KR100255522B1 - 생체시료중 금속의 측정방법 및 측정용 시약 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체시료중의 미량금속을 정밀도 좋게 측정하기 위한 측정 방법 및 측정용시약을 제공하는 것을 목적으로 하며, 본 발명은 다음의 구성을 갖는 생체시료중의 금속측정방법 및 측정용시약에 관한 것으로서, 생체시료중 금속을 측정할때에 측정계에 측정대상금속이외의 금속을 첨가하고, 상기 생체시료중 공존물질과 결합하고 있는 측정대상금속을 공존 물질에서 유리시켜 측정하는 생체시료중 금속의 측정방법과 생체시료중 금속을 측정하는 시약중에 생체시료중의 공존물질과 결합하고 있는 측정대상 금속을 공존물질에서 유리시키기 위해 측정대상 금속이외의 금속을 함유시킨 생체 시료중의 금속의 측정용 시약을 특징으로 한다.
Description
[발명의 명칭]
생체시료중 금속의 측정방법 및 측정용 시약
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 생체시료중 금속의 측정 방법 및 측정용 시약에 관한 것이다. 보다 상세하기로는 생체시료중의 금속을 측정할 때 측정계에 측정대상 금속이외의 금속을 첨가함에 따라 생체시료중의 공존물질과 결합하고 있는 측정 대상 금속을, 공존물질에서 유리시켜, 미량의 금속이라도 정밀도가 좋게 측정할 수 있도록한 생체시료중의 금속의 측정방법 및, 생체시료중의 금속을 측정하는 시약중에 상기 생체시료중의 공존물질과 결합하고있는 측정대상 금속을, 공존물질에서 유리시키기 위해, 측정대상 금속이외의 금속을 함유시킨 생체시료중의 금속의 측정용 시약에 관한 것이다.
[배경기술]
종래, 임상 검사분야에 있어서, 질병 진단의 지표로서 생체시료(성분)중의 각종금속의 측정이 빈번히 행해지고 있다.
예를들면, 마그네슘은 허혈성 심질환 또는 갑상선 기능 항진증등의 진단, 철은 각종 빈혈증 또는 만성 간질환등의 진단, 구리는 간도질환 또는 빈혈등의 진단, 칼슘은 신장염 또는 네프로제등의 진단, 아연은 순환기 질환과 용혈성 빈혈등의 진단목적을 위해 일상적으로 사용되고 있다. 생체내의 금속으로서는 이들외에 알루미늄, 니켈, 망간, 크롬 등도 있고 각각 여러 가지의 질병 진단 지표가 되고 있다.
이들 금속의 측정방법으로서는 원자 흡광도 분석법, 발광 분광 분석법, X 선 형광 분석법, 본탄메트리법, 킬레이트 적정법 등이 대표적인 것이지만, 특수하고 고가인 장치가 필요하고, 시료에 대한 전처리가 번잡하다는등의 이유로, 특히 임상 검사 분야에 있어서 일상 검사에는 맞지 않았다. 그 때문에 최근에는 여러 가지 측정방법이 개발되어 오고 있으며, 주요한 금속의 측정방법은 예를 들면 아래와 같다.
(가) 마그네슘의 측정방법으로서는 티탄옐로와 크실리딜블루를 발색제로서 이용하는 비색법 또는 마그네슘의 생리작용의 하나인 효소반응의 활성화를 이용한 효소법(일본국 특개소 61-124398, 일본국 특개평 1-30597호) 등이 알려져있다.
(나) 철의 측정방법으로서는 유리한 3가 철 이온을 아스코르빈산등의 환원제로 2가의 철 이온으로 환원후, 바소페난트롤린과 트리아진을 발색제로서 이용하는 비색법이 많이 이용되고 있고, 그외 많은 발색제가 개발되고 있다.(일본국 특개소 58-144750호, 일본국 특개평 1-301678호).
