JP4065355B2 - タンパク質測定用乾式分析要素及びタンパク質の測定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、乾式分析要素およびその要素を使用して流体試料中のタンパク質を定量する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、前記分析要素における特定の色素とモリブデン酸イオン、アクリルアミドを含む重合体、およびヒドロキシカルボン酸の使用に関する。
【0002】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
例えば生物学的流体などの各種流体中に存在する化学物質および生物学的物質を迅速かつ正確に測定するための医療と医学的研究ならびに分析法と診断法が引続き要望されている。例えば、タンパク質の存在と量は、多くのヒトの疾患の有効な研究、診断および治療を行うため迅速かつ正確に測定しなければならない。
【0003】
前記物質類を検出するため、多種類の分析法が、この数十年間に開発されている。これらの分析法は、信頼性が高くなり、場合によってはキットの形態で使用するのに適切なばかりでなく自動化にも適している。
タンパク質検定法は、伝統的に、溶液中で、または何らかの方法で流体を取り出した試験装置中で、検定に関与する試薬によって実施されてきた。溶液法は、この分野で広く受け入れられており、一般に、溶液を扱って輸送する複雑なキャピラリーを備えていることが多い分析装置が必要である。さらに、かような検定法に用いられる分析装置は、試料どうしの汚染を避けるため必要な操作と厳密な洗浄の両者を行うため、複雑な液体の操作を必要としかつ熟練者が要求されることがある。
【0004】
溶液化学法の代替法は乾式分析要素を使用する方法である。物質の沈着、試料の湿潤を促進または容易にしかつ前記要素の構造の一体性を維持するために必要な結合剤、界面活性剤および他の試薬などのコーティング剤からの妨害があるため、すべての溶液ベースの分析検定法が乾式分析要素で使用するのに適しているわけではないと解すべきである。さらに乾式分析要素は、非相容性の要素を隔離するため、現場で区画化を行わねばならない。このことは溶液化学法には当てはまらないが、溶液化学法では別個の液体の貯蔵および連続的な液体の添加を採用することができる。
【0005】
乾式分析要素とその使用については多数の刊行物に記載されており、その刊行物としては、Pierceらの米国特許第4,132,528号、同第4,786,605号、同第3,992,158号、同第4,258,001号;Frickeryらの米国特許第4,670,381号;国際特許願公開第WO82/2601号(1982年8月5日公開);ヨーロッパ特許願第051,183号(1982年5月12日公開);およびヨーロッパ特許願第066,648号(1982年12月15日公開)がある。なおこれら引用文献の全内容は本明細書に援用するものである。
【0006】
患者の腎機能を評価し監視するのに有用な診断指標は、尿中に存在する全タンパク質の濃度である。尿中に存在するタンパク質の種類と量は、変動し、そして腎臓不全をもたらしてタンパク質の尿への移動を阻害する特定疾患の症状に依存している。
尿中に見出すことができるタンパク質の例は、特に限定されないが、アルブミン、無傷の免疫グロブリン類、カッパー自由鎖類、ラムダ自由鎖類、レチノール結合タンパク質、α−1−ミクログロブリンおよびβ−1−ミクログロブリンがある。これらのタンパク質は、アミノ酸の組成と分子量が広範囲に異なっている。尿の全タンパク質選別検定法を利用する臨床医にとって興味深い情報は、尿試料の単位容積当りのタンパク質の全質量である。診断検定法、すなわち測定されるシグナルは、理想的には、存在しているタンパク質の種類またはタイプと無関係であるべきである。例えば、50mg/dLのアルブミンは50mg/dLの他のあらゆるタンパク質と同じシグナルを生成すべきである。ヒトの尿中の正常なタンパク質濃度の範囲は約5〜100mg/dLである。
【0007】
生物学的物質中の全タンパク質濃度を測定するのに各種の手段が使用されている。多くの分析検定法では、光のシグナルが測定され、例えば試料中のタンパク質の濃度に比例する、スペクトル中の可視光または紫外光の領域の吸光度がある。しかし、一般に、光のシグナルは、望ましくないことであるが、試料中のタンパク質の種類の関数となり、単に、存在するタンパク質の質量にだけ関連があるわけではない。これらの方法は、通常、検出可能な光のシグナルを生成させる下記の方法のうちの一つに依存している。
【0008】
1.タンパク質とCu(II)の錯体(ビウレット反応)は、スペクトルの可視光領域の検出可能であるが弱い吸収をもたらす。
2.タンパク質の芳香族アミノ酸類による、スペクトルの紫外光領域の吸収を測定することができる。
3.タンパク質の量は、特定のアミノ酸類を、固有の吸光または蛍光を用いて定量することができる発色団を含有する分子で誘導体化することによって測定できる。
【0009】
4.タンパク質と非共有結合を行って色素−タンパク質錯体を生成することができ、その錯体が色素の摂動をもたらす色素を利用して、試料中のタンパク質の存在または量を測定することができる。いくつかの色素は、モリブデンまたはタングステンなどの金属イオンの存在が必要であり、この場合、色素、金属イオンおよびタンパク質の非共有結合による錯体が生成し、その錯体が色素の吸収スペクトルの摂動をもたらし、この摂動を利用して試料中のタンパク質の存在または量を測定できる。
【0010】
5.Cu(II)の配位に対してタンパク質が色素と競合することによって、タンパク質の濃度に比例する吸収シグナルをもたらす〔Cu(II)/色素の配位錯体は、遊離色素すなわちCu(II)に配位していない色素とは異なる吸収スペクトルをもっている〕。
