１、つ以
上の記録帯または記録層を含んでなる。層のすべてにつ
いて以後、帯とも称する。本発明の−の態様では、要素
が試薬層と記録層との間に１つ以上の緩衝層も含む。要
素の各層は自立性であってもよいが、支持体上に置かれ
ることが好ましい。試薬層は浸透性でかつ多孔性である
ことが好ましい。多孔性に起因する浸透性を初めとする
浸透性は、米国特許第４，１４４，３０６号（上述）明
細書に記載される各種のキャリア、マトリックスまたは
バインター、例えば繊維質または多孔質の非繊維質を存
在させることによって付与することができる。この発明
の好ましい浸透性バインダーは、上述の部類に入るブラ
ッシングしたポリマー類である。また、多孔性キャリア
として有用なものは、分散した状態で不活性粒状物、例
えば微結晶セルロースを有するポリマーバインダーであ
る。光を反射する目的で試薬層に顔料粒子を組み込んで
もよい。記録層は前記米国特許第４，１４４，３０６号
明細書に記載されている。この記録層は、試薬層から拡
散するオキサロアセテ−１−を浸透可能であり２９０と
３８０ｎｍ間でＮＡＤＨの分光光度測定を可能にする。 記録層は試薬層由来の拡散性物質を受容するのに適する
。 本発明の好ましい要素は、展開層、下塗り層、試薬層、
記録層または記録／試薬層の組み合わさったものを含む
。これらの層の成分および要素におけるそれらの位置は
、当該技術分野で既知であり、米国特許第３，９９２．
１５８号および上述の同４，１４４，３０６号明細書に
記載されている。例えば、展開層は等方性の多孔質であ
ることができ、このような多孔性は不活性粒状物および
／またはプラッシュポリマーの使用によって付与するこ
とができ、そして要素の最外層としての試薬層に隣接し
て配置することができる（多層要素が使用される場合）
。本発明のいずれかの層は、周知の添加剤、例えば上述
の米国特許第４，１４４，３０６号明細書に記載される
ような緩衝剤、界面活性剤または塗布助剤も含んでよい
。本発明の多層要素は、当該技術分野で周知の各種の積
層法または塗布法、例えばハンドコーティング、ブラッ
ドコーティング、ビードコーティングまたは浸漬コーテ
ィングによって作製することができる。これらの要素は
自立性であるかまたは支持体上に保持されていてもよい
。有用な支持体としては、各種のポリマー材料、例えば
酢酸セルロース、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポ
リカーボネートおよびポリスチレン類のようなポリビニ
ル化合物が挙げられる。この支持体は、２９０と３８０
　ｎｍ間の輻射線に透過性である。支持体材料と共に塗
布法および積層法は、上述の米国特許第４，１４４．３
０６号明細書にさらに記載されている。塗布可能な試薬
層は、塗布溶液またはバインダーを含む分散体であって
、本明細書で説明するように塗布しそして乾燥したとき
寸法安定性の帯を形成する。いずれかの試薬層の厚さと
その浸透性の程度は、現実の使用に応じて広範に変動し
うる。乾燥厚さ１０〜１００ｍμが便利であるが、広範
に変動させた厚さのものも使用することができる。繊維
質試薬層は、周知の方法により繊維マトリックスの含浸
によって形成することができる。記録層および他の層は
、塗布可能な試薬層を形成する場合に使用したような方
法および厚さで形成することができるが、個別の層に適
する構成を有する。本発明の要素は、その要素にアッセ
イすべき体液試料を適用することによって使用される。 一般に、要素は体液が１つ以上の展開層または展開帯と
最初に接触するように形成されるであろう。その液体の
適用後、要素はいずれかの試験結果を速めるかまたは促
進するのに好ましいいずれかのコンディショニング、例
えば加熱または加湿下にさらすことができる。 展開層から試料の拡散および試薬層で生成したオキサロ
アセテートの記録層への拡散ならびにそのオキサロアセ
テートとＮＡＤＩ−（どの反応を可能にする適切な時間
後、その記録帯における検出可能な物質の量が分光光度
計で測定される。このような測定は、反射分光測光また
は透過分光測光に適する装置が提供する区画に前記要素
を通過させることによって行うことが可能である。この
ような装置は、支持体ならびに試薬および記録層を通過
するエネルギービーム、例えば光の方向を規制するのに
役立つ。次に、光を検出手段まで反射させるか、透過率
検出の場合には光が検出器まで要素を通過する。反射分
光光度計は、要素上または要素内に残る可能性のある残
滓、例えば血液細胞による妨害を有効に避けることがで
きるので一定の状況下ではそれを使用することが有利に
なりうる。血清が試験されるかまたは好ましくない全血
残滓を除去する手段が講じられた場合、要素の一表面に
紫外線流を向けそして要素のもう一つの表面からの紫外
線エネルギーの出力を測定することによるＮＡＤＨの検
出および定量に透過法を使用することができる。各種の
検量法を使用して分析用の基準を提供することができる
。ある例では、分析の示差測定法の使用を可能にするた
め、試料の液滴が置かれた領域の隣りに標準試験液試料
を適用することもできる。