(다) 구리의 측정방법으로서는 환원제의 첨가후 바소큐프로인디설폰산을 발색제로서 이용하는 방법과 공존금속을 마스킹하여 2-피리딜 아조아미노 페놀 유도체를 발색제로서 이용하는 비색법(일본국 특개소 60-69552호)등이 있다.
(라) 칼슘의 측정방법으로서는 알칼리성하 σ-크레졸프탈레인콘프렉손을 발색제로 하는 비색법이 많이 이용되고, 또 칼슘의 생리작용인 효소활성의 부활인자로서의 작용을 이용한 효소법(일본국 특개평 2-142498)도 알려져 있다.
(마) 아연의 측정방법으로는 계면활성제의 존재하, [2-(5-브로모-2-피리딘아조)-5-디에틸아미노페놀]과 반응시키고, 착화합물을 형성시키는 비색법이 다용되고 있다.
또, 금속측정을 위한 대상 생체시료로는 혈액(전혈, 혈청, 혈장, 혈구), 소변, 대변, 모발, 수액, 모유등을 들 수 있지만, 임상검사적으로는 주로 혈액 또는 소변중에 포함되는 금속을 측정하는 것이 일반적이다.
이들 생체시료중의 금속을 상기한 금속측정법에 의해 측정하는데는 통상적인 목적의 금속과 특이하게 반응(결합) 하는 발색제(이른바 킬레이트제)를 이용하고 있고, 또 효소법에 있어서도 목적의 금속에 특이하게 작용을 받는 효소를 선택하고, 그 효소활성치의 변동에서 금속 존재량을 정량적으로 측정하는 것이다.
그렇지만, 상기한 효소법과 발색물질을 이용한 비색법에 의한 금속의 측정에 있어서, 검체에 의해 원하는 측정치를 얻을 수 없는 경우가 있다. 즉 어떤 요인에 의해, 측정대상의 금속과 발생성물질 사이의 착체형성능과 측정 대상 금속의 효소에 대한 생리작용이 저해 또는 방해 받는 현상을 판단할 수 있다.
이 원인으로서는 여러 가지 원인이 있다고 생각되지만, 그 하나로서, 검체중 측정대상 금속이 생체액중 어느 종류의 공존물질과 이차적으로 첨가된 물질과 결합하고, 그 상태가 유지된 채로 측정계에 공급되는 것으로, 목적으로 하는 검출 반응이 충분히 발현되지 않기 때문으로 생각된다.
이와같은 검체로서는, 환자유래 또는 검체 채취후의 처리 방법의 유래의 두가지가 생각된다. 예를들면 환자유래로서는 금속결합능력을 갖는 성분을 함유하는 치료약(예를들면 신장결석 배설약, 해독제, 금속제거제, 항응고약등)을 복용하고 있는 환자유래의 생체 시료가 상당하고, 또 처리방법 유래로는 채혈관에 봉입되어 있는 각종 처리제 유래의 검체가 상당한다. 구체적으로는 에틸렌디아민의 각종유도체(에틸렌디아민테트라아세트산염등)데페록쓰아민 메실레이트, 시트르산과 타르타르산등이 특히 영향이 크다고 생각된다.
이들은 어디까지나 한예에 지나지 않고, 측정대상 금속과 결합할 수 있는 물질은 다른것에도 많이 존재한다.