米国特許第4,132,528号は、ビウレット反応に基づいたタンパク質の検定法に関するものである。’528特許の乾式検定要素は、ビウレット反応に使うCu(II)とキレート化剤のビウレット試薬、例えばCuSO4 と酒石酸もしくはこれら両者の錯体、およびpHを約12より上げる緩衝剤で構成されている。血清または脳脊髄液(CSF)などの水性流体中のタンパク質は、12を超えるpH下でビウレット試薬と相互に作用し、第二銅型の銅とタンパク質の反応が起こって紫色を呈する。その色の強度は血清のタンパク質含量に比例するので、そのタンパク質のレベルは、公知の比色分析法で測定することができる。あいにく、上記特許の乾式スライド要素は、感度が所望の感度より低く、すなわち約200mg/dL以下のタンパク質レベルを検出できない。
【0011】
米国特許第4,786,605号には、ビウレット試薬を、予め製造したCu(II)ピリジルアゾ色素の配位錯体(または遊離Cu(II)と遊離ピリジルアゾ色素)で取り替えることによって、’528特許の要素より感度が高い、タンパク質定量用の分析要素の配合物が記載されている。水性タンパク質が検定要素に添加されると、第二銅イオンが、タンパク質によって、錯体から追い出されて、Cu(II)色素錯体の吸収曲線が未配位色素の吸収曲線にシフトする。したがって、タンパク質を添加すると、Cu(II)/色素錯体の吸収ピークが、添加されたタンパク質の量に比例して小さくなるので、既知の濃度のタンパク質を含有する試料で適切に校正することによって、液体試料中のタンパク質の未知濃度を比色分析で測定することができる。この特許は、これらの要素が、非常に優れたダイナミックレンジと、ビウレット反応に基づいた要素の約30倍もの大きい感度を有していることを教示している。
【0012】
しかし、尿の試料中のタンパク質を定量するのに’605特許の方法を使用すると、一貫して、尿試料の約10〜20%が、参照標準としてタンパク質濃度についてクーマシー・ブルー溶液検定法を用いて得られた値と比べて、容認できないランダムな正のバイアスを示す。すなわち、’605特許の方法による特定の患者の尿試料(試料集団の約10〜20%)のタンパク質の指定濃度は、クーマシー・ブルーベースの検定法を用いて測定した濃度より大きい。このランダムな正のバイアスは、Cu(II)およびニトロ基のような色素の還元可能な基の両者の還元を起こすアスコルビン酸のような還元剤が、特定の尿試料中に存在していることが原因であると推定された。乾式分析要素としては、上記諸検定法の欠陥の作用を受けないことが望ましい。
【0013】
酸性条件下、タンパク質と金属イオンによって錯体を生成する際の特定の指示色素の溶液反応であって、測定可能な色の変化が生じる反応は公知である。上記のように、溶液中でうまく作用する分析検定法は、先に述べた理由のため、乾式分析要素に容易に採用できるわけではない。
異なるタンパク質が、色素と同等に反応して、試料中に存在するタンパク質の質量に関連しかつタンパク質の種類に無関係の光シグナルを生成することが非常に望ましい。尿は、各種の量の重炭酸塩(最高約200mMまで)を含有している。尿試料中に高レベルの重炭酸塩が存在していて、重炭酸塩を希釈するかまたは試料を前処理する(例えば分子サイズ排除法などで)ことによって除くことをしないと、非常にアルカリ性の状態を生成するのに十分な重炭酸塩を検定法に持ち込むことになり、このアルカリ性の状態は、色素−金属イオン−タンパク質の相互作用が低pH下(1.5〜3.5)で起こりおよび/または重炭酸塩がその上に、一貫して金属イオンの配位を妨害するので、検定法を信頼性がなく無用のものにする。次のような、タンパク質測定用の乾式分析要素を提供することが要望されている。すなわち、還元剤または重炭酸塩の存在の影響を受けず、存在するタンパク質の質量と実質的に相関関係があるシグナル測定値すなわち実質的に(「実質的に」とは、尿試料中の全タンパク質の尺度のような、特定のタンパク質を測定するのに適切なまたは容認可能なことを意味する)タンパク質の種類に無関係なシグナル測定値を生成し、そして約5〜約300mg/dLの範囲内のタンパク質の定量に使用でき、かつ試料の前希釈、前濃縮または前処理を行って前記妨害物を除く必要がない乾式分析要素が要望されている。
【0014】
予想外のことであったが、生物学的流体中のタンパク質の量または存在の測定に使用するのに適切な乾式分析要素、すなわちモリブデン酸イオンの存在下、アクリルアミドを含有する重合体およびヒドロキシカルボン酸化合物とともに指示色素を含有してなる乾式分析要素を提供できることが発見されたのである。
【0015】
【課題を解決するための手段】
タンパク質の濃度を測定するのに用いる従来技術の乾式分析要素の問題点は、本発明の乾式分析要素の、モリブデン酸イオンの存在下、アクリルアミド系重合体とヒドロキシカルボン酸化合物を組み合せた指示色素を用いることによって克服された。モリブデン酸イオンは本発明の実施態様に用いるのに好ましい金属イオンである。しかし本発明の実施態様は、モリブデン酸イオンにのみ限定されない。他の適切な金属イオン、例えばタングステン酸イオンも本発明の範囲内にあるとみなされる。
【0016】
先に述べたように、異なるタンパク質が色素と同等に反応して、試料中に存在しているタンパク質の質量に関連しかつタンパク質の種類には無関係の光シグナルを生成することが非常に望ましい。予想外のことであったが、本発明の乾式分析要素の各種試薬をコートするのに使用される重合体媒体が、指示色素系と異なるタンパク質類との見掛けの反応性に影響することが発見されたのである。したがって、測定された光シグナルの強度は、存在するタンパク質の種類またはタイプに依存しているが、タンパク質のタイプに対するこの依存性は、アクリルアミドを含む重合体が乾式分析要素内に存在している場合、顕著に低下する。
【0017】
