JP6295408B2 - 血液検体のatp測定方法及びキット - Google Patents
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(1)測定時間が長く、迅速性に問題がある。
(2)測定精度が低い。
(3)測定結果がばらつく。
(4)緩衝液の性能を補うための酸添加が必要。
(1)の測定時間が長く、迅速性に問題がある点については、特許文献1に記載の方法の測定条件はnMレベルの微量のATPに対して最適化されたものであるため、血液検体のように高濃度のATPの測定には適さないことを突き止めた。
(2)の測定精度が低いことについては、血液検体中のATP濃度の変化の幅が小さいく、特許文献1に示される方法は、濃度が桁で変化する場合に適しているためと推察された。
(3)の測定結果のばらつきについては、血液検体中にはアスコルビン酸及びピルビン酸が含まれており、これらの血液成分が特許文献1に示される方法では測定結果のばら付きを生じさせる原因であることを本発明者らは解明した。
(4)酵素反応に適した緩衝液の性能を補うために途中の操作で行う必要があった酸添加を不要とできる方法を開発した。
以下の工程1〜5を含み、発色試薬がキシレノールオレンジまたはクロマズロールSである、血液検体中に含まれるATPの測定方法。
工程1:血液検体をATPの少なくとも一部が遊離するように前処理してATP含有試料溶液を得る工程、
工程2:工程1で得たATP含有試料溶液の少なくとも一部とアデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼとを含有する緩衝液(pH7.8±0.3)を混合して1〜5分保持する工程、
(但し、工程1における希釈倍率(ATP含有試料溶液/血液検体)と工程2における希釈倍率((緩衝液+ATP含有試料溶液)/ATP含有試料溶液)との積は50倍以上である。希釈倍率は容量基準である。)
工程3:工程2で得た混合物の少なくとも一部とピルビン酸オキシダーゼを含有する緩衝液(pH5.7±0.3)を混合して所定時間保持する工程、
(但し、工程3における希釈倍率((工程2で得た混合物少なくとも一部+工程3の緩衝液)/工程2で得た混合物少なくとも一部)は20倍以上であり、かつ工程1における希釈倍率(ATP含有試料溶液/血液検体)と工程2における希釈倍率((緩衝液+ATP含有試料溶液)/ATP含有試料溶液)と工程3における希釈倍率((工程2で得た混合物少なくとも一部+工程3の緩衝液)/工程2で得た混合物少なくとも一部)の積は1000倍以上である。希釈倍率は容量基準である。)、
工程4:工程3で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄(II)、および発色試薬を加えて所定時間保持する工程、および
工程5:工程4で得た混合物の色からATPの濃度を判定する工程。
[2]
工程4で得た混合物の色を目視観察して、検体中に含まれるATPの濃度が、あらかじめ定めた境界濃度より高いか、低いかを判定する[1]に記載の方法。
[3]
前記発色試薬がキシレノールオレンジである場合には、検体中に含まれるATP濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程4で得た混合物が紫を呈し、低いときには黄または橙を呈するように、下記工程2〜4の条件を設定し、
前記発色試薬がクロマズロールSである場合には、検体中に含まれるATP濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程4で得た混合物が青を呈し、低いときには橙を呈するように、下記工程2〜4の条件を設定する[2]に記載の方法。
[4]
工程4で得た混合物の吸光度を測定して、検体中に含まれるATPの濃度を求める[1]に記載の方法。
[5]
前記血液検体が血液サンプルをATPが遊離するように前処理した物である[1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法。
[6]
工程2の保持時間は2〜3分であり、工程3の所定保持時間は3分以上であり、工程4の所定保持時間は3分以上であり、工程2、3及び4の合計保持時間は8〜20分である[1]〜[5]のいずれか1項に記載の方法。
[7]
工程2において、所定保持時間経過後即座に、混合液は、工程3におけるピルビン酸オキシダーゼを含有する緩衝液と混合する[1]〜[6]のいずれか1項に記載の方法。
[8]
以下の試薬1〜6を含み、[1]〜[7]のいずれか1項に記載の方法に用いられる、血液検体中に含まれるATPの測定用キット。
1:アデノシンモノリン酸、およびホスホエノールピルビン酸、
2:アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼ、