이와같은 시료중의 금속을 측정하는 경우, 측정대상 금속의 종류와 상기 공존물질의 종류와의 조합에 따라서는, 그 측정대상 금속이 검출계에 있어서 원하는 반응을 유기시키지 않고, 발색량과 효소활성은 측정대상 금속의 존재량과 정량적인 관계를 잃어 버린다. 예를들면, 에틸렌 디아민 4 아세트산 나트륨(이하 EDTA라고 한다)은 1가 금속 이외의 대부분의 금속이온에 대해서 작용하고, EDTA 또는 이것과 같은 성질의 물질이 검체중에 공존하고 있으면 검출반응이전에 측정대상 금속 킬레이트 모양의 착체를 형성해버려서 정확한 측정을 할 수 없게된다. 특히 환자 유래의 케이스에서는 미리 그 검체가 금속측정을 하는데에 불편한 요인을 포함하고 있는지 어떤지를 예측하는 것은, 임상검사의 현장에 있어서는 불가능한 것으로, 당연히 측정치에 대해서 의문이 생기면, 시료의 재채취와 재시험이 행해지고, 임상검사의 현장뿐만 아니라 환자의 부담도 증가하는 것이다. 그래서 본 발명자등은 이와같은 생체시료중의 금속의 측정에 있어서, 측정치에 커다란 영향을 주는 여러 가지 장애물질의 존재하에서도, 측정대상 금속을 정밀도 좋게 측정할 수 있는 생체 성분중의 금속의 측정방법 및 측정용 시약을 제공하는 것을 목적으로하고, 예의 검토를 반복해 본 발명을 완성했다.
[발명의 개시]
본원 발명은 다음의 (1) 및 (2)의 청구항에 의해 구성되어있다.
(1) 생체시료중의 금속을 측정할때에, 측정계에 측정대상 금속이외의 금속을 첨가하고, 상기 생체시료중의 공존물질과 결합하고 있는 측정대상 금속을 공존물질에서 유리시키는 것을 특징으로하는 생체시료중의 금속의 측정방법.
(2) 생체시료중의 금속을 측정하는 시약중에, 상기 생체시료중의 공존 물질과 결합하고 있는 측정대상 금속을, 공존물질에서 유리시키기 위해, 측정대상 금속이외의 금속을 함유시킨 것을 특징으로하는 생체시료중의 금속의 측정용 시약.
본원 발명을 이상과 같이 구성하는 이유는 다음과 같다.
(가) 상기와 같이 측정대상 금속과 결합할 수 있는 물질(이하 저해 킬레이트성 물질이라고도 한다)이, 환자유래 또는 처리방법 유래에 의해, 측정대상금속의 검출반응 이전부터 시료중에 존재하고 있으면, 측정대상 금속과 저해 킬레이트성 물질이 미리 결합한 상태로 존재한다.
(나) 이와같은 시료에 검출반응 시약(발색성 물질)을 첨가해도, 반응이 충분히 생기지 않기 때문에, 그결과 생기는 발색을 비색해도 그 정량치가 부정확해지고, 또는 측정자체가 불가능해지는 것도 있다. 즉, 측정계에 발색성 물질을 첨가하여 발생하는 발색을 측정할때의 비색법에 있어서 측정치의 부정확성은 목적 금속에 특이적으로 결합하여 발생하는 발색제와, 목적의 금속이 착체를 형성 하지 않는(또는 매우 어려움) 것에 의한 것이다. 그래서 이와같은 경우, 반응계에는 영향을 주지않는 물질, 즉 측정대상 금속에 특이적인 발색성 물질에는 작용하지 않든가, 또는 작용하는 정도가 매우 적은 측정 대상 금속 이외의 금속을 검출반응계에 첨가함에 따라, 시료중에 존재하는 저해킬레이트성 물질과 측정대상 금속과의 결합을, 저해킬레이트성 물질과 측정대상 금속이외의 금속과의 결합으로 치환하고, 측정대상 금속을 저해 킬레이트성물질의 영향이 없는 조건하에 도입시킴에 따라 생체 액중의 금속을 정확히 측정하는 것이 가능해 지는 것이다.
(다) 또한 효소 활성을 응용하는 방법에는, 측정치의 부정확성은 저해 킬레이트성물질의 존재에 의해, 효소활성의 발현에 필수적인 금속, 또는 효소활성을 저해하는 금속과 그 효소사이의 생리작용이 저해 되는데에 기인한다. 그래서 이와같은 작용, 효소활성의 발현을 저해하거나, 또는 저해의 정도가 매우적은, 측정대상 금속 이외의 금속을 검출반응계에 첨가함에 따라, 상기 (나)와 같은 원리에 의해, 생체액중의 금속을 정확하게 측정하는 것이 가능해 지는 것이다.