試料中の全タンパク質を定量するのに用いる乾式分析要素であって、モリブデン酸アンモニウムの存在下、指示色素とタンパク質の錯体を生成する際の適当な波長の反射濃度の変化を測定することに基づいた乾式分析要素を本明細書に開示する。本発明の乾式要素は、あらゆる液体試料、特に生物学的流体中のタンパク質の量を測定するのに有用である。
【0018】
さらに具体的に述べると、一実施態様で、本発明は、タンパク質の測定と定量を行うのに有用な乾式分析要素であって、
(i)多孔質展開層;
(ii)上記多孔質展開層と流体接触している一つ以上の追加の層;および
(iii) 支持体;
を含んでなり、前記要素が、これら層のうちの少なくとも一つに、前記要素を、タンパク質を含有していると予想される流体と接触させると、反応して、色素のスペクトル吸収または反射濃度に測定可能な変化を生成する、アクリルアミド含有重合体、指示色素およびモリブデン酸イオンを含有し、そして前記色素、前記モリブデン酸塩および前記アクリルアミド含有重合体が、同じ層中にともに存在しているか、または前記要素の別個の層に任意の組合わせもしくは個々に存在している乾式分析要素に関する。
【0019】
本発明は、タンパク質の測定と定量に、上記乾式分析要素を使用する下記の方法を提供するものであり、その方法は、
(A)式:
【0020】
【化4】
【0021】
(式中、R1 とR2 は独立してH,−CH3 ,−CH2 CH3 または−CH2 OHであり、そしてMはHまたは正電荷の金属もしくは非金属の対イオンである)で表されるヒドロキシカルボン酸を、タンパク質を含有していると予想される流体試料に添加し;
(B)前記ヒドロキシカルボン酸を含有する前記流体試料を、前記分析要素と接触させ;次いで
(C)タンパク質の存在と量の尺度として、色素のスペクトル吸収または反射濃度の変化を測定する;
ことからなる方法である。
【0022】
好ましい実施態様で、本発明は、タンパク質の測定と定量を行うのに有用な下記の分析要素に関し、その分析要素は、
(i)多孔質展開層
(ii)前記多孔質展開層と流体接触する一つ以上の追加の層;および
(iii) 支持体;
を含んでなり、前記要素が、これらの層のうちの少なくとも一つに、アクリルアミドを含有する重合体を含有し、そして前記要素が、式:
【0023】
【化5】
【0024】
(式中、R1 とR2 は独立してH,−CH3 ,−CH2 CH3 または−CH2 OHであり、そしてMはHまたは正電荷の金属もしくは非金属の対イオンである)で表されるヒドロキシカルボン酸を含有し、そしてさらに、前記要素を、タンパク質を含有していると予想される流体と接触させると、反応して、色素のスペクトル吸収または反射濃度の測定可能な変化を起こす指示色素およびモリブデン酸イオンを含有し、そして前記色素、前記モリブデン酸塩、前記アクリルアミド含有重合体および前記ヒドロキシカルボン酸が同じ層にともに存在している、または前記要素の別個の層に、任意に組み合わせるかもしくは個々に存在している;分析要素である。
【0025】
本発明は、タンパク質の測定および定量を行うのに上記好ましい乾式分析要素を使用する下記方法を提供するものであり、その方法は、
(A)タンパク質を含有していると予想される流体試料を前記分析要素と接触させ;
(B)タンパク質の存在と量の尺度として、スペクトル吸収または反射濃度の変化を測定する;
ことを含んでなる方法である。
【0026】
【発明の実施の形態】
本発明は、各種の水性流体、例えばヒトおよび動物の生物学的流体、食品、産業もしくは都市の流出汚水および上記の方法で通常試験される他の流体中のタンパク質の存在および/または濃度を測定するのに有利に使用される。試験できる生物学的流体としては、限定されないが、全血、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙液、滑液、リンパ液、組織もしくは血小板の懸濁液、歯肉液、膣液、脳液および当該技術分野の当業者にとって容易に分かる他の流体がある。
【0027】
測定できるタンパク質としては、限定されないが、ペプチド類、ポリペプチド類、タンパク質類(例えば、酵素類、抗体類、リポタンパク質類および糖タンパク質類など)、およびペプチド類、ポリペプチド類および/またはタンパク質類を含有またはこれらのものに(共有結合または非共有結合で)結合された化合物がある。本発明は、尿中のタンパク質を測定するのに特に有用である。
【0028】
本発明は、多孔質の展開層、通常は、希釈されたかまた希釈されていない試験試料(例えば1〜50μL)を収納するのに適した多孔度を有するコート層を含んでなる分析要素を使って実施される。本発明の要素は、当該技術分野で公知の方法を使用して組み立てられる。好ましくは、前記多孔質展開層は等方的に多孔質であり、その特性は、層の粒子、繊維または他の物理的要素の間の空間を相互に接続することによって提供される。“等方的に多孔質”という用語は、流体が層全体に均一に展開されることを意味する。このような層に有用な材料は、水に不溶性で、検定中その構造の一体性を維持する。分析要素を組み立てるのに用いる通常の材料と手段は、例えばPrzybylowiczらの米国特許第3,992,158号、Pierceらの米国特許第4,258,001号、Kitazimaらの米国特許第4,292,272号およびKoyamaらの米国特許第4,430,436号に記載されている。なおこれら文献の全内容は本明細書に援用するものである。好ましい多孔質展開層は、Przybylowiczらの米国特許第3,992,158号に記載されているようにESTANE中に硫酸バリウムを入れて製造される。
【0029】
本発明の分析要素には一つ以上の追加の層があり、これらの層はすべて、前記多孔質の展開層と流体接触している。用語“流体接触”は、本明細書で用いられる場合、流体が一つの層から別の層に容易に移動できることを意味する。かような追加の層の好ましくはコートされた重合体の層としては、試薬と放射線を遮断する下層があり、そしてゼラチンとビニルピロリドン重合体などのような当該技術分野で公知の1種以上の親水性結合剤で構成されている。いくつかの層は水不溶性であり、残りの層は水溶性であってもよい。
