KR100503562B1 - 단백질측정용건식분석요소 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단백질을 고감도로 신속하게 검출하고 정량하는 데 사용할 수 있는 건식 분석 요소(dry analytical element)에 관한 것이다. 단백질 및 몰리브데이트 이온과 반응하여 색소의 스펙트럼 흡광도에 측정가능한 변화를 발생시키는 색소를 사용하여 검정을 수행한다. 또한, 본 발명은 검정의 정확도를 안정화시키고 증진시키는 중합체 및 중탄산염에 의한 간섭을 감소시키는 화합물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 건식 분석 요소(element) 및 이를 사용하여 유체 샘플 중의 단백질을 정량하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 이러한 분석 요소에서 특정 색소 및 몰리브데이트 이온, 아크릴아미드를 포함하는 중합체 및 하이드록시카복실산의 용도에 관한 것이다.
각종 유체, 예를 들면, 생물학적 유체에 존재하는 화학적 및 생물학적 물질을 신속하고 정확하게 측정하기 위한 의료 및 연구 및 분석방법과 진단방법이 지속적으로 요구되고 있다. 예를 들면, 단백질의 존재 및 양은 많은 사람의 질환의 효과적인 연구, 진단 및 치료를 실시하기 위해 신속하고 정확하게 측정되어야만 한다.
주지된 물질을 검출하기 위해 광범위한 분석 방법이 최근 수십년 동안에 개발되어 왔다. 이들 방법은 신뢰성이 높고, 몇몇 경우에는 키트 형태로 사용하기에 적합할 뿐만 아니라 자동화에도 적합하다.
단백질 분석은 통상적으로 용액 속에서, 또는 유체를 특정 방식으로 제거하는 테스트 장치 속에서 검정에 사용되는 시약에 의해 실시되어 왔다. 용액 기술은 당해 분야에서 광범위하게 수용되어 왔지만, 용액을 취급하고 운송하는 복잡한 능력을 구비한 분석 장치가 요구되고 있다. 더욱이, 이러한 검정에서 사용되는 분석 장치는 샘플끼리의 오염을 방지하는 데 필요할 수 있는 조작과 정밀한 세정능 모두를 위해 복잡한 액체의 조작을 필요로 하고 또한 숙련자가 요구될 수 있다.
용액 화학의 또 다른 방편은 건식 분석 요소를 사용하는 것이다. 물질 침착, 샘플 습윤화를 촉진시키거나 용이하게 하고 이러한 요소들의 일체성을 유지하는 데 필요한 결합제, 계면활성제 및 또 다른 시약과 같은 피복제로부터의 간섭이 있기 때문에, 모든 용액 기본 분석법이 건식 분석 요소에서 사용하기에 적합한 것은 아니라는 것을 이해해야 한다. 더욱이, 건식 분석 요소는 동일 반응계에서 구획화하여 비상용성 성분을 분리시켜야 한다. 이것은, 분리된 액체를 저장하고 액체를 연속적으로 첨가할 수 있는 용액 화학에 해당되는 것은 아니다.
건식 분석 요소 및 이의 용도는 수많은 공보[참조: 피어스(Pierce) 등에게 허여된 미국 특허 제4,132,528호, 미국 특허 제4,786,605호, 미국 특허 제3,992,158호, 미국 특허 제4,258,001호, 프릭키(Frickey) 등에게 허여된 미국 특허 제4,670,381호, WO 82/2601(1982년 8월 5일에 공개), 유럽 특허원 제051 183호(1982년 5월 12일에 공개) 및 유럽 특허원 제066 648호(1982년 12월 15일에 공개)]에 기재되어 있고, 언급된 인용 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로서 인용된다.
환자의 신장 기능을 평가하고 모니터링하는 데 유용한 진단 지표는 뇨에 존재하는 총 단백질의 농도이다. 뇨에 존재하는 단백질의 종류와 양은 다양하고, 신부전증을 갖고 있어 단백질의 뇨로의 이동을 저해하는 특정 질환의 증상에 따라 다양하다.
뇨중에서 발견될 수 있는 단백질의 예는 알부민, 무손상 면역글로불린, 카파 자유(kappa free) 쇄, 람다 자유(lambda free) 쇄, 레티놀 결합 단백질, 알파-1-마이크로글로불린 및 베타-1-마이크로글로불린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 단백질은 아미노산의 조성 및 분자량에 있어서 상당한 차이가 있다. 뇨의 총 단백질 선별 검정을 사용하는 임상의에게 관심있는 정보는 뇨 시험편의 단위 용적당 단백질의 총 질량이다. 진단 검정, 즉 이상적으로 측정되는 시그날은 존재할 수 있는 단백질의 종류 또는 유형과 무관해야만 한다. 예를 들어, 알부민 50mg/dL은 다른 단백질 50mg/dL과 동일한 시그날을 생성해야만 한다. 사람 뇨 중의 정상적인 단백질 농도의 범위는 약 5 내지 100mg/dL이다.
생물학적 물질 중의 총 단백질 농도를 측정하기 위해 다양한 방법이 사용되고 있다. 많은 분석 검정에서, 광의 시그날이 측정되고, 예를 들면, 샘플 중의 단백질 농도에 비례하는 스펙트럼의 가시광선 또는 자외선 영역의 흡광도가 있다. 그러나, 일반적으로 광의 시그날은 바람직하지 못하게 샘플 중의 단백질의 종류에 대한 함수이고, 단순히 존재하는 단백질의 질량과 연관되어 있지 않다. 이들 방법은 일반적으로 검출가능한 광의 시그날을 생성시키기 위한 하기의 방법 중의 하나에 좌우된다:
1. 단백질 및 Cu(II)의 착물(뷰렛 반응)은 스펙트럼의 가시광선 영역에서 검출가능하지만 흡광도가 작다.
2. 단백질의 방향족 아미노산에 의한 스펙트럼의 자외선 영역에서의 흡광도를 측정할 수 있다.
3. 단백질의 양은 특정 아미노산을 고유 흡광도 또는 형광성을 사용하여 정량화될 수 있는 발색단을 포함하는 분자로 유도체화함으로써 측정할 수 있다.
4. 단백질과 비공유 결합하여 색소-단백질 착물을 형성할 수 있는, 색소의 흡광도 스펙트럼에 동요를 일으키는 색소를 사용하여 샘플 중의 단백질의 존재 또는 양을 측정할 수 있다. 몇몇 색소는 금속 이온, 예를 들면, 몰리브덴 또는 텅스텐의 존재를 필요로 하고, 각각의 경우, 색소, 금속 이온 및 단백질의 비공유 결합에 의해 착물이 형성되어 색소의 흡광도 스펙트럼의 동요를 일으키고, 이 동요를 이용하여 샘플 중의 단백질의 존재 또는 양을 측정할 수 있다.