본 발명에서 말하는 측정대상 금속은 생체내에 존재하는 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 아연, 망간, 알루미늄, 카드뮴, 크롬, 수온, 철, 동, 납, 니켈세렌, 비스무트, 비소등을 가리킨다. 상기와같이, 최근에는 이들 각각의 금속에 특이한 금속지시약이 여러 가지 개발되고, 분광 광학적인 측정이 용이하게 행해지게 되었다. 그 일부의 구체예를 아래에 표시한다.
(가) 마그네슘
크실리딜블루, δ-히드록시-5-퀴놀린-설폰산
(나) 칼슘
δ-크레졸프탈레인 콤플렉손
(다) 구리
바소큐프로인, 2-[(5-브로모-2-피리딜)아조]-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노] 페놀, 2-(2-티아졸릴아조)-5-N-에틸-N-설포프로필아미노벤조산(TSAB)
(라) 아연
[2-(5-브로모-2-피리딜)아조-5-디에틸아미노)페놀] (5-Br-PADAP)
(마) 철
바소페난트롤린, 트리피리딜트리아진, 페로진 σ-페난트롤린, 2-니트로소-5-(N-프로필-N-설포프로필아미노)-페놀(니트로소-PSAP)
(바) 알루미늄
1-(1-히드록시-4-메틸-2-페닐아조)-2-나프톨-4-설폰산
(사) 카드뮴
α, β, γ, σ-테트라페닐프로핀 테트라설폰산
(아) 크롬
3, 3'-디(N-카르복시 메틸아미노메틸)-σ-크레졸 설폰프탈레인
(자) 수은
디페닐티오카르바존
(차) 납
디페닐티오카르바존, 2, 7, -비스 [(4-메틸-2-설포페닐아조]-1, 8-디히드록시나프탈렌-3, 6-디설폰산
(카) 니켈
2-프릴디옥심
(타) 셀렌
3, 3, -디아미노벤지딘등이다.
또한, 효소반응을 응용하는 마그네슘, 칼슘의 측정법으로 이용되는 효소로서는 글루콕시나아제, 헥소키나아제, 아미라제, 글리세롤키나제, 이소시트레이트탈수소효소등을 들 수 있다. 이들의 기원은 균유래, 효모 유래등 특히 제한받지 않는다. 본원 발명에 있어서는, 생체중 금속을 측정 하는데 있어서 상기한 발색성의 금속지시약등 또는 효소등과의 반응성이 없는지, 또는 있어도 매우 적게 측정대상 금속이외의 금속을 임의로 선택해서 측정계에 첨가한다.
예를들면 혈청중의 철을 발색성의 금속 지시약으로서 2-(5-니트로-2-피리딜아조)-5-(N-프로필-N-설포프로필아미노)-페놀(NPS)을 이용해서 측정하는 경우에는, NPS와 결합해서 발색하는일이 없는 철 이외의 금속을 첨가하면 좋다. 구체예의 일부로서는 란탄, 망간, 테르븀, 이트륨, 이테리븀, 파라듐, 갈륨, 스트론튬, 알루미늄 등을 들 수 있다.
또 마그네슘을 효소법에 의해 측정하는데는, 효소헥소키나아제, 글루코나아제, 글리세롤키나아제등과 마그네슘과의 생리작용(효소활성의 발현)을 저해 하는 일 없는 마그네슘 이외의 금속을 측정계에 첨가하면 좋다. 구체예의 일부로서는 코발트, 알루미늄, 란탄, 비스무트, 니켈등 많은 금속을 이용할 수 있다.