【0030】
本発明の要素の諸層は自立性であってもよいが、好ましくはこれらの層は、寸法が適切で安定な化学的に不活性な支持体上に配置される。その支持体は、好ましくは非多孔質でかつ電磁線を透過する。好ましい支持体は、指定の検出モード(例えば透過分光法または反射率分光法)に適合するものでなければならない。有用な支持体の材料としては、限定されないが、紙、金属ホイル類、ポリスチレン類、ポリエステル類、ポリカーボネート類およびセルロースエステル類がある。
【0031】
本発明の要素の層の少なくとも一つに、タンパク質およびモリブデン酸イオンと特異的に反応することができる色素が存在している。
“タンパク質およびモリブデン酸イオンと反応する色素”という用語は、本明細書で使用する場合、モリブデン酸イオンとタンパク質の存在下での色素のスペクトル吸収または光吸収の特性が、タンパク質が存在しない場合の色素とモリブデン酸イオンの前記特性と異なるあらゆる色素化合物を意味する。所望の上記特性を有する色素としては、モリブデン酸イオンを配位結合させることができる官能基(例えば、限定されないが、芳香環上の隣接する二つのヒドロキシル基)を有する開放芳香族構造(open aromatic structure )および三環式芳香族構造を含んでなる色素がある。このような色素としては、限定されないが、ピロカテコールバイオレット、テトラブロモフェノールフタレインエチルエステル、トリヨードフェノールスルホンフタレイン、テトラブロモピロガロールレッドおよびピロガロールレッドなどがある。
【0032】
本発明の好ましい実施態様で、タンパク質の存在および/または量を測定するのに用いる多層分析要素が提供される。具体的に述べると、その多層要素は非多孔質の支持体を備え、その上に流動体接触で、
(i)タンパク質およびモリブデン酸イオンと反応する色素、モリブデン酸塩、アクリルアミド含有重合体を含有する第一試薬または緩衝層、
(ii)下層、および
(iii) 多孔質展開層、
を備えている。
【0033】
本発明の要素には、適当な層に、製造、流体の展開および不要な放射線の吸収を助成するため、当該技術分野で公知の各種の添加剤を含有させてもよい。
本発明の要素は、従来技術に説明されている通常のコーティング法および装置(グラビア法、カーテン法、ホッパー法などのコーティング法を含む)を用いて製造することができる。本発明の要素は、あらゆる所望の幅を有する細長いテープ、シート、スライドまたはチップを含む各種の形態で配置構成することができる。さらに本発明の方法は、適当な分析装置と方法を用いて手動でまたは自動化して実施できる。一般に、本発明の方法は、多孔質展開層上に試験試料(例えば1〜50μl)を点着することによって、分析要素の試薬に接触させて行われる。分析要素中を流体が移動して、試薬を有効に混合し、反応が起こる。
【0034】
試料を適用した後、分析要素は、タンパク質−色素−モリブデン酸イオン系錯体の生成を迅速化、あるいは促進するのに望ましい場合がある、インキュベーション、加熱などの方法のあらゆるコンディショニングに暴露される。
上記のように、本発明に利用され、タンパク質およびモリブデン酸イオンと反応する色素としては、限定されないが、モリブデン酸イオンを配位結合させることできる官能基(例えば、限定されないが芳香族環の隣接する二つのヒドロキシル基)を有する開放芳香族構造および三環式芳香族構造を含んでなる色素がある。このような色素としては、限定されないが、ピロカテコールバイオレット、テトラブロモフェノールフタレインエチルエステル、トリヨードフェノールスルホンフタレイン、テトラブロモピロガロールレッドおよびピロガロールレッドが挙げられる。
【0035】
上記色素化合物は、公知の化学メーカー、例えばEastman Organic Chemical Company, Aldrich Chemical Company, Sigma Chemical Companyなどから購入することができ、または当該技術分野の当業者にとって公知の通常の出発物質と方法を用いて製造できる。
下記の指示色素を別々に有している乾式分析要素を製造した。その色素はピロカテコールバイオレット〔ピロカテコール、4,4′−(3H−2,1−ベンゾキサチオール−3−イリデン)−ジ−S,S−ジオキシド〕;ピロガロールレッド〔2−(4,5,6−トリヒドロキシ−3−オキソ−3H−キサンテン−9−イル)ベンゼンスルホン酸〕;ブロモピロガロールレッド〔スピロ(3H−2,1−ベンゾキサチオール−3′,9′−〔9H〕−キサンテン−3′,4′,5′,6′−テトロール−2,7−ジブロモ−I,I−ジオキシド)〕;ガレイン〔3′,4′,5′,6′−テトラヒドロキシスピロ〔イソベンゾフラン−1(3H),9′−〔9H〕キサンテン〕−3−オン〕である。乾式分析要素の一般的特徴は、Przybylowiczらの米国特許第3,992,158号およびFrank とPierceの米国特許第4,258,001号に記載されている。これらの色素はすべて、物理化学的な環境の変化に対し敏感である。
【0036】
我々は、乾式分析要素においてモリブデン酸イオンと組み合わせた上記色素を用いて、尿タンパク質の定量分析を行えることを発見したのである。ピロカテコールバイオレットをモリブデン酸イオンと組み合わせて含んでなる乾式分析要素が、最高の分析検出感度(すなわち、300mg/dLまでの所望のタンパク質濃度範囲にわたる反射濃度Drの最高の変化)およびヒトアルブミンを含有する調製溶液に対して反復精度を提供した。
【0037】