【実施例１例にこの例は、従来技術の酵素的Ｃ０２処理
（米国特許第３，９７４，０３７号）によると溶血が実
際に負の偏差をもたらすことを示す。貯蔵溶血液を適当
なヒト給血者から新鮮な血液を集めることによって調製
した。血液の赤血球を集め、次いで生理食塩水で４度洗
浄した。次に、これらの赤血球を一７０℃への凍結と３
７℃での解凍からなるサイクル５回で溶解した。得られ
た溶血をワラ１−マン（Ｗｈａ　ｔｍａｎ）Ｎｏ、１　
　（Ｗｈａｔｍａｎ　　Ｌｔｄ、英国）濾紙を介して濾
過した。 ヘモグロビン濃度（ｍｇ／ｄＬ）をＳｃａ、Ｊ、Ｃ１１
ｎｉｃａｌ　　Ｌａｂ、ｒｎｖｅｓｔ、ＩＩ、６６〜７
０ページ、１９５９に記載されたＨａｒｂｏｅの方法に
よって測定した。ヘモグロビン濃度は、溶血貯蔵液中の
炭酸脱水酵素レベルに直接関連していた。重炭酸塩５０
ミリモル／Ｌ　（４，２ｇ　　ＮａＨＣＯ３／Ｌ）の貯
蔵液をトリシン１００ミリモル／Ｌ　（１７，９２ｇト
リシン／Ｌ）の緩衝液（ｐＨ８，０）で調製した。他の
緩衝液も使用可能である。この貯蔵重炭酸塩溶液を（ａ
）前記緩衝液または（ｂ）前記貯蔵溶血液およびその緩
衝液のいずれかで希釈し、ＨＣＯ３−約２５ミリモル／
Ｌ試験溶液試料といろいろな濃度のヘモグロビン試験溶
液試料を提供し、炭酸脱水酵素存在量の測度とした。コ
ーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）９６５二酸化炭素アナライ
ザーの熱伝導度法で各試験試料のＣＯ２に対する基準値
（表■）を測定した。対照の処理法は炭酸脱水酵素によ
って悪影響を受けない方法であった。この処理は、Ｊ、
Ｂｉ。 １、　Ｃｈｅｍ、　、　　６１　：　５２３ページ、１
９２４に記載されている。ＣＯ２に対する酵素法の値は
、ＥＫＴＡＣＨＥＭ臨床化学アナライザー（Ｅａｓｔｍ
ａｎ　　Ｋｏｄａｋ　　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｈｅｓ
ｔｅｒ、ＮｅｗＹｏ　ｒ　ｋ、より入手可能）の乾式化
学スライドにより各試験試料について測定したものであ
る。このアッセイの原理は、上述の反応系（１）と（５
）によって示されるようなものである。この発明の要素
が反応（２）〜（４）のいずれか１つへ容易に適用でき
ることは当業者にとって明らかであろう。この乾式要素
は炭酸脱水酵素阻害剤を含まない。これは以下のフォー
マットを有していた。 【表１】