3:ピルビン酸オキシダーゼ、並びに
4:酸、鉄(II)、および発色試薬(但し、発色試薬は、キシレノールオレンジまたはクロマズロールSである)
5:緩衝液A(pH7.8±0.3)
6:緩衝液B(pH5.7±0.3)
[9]
ATP抽出用試薬またはヌクレオチド抽出用試薬をさらに含む[8]に記載のキット。
[10]
境界濃度より高い場合および低い場合の発色の色見本を含む[8]または[9]に記載のキット。
[11]
キットの説明書を含む[8]〜[10]のいずれか1項に記載のキット。
[12]
希釈血液検体および試薬を混合し、発色を見るための容器を含む[8]〜[11]のいずれか1項に記載のキット。
[13]
前記容器がキュベット、マルチタイタープレート、または遠沈管である[12]に記載のキット。
より具体的には(1)測定時間が長く、迅速性に問題があった点については、各段階の所要時間を制御することで、測定開始から15分以内で測定を完了することも可能になった。(2)測定精度が低い、および(3)測定結果がばらつくことに関しては、測定方法を構成する段階の構成や条件を変更することで解決した。さらに(4)緩衝液の性能を補うための酸添加を不要とする方法とした。
本発明の測定方法は、以下の工程1〜5を含み、発色試薬がキシレノールオレンジまたはクロマズロールSである、血液検体中に含まれるアデノシン三リン酸(ATP)の測定方法である。
工程1は、血液検体をATPの少なくとも一部が遊離するように前処理して、ATP含有試料溶液を得る工程である。
工程2は、工程1で得たATP含有試料溶液の少なくとも一部とアデノシンモノリン酸(AMP)、ホスホエノールピルビン酸(PEP)、アデニル酸キナーゼ(AK)およびピルビン酸キナーゼ(PK)とを含有する緩衝液(pH7.8±0.3)を混合して1〜5分保持する工程である。工程2における酵素反応はATPの増幅反応およびピルビン酸生成反応であり、これらの反応開始を制御するという観点からは、ATP含有試料溶液とAMP、PEP、AKおよびPKを含有する緩衝液の混合は、例えば、酵素(AKおよびPK)の一方と基質(AMPおよびPEP)をあらかじめ混合したものを試料に加えたあとに、もう一方の酵素を加えるという方法を取ることができる。あるいは、酵素以外の試薬をあらかじめ混合したものを試料に加えたあとに、もう2つの酵素を加えるという方法を取ることもできる。すなわち、酵素の基質であるAMPおよびPEPを含有する緩衝液をATP含有試料溶液と混合し、次いで、酵素であるAKおよびPKを含有する緩衝液を、上記AMPおよびPEPを含有する緩衝液とATP含有試料溶液との混合液に添加し、酵素反応を開始することが好ましい。少なくとも一方の酵素を最後に加えることが適当である。また、酵素の一方とほかの試薬をあらかじめ混合したもの、あるいは酵素以外の試薬をあらかじめ混合したものを準備しておくことで、試薬添加の手間を省くこともできる。
工程2における保持時間をより厳密に設定するために、工程2において、所定保持時間経過後即座に、混合液は、工程3におけるピルビン酸オキシダーゼを含有する緩衝液と混合することが好ましい。前述のように工程1のATP含有試料溶液における血液検体の希釈倍率と、工程2におけるATP含有試料溶液の希釈倍率との積を所定の範囲に制御し、さらに、工程2における酵素反応の時間を上記範囲に制御することで、血液検体中のATP測定をより高精度に行うことができる。酵素反応は、室温(例えば、10〜30℃)で行うことができる。
工程3は、工程2で得た混合物の少なくとも一部とピルビン酸オキシダーゼ(PyO)を含有する緩衝液(pH5.7±0.3)を混合して所定時間保持する工程である。
ピルビン酸オキシダーゼ(PyO)は、例えば、工程3における混合液中で1〜10U/mlの範囲とすることができる。
工程4は、工程3で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄(II)、および発色試薬を加えて所定時間保持する工程である。工程4では、工程3で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄(II)、および発色試薬を加えて所定時間保持する。発色試薬は、キシレノールオレンジまたはクロマズロールSである。これらの発色剤は、検体中のATP濃度に応じた吸光度を示す他に、測定条件を制御することで、ATP濃度の境界値の前後で色の変化を生じさせることもできる。
工程5は工程4で得た混合物の色からATPの濃度を判定する工程である。工程5では、工程4で得た混合物の色からATPの濃度を判定する。混合物の色は、発色試薬としてキシレノールオレンジを用いる場合には、波長585nm付近(±1nm)の吸光度、発色試薬としてクロマズロールSを用いる場合には、波長615nm付近(±1nm)の吸光度を測定することで決定でき、別途作成した検量線と照合することで、検体中のATP濃度(量)を算出できる。