我々は、予想外のことであったが、乾式要素の各種試薬をコートするのに使用される重合体の媒体が、指示色素系の異なるタンパク質との見掛けの反応性に影響し、したがって、測定される光シグナルの強度の、存在しているタンパク質のタイプに対する依存関係に影響することを発見した。本発明に使用するのに適している重合体は、光シグナルを平坦化する作用を有し、すなわち、その重合体は、等量の質量または重量の異なるタンパク質に対して得られる反射濃度シグナルの測定値の差を減少させる作用を有している。このことは、異なるタイプのタンパク質が異なる試料で優勢であり、そして望ましい測定値は、試料の単位容積当りの存在するタンパク質の全質量(全タンパク質)であるので、望ましい。理想的には、全タンパク質の検定法は等しい感度ですべてのタンパク質を定量すべきである。本発明の重合体としては、限定されないが、水溶性ホモポリマー、共重合体およびターポリマーがあり、大部分がアクリルアミドで構成されている(約40重量%を超えている)。モリブデン酸イオンを配位結合させることができる官能基は、本発明の重合体中に存在している場合、タンパク質の測定を妨害する量で存在していてはならない。好ましい重合体はアクリルアミドのホモポリマーであり、すなわち重量平均分子量が約20,000〜250,000ダルトンのポリアクリルアミド(以後、ポリAと呼ぶ)である。最も好ましい範囲は、約100,000〜150,000ダルトンである。
【0038】
その上に、我々は、全く予想外のことであったが、多層の分析要素にグリコール酸を添加すると〔分析要素にプレコート(precoat)することが好ましい〕、重炭酸塩が原因の妨害が実質的に低下することを発見したのである。一般構造式:
【0039】
【化6】
【0040】
(式中、R1 とR2 は独立してH,−CH3 ,−CH2 CH3 または−CH2 OHであり、そしてMはHまたは正電荷の金属もしくは非金属の対イオンである)で表される他のヒドロキシカルボン酸類は類似の作用を有しているので本発明で使用するのに適している。上記式で表される代表的なヒドロキシカルボン酸類としては、2−ヒドロキシプロパン酸、2−メチル−2−ヒドロキシプロパン酸およびそれらの塩類がある。
【0041】
上記アクリルアミド重合体とヒドロキシカルボン酸類を組み合わせて指示色素とモリブデン酸イオンを含んでなる乾式分析要素を使用して、尿タンパク質の満足すべき定量分析結果を得ることができる。分子量が約20,000〜250,000ダルトンのポリアクリルアミド重合体およびグリコール酸も組み合わせたピロカテコールバイオレットとモリブデン酸イオンは好ましい乾式分析要素であり、300mg/dLまでのタンパク質濃度の鋭敏な尺度および非常に優れた反復精度を提供する。最も好ましい乾式分析要素は、試薬/緩衝層中に入れるコートされた重合体媒体としてのポリA(平均分子量が100,000〜150,000ダルトン)およびプレコートされたグリコール酸を含有している。
【0042】
ポリアクリルアミドは、指示色素のピロカテコールバイオレット/モリブデン酸イオン系と異なるタンパク質類の反応性を平坦化する作用を有している。同じ重量濃度の異なるタイプのタンパク質に対する反射濃度のシグナルの差は、好ましい重合体を用いる乾式要素では顕著に減少する。ピロカテコールバイオレットおよびモリブデン酸塩を使う重合体の作用は、他のタイプの指示色素と金属イオンを用いる場合に観測される。本発明は、約5〜300mg/dLの範囲の、尿中全タンパク質を定量するのに用いる乾式要素を製造することができる。本発明の乾式要素は、異なるタンパク質に対する感度がほゞ等しいので、その目的とする用途に対して適切でかつ従来技術の溶液と乾式要素がベースの検定法より優れた精度が得られる。尿試料中に広範囲で各種の濃度の重炭酸塩が存在していることが原因の主な妨害作用は、ピロカテコール−モリブデン酸イオンの化学反応を利用する乾式要素にグリコール酸を添加することによって克服された。先に開示したような他のヒドロキシカルボン酸類は、乾式要素に組み込むかまたは試料に添加するかにかゝわらず類似の効果をもっている。これら二つの非常に異なりかつ予想外の発見は、液体試料中の全タンパク質を定量するのに特に適切な、鋭敏でかつ強力な乾式検定要素を提供している。
【0043】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明の範囲を説明する。これらの実施例は、例示だけを目的として示すものであるから、実施例に具体的に示されている発明を、その実施例に限定すべきではない。特にことわらない限り、試薬と装置はすべて製造業者から入手した。
【0044】
以下の実施例1〜4は、異なる指示色素を含有してなる分析要素の分析検出の感度と反復精度を比較した実験結果を示す。
実施例1
ピロカテコールバイオレット
ピロカテコールバイオレットを、0.12g/m2 の量で、その外に、12g/m2 の次の組成〔ポリ(アクリルアミド−コ−N−ビニル−2−ピロリドン)、50:50重量比)〕を有するアクリルアミド重合体(以後、重合体AVPと呼ぶ)、界面活性剤のZonyl FSN(0.36g/m2 )と緩衝剤としてのコハク酸5.9g/m2 (pH2.5)、モリブデン酸アンモニウム(0.18g/m2 )およびシュウ酸カリウム(0.15g/m2 )を含有する試薬層中に入れてコートした。ビーズ展開層(米国特許第4,258,001号に記載されている下記組成を有する)を用いた。展開層と試薬層の間に、ポリ(N−ビニル−2−ピロリドン)の下層を設置した。この要素を1cm2 四角に切断してスライドに取り付けた。Johnson & Johnson Clinical Diagnostic slide analyzerを使用して、スライドの要素にタンパク質含有溶液を点着し、そのスライドをインキュベートして反射濃度Drを読み取った。要素を評価するこの方法によれば、測定者は、多数の要素を試験しかつ簡便に反復測定値を得ることができる。点着し、インキュベートし次に光シグナルを測定する他の方法も、乾式要素を評価するのに適している。要素の構造を以下に示す。
