JPS626170A - 蛋白測定用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、蛋白、特に尿蛋白の測定用試験片に関する。

〔発明の背景〕

健康な人でも毎日尿中に２０〜８０■ｇの蛋白質を排泄
するといわれているが、この排泄される蛋白質は通常粒
子が小さく糸球体を通過し易いアルブミンが主体である
。一方、溶血がひどく血漿内に赤血球のヘモグロビンが
多量に遊出しこれが腎糸球体から漏れたり、あるいは腎
臓や尿路に炎症がある場合などには白血球を尿中に放出
するので、グロブリンを主体とする尿蛋白となる。尿蛋
白は一般に次のような場合に高値となり腎疾患の重要な
指針となる。

（１）急性、および慢性腎炎、ネフローゼ。

（２）心不全による腎の響血、その他。

（３）８性蛋白尿。

（４）化学薬品中毒、細菌性中毒。

（５）白血病、紫斑病。

（８）狭窄、結石、腫瘍による尿管の閉塞。

（７）脳腫瘍、癲搗、その他中枢神経系疾患、精神感動
。

（８）　ｆｌｌ、血液、精液などの混入。

（９）卵など分子量の小さい蛋白質の多量摂取。

（ｌＯ）激しい運動、熱い湯又は冷水に長時間つかった
後に現われる一過性のもの。

（１１）体位性および若年性蛋白尿。

現在、一般に行なわれている尿蛋白測定法としては下記
の如き方法がある。

（１）スルホサルチル酸沈（鋭敏度０．００２％）透明
法４〜５ＷＬｌ＋スルホサリ・チル酸２０１１／Ｖ％溶
液２〜３滴→白色混濁又は沈澱を生ずれば蛋白陽性。

（２）煮沸試験法（鋭敏度　約０．００５％）透明法５
ｓｄｔ−１〜２分間煮沸し、混濁を生じたならば熱時５
％酢酸、又は７０％硝酸を１〜３滴添加し、混濁が不変
又は増加した場合は蛋白陽性。

（３）　Ｒｏｂｅｒｓ法（鋭敏度Ｑ、ＯＱ３％）試料と
硫酸マグネシウムの硝酸溶液とを等容混合し境界面に自
軸が生ずれば蛋白陽性。

（４）試験紙法（鋭敏度　０．０３％）ブロムフェノー
ルブルーあるいはテトラブロムフェノールブルー等のｐ
Ｈ指示薬がタンパクの存在により、アルカリ側の呈色を
するタンパク誤差法を利用。

（５）ダマシーブリリアントブルー法 （鋭敏度ｏ、ｏｏｔ％） 色素と蛋白の結合による高感度測定法で、試料５０ｇ／
＋ＣＢＢ−Ｇ２５０溶液３１Ｉｌ→５１３５ｎｍの吸光
度を測定。

（６）トリクロル酢酸沈澱によるビウレット法検体（原
振）２ｗ！＋蒸留水２−十トリクロル酢酸（１０％溶液
）混和後３．００Ｏｒｐｍで５分以上遠心後上清を捨て
る。沈澱にビウレ−／　ト試薬（ＮａＯＨ４％、酒石酸
カリウムナトリウム結晶４．５％。

ＣｕＳＯ４・５　Ｈ２Ｏ０，５％、ヨウ化カリウム０．
５％）２−十蒸留水２ＷＩｌ混和後、３７℃、３０分間
加温し５４０　ｎ−で比色。

これらの内、スルホサリ・チル酸性、煮沸試験法、Ｒｏ
ｂｅｒｓ法は、比濁法又はそれに準する方法で多量の試
料を必要とし、しかも定量分析に適用するには精度的に
限界がある。一方りマシーブリリアントブルー法は比色
法であるが、検量線が湾曲することや、セル、試験管等
の汚染があることなどから多数検体を連続処理するには
そぐわないものとされている。

又、トリクロル酢酸沈澱によるビウレット法は、沈澱分
離操作を必要とするので操作が繁雑であり実用的ではな
い。

又、蛋白誤差法を利用した試験紙法は非常に簡便であり
、広く普及しているが、感度が低く、特に正常、異常の
境界域での判定が困難であり、さらにアルブミンに対し
グロブリンの呈色が極めて低いという欠点があった。