그외 아연과 구리등을 발색성의 금속 지시약을 이용하여 측정하는 경우에도, 상기와 같은 개념에 따라 본 발명을 실시할 수 있다. 반응계에 존재시키는 이들 측정대상 금속이외의 금속의 농도는, 저해 킬레이트성 물질과 측정대상 금속의 함유량에서 임의로 선택할 수 있다. 적어도 저해 킬레이트성 물질에서 측정대상 금속을 유리의 상태로 하는데 필요한 양을, 환언하면 발색성 금속지시약 또는 효소와의 사이에, 목적의 반응을 완전하게 일으키는데 충분한 양의 측정대상 금속 이외의 금속을 첨가하면 좋다. 측정대상 금속 이외의 금속의 첨가량은 측정대상 금속과, 그 반응계의 구성, 또 저해 킬레이트성 물질의 양 및 종류에 따라 필요에 따라서 조제되는 것으로, 한마디로 말할 수 없지만, 5μM-2M, 바람직스럽기로는 10μM-1M의 범위에서 측정대상 금속 이외의 금속을 포함하는 시약을 제조하고, 측정에 이용하면 좋다. 측정대상 금속이외의 금속으로는 바람직스럽기로는 그들 금속염(아세트산염, 황산염, 염화물등)을 이용해 상기 농도범위가 되도록 조제한다.
반응계의 조성에 대해서는 발색성의 금속지시약과 효소의 량은 공지된 사용량 범위가 좋고, 그것을 바람직스럽기로는 공지된 완충용액, 즉 금속 지시약의 발색 반응과 효소활성의 발현이 가능한 pH 영역(예를들면 pH4~10 정도의 범위내의 적당한 pH 부근)을 완충할 수 있는 예를들면 트리스염산 완충액, 아세트산염 완충액, 인산염 완충액, 시트르산염 완충액, 굳완충액등에 용해하여 이용한다. 이 용액중에 측정대상 금속이외의 금속을 공존 시키든가, 필요에 따라서 별개의 시약으로서 조제하고 생체 액중의 금속의 측정에 이용한다. 이와같이 조제된 시약중에는 종래공지의 방부제, 안정화제 및 각종 계면활성제, 또는 환원제와 산화제를 함유시킬 수 있다.
또, 효소법의 시약의 경우는 효소등의 안정성을 고려하여, 종래 공지의 수단에 의해 동결 건조품으로 하면 장기간 보존도 가능해진다. 이상의 경우로 하여 본 발명에 의하면 특정대상 금속을 저해 킬레이트성 물질의 영향이 없는 조건하로 용이하게 이끌 수 있기 때문에, 생체액중의 금속을 정확히 측정하는 것이 가능해진다.
[도면의 간단한 설명]
제1(a)도는 측정대상금속이외의 금속으로서 알루미늄을 첨가하여 정량한 혈청중의 마그네슘 함량을 나타낸 그래프.
제1(b)도는 측정대상금속이외의 금속으로서 코발트를 첨가하여 정량한 혈청중의 마그네슘 함량을 나타낸 그래프.
제2도는 측정대상금속이외의 금속을 첨가하지 않고 정량한 혈청중의 마그네슘 함량을 나타낸 그래프(제1도의 비교예).
제3도는 측정대상금속이외의 금속으로서 니켈 및 비스무트를 첨가하여 정량한 혈청중의 마그네슘 함량을 나타낸 그래프.
제4(a)도는 측정대상금속이외의 금속으로서 란탄을 첨가하여 정량한 혈청중의 철함량을 나타낸 그래프.
제4(b)도는 측정대상금속이외의 금속으로서 망간을 첨가하여 정량한 혈청중의 철함량을 나타낸 그래프.
제5도는 측정대상금속이외의 금속을 첨가하지 않고 정량한 혈청중의 철함량을 나타낸 그래프(제4도의 비교예).
제6도는 측정대상금속이외의 금속으로서 란탄을 첨가하여 정량한 구리함량을 나타낸 그래프.