支持体
Drは670nmで測定した。下記表1は、上記のピロカテコール要素を用いて得た試験結果を示す。タンパク質を含有する流体は、既知重量のヒト血清アルブミンを、既知容積の0.15M塩化ナトリウム水溶液を添加することによって調製し、アルブミンの濃度が表1に示す濃度である流体を得た。アルブミンを含有する上記流体10μLずつを分析要素の展開層の上に点着した。点着された要素を37℃で5分間インキュベートした。次に反射濃度を測定した。Drの測定値は、六つの反復測定値(n−6)の平均値(<Dr>)である。%CVはDr平均値の変動係数である。
【0045】
10〜300mg/dLアルブミンの反射濃度の変化(ΔDr=0.710)で測定した場合のピロカテコール要素の検出感度は非常に優れている。その%CVは比較的小さく、優れた反復精度を示している。
実施例2
ピロガロールレッド
ピロガロールレッドを、0.18g/m2 の量で、米国特許第3,992,158号に記載されている硫酸バリウムの展開層中に入れてコートした。界面活性剤のTRITON X−10(0.001g/m2 )、酒石酸(6.0g/m2 、pH2.5)およびシュウ酸(2g/m2 )を、アクリルアミドのホモポリマーのポリA(平均分子量100,000ダルトン)を被覆量10g/m2 で用いる試薬層中に入れてコートした。モリブデン酸アンモニウムは0.9g/m2 の量で、硫酸バリウムの展開層中に入れてコートした。ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)の下層を、展開層と試薬層の間にコートした。その要素の構造を以下に示す。
Estar
支持体
pH2.5のいくつもの緩衝剤をコートしたが、酒石酸が試験したタンパク質の濃度範囲にわたって最も直線的な応答を示した(540nmにて)。実験のプロトコルは、Drを540nmで測定したことを除いて、ピロカテコールバイオレットの要素について記載したのと同じであった。試験結果(n=6)を表2に示す。
【0046】
ピロガロールレッドの要素を使って試験したアルブミン濃度の範囲を通じてのDrの変化は0.101なので、検出感度は、ピロカテコールバイオレットの要素で得た感度より低い。%CVは小さいが、ピロカテコールバイオレットの要素を用いて測定した場合よりいくぶん大きい。
実施例3
ブロモピロガロールレッドの要素
ブロモピロガロールレッドを、0.24g/m2 の量で、12g/m2 のポリアクリルアミド媒体のポリ(アクリルアミド−コ−N−(3−アセトアセトアミドプロピル)メタクリルアミド)(95:5重量比)(以後重合体AAMと呼ぶ)を含有する試薬層に入れてコートした。界面活性剤TRITON X−165(0.20g/m2 )、マロン酸(8.0g/m2 、pH2.5)およびモリブデン酸アンモニウム(0.4g/m2 )もAAM層に入れてコートした。硫酸バリウムの展開層は、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)の下層の上にコートした。硫酸バリウムを含有する要素の構造を以下に示す。
Estarベース
ブロモピロガロール要素を、ピロカテコールおよびピロガロールレッド指示色素を含有する要素について先に述べたようにして評価した。ブロモピロガロール(n=6)要素を評価して得たデータを表3に示す。
【0047】
アルブミンの濃度範囲を通じてのDrの変化は0.178であるので、検出感度はピロカテコールバイオレットの要素より低い。%CVは大きい。これは反復精度が顕著に低いことを示している。
実施例4
ガレイン
ガレインを、0.12g/m2 の量で、硫酸バリウムの展開層に入れてコートした。界面活性剤TRITON X−165(0.2g/m2 )、マロン酸(8.0g/m2 、pH2.5)およびシュウ酸(2.5g/m2 )を、分子組成:ポリ(アクリルアミド−コ−N−ビニル−2−ピロリドン)(50:50重量比)を有し、以後、重合体AVPと呼ぶ共重合体(10.0g/m2 )に入れてコートして、緩衝層を製造した。モリブデン酸アンモニウム(0.90g/m2 )と界面活性剤TRITON X−100(1g/m2 )を、色素に追加して、硫酸バリウム展開層に入れてコートした。その要素の構造を以下に示す。
Estar支持体
上記ガレインの要素を他の要素について先に述べたのと同様にして(n=6)評価し、Drは550nmで測定した。試験結果を表4に示す。
【0048】
アルブミンの濃度範囲を通じてのDrの変化は0.039なので、検出感度はピロカテコールバイオレットの要素と比べてかなり低下している。%CVはかなり大きく、このことは反復精度がかなり低いことを示している。
【0049】
この実施例で、ピロカテコールバイオレットすなわち好ましい色素とモリブデン酸アンモニウムを含有する乾式分析要素を用いて行う異なるタイプのタンパク質の測定に対する、試薬層の異なる重合体媒体の効果を試験した。この実験で比較した重合体は、ポリA(重量平均分子量が約120,000ダルトン);〔ポリ(アクリルアミド−コ−N−ビニル−2−ピロリドン)、50/50重量比〕(重合体AVP);および分子組成(ポリ(ポリアクリルアミド−コ−アクリル酸)、90/10重量比)を有する重合体、(以後、重合体PAAと呼ぶ)であった。展開層はすべての場合、前記米国特許第3,992,156号に記載されているように、硫酸バリウムとした。重合体類は、同じ乾燥被覆量(12g/m2 )でコートした。タンパク質を含有する溶液は、既知重量の対象の精製ヒトタンパク質(IgG、レチノール結合タンパク質およびカッパー軽鎖を含む)を、既知容量の0.15M塩化ナトリウム水溶液に添加することによって調製した。諸要素は、上記のようにスライドに形成させた。検定の校正を、精製ヒトアルブミンを含有する溶液(以後、校正流体と呼ぶ)を用いて行った。100mg/dLの試験タンパク質を含有する各溶液10μLずつを、別個の乾式分析(スライド)要素に、個々に点着した。そのスライドを37℃で5分間インキュベートした後、670nmで反射濃度を測定した。試料中の全タンパク質のレベルを、測定した反射濃度および上記校正流体を用いる検定校正法から算出した。結果を表5に示す。