一方、分析化学Ｖｏ１．３２３７９〜３８６　（１９８
３）ニよれば、ピロガロールレッドとモリブデン酸塩混
合物度で比色定量することが可能であるとの記載がある
。しかしながら１文献記載の試薬に試料として健常人の
尿（スルホサリチル酸法で陰性）を使用して蛋白濃度を
測定すると殆んどの検体で吸光度が試薬ブランクより低
値となり蛋白濃度として負値が算出される現象に遭遇す
る。従って、この方法をそのまま人尿検体を試料とした
尿蛋白の測定に適用することは側底不可能であり、尿蛋
白の簡便で且つ高感度、高精度の測定法が渇望されてい
る現状にある。

〔発明の目的〕

本発明は、上記した如き現状に鑑み、簡便で且つ高感度
、高精度の尿蛋白測定法を提供すべく。

モリブデン酸塩と、モリブデンと錯体を形成し蛋白の存
在で波長がシフトする色素とを用いる尿試験紙法による
尿蛋白測定法の実用化を目的としてなされたものである
。

〔発明の構成〕

本発明は、■モリブデン酸塩と、■モリブデンと錯体を
形成し、さらに蛋白の存在で波長がシフトする色素と、
■モリブデンと結合するキレート剤、又は前記色素とは
反応せず、試料中に共存が予想されるシュウ酸、クエン
酸、リン酸及びこれらの塩と結合し得る金属イオンと、
■緩衝剤とから成る蛋白測定用組成物を含浸させた吸収
性担体から成る蛋白測定用試験片の発明である。

即ち、本発明者らはモリブデンと錯体を形成し、更に蛋
白の存在で波長がシフトする色素を用いる尿蛋白の測定
法の実用化について鋭意研究を重ねた結果１色素及びモ
リブデンを主成分とする測定試薬中に予めモリブデンと
結合し得るキレート剤を添加するか、又は前記色素とは
反応せず、試料中に共存が予想されるシュウ酸、クエン
酸。

リン酸、及びこれらの塩と結合し得る金属イオンを添加
することにより、その目的を達成し得ること及びかかる
試薬組成物を含浸させた担体（試薬保持片）から成る試
験片を用いることにより簡便、且つ高感度、高精度の尿
蛋白測定が可能となることを見出し本発明を完成するに
到った。

本発明は、ピロガロールレッド、ピロカテコールバイオ
レット等の色素がモリブデンと錯体を形成し、この錯体
が蛋白と結合して極大吸収波長が長波長側にシフトする
ことを利用して蛋白、特に尿蛋白の測定を試験紙法によ
り行うに当り、試料中に存在し、呈色をうすくする原因
となるキレート剤、即ち、有機酸又は／及びリン酸塩類
、又はこれらと同じ作用をもつキレート剤を予め含浸試
壕中に添加しておくか、又は前記色素とは反応せず、試
料中に共存が予想されるシュウ酸、クエン酸、リン酸、
及びこれらの塩と結合し得る金属イオンを含浸試薬中に
添加しておくことにより。

正常尿の呈色がうすくなる現象を回避し、極めて高精度
に尿中蛋白の測定を行うことを可能とすると共に、グロ
ブリンをアルブミンとほぼ同程度の感度で測定すること
を可能ならしめたものである。

即チ、ピロガロールレッド、ピロカテコールバイオレッ
ト等の色素類は、モリブデンと錯体を形成して着色する
（或いは着色が増す）が、モリブデンと結合力のある他
のキレート剤が存在すると、モリブデンの一部はこれら
色素類との結合から離れ他のキレート剤と結合し、この
為盲検の呈色かうすくなる。含浸試薬中にキレート剤を
徐々に添加していくと盲検の呈色は添加量に従って徐々
にうすくなり、ある添加量を超えると試料に由来するキ
レート剤が混入されてきてももはやそれ以上に呈色がう
すくなる現象は殆んど認められなくなりうすい呈色を示
さなくなる。