제7도는 측정대상금속이외의 금속으로서 란탄을 첨가하여 정량한 아연함량을 나타낸 그래프이다.
[발명을 실시하기 위한 가장 좋은 형태]
본 발명을 다시 실시예에 의해 상세히 설명한다.
[실시예 1]
[마그네슘의 측정]
공지된 마그네슘 함량(2.8㎎/dl) 의 시판관리 혈청(상품면;네스콜 x A (등록상표), 일본 쇼지 주식회사 제품)에, 저해킬레이트성 물질로서 EDTA.2Na를 40,80,120,160,200㎎/dl 이 되도록 첨가하여 시료로 하고, 이하의 시약을 조제하여 마그네슘 함량을 측정했다.
(시약 1)
ATP(아데노신트리인산) 10mM
NADP(니코틴 아미드아데닌디누클레오티드 인산) 0.5 mM
글루코키나아제 0.35μ/ml
G6PDH(글루코스-6-인산탈수효소) 0.6μ/ml
GEDTA(그리콜 에테르 디아민 아세트산) 0.4 μM
을 포함하는 100M 트리스완충액(pH 8.5)
(시약 2)
글루코스 10mM을 포함하는 100mM 트리스완충액 (pH 8.5)
(조작)
EDTA를 포함하는 각관리 혈청 5㎕ 에, 측정대상 금속이외의 금속으로서 알루미늄, 코발트를 300μM 이 되도록 각각 조제한 시약 1을 400 ㎕ 더하여 37℃로 가온한다. 이에 시약2를 100㎕ 더해 37℃에서 반응을 개시하고, 반응개시후 2분 ~ 3분간의 파장 340nm에 있어서 흡광도 변화를 측정했다. 동시에 관리혈청으로 바꾸어 정제수를 이용해 같은 형의 조작을 하고, 이때의 값을 검정값으로 했다. 얻어진 흡광도에서 EDTA 무첨가의 관리혈청을 표준으로서 EDTA 첨가의 각 관리 혈청중의 마그네슘량을 산출했다. 그 결과를 제1(a)도 및 (b)도에 표시한다.
[비교예 1]
상기 실시예 1의 시약 1을 그대로 이용하고, 실시예 1과 같은 형태의 조작에 의해 각 관리 혈청의 마그네슘량을 산출했다. 그 결과를 제2도에 표시한다. 제1(a)도 및 (b)도와 제2도를 비교하면 알 수 있듯이, 마그네슘(측정대상금속)이외의 금속을 첨가한 경우, 저해 킬레이트성 물질인 EDTA의 영향을 받지않고, 정확히 마그네슘량을 측정할 수 있다.
[실시예 2]
실시예 1의 시판관리 혈청을 정제수로 2배로 희석하고 (마그네슘 함량 1.4㎎dl), 저해 킬레이트성 물질로서 EDTA · 2Na를 10, 20, 30, 40, 50㎎/dl 이 되도록 첨가하여 시료로 하고, 실시예 1의 시약 1 및 시약 2를 이용하여 같은 조작에 의해 마그네슘 함량을 측정했다.
단 시약 1에 첨가한 금속으로서는 니켈 및 비스무트를 150 μM 이 되도록 각각 조제한 시약 1을 이용했다. 그 결과를 제3도에 표시한다. 제3도에서 알 수 있듯이, 마그네슘 이외의 금속의 첨가 효과를 확인 할 수 있다.
[실시예 3]
[철의 측정]
공지된 철 함량(150㎍/dl)의 시판관리 혈청 (상품명 ; Q-PAK, 하이랜드사제품)에, 저해성물지로서 EDTA, 2Na를 40, 80, 120, 160, 200㎎/dl 이 되도록 첨가하여 시료로 하고, 하기의 시약을 조제하여 철의 함량을 측정했다.