【0050】
** 測定せず
表5のデータは、重合体が、ピロカテコールおよびモリブデン酸イオンとタンパク質の相互作用に影響することを示している。ポリAは特に、タンパク質のタイプ間のDr測定値の差を低下させる作用を有しているので、推定タンパク質濃度が、ヒトアルブミンを含有する流体を使用する校正法にしたがって測定される。その結果、流体に加えられたタンパク質の量に対して予想される100mg/dLに近いタンパク質濃度の推定値が得られた。最高の機能、すなわち、被検タンパク質のタイプに対する、測定されたシグナルの依存度が最も小さいのはポリAであった。
実施例6
この実施例では、重炭酸塩による妨害に対するグリコール酸の効果を評価した。グリコール酸は、ポリAを12g/m2 含有する試薬層に入れてプレコートした。グリコール酸を表6に示すレベルで試薬層に入れてコートした。プールされたヒト尿の試料に重炭酸ナトリウムを添加して、重炭酸塩の最終濃度を100mMまたは200mMにした(両方の場合、最終のプールされた尿試料のpHは8.5であった)。そのpHは最終測定値に対して調節しなかったが、重炭酸塩を添加した後もそのpHであった。未処理尿プールの対照試料の全タンパク質は18mg/dLであった(全タンパク質測定用BIOTROL(登録商標)キットを用いて測定した。なおそのキットはピロガロールレッド/モリブデン酸アンモニウムの色素結合法を利用する溶液ベースの検定法によるものであり、米国ペンシルベニア州 19341,イクストン所在のBiotrol Diagnostics 社から入手した。カタログ番号:A01217U)。反射濃度は前記実施例5と同様にして測定し、そして全タンパク質濃度は、実施例5と同じ校正流体のヒトアルブミンを含有する流体を用いて検定要素を校正した後、測定したDr値を用いて推定した。この対照尿について得たタンパク質推定値を、重炭酸塩で処理した尿の試料について得たタンパク質推定値から差し引いた。データを表6に示す。
【0051】
重炭酸塩には、タンパク質に似た光シグナルを生成する作用がある。例えば、グリコール酸なしの場合、重炭酸塩の濃度が200mMの尿試料の推定タンパク質濃度は実際のレベルより約110mg/dL高い。表6に示すように、グリコール酸は、重炭酸塩による効果を劇的に低下させる。グリコール酸(または、先に述べた他の適切なヒドロキシカルボン酸類)は、実施例6のように乾式分析要素に直接添加してもよく、あるいは、乾式分析要素を試料と接触させる前に試料に添加してもよい。分析要素にコートされるグリコール酸の有用な濃度範囲は、約0.125〜2.0g/m2 である。その好ましい範囲は0.125〜1.5g/m2 であり、より好ましい範囲は0.25〜1.25g/m2 である。好ましい乾式分析要素の構造を以下に示す。
支持体
上記実験と実施例は、本発明の範囲と精神を説明するために提供するものである。これらの実施態様と実施例から、当該技術分野の当業者にとって、他の実施態様と実施例が明らかになるであろう。これら他の実施態様と実施例は本発明の思想の範囲内にある。したがって本発明は、本明細書の特許請求の範囲によってのみ限定すべきである。
Claims (36)
- タンパク質測定用乾式分析要素であって、
(A)多孔質展開層;
(B)(i)タンパク質およびモリブデン酸イオンと反応して、自らのスペクトル吸収または反射濃度を変化させることができる色素、
(ii)モリブデン酸塩、および
(iii)アクリルアミドを含む水溶性重合体、
を含んでなり、前記色素、前記モリブデン酸塩および前記アクリルアミドを含む水溶性重合体が、ともに同じ層中に存在しているか、または前記要素の別個の層中に任意の組み合わせでもしくは個々に存在している一つ以上の追加の層;
(C)支持体;
を含んで成る乾式分析要素。 - 前記色素が、ピロカテコールバイオレット、ピロガロールレッド、ブロモピロガロールレッドおよびガレインからなる群から選択された、請求項1記載の乾式分析要素。
- 前記色素がピロカテコールバイオレットである、請求項2記載の乾式分析要素。
- 前記モリブデン酸塩がモリブデン酸アンモニウムである、請求項1記載の乾式分析要素。
- 前記アクリルアミドを含む重合体が、ポリA、重合体AVP、重合体PAAおよび重合体AAMからなる群から選択された、請求項1記載の乾式分析要素。
- 前記重合体が、分子量の範囲が100,000〜150,000ダルトンのポリAである、請求項5記載の乾式分析要素。
- 前記色素がピロカテコールバイオレットであり、前記モリブデン酸塩がモリブデン酸アンモニウムであり、そして前記アクリルアミドを含む重合体が、分子量範囲100,000〜150,000ダルトンのポリAである、請求項1記載の乾式分析要素。
- 前記多孔質展開層が硫酸バリウムを含む、請求項7記載の乾式分析要素。
- タンパク質を測定する方法であって、
(A)タンパク質を含有していると予想される流体を、一般構造式:
(B)前記ヒドロキシカルボン酸を含有しかつタンパク質を含有していると予想される前記流体を、
(a)多孔質展開層、
(b)(i)タンパク質およびモリブデン酸イオンと反応して、自らのスペクトル吸収または反射濃度を変化させることができる色素、
(ii)モリブデン酸塩、
(iii)アクリルアミドを含む水溶性重合体、
を含んでなり、前記色素、前記モリブデン酸塩および前記アクリルアミドを含む水溶性重合体が、ともに同じ層中に存在しているか、または前記要素の別個の層中に、任意の組み合わせでもしくは個々に存在している一つ以上の追加の層であって、前記多孔質展開層と流体接触している層、
(c)支持体、