又同様に含浸試薬中にアルミニウムイオン、セリウムイ
オン等を添加すると試料中のキレート剤（シュウ酸、ク
エン酸、リン酸等）はアルミニウムイオン、セリウムイ
オン等と結合してモリブデンとは結合しなくなり　（又
は結合する割合が少なくなり）呈色がうずくなるのを回
避することができる。従って、測定組成物中に予めモリ
ブデンと結合し得るキレート剤、若しくはアルミニウム
イオン、セリウムイオン等の金属イオンを添加しておく
ことにより、正常尿の呈色がうずくなりすぎる現象は解
消されると同時に、モリブデンと結合するキレート剤や
アルミニウムイオン、セリウムイオン等を含んだ試薬を
用いて高濃度の蛋白含有試料について測定しても正確な
測定が可能となる。

本発明者らは、モリブデンと錯体を形成し、更に蛋白の
存在で波長がシフトする色素を使用した尿蛋白の測定法
に於て、これまで解明されていなかった正常尿が負債を
示す原因について究明し、その解決方法として、本発明
者ら独自の知見に基づいて上記結論を導き出し本発明に
到達した。

本発明の方法によれば、正常尿の呈色がうす〈なりすぎ
ることもなく、定量性、再現性共に良好である。

更に１本発明の蛋白測定用試験片は高感度である為、従
来のタンパク誤差法を用いた試験紙法では判定が極めて
不明瞭であった正常と異常の境界域（蛋白濃度ｌＯ〜３
０腸ｇ／ｄ　ｌ）が明瞭となり、判定が容易となった。

また、従来のタンパク誤差法ではアルブミンに対する、
グロブリンの呈色は極めて低かったが、本発明の方法で
は、グロブリンはほぼアルブミンと同程度呈色し、従来
の試験紙法では見逃していた可能性のあるグロブリン尿
の検知が可能となった。

本発明に於て用いられるキレート剤としては、エチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、　　ヒドロキシエチルエ
チレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、エチレンジ
アミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、
ニトリロプロピオン酸（ＮＴＰ）、ニトリロ三酢酸（Ｎ
ＴＡ）、　　ヒドロキシエチルイミノ二酢酸　（ＨＩＤ
Ａ）、クエン酸、酒石酸、シュウ酸、ｌ−ヒドロキシエ
タン１．１−ジホスホン酸、ピロリン酸、ヘキサメタリ
ン酸、トリポリリン酸、メタリン酸等が挙げられる。

これらは単独で用いても２種類以上の混合物で用いても
良く、又含浸液調製時溶解性を増す為にこれらをナトリ
ウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属塩やアンモ
ニウム塩等として塩の型で添加してもよい。

その添加量は添加するキレート剤により異なるが、通常
ｏ、ｏｏｔ〜１％の濃度で１乃至セ数回に分は濾紙、不
織布等の吸収性担体に含浸させる。

又本発明に使用可能な金属イオンとしては、アルミニウ
ムイオン、セリウムイオン（ｎ、ｒｖ）等が適当である
０本発明に於て使用可脂な色素としては、モリブデンの
存在下アルブミンと定量的に錯体を形成するピロガロー
ルレッド（ＰＲ）、ブロムピロガロールレッド、ピロカ
テコールバイオレット　（ＰＶ）、ｏ−ヒドロキシヒド
ロキノンフタレン、ガレイン等の色素が挙げられる。こ
れら色素類の使用量は通常含浸液濃度として０．０００
５〜０．１％であり、ｌ乃至数回に分けて濾紙あるいは
不織布等の吸収性担体に含浸させればよい、又これら色
素類と錯体を形成するモリブデンは、通常モリブデン酸
のアンモニウム塩、若しくはアルカリ金属塩として用い
られるがこれらに限定されるものではない、その使用量
は例えばモリブデン酸塩の場合、モリブデン酸イオンの
濃度として通常含浸液中濃度として０．０００５〜０．
１％程度が用いられ、ｌ乃至数回に分は吸収性担体に含
浸させることが出来る。