5. Cu(II)의 배위에 대한 색소와 단백질간의 경쟁은 흡광도 시그날을 발생시키고, 이는 단백질 농도[Cu(II)/색소의 배위 착물은 유리된 색소, 즉 Cu(II)와 배위결합되어 있지 않은 색소와는 상이한 흡광도 스펙트럼을 갖는다]에 비례한다.
미국 특허 제4,132,528호는 뷰렛 반응을 기초로 하는 단백질의 검정에 관한 것이다. 미국 특허 제4,132,528호 색소 검정 요소는 뷰렛 반응에 사용하는 Cu(II) 및 킬레이팅제의 뷰렛 시약, 예를 들면, CuSO4 및 타르타르산, 또는 이들 2개의 착물 및 pH가 약 12 이상인 완충제를 포함한다. 수성 유체 중의 단백질, 예를 들면, 혈청 또는 뇌척수액(CSF)이 pH 12 이상에서 뷰렛 시약과 상호 반응하고, 제2구리와 단백질간의 반응을 유발하여 자색을 나타낸다. 색상의 강도는 혈청의 단백질 함량과 직접적으로 비례하기 때문에, 단백질 농도는 널리 공지된 비색 분석 기법으로 측정할 수 있다. 불행하게도, 인용된 특허의 건식 슬라이드 요소는 감도가 목적하는 것보다 낮고, 즉 이들은 농도가 약 200mg/dL 이하인 단백질을 검출할 수 없다.
미국 특허 제4,786,605호에는 뷰렛 시약(들)을 미리 형성된 Cu(II)/피리딜아조 색소의 배위 착물(또는 유리된 Cu(II) 및 유리된 피리딜아조 색소)로 대체함으로써 미국 특허 제4,132,528호의 요소보다 감도가 높은, 단백질 정량용의 건식 분석 요소 제형이 기재되어 있다. 수성 단백질이 검정 요소에 첨가되는 경우, 제2구리 이온은 단백질에 의해 착물로부터 대체되어 Cu(II)/색소 착물의 흡광도 곡선이 배위되지 않은 색소의 흡광도 곡선으로 이동된다. 따라서, 단백질을 첨가하면, Cu(II)/색소 착물의 흡광도 피크는 첨가되는 단백질의 양과 비례하여 감소하기 때문에, 공지된 농도의 단백질을 함유하는 샘플로 적당히 조정하여 액체 샘플 중의 미지의 단백질 농도를 비색 분석으로 측정할 수 있다. 상기 특허는 이들 요소가 매우 우수한 역동적 범위 및 뷰렛 반응에 기초하는 요소보다 약 30배 이상의 감도를 갖는다는 것을 교시하고 있다.
그러나, 뇨 샘플 중의 단백질을 정량하기 위해 미국 특허 제4,786,605호의 방법을 사용하면, 일관적으로 뇨 샘플의 약 10 내지 20%가, 참조 표준으로서 단백질 농도에 대하여 코마시 블루 용액 검정(Coomassie Blue solution)을 사용하여 수득된 값과 비교하여, 허용될 수 없는 랜덤 포지티브 바이어스를 나타낸다, 즉, 미국 특허 제4,786,605호의 방법에 의해 특정 환자의 뇨 샘플(샘플 그룹의 약 10 내지 20%)의 평가된 단백질 농도는 코마시 블루계 검정 방법을 사용하여 측정된 농도보다 크다. 이러한 랜덤 포지티브 바이어스는 Cu(II) 및 질소 그룹과 같은 색소의 환원성 그룹 모두를 환원시키는 아스코르브산과 같은 환원제가 특정한 뇨 샘플 중에 존재함으로써 발생된다고 추론된다. 건식 분석 요소로서는 위에서 언급한 검정 방법의 결점의 작용을 받지 않는 것이 바람직하다.
산성 조건하에서 용액 중의 단백질 및 금속 이온에 의해 착물을 형성할 때의 특정한 지시 색소의 용액 반응이고, 측정 가능한 색상 변화를 발생한다는 것은 널리 공지되어 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 용액 중에서 잘 작용하는 분석 검정 방법은 본원에서 인용된 이유 때문에 건식 분석 요소에 용이하게 적용될 수 없다.
상이한 단백질이 색소와 균등하게 반응하여 샘플 중에 존재하는 단백질의 질량과 연관되고, 단백질의 종류와 무관한 광 시그날을 생성하는 것이 매우 바람직하다. 뇨는 매우 다양한 양의 중탄산염(약 200mM 이하)을 포함한다. 뇨 시험편 중의 고농도의 중탄산염이 존재하여, 중탄산염을 희석하거나 샘플을 전처리(예를 들면, 분자 크기 배제 기법)하는 것에 의해 제거하지 않는 한, 매우 알칼리성 상태를 생성하기에 충분한 중탄산염이 검정에 유입되도록 하고, 이러한 알칼리성 상태는 색소-금속 이온-단백질의 상호작용이 낮은 pH(1.5 내지 3.5)에서 일어나고/나거나 중탄산염이 추가로 일관되게 금속 이온과의 배위를 방해할 수 있기 때문에, 검정법을 신뢰성이 없는 무용한 것으로 되게 한다. 다음과 같이, 단백질 측정용의 건식 분석 요소를 제공하는 것이 요구되고 있다. 즉, 환원제 또는 중탄산염의 존재에 영향을 받지 않고 존재하는 단백질의 질량과 실질적으로 관계가 있는 시그날 측정을 할 수 있는, 즉 실질적으로(여기서, 실질적으로란 뇨 샘플 중의 총 단백질의 척도와 같은 특이적 단백질을 측정하기에 적합하거나 허용될 수 있다는 것을 의미한다) 단백질 종류와 무관한 시그날 측정치를 생성하고, 약 5 내지 약 300mg/dL 범위의 단백질의 정량에 사용할 수 있고, 샘플의 예비희석, 예비농축 또는 전처리를 실시하여 방해물을 제거할 필요가 없는 건식 분석 요소가 요구되고 있다.
예상치 않게, 생물학적 유체 중에 단백질의 존재 또는 양을 측정하는 데 사용하기에 적합한 건식 분석 요소, 즉 몰리브데이트 이온의 존재하에 아크릴아미드를 포함하는 중합체 및 하이드록시카복실산 화합물과 함께 지시 색소를 포함하는 건식 분석 요소를 제공할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
단백질 농도를 측정하기 위해 사용되는 종래 기술의 건식 분석 요소의 문제점은 본 발명의 건식 분석 요소 중의 몰리브데이트 이온의 존재하에 아크릴아미드 중합체 및 하이드록시카복실산 화합물과 배합한 지시 색소를 사용하여 해결되었다. 몰리브데이트 이온은 본 발명의 양태에 사용되는 바람직한 금속 이온이다. 그러나, 본 발명의 양태는 단지 몰리브데이트 이온에만 국한되지 않는다. 또 다른 적합한 금속 이온, 예를 들면, 텅스테이트 이온도 또한 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다.