(시약 3)
0.2M의 아스코르빈 산을 포함한 0.5M 아세트산 완충액(pH 4.0)
(시약 4)
NPS 200㎎를 정제수로 1000ml로 한 수용액.
(조작)
EDTA를 포함한 각 관리혈청 100㎕ 에, 측정대상 금속이외의 금속으로서 란탄, 망간, 테르븀, 이토륨, 이테르븀, 파라듐, 갈륨, 인듐, 스토론튬, 알루미늄을 20 mM이 되도록 각각 조제한 시약 3을 350㎕ 더하여 37℃로 가온한다. 이것에 시약 4를 200㎕ 더해 37℃로 반응을 개시하고, 반응 개시후 5분 후의 파장 590nm에 있어서 흡광도를 측정했다.
동시에 관리혈청으로 바꾸어 정제수를 이용해 같은 조작을 하고, 이때의 값을 블랭크 값으로 했다. 얻어진 흡광도에서 EDTA 무첨가의 관리혈청을 표준으로서 EDTA 첨가의 각 관리 혈청중의 철의 량을 산출했다. 란탄 및 망간의 결과를 제4(a)도 및 (b)도에 표시한다. 그외의 것에 대해서는 EDTA 200㎎/dl를 포함하는 관리혈청중의 철의 측정치를 다음의 표 1에 표시한다.
[표 1]
[비교예 2]
상기 실시예 3의 시약 (3)을 그대로 이용하여, 실시예 3과 같은 조작에 의해 각 관리혈청중의 철의 량을 산출했다. 그 결과를 제5도에 표시한다.
제4(a),(b)도 및 표 1과, 제5도를 비교하면 명백하게 철(측정대상금속)이외의 금속을 첨가한 경우 저해 킬레이트 물질인 EDTA의 영향을 받지 않고 정확히 철의 량을 측정할 수 있다.
[실시예 4]
[철의 측정]
실시예 4의 시약 4로 바꾸어 니트로 소-PSA 200㎎을 정제수로 1000ml 로 한 수용액을 이용해 실시예 3과 같은 조작을 했다. 단 측정 파장은 760nm에서 행했다. 그 결과를 표 2에 표시한다.
[표 2]
[실시예 5]
[가열혈청중의 철의 측정]
종래방법의 수단에 의해 철을 측정한때, 음의값을 표시한 가열혈청검체에 대해서 아래의 시험을 했다.
즉 데이터는 표시하지 않았지만 상기 검체에 대해서 Mg 및 Ca를 종래 방법에 의해 측정하는 것을 가능했기 때문에, 검체중에는 EDTA 물질(금속 킬레이트 작용을 표시한 물질)의 존재는 고려되지 않았다. 그렇지만 이 검체에 대해서 실시예 3의 방법에 따라서 철을 측정한 바 측정이 가능해졌다.
결과를 다음의 표 3에 표시한다.
[표 3]
이 표 3에 있어서 검체 1~4는 실시예 3의 시약 (3)에 망간을 20mM이 되도록 첨가한 것, 검체(5)는 망간으로 바꾸어 란탄을 20mM이 되도록 첨가한 것이다.
[실시예 6]
[구리의 측정]
황산규리 5 수염 7.9mg을 정제수에 녹이고, 전량을 1000ml 로 하고, 구리로서 200㎍/dl 의 표준액을 조제했다. 이것을 다시 정제수로 희석하고, 구리로서 25, 50, 100, 150, 200㎍/dl 이 되도록 희석예를 조제했다. 상기 희석예에 저해 킬레이트성 물질로서 EDTA, 2Na 염을 200 ㎎/dl 이 되도록 첨가하여, 아래의 시약을 조제하여 구리의 함량을 측정했다.
(시약 5)
0.5M 아세트산 완충액(pH 4.0)
(시약 6)
TSAB 200mg을 정제수로 100ml 로 한 수용액.
