JPS6252467A - タンパク質分析用多層分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、血液、血清及び尿のような液体試料中のタン
パク質分析用の一体型多層分析素子に関する。

［発明の背Ｉｌｌ 液体試料中の総タンパク質の分析は、従来、ごウレット
反応を利用した溶液法（湿式法）により行われていた（
例えば、菅原、副島著、蛋白質の定岱法、学会出版セン
ター（１９７７）参照）。この湿式法は有用ではあるが
、操作が煩雑であり、高価で複雑な分析装置を必要とし
、また、分析に要する時間が長いという欠点があった。

このような湿式法に代わるものとして、低コストで簡易
かつ迅速に分析が可能な乾式法と呼ばれる方法及びそれ
に用いられる分析素子が提案されている。例えば、特開
昭５４−１０１３９８号公報には、液体試料を受容して
定伍的に拡げるための展開層と、試料を保持し発色反応
が行われる試薬層とを有する一体型多層分析素子におい
て、該試薬層が実質的にナトリウムイオンを含まず、使
用条件下で素子内をｐｌ−１約１２．０にするのにト分
な量の塩基と、アルカリ保護性ポリマーとを含むことを
特徴とする、ビウレット反応を乾式一体化した分析素子
が開示されている。このような乾式一体型分析素子にお
いて試薬層にナトリウムイオンが含まれていると、試薬
層を塗布形成する際、塗布液が相分離を起こしやすく、
また塗布面が均一になり難いなど塗布性に難点がある。

しかもナトリウムイオンが含まれている試薬層は吸湿性
が高く、そのために性能劣化が起こり黄変速度が早いと
いう欠点がある。したがって、このような一体型分析素
子においては、従来の溶液法において一般的に用いられ
ているビウレット試薬、すなわち、ロッシェル塩（酒石
酸ナトリウムカリウム）や水酸化ナトリウム等のナトリ
ウムイオン液を含むビウレット試薬をそのまま用いるこ
とはできなかった。

更に特開昭５８−８５１６３号公報には、ナトリウムイ
オンを含むタンパク質分析用多層分析素子が開示されて
いる。これらは、ビウレット試薬を含む耐アルカリ性ポ
リマーから成る試薬層に、アルカリ金属イオン錯化剤を
含有させたものである。

しかしながら、これらアルカリ金属イオン錯化剤として
記載されているポリアルキレングリコール、クリプテー
ト、クラウンエーテル等は高濃度で耐アルカリ性ポリマ
ー中に含有されると、塗布液が相分離を誘起するだけで
なく、塗布した試薬層は、これら化合物の析出によるい
わゆる発汗用象を起こし、劣化の原因となるという欠点
を有していた。

上記欠点を改良するものとして、特願昭６０−７２５９
４号には、ごウレット試薬を含有する蛋白質分析用分析
素子において、スルホン酸塩型のアニオン性界面活性剤
を含有させ、特に分析素子の保存安定性が改良されるこ
とを開示されている。

このスルホン酸塩型のアニオン性界面活性剤は、特にナ
トリウムイオンを含む塩基（Ｎａ　０）−１）で、あっ
ても十分な保存安定性を分析素子に付与することができ
る。しかしながら、疎水基の炭化水素系の基を有するス
ルホン酸塩は、強アルカリ条件下で系外に析出しやすい
傾向を有しており、このため塗布性が不安定になりやす
く、不均一な膜厚分布を有する試′ａ層が形成されやす
く、この結果発色濃度のバラツキによる分析結果の同時
再現性が悪い傾向があった。

［発明の目的］ 本発明の目的は、安定で、分析結果の同時再現性が良好
なタンパク質分析用多層分析素子を提供することにある
。

［発明の構成］ 液体不浸透性でかつ、光透過性の支持体上に、水溶性第
二銅塩、銅キレート化剤もしくはその前駆体、１）８１
２以上にするために必要な塩基を含有する非タンパク質
性親水性ポリマー層からなる試薬層、さらに多孔性展開
層を順次積層してなるタンパク質分析用多層分析素子に
おいて、前記試薬層は下記一般式で示されるアニオン性
界面活性剤を含有するタンパク質分析用多層分析素子に
より達成される。