本発明の蛋白測定用試験片に於て用いられる吸収性担体
としては紙、セルローズ、化学ｔａ維、合成樹脂製織布
および不織布等通常の測定用試験片に於て用いられる吸
収性担体が例外なく用いられる。又、吸収性担体を保持
する支持体としては、ガラスｌ＆維、およびポリ塩化ビ
ニル、ポリスチレン、ポリビニルアセタール、アセチル
セルロース、ニトロセルロース、ポリＩｆｉ化ビニリデ
ン、ポリプロピレン等の合成高分子化合物などが挙げら
れ、これらのシートあるいはこれらをコーティングした
厚紙等が好ましく用いられる。

これら吸収性担体及び支持体の大きさ、寸法等について
は特に制約はなく、通常用いられている測定用試験片に
於ける吸収性担体及び支持体の大きさ、寸法に準じたも
のを用いれば足りる。また、吸収性担体への薬剤の含浸
方法、及び吸収性担体の支持体への接着方法に関しては
、通常の測定用試験片に於て行われているいずれの方法
で行ってもよく、特別な方法は必要としない。

表１に本発明の方法に於けるキレート剤の添加効果を示
す、尚、測定条件は下記の通りである。

測定条件 検体床 蛋白陰性（スルホサリチル酸法による）尿Ａ。

Ｂ、Ｃに、大アルブミン又は人γ−グロブリンを２０ｍ
ｇ／ｄ　＋　となるように添加したものを検体とした。

含浸液 ピロガロールレッドを２５０　＠ｇ／ｌ　、モリブデン
酸ナトリウムを３００ｍｇ／４１の濃度になるようニ０
．５Ｍり！Ｊ　シン−１１ｉｆ！ａｌｌ衝液（ｐＨ２，
５）　ニ溶解した。

試験片の作製法 上記含浸液に種々のキレート剤を表中の濃度添加し、こ
れを厚さ０，４■のが紙に含浸させ乾燥した。このよう
にして得られた試験紙を５ｍｍ角に切断し、両面接着テ
ープを用いて５　＋＋ｎＸ　８　ｃｍ＋のポリ塩化ビニ
ルシートの一端に貼り付は試験片とした。

測定方法 本試験片を検体法に瞬時浸漬して、これを含浸させ８０
秒後の呈色を測定した。呈色は、陰性法の呈色と１人ア
ルブミンあるいはγ−グロブリンを添加した尿の呈色と
を対比させ調べた。

以下余白 表１より明らかな如く、キレート剤の添加により、試験
紙は、尿中の蛋白によって呈色し、蛋白の測定が可能と
なることが判る。

また１表２に本発明の方法に於けるアルミ１ニウムイオ
ン及びセリウムイオンの添加効果を示す。

尚、測定条件は下記の通りである。

測定条件 検体法 表１の場合と同じ。

含浸液 表１の場合と同じ。

試験片の作製法 上記含浸液に酢酸セリウム（０，０５％）又は硫酸アル
ミニウム（０，０５％）を添加し、これを厚さ０．ヰ腸
■の濾紙に含浸させ乾燥した。このようにして得られた
試験紙を６■諺角に切断し１両面接着テープを用いて５
腸層Ｘｇｃ■のポリ塩化ビニルシートの一端に貼り付は
試験片とした。

測定方法 表１の場合と同じ。

以下余白 の場合もキレート剤を添加した場合と同様。

験紙は尿中の蛋白によって呈色し、蛋白の測定可能とな
ることが判る。

以下に実施例を示すが、本発明はこれら実施例より何ら
限定されるものではない。

実施例〕 流側　ｌ ）含浸液の調製 ピロガロ−Ｊレレッド　　　　　　　　２５禦ｇモリブ
デン酸アンモニウム　　　　　３０−ｇシュウ酸　　　
　　　　　　　　　　３００騰ｇグリシン　　　　　　
　　　　　　　３．７５ｇ塩化ナトリウム　　　　　　
　　　　　３ｇこれらを水８０−に溶解して、塩酸でｐ
Ｈ２，５と、全量を　１００−とした、　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｇ）試験片の作製 クロマト用濾紙（厚さ０．４ｍｍ）に上記含浸液を浸さ
せ、乾燥した。このようにして作製した験紙を５■角の
正方形に切断し、両面テープをいてポリ塩化ビニルシー
）　（５ｍｍＸ８ｃｍ）に貼り付は試験片とした。