本発明の測定用キットは、以下の試薬1〜6を含み、前記本発明の方法に用いられる、血液検体中に含まれるアデノシン三リン酸の測定用キットである。
1:アデノシンモノリン酸、およびホスホエノールピルビン酸、
2:アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼ、
3:ピルビン酸オキシダーゼ、並びに
4:酸、鉄(II)、および発色試薬(但し、発色試薬は、キシレノールオレンジまたはクロマズロールSである)
5:緩衝液A(pH7.8±0.3)
6:緩衝液B(pH5.7±0.3)
本発明の方法を実施する操作方法の典型例を以下のスキームに示す。下記スキームに示す各条件は、以下に示す参考例1〜6の結果に基づいて決定したものである。検体中のATPは、ATP試料作製(希釈倍率は記載せず、工程1)、及び工程2の反応の際(希釈倍率=(25+400+75)/25)に希釈される。工程2の酵素反応でATP増幅を行うため測定には支障はなく、むしろ血液検体中に含まれるピルビン酸からの妨害を回避するに役立つ。また、工程3で希釈する(希釈倍率=(40+960)/40)ことによりpH調節のための酸の添加を不要にし、かつ血液検体中に含まれるアスコルビン酸の妨害を回避するに役立つ。
図1および図2は、各種濃度のAMPおよびPEPにおいてAK/PK反応の反応時間を変えながら、前記スキームと同様の操作をおこなって、反応時間に対して、吸光度をプロットしたものである。従来のAMPおよびPEP濃度(0.5 mM;▽)では反応が非常に遅いのに対して、AMPおよびPEP濃度を8.5 mM(▲)にすることにより反応が迅速になった。さらに、AMP濃度を最適化し、4.3 mM(△)を得た。なお、濃度は反応液中の値として示している。
図3は前記スキームと同様の操作を行い、図1のような曲線を取得し、吸光度が0.3に到達する時間を直線補間によって求め、Mg2+濃度に対してプロットしたものである。反応濃度を5 mMとした。これにより、従来は10〜20分かかっていた反応時間が3分程度となった。
酵素活性を変えて図1のようなプロットを作成した結果を図4に示す。酵素活性を2 U/ml(反応液中の値)とすることにより、反応時間が2.5分程度となった。これ以上の活性でもよいがコストを考慮してこの値に定めた。
図5は反応液中でのキシレノールオレンジ濃度20μM(●)および30μM(○)において、前記スキームの操作を行うことにより、吸光度を測定し、既知濃度のATP(ATP含有試料溶液中の濃度で示している)に対してプロットした検量線である。キシレノールオレンジ濃度を30μMにすることにより、20μM(●)と比べて検量線の吸光度スケールが約2倍拡張し、良好な感度で精度良い測定が可能となった。20μMは特許文献1で用いられている濃度で、これを用いるとATP0.1mM以上では感度(傾き)がかなり低い。なお、血液試料の前処理をしたあとでの正常値の最低値は0.08 mMである。本発明ではそれより高い場合は紫に、それより低い場合は黄・橙に呈色する。
図6は工程2の反応液にピルビン酸カリウムを添加し、その濃度に対して吸光度の変化割合((ピルビン酸を含むときの吸光度−ピルビン酸を含まないときの吸光度)/ (ピルビン酸を含まないときの吸光度)×100%)をプロットしたものである。ピルビン酸濃度の増加とともに、吸光度変化が大きくなり、正の誤差を与えることがわかる。一般に、血清中のピルビン酸濃度は0.04-0.13 mMとされているため、図6から工程2時点でのピルビン酸濃度を多くとも0.001 mM以下にしておく必要がある。本法では工程2までに100倍以上に希釈されるため、血中ピルビン酸の影響はないか、かなり小さいといえる。実際の測定上は、吸光度変化が5%以内であれば、血中ピルビン酸の影響は無視できる。
図7は工程3の反応液に含まれるアスコルビン酸濃度に対して吸光度変化((アスコルビン酸を含むときの吸光度−アスコルビン酸を含まないときの吸光度)/(アスコルビン酸を含まないときの吸光度)×100%)をプロットしたものである。アスコルビン酸濃度の増加とともに負の誤差を与えることを示している。血中のアスコルビン酸濃度は0.031-0.095 mMであるため、図7からアスコルビン酸濃度を工程3の時点で多くとも0.001 mM以下にしておく必要があると推定される。本法では工程3までに1000倍以上希釈されるため、血中アスコルビン酸の影響はないか、かなり小さいといえる。実際の測定上は、吸光度変化が5%以内であれば、血中アスコルビン酸の影響は無視できる。
Claims (11)