【表２】 ２ヱニヱヱ上 展開層 下塗り層 試薬層 硫酸バリウム 酢酸セルロース ＴｒｌＬｏｍ　Ｘ−４０５界面活性剤 トリス（ヒＹロヰシメチル） アミノメタン（ｒｕ緒） トリス塩酸（Ｔｒｌｓ　ＩＩｃＩ） ｂｔａｎｅ樹庸 Ｎ−ビニルピロリドン （ＰＶＰ） ゼラチン Ａｌｋａｎｏｌ　ＸＣ′＃ｉｌ活性剤 Ｚｏａｙｌ　ＦＳＮ　ｌｉｊ活性剤 Ｍｇ５ｏ。 トリシン ホスホエノールピルベート ホスホエノールピルビン酸 カルボキシラーゼ 乾燥被覆量 １７！ニー １０８−５９２　ｇ Ｂ、８２９Ｊ！ ２．１５９ｇ １．３８５ｇ １−２０３゜ １．０８２ｇ １．０７０ｇ １０．０　ｇ ｏ、１ｇ ＬＯ２゜ ０．５０　ＪＩ ３．４０１ｇ ３．２５　＄ ＊＊ 一しラＤ− 父−２５０ｇ ２．０−１０．０ｇ ０．５−５．０ｇ ０．０−５．０　ｇ ０．０−５．０　ｇ １．０−５．（ｌ　ｇ ０．３−５．（）　ｔ １．０−２０．０ｇ Ｏ，Ｇ５−２．５　ｇ ０．０１−２．５　ｇ ０．１−５．０　ｇ ０．５−５．Ｏｇ ２．５−１０．０ｇ １、（Ｘ）Ｏ−２０，０（ＩＯＵ 記録層 ゼラチン Ａｌｋａａｏｌ　ＸＲ１１ｌ活性剤 Ｚｏｍｙｌ　ＦＳＮ昇面活性刑 ビス（ビニルスルホニル メチル）エーテル（ＢＹ望Ｅ） トリシン ＮＡＤ）［ ＭＤ）Ｉ ’１１４　ｇ ０．１　ｇ ０　、０２０　ｘ Ｏ，１７３ｇ ３．４０１ｇ ３．０　ｇ ０７６　Ｕ １．０−２０．０ｇ Ｏ，Ｇ５−２．５　ｇ ０．０１−２．５　ｇ Ｇ−２，５ｇ ０．５−５．０　ｇ ２．０−５．０　ｇ １．０００−３０．ＧＯＯＵ 試験 試　料　ヘモグロビン 一蝕−−１１乙ルＬ 盈−１ ＜卵０１／　Ｌ　） 藁！　　　酸Ｓ法 ２４．３　　　　２３．３ ２４．１　　　　２２゜９ ２４．２　　　　２２．９ ２３．９　　　　２ｍ、７ ２４．０　　　　２２．１ ２４゜１　　　　２０．２ ２４゜３　　　　１６．８ 詔、９　　　　１５．７ ２３゜１　　　　１４．０ 偏　　差 一伽厳しクリ− −１，０ −１，２ −１，３ −２，２ −１，９ −３゜９ −７．５ ８．２ ９．１ 試験溶液におけるヘモグロビン濃度の増大によって示さ
れるような炭酸脱水酵素のレベルに従って、基準値に比
較した場合の前記酵素的アッセイ（酵素法）における負
の偏差が増大した。この偏差は、ヘモグロビン約６　ｍ
　ｇ／ｄＬにおいて有意になってくる。 例２：この例は、例１で見られる負の偏差が炭酸脱水酵
素に起因することを確認する。重炭酸塩５０ミリモル／
Ｌ貯蔵液をトリシン１００ミリモル／Ｌ緩衝液で希釈し
て重炭酸塩約２５ミリモル／Ｌ液を得た。この溶液に精
製炭酸脱水酵素（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　
Ｃｏ、　）を加えた。炭酸脱水酵素を含まない重炭酸塩
貯蔵液を対照として使用した。

【表３】 炭酸脱水酵素 盈−■ 重囲１１伽貌Ｖ工γ ｉ！　　胛員癒 ２２．３　　　２２．１ ２２．０　　　１０．８ ａ　　差 （ｒｗｉｏｌ／　Ｌ　） −０，２ −１１，２ この結果より、例１で見られる偏差は、溶血を介して赤
血球から放出される炭酸脱水酵素に起因している。 例３：この例は、ＣＯ２に対する酵素的アッセイの炭酸
脱水酵素の偏差抑制に対するアセタゾラミドの有効性を
例証する。各種の炭酸脱水酵素阻害剤を試験した。すべ
て市販されている。重炭酸塩５０ミリモル／Ｌ貯蔵液を
トリシン］、　ＯＯミリモル／Ｌ緩衝液（ｐＨ８，０）
で調製した。この重炭酸塩貯蔵液を、　（ａ）試験炭酸
脱水酵素阻害剤だけを含有する前記緩衝液（内部基準）
、または（ｂ）炭酸脱水酵素阻害剤と希釈した溶面貯蔵
液を含有する前記緩衝液のいずれかで希釈して最終ヘモ
グロビン濃度２００ｍｇ／ｄＬとした。すべての溶液を
室温で１−時間インキュベーションした後、例１で使用
した酵素法ＣＯ２スライドＬに試料としてスボットシた
。結果を表ＩＩＩに示す。