(시약 7)
30mM 란탄을 포함한 0.5M 아세트산 완충액(pH 4.0)
(조작)
EDTA 함유 각 희석예 100㎕ 에 시약 5를 2.0ml 가해 37℃로 가온한다. 이것에 시약 6을 500㎕ 더한 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 파장 640nm 에 있어서 흡광도를 측정했다. 시약 5로 바꾸어 시약 7을 이용해 같은 시험을 했다. 또 희석예로 바꾸어 정제수를 이용해 같은 조작을 하고 그때의 값을 검정으로했다.
그 결과를 제6도에 표시한다.
제6도에 의하면 본 발명의 방법은 종래법에 비교해 명확히 구리를 정밀도 좋게 측정할 수 있다.
[실시예 7]
[아연의 측정]
아연말 2.0mg을 세밀하게 측정하여 염산 25㎕을 더하여 정제수에 용해해 전량을 1000ml로 하고, 아연으로서 200㎍/dl 의 표준액을 조제했다. 이것을 다시 정제수로 희석하여, 아연으로서 25,50,100,150,200㎍/dl 이 되도록 해서 희석예를 조제했다. 그 각 희석예에 저해 킬레이트성 물질로서 EDTA, 2Na 염을 200㎎/dl 이 되도록 첨가하여, 이하의 시약을 조제하여 아연의 함량을 측정했다.
(시약 8)
0.5M 초산 완충액 (pH 6.5)
(시약 9)
5-Br-PADA 200㎎을 정제수로 500ml 로 한 수용액.
(시약 10)
65mM 란탄을 포함하는 0.5M 초산 완충액(pH 6.5)
(조작)
EDTA 함유 각 희석예 25㎕에 시약(8)을 2.0ml 가해 37℃로 가온한다. 여기에 시약 (9)을 200㎕ 가해 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 파장 555nm에 있어서 흡광도를 측정했다. 시약 8로 바꾸어 시약(10)을 이용해 같은 시험을 했다. 또 희석예로 바꾸어 정제수를 이용해 같은 조작을 하고, 그때의 값을 검정으로 했다. 그 결과를 제7도에 표시한다.
제7도에 의하면 본 발명의 방법은 종래방법에 비교해 명확히 아연을 정밀도 좋게 측정할 수 있다.
[산업상의 이용가능성]
본원의 생체 시료중 금속 측정 방법 및 측정용 시약은 이상과 같이 구성했기 때문에 생체 시료중 공존물질과 결합하고 있는 측정대상 금속을 공존물질에서 용이하게 유리시킬 수 있기 때문에, 생체 시료중 미량의 금속에서도 정밀도 좋게 측정할 수 있고, 사람의 병의 진단을 담당하는 임상 검사 분야에 있어서 폭넓게 이용할 수 있다.
Claims (2)
- (가)저해 킬레이트성 물질로부터의 시료내 저해 킬레이트성 물질과 결합한 측정대상 금속을 유리시키는, 측정대상 금속이외의 금속을 시료에 5㎛ 내지 2M의 양으로 첨가하고; (나)측정대상금속을 특이적으로 겸합시키거나 또는 효소를 첨가하기 위해 발색물질을 시료에 첨가하고; 및 (다)발색물질로부터 유래된 신호 또는 효소활성을 분광광학적으로 측정하는 단계로 구성된, 저해 킬레이트성 물질을 함유하는 생체시료중 금속의 측정방법.
- 제1항에 있어서, 상기 측정대상 금속은 마그네슘, 철, 아연, 칼륨, 칼슘, 망간, 알루미늄, 카드뮴, 크롬, 수은, 구리, 납, 니켈, 셀렌, 비스무트, 비소, 나트륨 및 인으로 구성된 군에서 선택되며, 상기 측정대상 금속이외의 금속은 란탄, 망간, 테르븀, 이트륨, 이테리븀, 파라듐, 갈륨, 스트론튬, 알루미늄, 코발트, 비스무트 및 니켈로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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