앞에서 서술한 바와 같이, 상이한 단백질이 색소와 균등하게 반응하여 샘플중에 존재하는 단백질의 질량과 연관되고 단백질의 성질과는 무관한 광 시그날을 생성하는 것이 매우 바람직하다. 예상치 않게, 본 발명의 건식 요소의 각종 시약을 피복시키는 데 사용되는 중합체 비히클이 지시 색소 시스템과 상이한 단백질과의 명백한 반응성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 측정된 광 시그날의 강도는 존재하는 단백질의 종류 또는 유형에 좌우되지만, 이라한 단백질 유형에 대한 의존성는 아크릴아미드를 포함하는 중합체가 건식 분석 요소 중에 존재하는 경우 현저히 저하된다.
샘플 중의 총 단백질을 정량하는 데 사용되는 건식 분석 요소에 있어서, 암모늄 몰리브데이트의 존재하에 지시 색소와 단백질과의 착물을 형성할 때의 적당한 파장에서 반사 밀도의 변화를 측정하는 것을 기초로 하는 분석 요소가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명의 건식 요소는 임의의 액체 샘플, 특히 생물학적 유체 중의 단백질 양을 측정하는데 유용하다.
더욱 구체적으로는, 한 양태에서 본 발명은 단백질을 측정 및 정량하는 데 유용한 건식 분석 요소로서, 다공성 전개층(i), 다공성 전개층과 유체 접촉하는 하나 이상의 추가의 층(ii) 및 지지체(iii)를 포함하고, 당해 요소는, 하나 이상의 층에, 위의 요소를 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 유체와 접촉시키면, 반응하여 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도의 측정가능한 변화를 생성하는, 아크릴아미드 함유 중합체, 지시 색소 및 몰리브데이트 이온을 함유하는 건식 분석 요소(여기서, 염료, 몰리브데이트 염 및 아크릴아미드를 포함하는 중합체는 동일한 층에 함께 존재하거나, 당해 요소의 개별적인 층에 단독으로 또는 배합물로서 존재할 수 있다)에 관한 것이다.
본 발명은, 하기 화학식 1의 하이드록시카복실산을 단백질을 포함하는 것으로 추정되는 유체 샘플에 첨가하는 단계(A), 하이드록시카복실산을 포함하는 유체 샘플을 분석 요소와 접촉시키는 단계(B) 및 단백질의 존재와 양의 척도로서 색소의 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도의 변화를 측정하는 단계(C)를 포함하는, 단백질의 측정 및 정량화에 건식 분석 요소를 사용하는 방법을 제공한다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 독립적으로 H, -CH3, -CH2CH3 또는 -CH2OH이고,
M은 H 또는 양(陽)으로 하전된 금속 또는 비금속 카운터이온이다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 단백질을 측정 및 정량하는 데 유용한 건식 분석 요소에 관한 것이고, 당해 분석 요소는 다공성 전개층(i), 다공성 전개층과 유체 접촉하는 하나 이상의 추가의 층(ii) 및 지지체(iii)를 포함하고, 당해 분석 요소는 하나 이상의 층에, 아크릴아미드를 포함하는 중합체, 하기 화학식 1의 하이드록시카복실산 및 추가로, 위의 요소를 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 유체와 접촉시키면, 반응하여 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도의 측정가능한 변화를 일으키는 지시 색소 및 몰리브데이트 이온을 포함하는 분석 요소(여기서, 색소, 몰리브데이트 염, 아크릴아미드를 포함하는 중합체 및 하이드록시카복실산은 동일한 층에 함께 존재하거나, 요소의 개별적인 층에 단독으로 또는 배합물로서 존재할 수 있다)이다.
화학식 1
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 독립적으로 H, -CH3, -CH2CH3 또는 -CH2OH이고,
M은 H 또는 양으로 하전된 금속 또는 비금속 카운터이온이다.
본 발명은, 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 유체 샘플을 분석 요소와 접촉시키는 단계(A) 및 단백질의 존재 및 양의 척도로서 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도의 변화를 측정하는 단계(B)를 포함하는, 단백질을 측정 및 정량하는 데 바람직한 건식 분석 요소를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 각종 수성 유체, 예를 들면, 사람 및 동물의 생물학적 유체, 식품, 산업 또는 도시의 하수 및 이러한 방법으로 통상 시험되는 다른 유체 중의 단백질의 존재 및/또는 농도를 측정하는 데 유리하게 사용된다. 시험될 수 있는 생물학적 유체에는 전혈, 혈청, 혈장, 뇨, 척수액, 누액, 활액, 림파액, 조직 또는 혈소판의 현탁액, 치은액, 질액, 뇌액 및 당해 분야의 숙련자에게 용이하게 명백한 다른 유체가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
측정될 수 있는 단백질로서는 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질(예: 효소, 항체, 지단백질 및 당단백질) 및 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 함유하거나 여기에 (공유결합 또는 비공유결합) 부착된 화합물이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명은 뇨 중의 단백질을 측정하는 데 특히 유용하다.
본 발명은 다공성 전개층, 일반적으로 희석되거나 희석되지 않은 시험 샘플 (예를 들면, 1 내지 50㎕)을 수납하는 데 적합한 다공성을 갖는 피복층을 포함하는 분석 요소를 사용하여 실시된다. 본 발명의 요소는 당해 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 어셈블링된다. 바람직하게는, 다공성 전개층은 등방성 다공성이고, 이의 특성은 층의 입자, 섬유 또는 다른 물리적 요소들 사이의 공간을 상호연결하는 것에 의해 제공된다. "등방성 다공성"이란 유체가 층 전반에 걸쳐 균등하게 전개되어 있는 것을 의미한다. 이러한 층에 유용한 재료는 수불용성이고 검정 동안에 당해 구조의 일체성을 유지한다. 요소를 어셈블링하기 위한 통상적인 재료 및 방법은, 예를 들면, 프리지바일로비츠(Przybylowicz) 등에게 허여된 미국 특허 제3,992,158호, 피어스(Pierce) 등에게 허여된 미국 특허 제4,258,001호, 기타지마(Kitazima) 등에게 허여된 미국 특허 제4,292,272호 및 고야마(Koyama) 등에게 허여된 미국 특허 제4,430,436호에 기재되어 있고, 이들은 본원에 참조 문헌으로서 인용된다. 바람직한 다공성 전개층은 프리지바일로비츠 등에게 허여된 미국 특허 제3,992,158호에 기재된 바와 같이 에스탄 중의 황산바륨으로부터 제조된다.