【表４】 鳳−豊一戸 ナジ アジド チオシアネート グリシン ［）Ｌ−アラニン ＨＥ［）ＴＡ” ２．５ ２゜５ ２０．０ 冗、０ ５．０ 表　ＩＩＩ 重１帽１ｊ竺Ｖ１Ｌ り腹王衾皇ｌ血皇宣 ２２．３　　　　１５．９ ２３Ｊ　　　　　１６．５ ２２．０　　　　１５．３ ２２゜４　　　　１４．３ ２２．９　　　　１４，３ ２３．３　　　　１５．７ 最終阻害剤 濃度（閤ａｌ／Ｌ） 優　　斧 （ｒｍｏｌ／Ｌ） −６，４ −Ｇ、７ −８．１ −８．６ −７．６ ＩＤＴＡ”　　　　　　　　　　　　　　　　５．０　
　　　　　　　　２２，８　　　　　１４．７シアニド
　　　　　　　　２．５　　　　　　ｎ。５　　　１８
．７ジチオエリスリトール　　５Ｊ　　　　　　　２３
．３　　　１７．５スル７アニルアミド　　　２，０　
　　　　　２２．８　　　１４．９スルフ１チアゾール
　　　２．Ｑ　　　　　　　２４．２　　　１５．８ア
セタゾラミド　　　　　１，０　　　　　　２３゜２　
　　２２．９”ｔｉＥＤＴＡ　８　Ｎ−ヒドロキシエチ
ルエチレンジアミン三酢酸ＥＤＴＡ　！エチレンジアミ
ン四酢最 −８，１ −３゜８ −５．８ ７．９ −８．４ 一〇、３ 試験した炭酸脱水酵素阻害剤の中でアセタゾラミドが酵
素的ＣＯ２アッセイの負の偏差を最も効率よく減少させ
た。 例４：前記酵素的ＣＯ・乾式化学要素にアセタゾラミド
を含めると調製したばかりの溶血でみられる偏差を有意
に減少する。アセタゾラミドを例１に記載したような酵
素的ＣＯ２乾式要素の展開層中に含まぜた。アセタゾラ
ミドを試薬層に含ませたときも同様の効果を示した。ト
リシン１００ミリモル／Ｌ緩衝液（ｐＨ８，０）により
重炭酸塩５０ミリモル／Ｌ貯蔵液を調製した。この重炭
酸塩貯蔵液を、　（ａ）前記緩衝液または（ｂ）前記溶
血貯蔵液と前記緩衝液のいずれかで希釈してＨＣｏ　３
−約２５ミリモル／Ｌと各種濃度のヘモグロビンの試験
液を得た。この試験液を、アセタゾラミドを含有しない
要素（例１に記載したような）と展開層にアセタゾラミ
ドを含有する要素上にそれぞれスボッ１−シた。アッセ
イ結果を例１に記載した基準の方法で得た重炭酸塩値と
比較して偏差の測度を得た。

【表５】 盈−式 ％式％（１ ｔ１力１４弗と アセタゾラミド不含有 −」−一１−ｍ− アセタゾラミド含有 一−！−−員一一一 ０．６１ −３．５９ −４．３９ ５．３９ −５．７Ｏ −ｓ−ｒ！ −０，８３ −１，４４ −１，４４ −１，９４ １，９Ｇ 例５：この例は、酵素的ＣＯ２乾式化学要素ヘアセタゾ
ラミドを含めることが、溶血した患者試料および一見濡
血していないような患者試料で見られた偏差を効率よく
除去することを示す。目に見えて溶血している試料と一
見溶血していないような試料を、アセタゾラミド含有力
折要素および不含有分析要素上にスポットすることによ
りＣ０２について分析した。各個を例１に記載したよう
な基準Ｃ○２方法で得られた値と比較した。例１に記載
したような方法で各試料中のヘモグロビンが定量された
。

【表６】 −ｙ 炭酸塩ａ差（ｍｏＬ／Ｌ） ヘモグロビン 盪鷹ユ鴎Ｚ虱Ｌ １セタゾラジド 不含有！Ｉ！嚢 アセタゾラミド 」１ −０．７１ −２．２２ −１．２９ −１．６３ −３．１１ −３．５７ −０．１７ １．１２ ０．１６ ０．４５ ０．２９ −０．２０ −２，５９ ０，９６ −４，２３ −０，２７ ０，１８ −０，１４

【発明の効果】酵素的アッセイでアセタゾラミドを含め
ると、体液中に存在する炭酸脱水酵素によってもたらさ
れるＣＯ２の測定量に対する不正確さが減少し、では完
全に解消される。 ある例

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）所定量の体液を、過剰量のアセタゾ
   ラミド、ホスホエノールピルベート、ホスホエノールピ
   ルビン酸カルボキシラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
   および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドと
   混合する工程、ならびに（ｂ） この混合物を実質的に一定の温度と実質的に一定のｐＨ
   に保持することにより生ずる前記混合物中の還元型ニコ
   チンアミドアデニンジヌクレオチド濃度の変化を測定す
   る工程、を含んでなる体液中の二酸化炭素（ＣＯ＿２）
   の酵素的定量アッセイ方法。
2. 【請求項２】ａ）アセタゾラミドを含みそして湿潤時に
   ｐＨ７．０〜９．０を示す展開層、 ｂ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼおよび
   ホスホエノールピルビン酸塩を含む試薬層、ならびに ｃ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよ
   びリンゴ酸デヒドロゲナーゼを含む記録層、を含んでな
   る体液中のＣＯ＿２定量アッセイのための多層乾式要素
   。