を含んでなる乾式分析要素と接触させ;次いで
(C)タンパク質の尺度として、前記色素のスペクトル吸収または反射濃度の変化を測定する;
ことからなる方法。 - 前記色素が、ピロカテコールバイオレット、ピロガロールレッド、ブロモピロガロールレッドおよびガレインからなる群から選択される、請求項9記載の方法。
- 前記色素がピロカテコールバイオレットである、請求項10記載の方法。
- 前記モリブデン酸塩がモリブデン酸アンモニウムである、請求項9記載の方法。
- 前記アクリルアミドを含む重合体が、ポリA、重合体AVP、重合体PAAおよび重合体AAMからなる群から選択される、請求項9記載の方法。
- 前記重合体が、分子量の範囲が100,000〜150,000ダルトンのポリAである、請求項13記載の方法。
- 前記色素がピロカテコールバイオレットであり、前記モリブデン酸塩がモリブデン酸アンモニウムであり、そして前記アクリルアミド重合体が、分子量範囲が100,000〜150,000ダルトンのポリAである、請求項9記載の方法。
- 前記多孔質展開層が硫酸バリウムを含む、請求項15記載の方法。
- タンパク質測定用乾式分析要素であって、
(A)多孔質展開層;
(B)(i)タンパク質およびモリブデン酸イオンと反応して、自らのスペクトル吸収または反射濃度を変化させることができる色素、
(ii)モリブデン酸塩、
(iii)アクリルアミドを含む水溶性重合体、
(iv)一般構造式:
を含んでなり、前記色素、前記モリブデン酸塩、前記アクリルアミドを含む水溶性重合体および前記ヒドロキシカルボン酸が、ともに同じ層中に存在しているか、または前記要素の別個の層中に、任意の組み合わせでもしくは個々に存在している一つ以上の追加の層であって、前記多孔質展開層と流体接触している層、および
(C)支持体;
を含んでなる乾式分析要素。 - 前記色素が、ピロカテコールバイオレット、ピロガロールレッド、ブロモピロガロールレッドおよびガレインからなる群から選択された、請求項17記載の乾式分析要素。
- 前記色素がピロカテコールバイオレットである、請求項18記載の乾式分析要素。
- 前記モリブデン酸塩がモリブデン酸アンモニウムである、請求項17記載の乾式分析要素。
- 前記アクリルアミドを含む重合体が、ポリA、重合体AVP、重合体PAAおよび重合体AAMからなる群から選択された、請求項17記載の乾式分析要素。
- 前記重合体が、分子量範囲が100,000〜150,000ダルトンのポリAである、請求項21記載の乾式分析要素。
- 前記ヒドロキシカルボン酸が、グリコール酸、2−ヒドロキシプロパン酸、2−メチル−2−ヒドロキシプロパン酸およびそれらの塩からなる群から選択された、請求項17記載の乾式分析要素。
- 前記ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸である、請求項23記載の乾式分析要素。
- 前記色素がピロカテコールバイオレットであり、前記モリブデン酸塩がモリブデン酸アンモニウムであり、前記アクリルアミド重合体が、分子量範囲が100,000〜150,000ダルトンのポリAであり、そして前記ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸である、請求項17記載の乾式分析要素。
- 前記多孔質展開層が硫酸バリウムを含む、請求項25記載の乾式分析要素。
- タンパク質を測定する方法であって、
(A)タンパク質を含有していると予想される流体試料を、
(a)多孔質展開層、
(b)(i)タンパク質およびモリブデン酸イオンと反応して、自らのスペクトル吸収または反射濃度を変化させることができる色素、
(ii)モリブデン酸塩、
(iii)アクリルアミドを含む水溶性重合体、
(iv)一般構造式:
を含んでなり、前記色素、前記モリブデン酸塩、前記アクリルアミドを含む水溶性重合体および前記ヒドロキシカルボン酸が、ともに同じ層中に存在しているか、または前記要素の別個の層中に、任意の組み合わせでもしくは個々に存在している、一つ以上の追加の層であって前記多孔質展開層と流体接触している層、
(c)支持体;
を含んでなる乾式分析要素と接触させ;次いで
(B)タンパク質の尺度として、前記色素のスペクトル吸収または反射濃度の変化を測定する;
ことからなる方法。 - 前記色素が、ピロカテコールバイオレット、ピロガロールレッド、ブロモピロガロールレッドおよびガレインからなる群から選択される、請求項27記載の方法。
- 前記色素がピロカテコールバイオレットである、請求項28記載の方法。
- 前記モリブデン酸塩がモリブデン酸アンモニウムである、請求項27記載の方法。
- 前記アクリルアミドを含む重合体が、ポリA、重合体AVP、重合体PAAおよび重合体AAMからなる群から選択される、請求項27記載の方法。
- 前記アクリルアミドを含む重合体が、分子量の範囲が100,000〜150,000ダルトンのポリAである、請求項31記載の方法。
- 前記ヒドロキシカルボン酸が、グリコール酸、2−ヒドロキシプロパン酸、2−メチル−2−ヒドロキシプロパン酸およびそれらの塩からなる群から選択される、請求項27記載の方法。
- 前記ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸である、請求項33記載の方法。
- 前記色素がピロカテコールバイオレットであり、前記モリブデン酸塩がモリブデン酸アンモニウムであり、前記アクリルアミド重合体が分子量範囲が100,000〜150,000ダルトンのポリAであり、および前記ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸である、請求項27記載の方法。
- 前記多孔質展開層が硫酸バリウムを含む、請求項35記載の方法。
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