본 발명의 분석 요소에는 추가의 층이 하나 이상 있는데, 이들 모두는 다공성 전개층과 유체 접촉되어 있다. 용어 "유체 접촉"은, 본원에서 사용되는 경우, 유체가 하나의 층에서 다른 층으로 용이하게 이동할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 추가되는 층, 바람직하게는 피복된 중합체 층은 시약 및 방사선을 차단하는 하부층을 포함하고, 당해 분야에서 공지된 하나 이상의 친수성 결합제 물질, 예를 들어, 젤라틴 및 비닐피롤리돈 중합체로 구성되어 있다. 몇몇 층은 수불용성인 반면에, 나머지 층은 수용성일 수 있다.
본 발명의 요소의 층은 자기 지지될 수 있지만, 바람직하게는 이들 층은 치수가 적당하게 안정적이며 화학적으로 불활성인 지지체에 배치된다. 지지체는 바람직하게는 다공성이 아니며 전자기 방사선에 투과된다. 선택된 지지체는 의도된 검출 방식(투과 또는 반사 분광법)과 상용성이어야만 한다. 유용한 지지체 재료는 종이, 금속 호일, 폴리스티렌, 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및 셀룰로즈 에스테르를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 요소 층의 하나 이상에 단백질 및 몰리브데이트 이온과 특이적으로 반응할 수 있는 색소가 존재한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단백질 및 몰리브데이트 이온과 반응하는 색소"는 몰리브데이트 이온 및 단백질의 존재하에 색소의 스펙트럼 흡광 또는 광학적 흡광 특성이 단백질 부재하의 색소 및 몰리브데이트 이온의 특성과는 상이한 임의의 색소 화합물을 의미한다. 목적하는 상기 언급한 특성을 갖는 색소는 몰리브데이트 이온을 배위결합시킬 수 있는 작용성 그룹(예: 방향족 환상의 인접한 2개의 하이드록실 그룹을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다)을 갖는 개방된 방향족 구조 및 트리사이클릭 방향족 구조를 포함하는 색소이다. 이러한 색소는 피로카테콜 바이올렛, 테트라브로모페놀프탈레인 에틸 에스테르, 트리요오도페놀설폰프탈레인, 테트라브로모피로갈롤 레드 및 피로갈롤 레드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 단백질의 존재 및/또는 양을 측정하기 위한 다층 분석 요소가 제공된다. 구체적으로, 다층 요소는 유체 접촉에서 단백질 및 몰리브데이트 이온과 반응하는 색소, 몰리브데이트 염, 아크릴아미드를 포함하는 중합체를 포함하는 제1 시약층 또는 완충층(i), 하부(sub) 층(ii) 및 다공성 전개층(iii)을 갖는 비다공성 지지체를 포함한다.
본 발명의 요소는 제조, 유체의 전개 및 목적하지 않는 방사선의 흡수를 보조하기 위해 적당한 층에 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 다양한 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 분석 요소는 선행 기술 분야에 공지된 통상적인 피복 방법 및 장치(그라비야법, 커튼법, 호퍼법 및 또 다른 피복법)를 사용하여 제조할 수 있다. 분석 요소는 임의의 목적하는 폭을 갖는 연장 테이프, 시트, 슬라이드 또는 칩을 포함하는 다양한 형태로 배치될 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 적당한 분석 장치 및 방법을 사용하여 수동 또는 자동화로 실시할 수 있다. 일반적으로, 당해 방법은 다공성 전개층 위에 시험 샘플(예: 1 내지 50㎕)을 점착(spotting)시킴으로써 요소 중의 시약을 접촉시켜 실시한다. 요소 속에서 유체가 이동하여 시약을 효과적으로 혼합하고, 반응이 발생한다.
샘플 도포 후, 분석 요소는 임의의 컨디셔닝, 예를 들면, 항온처리, 가열 또는 다른 과정에 노출시키고, 이는 단백질-색소-몰리브데이트 착물의 형성을 신속하게 하거나 촉진시키는 것이 바람직할 수 있다.
위에서 기재한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 단백질 및 몰리브데이트 이온과 반응하는 색소는 몰리브데이트 이온과 배위결합할 수 있는 작용성 그룹(방향족 환상의 인접한 2개의 하이드록실 그룹을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다)을 갖는 개방 방향족 구조 및 트리사이클릭 방향족 구조를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 색소는 피로카테콜 바이올렛, 테트라브로모페놀프탈레인 에틸 에스테르, 트리요오도페놀설폰프탈레인, 테트라브로모피로갈롤 레드 및 피로갈롤 레드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
위에서 언급한 색소 화합물은 널리 공지된 화학 공급업체(Eastman Organic Chimical Company, Aldrich Chemical Company, Sigma Chemical Company)로부터 구입할 수 있거나, 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 통상적인 출발 물질 및 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
다음의 지시 색소를 별도로 포함하는 건식 분석 요소를 제조한다:
피로카테콜 바이올렛(피로카테콜, 4,4'-(3H-2,1-벤즈옥사티올-3-일이딘)-디-S,S-디옥사이드), 피로칼롤 레드(2-(4,5,6-트리하이드록시-3-옥소-3H-크산텐-9-일)벤젠설폰산), 브로모피로갈롤 레드(스피로[3H-2,1-벤즈옥사티올-3',9'-[9H]-크산텐-3',4',5',6',-테트롤-2,7-디브로모-I,I-디옥사이드]), 갈레인(3',4',5',6'-테트라하이드록시스피로[이소벤조푸란-1-(3H),9'-[9H]크산텐]-3-온). 건식 분석 요소의 일반적인 특징은 프리지바일로비츠 등에게 허여된 미국 특허 제3,992,158호 및 프랭크 및 피어스에게 허여된 미국 특허 제4,258,001호에 기재되어 있다. 모든 색소는 물리-화학적 환경 변화에 민감하다.
본 발명자들은 건식 분석 요소에서 몰리브데이트 이온과 배합된 위에서 언급한 색소를 사용하여 뇨 단백질의 정량 분석을 실시할 수 있다는 것을 밝혔다. 피로카테콜 바이올렛을 몰리브데이트 이온과 배합하여 포함하는 건식 분석 요소가 최상의 분석 검출 감도(즉, 300mg/dL 이하의 목적하는 단백질 농도 범위에 대한 반사 밀도(Dr)의 최대 변화) 및 사람 알부민을 포함하는 제조 용액에 대한 반복 정확도를 제공한다.