一般式 ％式％ 式中、Ｍは１価の陽イオンを表わし、ｎは２〜１１の整
数を表わす。

［発明の具体的構成］ 本発明の多層分析素子の基本構造は、透明支持体、試薬
層、試料展開層がこの順にあるように構成されたもので
ある。

本発明に用いられる多層分析素子の基本構造自体は、液
体試料中の特定化学成分を乾式で、かつ迅速、簡便に定
岱する材料としての多層分析素子として公知であり、例
えば、特公昭５３−２１６７７号、特開昭５５−１６４
３５６号、同５７−１９７４６６号各公報、クリニカル
　ケミストリー（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）第２４巻、第８号、第１３３５〜１３５０頁（１９
７８）などに詳細に説明されている。

本発明の多層分析素子において用いられる支持体は、液
体不浸透性でかつ、光透過性の支持体（以下、本発明の
支持体という）であれば、その種類を問わないが、例え
ば酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリ
カーボネート、またはポリスチレンのような種々の重合
体材料が、この使用目的に適する。この場合の上記支持
体の厚さは任意であるが、好ましくは約５０ミクロンか
ら２５０ミクロンである。また、本発明の支持体の観察
側の一側面は、その目的に応じて任意に加工することは
可能である。上記の支持体上に試薬層を設ける場合、直
接被覆することもできるが、場合によっては、光透過性
の下塗り層を使用して試薬層と支持体との間の接着性を
高めることは効果的である。

上記支持体上に試薬層が設けられるが、本発明において
は、該試薬層には前記一般式で表わされ−るアニオン性
界面活性剤を含有する。

前記一般式のＭで表わされる１価の陽イオンとしては、
例えばナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウ
ムイオン等が挙げられる。

前記一般式で表わされるアニオン性界面活性剤−、■ の代表的な例としては、フロフート　ＦＣ−１２９（ミ
ネソタ・マイニング・アンド・マニファクチ１ｒリング
社製）が挙げられる。

前記一般式で表わされるアニオン性界面活性剤の添加ａ
は、該試薬層に用いられるバインダーとしての非タンパ
ク質性親水性ポリマーに対して０．０５重量％〜８重伍
％が好ましく、より好ましくは０．５重分％〜５重量％
である。

上記本発明の試薬層に用いられる水溶性第二銅塩として
は、例えば過塩素酸第二銅、硫酸第二銅、酢酸第二銅、
酪酸第二銅、臭素酸第二銅、塩素酸第二銅、臭化第二銅
、塩化第二銅、弗化第二銅、重クロム酸第二銅、ギ酸第
二銅、沃素酸第二銅、乳酸第二銅、オルトリン酸第二銅
、ラウリン酸第二銅、サリチル酸第二銅、酒石酸第二銅
、及びシュウ酸第二銅等が挙げられ、特に好ましい第二
銅は硫酸第二銅が挙げられる。

本発明の試薬層に用いられる銅キレート化剤、もしくは
その前駆体としては、例えば酒石酸塩、クエン酸塩、エ
チレンジアミン等が挙げられる。

本発明の試薬層をｐＨ１２以上にするために必要な塩基
としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
水酸化リチウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。

本発明の試薬層に用いられる非タンパク質性親水性ポリ
マーとしては、コポリ（アクリルアミド′−アルキルア
クリレート）、コポリ（アクリルアミド−アルキルメタ
アクリレート）（但し、アルキル基は炭素数１〜４の低
級アルキル基）、コポリ（アクリルアミド−スチレン）
、特開昭５４−１０１３９８号記載のアルカリ保護性ポ
リマー、例えばアガロース、コポリ（アクリルアミド−
Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアクリルアミド、ポリ−
Ｎ−ビニルピロリドン等が挙げられる。