（３）測定方法及び測定結果 検体銀に試験片を瞬時浸漬しこれを含浸させた後、約１
分後の呈色をみた。蛋白濃度に応じて試験紙部分は青紫
〜青色に呈色した。検出限界は、１０ｍｇ／ｄ！であっ
た。

実施例　２ （１）含浸液の調製 ピロガロールレッド　　　　　　　　　２５ｍｇモリブ
デン酸アンモニウム　　　　　３０腸ｇクエン酸　　　
　　　　　　　　　６００ｍｇグリシン　　　　　　　
　　　　　　３．７５ｇ塩化ナトリウム　　　　　　　
　　　　２ｇこれらを水９０ｄに溶解して、塩酸でｐＨ
２，５とし、全量を　１００ａ／とした。

（２）試験片の作製 実施例１と同様にして試験片を作製した。

（３）測定方法及び測定結果 実施例１と同様にして測定を行い同様の結果が得られた
。

実施例　３ （１）含浸液の調製 ピロガロールレッド　　　　　　　　２５鳳ｇモリフテ
ン酸アンモニウム　　　　　３０ｍｇＥＤＴＡ　ｌＩ２
Ｎａ　　　　　　　　　　１００ｇｇグリシン　　　　
　　　　　　　　　３．７５ｇこれらを水９０−に溶解
して、塩酸でｐ）１２．５とし、全量を　１００ｍ１と
した。

（２）試験片の作製 実施例１と同様にして試験片を作製した。

（３）測定方法及び測定結果 実施例１と同様にして測定を行い実施例１と同様の結果
が得られた。

実施例　４ （１）含浸液の調製 ピロカテコールバイオレット　　　　１０１ｇモリブデ
ン酸アンモニウム　　　　　３０ｍｇＥＤＴＡ　　・　
２Ｎａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　０
　０ｍｇグリシン　　　　　　　　　　　　　３．７５
ｇ塩化カリウム　　　　　　　　　　　　２ｇこれらを
水９０ｍ１に溶解して、塩酸でｐＨ２，５とし、全量を
　ｔｏｏａｇとした。

（２）試験片の作製 実施例１と同様にして試験片を作製した。

（３）測定方法及び測定結果 検体銀に試験片を瞬時浸漬してこれを含浸させた後、約
１．５分後の呈色をみた。蛋白濃度に応じて試験紙部分
は緑色に呈色した。検出限界は、１０■ｇ／ｄｌであっ
た。

〔発明の効果〕

以上述べた如く１本発明は蛋白、特に尿蛋白の試験紙法
による改良された測定法を提供するものであり、筒便且
つ高感度、高精度の蛋白測定法であると共に従来の蛋白
誤差法による試験紙法と異なり、γ−グロブリンの検出
も可能な測定法である点に顕著な効果を奏する発明であ
って斯業に貢献するところ極めて大なる発明である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）［１］モリブデン酸塩と、［２］モリブデンと錯
   体を形成し、さらに蛋白の存在で波長がシフトする色素
   と、［３］モリブデンと結合するキレート剤、又は前記
   色素とは反応せず、試料中に共存が予想されるシュウ酸
   、クエン酸、リン酸及びこれらの塩と結合し得る金属イ
   オンと、［４］緩衝剤とから成る蛋白測定用組成物を含
   有させた吸収性担体から成る蛋白測定用試験片。
2. （２）蛋白が尿蛋白である、特許請求の範囲第１項記載
   の試験片。
3. （３）キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
   Ａ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＥＤ
   ＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、
   イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロプロピオン酸（ＮＴ
   Ｐ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルイ
   ミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、クエン酸、酒石酸、シュウ酸
   、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸、ピロ
   リン酸、ヘキサメタリン酸、トリポリリン酸、メタリン
   酸、及びこれらの塩類の内の１種又は２種以上である特
   許請求の範囲第１項又は第２項記載の試験片。
4. （４）金属イオンがアルミニウムイオン又は／及びセリ
   ウムイオンである特許請求の範囲第１項又は第２項記載
   の試験片。
5. （５）色素がピロガロールレッド又はピロカテコールバ
   イオレットである特許請求の範囲第１項〜第４項のいず
   れかに記載の試験片。