예상치 않게, 본 발명자들은 건식 요소의 각종 시약을 피복하는 데 사용되는 중합체 비히클이 지시 색소 시스템과 상이한 단백질과의 명백한 반응성에 영향을 미치고, 존재하는 단백질 유형에 대한 측정된 광 시그날의 강도의 의존성에 영향을 미친다는 것을 밝혔다. 본 발명에 사용하기에 적합한 중합체는 광 시그날을 평탄화하는 작용을 갖고, 즉 중합체는 상이한 단백질의 동등한 질량 또는 중량에 대해 수득된 반사 밀도 광 시그날의 측정치의 차이를 감소시키는 작용을 갖는다. 이것은 상이한 유형의 단백질이 상이한 시험편 중에 존재할 수 있고, 목적하는 측정치는 샘플의 단위 용적당 존재하는 단백질(총 단백질)의 총 질량이기 때문에 바람직하다. 이상적으로, 총 단백질의 검정은 동일한 감도를 갖는 모든 단백질을 정량해야 한다. 본 발명의 중합체로서는 대부분 아크릴아미드를 포함하는(약 40중량% 초과) 수용성 단독중합체, 공중합체 및 삼원공중합체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 몰리브데이트 이온과 배위결합할 수 있는 작용성 그룹은, 본 발명의 중합체 중에 존재하는 경우, 단백질의 측정을 방해하는 양으로 존재해서는 안된다. 바람직한 중합체는 아크릴아미드의 단독중합체, 즉 중량 평균 분자량이 약 20,000 내지 250,000돌턴인 폴리아크릴아미드(이후부터 폴리A로서 언급됨)이다. 가장 바람직한 범위는 약 100,000 내지 150,000돌턴이다.
추가로, 본 발명자들은, 매우 예기치 않게, 다층 분석 요소에 글리콜산을 첨가하면(분석 요소에 예비 피복하는 것이 바람직하다), 중탄산염으로 인한 간섭을 실질적으로 저하시킬 수 있다는 것을 밝혔다. 하기 화학식 1의 다른 하이드록시카복실산이 유사한 효과를 갖고 있기 때문에 본 발명에서 사용하기에 적합하다.
화학식 1
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 독립적으로 H, -CH3, -CH2CH3 또는 -CH2OH이고,
M은 H 또는 양으로 하전된 금속 또는 비금속 카운터이온이다.
화학식 1의 대표적인 하이드록시카복실산으로서는 2-하이드록시프로판산, 2-메틸-2-하이드록시프로판산 및 이의 염이 포함된다.
주지된 아크릴아미드 중합체 및 하이드록시카복실산과 배합하여 지시 색소 및 몰리브데이트 이온을 포함하는 건식 분석 요소를 사용하여 뇨 단백질의 만족할만한 정량 분석 결과를 수득할 수 있다. 분자량이 약 20,000 내지 250,000돌턴인 폴리아크릴아미드 중합체 및 또한 글리콜산과 배합된 피로카테콜 바이올렛 및 몰리브데이트 이온은 바람직한 건식 분석 요소로서, 300mg/dL 이하의 단백질 농도의 민감한 척도 및 매우 우수한 반복 정확도를 제공한다. 가장 바람직한 건식 요소는 시약층/완충층 속에 피복된 중합체 비히클로서 폴리A(평균 분자량 100,000 및 150,000돌턴) 및 예비피복된 글리콜산을 포함한다.
폴리아크릴아미드는 상이한 단백질과 지시 색소 피로카테콜 바이올렛/몰리브데이트 이온 시스템의 반응성을 평탄화하는 작용을 한다. 상이한 단백질 유형의 동일 중량 농도에 대한 반사 밀도 시그날의 차이는 바람직한 중합체를 사용하는 건식 요소에서는 현저히 감소된다. 피로카테콜 바이올렛 및 몰리브데이트를 사용하는 중합체의 효과는 다른 유형의 지시 색소 및 금속 이온을 사용하는 경우에 관찰된다. 본 발명은 약 5 내지 300mg/dL 범위를 갖는 뇨 중의 총 단백질을 정량하는데 사용되는 건식 요소를 제조할 수 있게 한다. 건식 요소는, 상이한 단백질에 대한 감도가 거의 동일하기 때문에, 이의 의도된 용도에 적합하고 선행 기술의 용액 및 건식 요소에 기초하는 검정보다 우수한 정확도가 수득된다. 뇨 시험편 중에 광범위하고 다양한 농도의 중탄산염의 존재로 인한 주된 간섭은 피로카테콜-몰리브데이트 화학반응을 사용하는 건식 요소에 글리콜산을 첨가함으로써 극복되었다. 위에서 기재한 바와 같은 다른 하이드록시카복실산은 요소내로 도입되거나 샘플과 함께 첨가되든지 간에 유사한 효과를 갖는다. 이러한 두가지의 매우 상이한 예상치 않은 발견은 액체 샘플 중의 총 단백질을 정량하는 데 특히 적합한, 민감하고 강력한 건식 분석 요소를 제공한다.
하기 실시예는 본 발명의 범위를 설명하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 단지 설명을 목적으로 하는 것이기 때문에 본원에서 구현된 발명은 이들 실시예로 제한되지 말아야 한다. 주지된 것을 제외하고는 모든 시약 및 장치는 시판 공급업체로터 구입한다.
하기 실시예 1 내지 4는 상이한 지시 색소를 포함하는 요소의 분석 검출 감도 및 반복 정확도를 비교한 실험 결과를 나타낸다.
실시예 1
피로카테콜 바이올렛
피로카테콜 바이올렛을 0.12g/m2의 양으로 하기의 조성비(폴리(아크릴아미드-co-N-비닐-2-피롤리돈, 50:50 중량비))를 갖는 아크릴아미드 중합체(이후부터 중합체 AVP로 언급됨) 12g/m2, 계면활성제 조닐 FSN(0.36g/m2) 및 완충제로서의 석신산(pH 2.5) 5.9g/m2, 암모늄 몰리브데이트(0.18g.m2) 및 칼륨 옥살레이트(0.15g/m2)를 추가로 포함하는 시약층에 피복한다. 비드(bead) 전개층(미국 특허 제4,258,001호에 기재되고 하기에 기재된 조성을 가짐)을 사용한다. 전개층 및 시약 층 사이에는 폴리(N-비닐-2-피롤리돈) 하부층이 있다. 요소를 1cm 사각으로 절단하여 슬라이드에 올려놓는다. 죤슨 앤드 죤슨 임상 진단 슬라이드 분석기(Johnson & Johnson Clinical Diagnostic slide analyzer)를 사용하여, 슬라이드 요소에 단백질 함유 용액을 점착시키고, 슬라이드를 항온처리하여 반사 밀도(Dr)를 판독한다. 측정자는 다수의 요소를 시험하고 간편하게 반복 측정치를 수득할 수 있다. 점착, 항온처리 및 광 시그날을 측정하는 임의의 다른 방법도 또한 건식 요소를 평가하는 데 적합하다. 요소의 구조는 다음과 같다:
Dr을 670nm에서 측정한다. 하기 표 1은 위에서 기재한 피로카테콜 요소를 사용하여 수득된 시험 결과를 나타낸다. 단백질을 포함하는 유체는 공지된 중량의 사람 혈청 알부민을 공지된 용적의 0.15M 염화나트륨 수용액에 첨가하여 제조하고, 표 1에 나타낸 알부민 농도를 갖는 유체를 수득한다. 알부민을 포함하는 유체의 분액(10㎕)을 요소의 전개층에 점착시킨다. 점착된 요소를 37℃에서 5분 동안 항온처리한다. 이어서, 반사 밀도를 측정한다. Dr의 측정치는 6회 반복 측정치(n=6)의 평균(<Dr>)이다. %CV는 Dr의 평균치에 대한 변동 계수이다.