本発明の試薬層の膜厚としては、乾燥膜厚として一般に
５ミクロンから５０ミクロンが好ましく、より好ましく
は１５ミクロンから４５ミクロンである。

水溶性第二銅塩および銅キレート化剤もしくはその前駆
体の但は、特定の試薬組成物が有効であるタンパク質被
検体の濃度範囲にある稈度依存して可変である。

一般に分析すべきタンパク質１グラムに対して水溶性第
二銅塩約０．５ｇ乃至約１０ｇとしなければならない。

銅キレート化剤もしくはその前駆体の量は、一般に組成
物に存在する第二銅塩の世に依存し、典型的には第二銅
塩１モルに対し約０．５乃至約２モルの銅キレート化剤
もしくはその前駆体となるように存在させる。

更に塩基は使用条件下でｐＨが１２以上になるように十
分な量が必要であり、好ましくはＩ）Ｈが約１２．５を
超えるに十分な母が必要とされる。

更に具体的な試薬組成物の蚤は上記の範囲内で、測定濃
度範囲、適用する検体の徂等に依存して十分可変である
事は言うまでもない。

試薬組成物の成分中、水溶性第二銅塩は非タンパク質性
親水性ポリマーに対して約５０乃至約１５０ｆｆｌｆａ
％が好ましく、より好ましくは約７０乃至１３０重伍重
旦ある。又、銅キレート化剤もしくはその前駆体は、同
様に非タンパク質性親水性ポリマーに対して約５０乃至
約２０重世％が好ましく、より好ましくは約１００乃至
約２５０重世％である。更に使用条件下で試薬層内のｐ
Ｈを１２以上にするに必要な塩基の旦は、同じく非タン
パク質性親水性ポリマーに対して約２５乃至約２００重
世％が好ましく、より好ましくは約５０乃至約１５０重
量％である。

本発明によれば、本発明の支持体上に前記本発明の試薬
層及び多孔性展開層を順次積層して、本発明の多層分析
素子とされる。

本発明の多層分析素子に適用できる多孔性展開層として
は、本発明の支持体上に設けられた試薬層上に直接また
は間接に１層または複数層設けられる。

この多孔性展開層は、 （１）一定容量の生物学的流体試料を単位面積当り一定
容凹に試薬層内に均一に配布する機能を有すればよいが
、更に必要に応じて、 （２）生物学的流体試料中の分析反応を阻害する物質ま
たは要因を除去する機能を有し、更には（３〉例えば分
光光度分析を行なう際には支持体を経て透過する測定光
を反射するバックグラウンド作用を行なう機能を併せて
有してもよい。

本発明に用いられる多孔性展開層は、一つで上記３つの
機能を全て兼ねそなえてもよいし、また３つの機能を適
宜分離し、各機能毎に別の層を使用することも可能であ
る。

更に、３つの機能のうち、２つの機能を有する層と、残
りの他の機能を有する層を組合わせ使用することもでき
る。

上記本発明に用いられる多孔性展開層の膜厚は、目的に
応じて任意に選ぶことができるが、好ましくは約３０ミ
クロン乃至約６００ミクロンであり、更に好ましくは約
５０ミクロン乃至約４００ミクロンである。

本発明に用いられる多孔性展開層は、特公昭５３−２１
６７７号記載のプラッシュポリマー層、特開昭５５−１
６４３５６号記載の親水化処理された織物、特開昭５７
−１９７４６６号記載のバラバラの！！維と反応性基を
含む高分子重合体の混合物から成る多孔性層、特開昭５
５−９０８５９号記載のポリマービーズと接着剤から成
る粒状構造物、特開昭５７−１０１７６０号及び同５７
−１０１７６１号記載の反応性基を有するポリマービー
ズが低分子化合物を介して、又は直接結合した粒子結合
体等を挙げる事が出来る。

特に、特開昭５７−１９７４６６号記載のバラバラの繊
維と反応性基を有する高分子重合体から成る多孔性層は
製造が容易でかつ、すぐれた性能を有するものである。

本発明に係る多孔性展開層が繊維構造展開層である場合
、該展開層を形成する素材としては天然のセルロース、
あるいはその誘導体、ポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリアミド等の合成繊維が挙げられ、該層はこれら天然
、合成を問わず各種繊維のランダムが三次元的からみ合
いによって構成されたものが挙げられる。

さらに、上記素材として任意のサイズのものを単独もし
くは複数以上選、玉ことが出来るが、ＪＩＳ標準フルイ
で５０メツシユ〜３２５メツシユ、好ましくは１００〜
３２０メツシユ、さらに好ましくは２００〜３００メツ
シユのものが挙げられる。