- 以下の工程1〜5を含み、発色試薬がキシレノールオレンジまたはクロマズロールSである、血液検体中に含まれるアデノシン三リン酸(以下、ATPと略記する)の測定方法。
工程1:血液検体をATPの少なくとも一部が遊離するように前処理してATP含有試料溶液を得る工程、
工程2:工程1で得たATP含有試料溶液の少なくとも一部とアデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼとを含有する緩衝液(pH7.8±0.3)を混合して1〜5分保持する工程、
(但し、工程1における希釈倍率(ATP含有試料溶液/血液検体)と工程2における希釈倍率((緩衝液+ATP含有試料溶液)/ATP含有試料溶液)との積は50倍以上である。希釈倍率は容量基準である。緩衝液はMg 2+ を含有し、緩衝液を混合して得られる溶液のMg 2+ 濃度は0.5mM〜60mMの範囲である。)
工程3:工程2で得た混合物の少なくとも一部とピルビン酸オキシダーゼを含有する緩衝液(pH5.7±0.3)を混合して所定時間保持する工程、
(但し、工程3における希釈倍率((工程2で得た混合物少なくとも一部+工程3の緩衝液)/工程2で得た混合物少なくとも一部)は20倍以上であり、かつ工程1における希釈倍率(ATP含有試料溶液/血液検体)と工程2における希釈倍率((緩衝液+ATP含有試料溶液)/ATP含有試料溶液)と工程3における希釈倍率((工程2で得た混合物少なくとも一部+工程3の緩衝液)/工程2で得た混合物少なくとも一部)の積は1000倍以上、4000倍以下である。希釈倍率は容量基準である。)、
工程4:工程3で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄(II)、および発色試薬を加えて所定時間保持する工程、および
工程5:工程4で得た混合物の色を目視観察して、検体中に含まれるATPの濃度が、あらかじめ定めた境界濃度より高いか、低いかを判定するか、又は工程4で得た混合物の吸光度を測定して、検体中に含まれるATPの濃度を求める工程。 - 工程4で得た混合物の色を目視観察する場合であって、
前記発色試薬がキシレノールオレンジである場合には、検体中に含まれるATP濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程4で得た混合物が紫を呈し、低いときには黄または橙を呈するように、下記工程2〜4の条件を設定し、
前記発色試薬がクロマズロールSである場合には、検体中に含まれるATP濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程4で得た混合物が青を呈し、低いときには橙を呈するように、下記工程2〜4の条件を設定する請求項1に記載の方法。 - 前記血液検体が血液サンプルをATPが遊離するように前処理した物である請求項1〜2のいずれか1項に記載の方法。
- 工程2の保持時間は2〜3分であり、工程3の所定保持時間は3分以上であり、工程4の所定保持時間は3分以上であり、工程2、3及び4の合計保持時間は8〜20分である請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程2において、所定保持時間経過後即座に、混合液は、工程3におけるピルビン酸オキシダーゼを含有する緩衝液と混合する請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の試薬1〜6を含み、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法に用いられる、血液検体中に含まれるアデノシン三リン酸(以下、ATPと略記する)の測定用キット。
1:アデノシンモノリン酸、およびホスホエノールピルビン酸、
2:アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼ、
3:ピルビン酸オキシダーゼ、並びに
4:酸、鉄(II)、および発色試薬(但し、発色試薬は、キシレノールオレンジまたはクロマズロールSである)
5:緩衝液A(pH7.8±0.3、Mg 2+ を含有する)
6:緩衝液B(pH5.7±0.3) - ATP抽出用試薬またはヌクレオチド抽出用試薬をさらに含む請求項6に記載のキット。
- 境界濃度より高い場合および低い場合の発色の色見本を含む請求項6または7に記載のキット。
- キットの説明書を含む請求項6〜8のいずれか1項に記載のキット。
- 希釈血液検体および試薬を混合し、発色を見るための容器を含む請求項6〜9のいずれか1項に記載のキット。
- 前記容器がキュベット、マルチタイタープレート、または遠沈管である請求項10に記載のキット。
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