[표 1]
알부민 10 내지 300mg/dL의 반사 밀도의 변화(△Dr=0.710)에 의해 측정된 피로카테콜 요소의 검출 감도는 매우 우수하다. %CV는 비교적 작고 우수한 반복 정확도를 나타낸다.
실시예 2
피로갈롤 레드
피로갈롤 레드를 0.18g/m2의 양으로 미국 특허 제3,992,158호에 기재된 바와 같이 황산바륨 전개층에 피복한다. 계면활성제 트리톤 X-100(0.001g/m2), 타르타르산(6.0g/m2, pH 2.5) 및 옥살산 2g/m2을 아크릴아미드의 단독중합체, 폴리A(중량 평균 분자량: 100,000돌턴)를 피복량 10g/m2 으로 사용하여 시약층에 피복한다. 암모늄 몰리브데이트를 0.9g/m2의 양으로 황산바륨 전개층에 피복한다. 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)의 하부층을 전개층 및 시약층 사이에 피복한다. 요소의 구조는 다음과 같다:
피로갈롤 레드의 요소
전개층 황산바륨
피로갈롤 레드
암모늄 몰리브데이트
하부층 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)
시약층 폴리아크릴아미드(폴리A)
타르타르산
옥살산
트리톤 X-100
에스타르 지지체 /////////////////////////////////
pH 2.5의 몇몇 완충제를 피복시키지만, 타르타르산이 시험된 단백질 농도 범위에서 가장 선형 반응(540nm)을 제공한다. 실험 프로토콜은, Dr을 540nm에서 측정한 것을 제외하고는, 피로카테콜 바이올렛 요소에 대해 기재한 것과 동일하다. 시험 결과(n=6)는 표 2에 나타낸다.
[표 2]
피로갈롤 레드의 요소를 사용하여 시험한 알부민 농도 범위에 대한 Dr의 변화는 0.101이기 때문에, 검출 감도는 피로카테콜 바이올렛의 요소에서 수득한 감도보다 작다. %CV는 작지만, 피로카테콜 바이올렛의 요소를 사용하여 측정한 것보다 다소 크다.
실시예 3
브로모피로갈롤 레드의 요소
브로모피로갈롤 레드를 0.24g/m2의 양으로 폴리아크릴아미드 비히클, 폴리(아크릴아미드-co-N-(3-아세토아세트아미도프로필)메타크릴아미드)(95:5의 중량비) (이후부터 중합체 AAM으로서 명명됨) 12g/m2을 포함하는 시약층에 피복한다. 또한, 계면활성제 트리톤 X-165(0.20g/m2), 말론산(8.0g/m2, pH 2.5) 및 암모늄 몰리브데이트(0.4g/m2)으로 AAM 층을 피복한다. 황산바륨 전개층을 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 하부층 위에 피복한다. 황산바륨 전개층을 포함하는 요소의 구조는 다음과 같다:
브로모피로갈롤 레드의 요소
전개층 황산바륨
하부층 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)
시약층 폴리(아크릴아미드-co-N-(3-아세토아세트아미도프로필)
메타크릴아미드)(95:5 중량)Wt
브로모피로갈롤 레드
말론산
암모늄 몰리브데이트
칼륨 옥살레이트
비스비닐설포닐메틸 에테르(BVSME)
에스타르 기제 ////////////////////////////////
브로모피로갈롤 요소를 피로카테콜 및 피로갈롤 레드 지시 색소를 포함하는 요소에 대해 위에서 기재한 바와 같이 평가한다. 브로모피로갈롤(n=6) 요소를 평가하여 수득한 데이터는 표 3에 나타낸다.
[표 3]
알부민의 농도 범위에 대한 Dr의 변화는 0.178이기 때문에, 검출 감도는 피로카테콜 바이올렛의 요소보다 낮다. %CV는 크고, 이는 반복 정확도가 현저히 낮다는 것을 나타낸다.
실시예 4
갈레인
갈레인을 0.12g/m2의 양으로 황산바륨의 전개층에 피복한다. 계면활성제 트리톤 X-165(0.2g/m2), 말론산(8.0g/m2, pH 2.5) 및 옥살산(2.5g/m2)을, 분자 조성 폴리(아크릴아미드-co-N-비닐-2-피롤리돈)(50:50)wt을 갖는 공중합체(이후에 중합체 AVP로서 명명됨)에 피복하여 완충층을 형성한다. 암모늄 몰리브데이트(0.90g/m2) 및 계면활성제 트리톤 X-100(1g/m2)을 색소에 추가하여 황산바륨 전개층에 피복한다. 요소의 구조는 다음과 같다:
갈레인의 요소
전개층 황산바륨
갈레인
암모늄 몰리브데이트
트리톤 X-100
하부층 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)
완충층 폴리(아크릴아미드-co-N-비닐-2-피롤리돈)(50:50)Wt
말론산
트리톤 X-165
옥살산
에스타르 지지체 /////////////////////////////////////////
갈레인의 요소를 다른 요소에 대해 위에서 기재한 바와 같이 평가하고(n=6), Dr은 550nm에서 측정한다. 위의 시험 결과는 표 4에 나타낸다.
[표 4]
알부민의 농도 범위에 대한 Dr의 변화는 0.039이기 때문에, 검출 감도는 피로카테콜 바이올렛의 요소와 비교하여 현저히 저하된다. %CV는 매우 크고, 이는 반복 정확도가 낮다는 것을 나타낸다.
상기 실시예에서, 피로카테콜 바이올렛, 즉 바람직한 색소 및 암모늄 몰리브데이트를 포함하는 건식 분석 요소를 사용하여 상이한 단백질 유형의 측정에 대한 시약층의 상이한 중합체 비히클의 효과를 시험한다. 상기 실험에서 비교한 중합체는 폴리A(중량 평균 분자량; 약 120,000돌턴), (폴리(아크릴아미드-co-N-비닐-2-피롤리돈, 50/50 중량비)(중합체 AVP) 및 분자 조성(폴리(아크릴아미드-co-아크릴산), 90/10 중량비)을 갖는 중합체(이후부터 중합체 PAA로서 명명됨)이다. 모든 경우에, 전개층은 이전에 언급한 미국 특허 제3,992,156호에 기재된 바와 같이 황산바륨이다. 당해 중합체는 동일한 건식 피복량(12g/m2)으로 피복한다. 단백질을 포함하는 용액은 관심이 되는 공지된 중량의 정제된 사람 단백질(IgG, 레티놀 결합 단백질 및 카파 경쇄를 포함함)을 0.15M 염화나트륨을 포함하는 공지된 용적의 수용액에 첨가함으로써 제조한다. 요소는 위에서 언급한 바와 같이 슬라이드로 조립한다. 검정의 보정은 정제된 사람 알부민을 포함하는 용액(이후부터 보정 유체로서 언급됨)을 사용하여 실시한다. 시험 단백질 100mg/dL을 포함하는 각각의 용액 10㎕ 분액을 별개의 건식 분석(슬라이드) 요소에 각각 점착시킨다. 슬라이드를 37℃에서 5분 동안 항온처리한 후, 670nm에서의 반사 밀도를 측정한다. 샘플 중의 총 단백질의 농도를 측정된 반사 밀도 및 위에서 언급한 보정 유체를 사용하는 검정 보정으로부터 산출한다. 위의 결과는 표 5에 나타낸다.