本発明の多層分析素子には、接着層、光反射層、ろ渦層
等、一般に一体型多層分析素子に用いられる種々の層を
、所望により設けることが可能である。

本発明の多層分析素子の好ましい態様の一例として、試
薬層と多孔性展開層の間に保護層を設ける事が出来る。

この保護層を設ける事で、試薬層中に含有されるビウレ
ット試薬、特に塩基の劣化を更に低減し保存安定性をよ
り良好なものとする事が出来る。

上記保護層として用いる事が可能なバインダーとしては
、親水性でかつ有機溶媒可溶性の高分子重合体が適して
いる。これは積層時において、隣接する試薬層との相互
作用が最少となり試薬層からの各種試薬の移行による劣
化や、試薬類の変化が抑制される事による。

好ましい保護層の高分子重合体の例として、ポリ−Ｎ−
ビニルとロリドン、メチルセルロース、エチルセルロー
ス及び特願昭６０−１０４７７６号に開示のビニルピロ
リドン共重合体等を挙げる事が出来る。

更に上記保護層の乾燥膜厚としては約１ミクロン乃至約
１０ミクロンが好ましく、より好ましくは約２ミクロン
乃至約８ミクロンである。

本発明のタンパク質分析用多層分析素子を用いて、液体
流体中の総タンパク質を測定するには、展開層上に試料
を５〜２０μ２、好ましくは８〜１５μ２、通常１０μ
２を滴下し、必要により３０℃〜５０℃、通常３７℃で
、好ましくは１〜１０分間程度インキュベーションを行
なった後、透明支持体側から５００〜６５０ｎＩＩｌの
条件に応じた波長の光で、反射濃度を測定し、あらかじ
め作成した検量線から、タンパク質濃度を求めることが
できる。更にタンパク質濃度に対応する色見本をあらか
じめ作成しておき、これと視覚的に比較することで手足
堡的な測定も可能である。

［実施例］ 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例−１ 透明な厚さ１８０ミクロンの下塗り済ポリエチレンテレ
フタレート支持体上に、下記組成の試薬層を積層した。

（試薬層） 下記表−１の組成の層とした。

（多孔性展開層） 上記試薬層上に下記組成の多孔性展開層を積層した。

（多孔性展開層組成） 濾紙粉末Ｃ８Ｃ８９Ｏ／　１００Ｃ１１’（東洋濾紙■
製 ３００メツシュ以上） スチレン／グリシジルメタ　　２５５ｍｇ／　１００Ｃ
Ｉ＋２アクリレート共重合体 （重合比９／１） ■ トリトン　Ｘ　−１００１９０ｍ（１／　１００Ｃｉ’
前記本発明の試薬層（１）及び（２）を有する多層分析
素子を、本発明の分析素子試料（１）及び（２）、比較
試薬層（１）及び（２）を有する分析素子を比較分析素
子試料（１）及び（２）とした。

上記本発明の分析素子試Ｉｌ　（１）及び（２）、比較
分析素子試料（１）及び（２）に対してヒト血清アルブ
ミンを生理食塩水に溶解したタンパク質標準液（４ミ２
　ｏ／　ｄｉ、６．１　ａ／　ｄｉ。

８．３　ａ／　ｄ（１、ビウレット法により検定）を用
意し、各分析素子試料に多孔性展開層側から１０μ２を
点着した後、３７℃　７分間インキュベーションを行な
いサクラ光電濃度計ＰＤＡ’−６５（１小西六写真工業
（１）製）を用い、５４５ｎｍのフィルターを用い反射
濃度を測定した。但し、各分析素子試料は各標準液に対
してｎ−１５回測定を行なった。結果を下記表−２に示
す。

但し、表−２において、上段のＸは平均値であり、中段
のＳＤは標準偏差、下段のＣｖは次式で表わされる同時
再現性である。

以下余白 以上表−２から明らかなように、比較分析素子試料は各
タンパク質濃度で、本発明の分析素子試料に比べて反則
濃度の同時再現性牽゛悪い。

実施例−２ 実施例−１で作成した本発明の分析素子試料（１）、（
２）及び比較分析素子試料（１）、（２）を用い、分析
素子試料製造直後に測定した反ｒＡ濃度と４０℃５５％
ＲＨの条件下に１４日間保存した後の反射濃度を測定し
た。操作方法は実施例−１と同様に行なった。結果は以
下の表−３に示す。

以下余白 以上表−３から明らかなように本発明の分析素子試料（
１）、（２）は良好な保存安定性を示し、更に比較分析
素子試料（２）も同様に良好であるが、これに比較して
比較分析素子試料（１）では保存後の識別能が著しく低
下している事が判る。

実施例−３ 透明な厚さ１８０ミクロンの下塗り済みポリエチレンテ
レフタレート支持体上に、下記組成の層を積層し、本発
明の分析素子試料（３）を作成した。

（試薬層） アクリルアミド／メチル メタアクリレート共重合体　１３０ｍｏ／　１００ｃ１
１ｔ（重合比９／１） 酒石酸ナトリウムカリウム　２７５ｍ（１／　１００Ｃ
ｖ’硫酸銅・５水和物　　　　　１３０ｍＱ／１００Ｃ
ｖ水酸化ナトリウム　　　　　１７５ｍｏ／　１００Ｃ
ｔ’−、■ ）［１７−ト　Ｆ　Ｃ−１２９６ｍ（１／　１００Ｃｔ
’から成る試薬層。

（商品名、ＢＡＳＦ社製Ｎ−ビニルピロリドン／酢酸ビ
ニル共重合体　重合比１／４）から成る保護層。

（多孔性展開層） 濾紙粉末Ｃ８９０ｍｇ／　１００ｃｌｔ（東洋濾紙側腹
） スチレン／グリシジルメタ アクリレート共重合体　　　２５５ｍ０／　１００１０
０Ｃ重合比９／１〉 、１，１１、ア■Ｘ　−１００１７０ｍｇ／　１１００
Ｃ’から成る多孔性展開層。

以上のようにして作成した本発明の分析素子試料（３）
を、実施例−１及び−２に従って同時再現性の検討を行
なった。同時再現性はヒト血清アルブミン生理食塩水（
蛋白質濃度４．２　ＣＪ／　ｄｉ、６、Ｉ　Ｑ／　ｄｉ
、８．３　（１／　ｄｌ、ビウレット法により検定）を
同様に１０μ２分析素子に点着し。

３７℃　７分間インキュベーションを行なった後、サク
ラ光電濃度計ＰＤＡ−６５を（小西六写真工業■製）を
用い、５４５ｎｍのフィルターを用いて反射濃度を測定
した。但し実施例−１と同様に各標準液に対してｎ＝１
５回測定を行なった。結果を以下の表−４に示す。又、
ＳＤ、、ＣＶは実施例１の表−２と同義である。

表−４ 表−４からも明らかなように、本発明の分析素子試料（
３）は、良好な感度及び同時再現性を有している事が明
らかである。

実施例−４ 前記実施例−３で作成した本発明の分析素子試料（３）
を用いて、実施例−２と同様に４０℃５５％ＲＨで１４
日及び２１日保存した後、前記実施例−２と同様に、標
準液を用い反ｒＡ濃度を測定し、分析素子製造直後の反
射濃度との比較を行なった。

結果は以下の表−５に示す。

表−５ 以上衣−５からも明らかなように、本発明の分析素子試
料は良好な保存安定性を示している事が明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 液体不浸透性でかつ、光透過性の支持体上に、水溶性第
   二銅塩、銅キレート化剤もしくはその前駆体、ｐＨ１２
   以上にするために必要な塩基を含有する非タンパク質性
   親水性ポリマー層からなる試薬層、および多孔性展開層
   を積層してなるタンパク質分析用多層分析素子において
   、前記試薬層は下記一般式で示されるアニオン性界面活
   性剤を含有することを特徴とするタンパク質分析用多層
   分析素子。 一般式 ＣＦ＿３（ＣＦ＿２）＿ｎＣＯＯＭ 式中、Ｍは１価の陽イオンを表わし、ｎは２〜１１の整
   数を表わす。