[표 5]
단백질 반응성에 대한 중합체 유형의 효과
표 5의 데이터는 중합체가 피로카테콜 및 몰리브데이트 이온과 단백질의 상호작용에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 폴리A는 특히 단백질의 유형 중에서 Dr 관측치의 차이를 저하시키는 작용을 갖고 있기 때문에, 추정된 단백질 농도가 사람 알부민을 포함하는 유체를 사용하는 보정에 대해 측정된다. 이 결과, 유체에 첨가된 단백질의 양을 기준으로 예상되는 100mg/dL에 근접하는 단백질 농도의 추정치가 수득된다. 최고의 기능, 즉 피검 단백질의 유형에 대한 측정된 시그날의 의존도가 최소인 것은 폴리A이었다.
실시예 5
본 실시예에서, 중탄산염에 의한 간섭에 대한 글리콜산의 효과를 평가한다. 글리콜산은 폴리A를 12g/m2의 양으로 또한 포함하는 시약층에 피복한다. 글리콜산을 표 6에 나타낸 농도로 시약층에 피복한다. 수집된 사람 뇨의 샘플에 중탄산나트륨을 첨가하여 최종 중탄산염 농도를 100mM 또는 200mM로 조정한다(모든 경우, 최종 수집된 뇨 샘플의 pH는 8.5이다). pH는 최종 측정치에 대하여 조정되지 않지만, 중탄산염을 첨가한 후에도 그 pH였다. 미처리 수집된 뇨 대조군의 총 단백질은 18mg/dL(총 단백질 측정용 바이오트롤(BIOTROL)TM 키트를 사용하여 측정하고, 이 키트는 제조원(Merck Biotrol Diagnostics, Exton, PA 19341; catalog no A01217U)으로부터 시판되는 피로갈롤 레드/암모늄 몰리브데이트의 색소 결합 방법을 사용하는 용액 기초 검정이다)이다. 반사 밀도는 위의 실시예 5와 같이 측정하고, 총 단백질 농도는, 실시예 5와 같이 보정 유체로서 사람 알부민을 포함하는 유체를 사용하는 검정 요소를 보정한 후, 측정된 Dr 값을 사용하여 추정한다. 대조군 뇨에 대해 수득된 단백질 추정치를 중탄산염으로 처리된 뇨 샘플에 대해 수득된 단백질 추정치로부터 공제한다. 위의 데이터는 표 6에 나타낸다.
[표 6]
중탄산염에 의한 간섭에 대한 글리콜산의 효과; 중탄산염으로 처리한 뇨와 중탄산염 부재 대조군 뇨 사이의 단백질 농도의 차이
중탄산염에는 단백질과 유사한 광 시그날을 생성하는 작용이 있다. 예를 들어, 글리콜산의 부재하에, 중탄산염의 농도가 200mM인 뇨 시험편의 추정 단백질 농도는 실질적인 농도보다 약 110mg/dL 높다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 글리콜산은 중탄산염에 의한 효과를 급격하게 저하시킨다. 글리콜산(또는 앞서 기재한 바와 같이 다른 적합한 하이드록시카복실산)은 실시예 6에서와 같이 건식 분석 요소에 직접 첨가할 수 있거나, 이와는 달리 건식 분석 요소를 샘플과 접촉시키기 전에 샘플에 첨가할 수 있다. 분석 요소에 피복되는 글리콜산의 유용한 농도는 약 0.125 내지 2.0g/m2이다. 바람직한 범위는 0.125 내지 1.5g/m2이고, 보다 바람직한 범위는 0.25 내지 1.25g/m2이다. 바람직한 건식 분석 요소의 구조는 다음과 같다:
전개층 황산바륨
하부층 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)
시약/완충층 폴리아크릴아미드(폴리A)
글리콜산
피로카테콜 바이올렛 색소
암모늄 몰리브데이트
칼륨 옥살레이트
조닐-FSN 계면활성제
말론산 완충제, pH=2.5
지지체 ////////////////////////
위의 실험 및 실시예는 본 발명의 범위 및 취지를 설명하기 위해 제공된 것이다. 이들 양태 및 실시예는 당해 기술 분야의 숙련가에게 명백하다. 이러한 다른 양태 및 실시예는 본 발명의 사상의 범위에 속한다. 따라서, 본 발명은 단지 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한되어야 한다.
본 발명에 따르는 건식 분석 요소를 사용하여 단백질을 고감도로 신속하게 검출하고 정량할 수 있다.
Claims (36)
- 다공성 전개층(A),단백질 및 몰리브데이트 이온 또는 텅스테이트 이온과 반응하여 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도를 변화시킬 수 있는 색소(i), 몰리브데이트 염 또는 텅스테이트 염(ⅱ) 및 아크릴아미드를 포함하는 수용성 중합체(iii)를 포함하는 하나 이상의 추가의 층(B)(여기서, 색소, 몰리브데이트 염 또는 텅스테이트 염 및 아크릴아미드를 포함하는 중합체는 동일한 층에 함께 존재하거나, 요소의 개별적인 층에 배합물로서 또는 단독으로 존재할 수 있다) 및지지체(C)를 포함하는, 단백질 측정용 건식 분석 요소(dry analytical element).
- 제1항에 있어서, 색소가 피로카테콜 바이올렛, 피로갈롤 레드, 브로모피로갈롤 레드 및 갈레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 건식 분석 요소.
- 제2항에 있어서, 색소가 피로카테콜 바이올렛인 건식 분석 요소.
- 제1항에 있어서, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트인 건식 분석 요소.
- 제1항에 있어서, 아크릴아미드를 포함하는 중합체가 폴리A, 중합체 AVP, 중합체 PAA 및 중합체 AAM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 건식 분석 요소.
- 제5항에 있어서, 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A인 건식 분석 요소.
- 제1항에 있어서, 색소가 피로카테콜 바이올렛이고, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트이며, 아크릴아미드를 포함하는 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A인 건식 분석 요소.
- 제7항에 있어서, 다공성 전개층이 황산바륨을 포함하는 건식 분석 요소.
- 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 유체를 화학식 1의 하이드록시카복실산과 혼합하는 단계(A),하이드록시카복실산을 함유하고 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 유체를, 다공성 전개층(a), 단백질 및 몰리브데이트 이온 또는 텅스테이트 이온과 반응하여 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도를 변화시킬 수 있는 색소(i), 몰리브데이트 염 또는 텅스테이트 염(ii) 및 아크릴아미드를 포함하는 중합체(iii)를 포함하고 다공성 전개층과 유체 접촉하는 하나 이상의 추가의 층(b)(여기서, 색소, 몰리브데이트 염 또는 텅스테이트 염 및 아크릴아미드를 포함하는 중합체는 동일한 층에 함께 존재하거나, 요소의 개별적인 층에 배합물로서 또는 단독으로 존재할 수 있다)및 지지체(c)를 포함하는 건식 분석 요소와 접촉시키는 단계(B) 및단백질의 척도로서 색소의 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도의 변화를 측정하는 단계(C)를 포함하는, 단백질의 측정방법.화학식 1상기 화학식 1에서,R1 및 R2는 독립적으로 H, -CH3, -CH2CH3 또는 -CH2OH이고,M은 H 또는 양(陽)으로 하전된 금속 또는 비금속 카운터이온이다.
- 제9항에 있어서, 색소가 피로카테콜 바이올렛, 피로갈롤 레드, 브로모피로갈롤 레드 및 갈레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제10항에 있어서, 색소가 피로카테콜 바이올렛인 방법.
- 제9항에 있어서, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트인 방법.
- 제9항에 있어서, 아크릴아미드를 포함하는 중합체가 폴리A, 중합체 AVP, 중합체 PAA 및 중합체 AAM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제13항에 있어서, 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A인 방법.
- 제9항에 있어서, 색소가 피로카테콜 바이올렛이고, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트이며, 아크릴아미드 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A인 방법.
- 제15항에 있어서, 다공성 전개층이 황산바륨을 포함하는 방법.
- 다공성 전개층(A),단백질 및 몰리브데이트 이온 또는 텅스테이트 이온과 반응하여 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도를 변화시킬 수 있는 색소(i), 몰리브데이트 염 또는 텅스테이트 염(ii), 아크릴아미드를 포함하는 중합체(iii) 및 화학식 1의 하이드록시카복실산(ⅳ)을 포함하고 다공성 전개층과 유체 접촉하는 하나 이상의 추가의 층(B)(여기서, 색소, 몰리브데이트 염 또는 텅스테이트 염, 아크릴아미드를 포함하는 중합체 및 하이드록시카복실산은 동일한 층에 함께 존재하거나, 요소의 개별적인 층에 배합물로서 또는 단독으로 존재할 수 있다) 및지지체(C)를 포함하는, 단백질 측정용 건식 분석 요소.화학식 1상기 화학식 1에서,R1 및 R2는 독립적으로 H, -CH3, -CH2CH3 또는 -CH2OH이고,M은 H 또는 양으로 하전된 금속 또는 비금속 카운터이온이다.
- 제17항에 있어서, 색소가 피로카테콜 바이올렛, 피로갈롤 레드, 브로모피로갈롤 레드 및 갈레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 건식 분석 요소.
- 제18항에 있어서, 색소가 피로카테콜 바이올렛인 건식 분석 요소.
- 제17항에 있어서, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트인 건식 분석 요소.
- 제17항에 있어서, 아크릴아미드를 포함하는 중합체가 폴리A, 중합체 AVP, 중합체 PAA 및 중합체 AAM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 건식 분석 요소.
- 제21항에 있어서, 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A인 건식 분석 요소.
- 제17항에 있어서, 하이드록시카복실산이 글리콜산, 2-하이드록시프로판산, 2-메틸-2-하이드록시프로판산 및 이들의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 건식 분석 요소.
- 제23항에 있어서, 하이드록시카복실산이 글리콜산인 건식 분석 요소.
- 제17항에 있어서, 색소가 피로카테콜 바이올렛이고, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트이며, 아크릴아미드 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A이고, 하이드록시카복실산이 글리콜산인 건식 분석 요소.
- 제25항에 있어서, 다공성 전개층이 황산바륨을 포함하는 건식 분석 요소.
- 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 유체 샘플을, 다공성 전개층(a), 단백질 및 몰리브데이트 이온 또는 텅스테이트 이온과 반응하여 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도를 변화시킬 수 있는 색소(i), 몰리브데이트 염 또는 텅스테이트 염(ii), 아크릴아미드를 포함하는 중합체(iii) 및 화학식 1의 하이드록시카복실산(ⅳ)을 포함하고 다공성 전개층과 유체 접촉하는 하나 이상의 추가의 층(b)(여기서, 색소, 몰리브데이트 염 또는 텅스테이트 염, 아크릴아미드를 포함하는 중합체 및 하이드록시카복실산은 동일한 층에 함께 존재하거나, 요소의 개별적인 층에 배합물로서 또는 단독으로 존재할 수 있다) 및 지지체(c)를 포함하는 건식 분석 요소와 접촉시키는 단계(A) 및단백질의 척도로서 색소의 스펙트럼 흡광도 또는 반사 밀도의 변화를 측정하는 단계(B)를 포함하는, 단백질의 측정방법.화학식 1상기 화학식 1에서,R1 및 R2는 독립적으로 H, -CH3, -CH2CH3 또는 -CH2OH이고,M은 H 또는 양으로 하전된 금속 또는 비금속 카운터이온이다.
- 제27항에 있어서, 색소가 피로카테콜 바이올렛, 피로갈롤 레드, 브로모피로갈롤 레드 및 갈레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제28항에 있어서, 색소가 피로카테콜 바이올렛인 방법.
- 제27항에 있어서, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트인 방법.
- 제27항에 있어서, 아크릴아미드를 포함하는 중합체가 폴리A, 중합체 AVP, 중합체 PAA 및 중합체 AAM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제31항에 있어서, 아크릴아미드를 포함하는 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A인 방법.
- 제27항에 있어서, 하이드록시카복실산이 글리콜산, 2-하이드록시프로판산, 2-메틸-2-하이드록시프로판산 및 이들의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제33항에 있어서, 하이드록시카복실산이 글리콜산인 방법.
- 제27항에 있어서, 색소가 피로카테콜 바이올렛이고, 몰리브데이트 염이 암모늄 몰리브데이트이며, 아크릴아미드 중합체가, 분자량 범위가 100,000 내지 150,000돌턴인 폴리A이고, 하이드록시카복실산이 글리콜산인 방법.
- 제35항에 있어서, 다공성 전개층이 황산바륨을 포함하는 방법.
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