WO2006118093A1 - 検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析方法 - Google Patents

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WO2006118093A1
WO2006118093A1 PCT/JP2006/308601 JP2006308601W WO2006118093A1 WO 2006118093 A1 WO2006118093 A1 WO 2006118093A1 JP 2006308601 W JP2006308601 W JP 2006308601W WO 2006118093 A1 WO2006118093 A1 WO 2006118093A1
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concentration
atp
iron
acid
reagent
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PCT/JP2006/308601
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Akihiko Ishida
Yasuko Yamada
Tamio Kamidate
Original Assignee
National University Corporation Hokkaido University
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing adenosine triphosphate contained in a specimen.
  • the present invention relates to a method for visually determining the concentration of adenosine triphosphate. More specifically, it is useful for determining the concentration level of adenosine triphosphate extracted from bacterial power when measuring the number of bacteria in food using adenosine triphosphate as an indicator substance in hygiene tests at food production sites, etc. This relates to a simple judgment method.
  • ATP detected in the food manufacturing environment is mainly derived from bacteria and food residues. Bacteria-derived ATP has the potential to cause food poisoning as it is. Shows the potential for bacterial growth. It is also known that there is a correlation between the number of bacteria in the sample and the ATP concentration. Shigeru Honma, Food and Development, Vol.31 pages 22-25 1997 (non-patent document 3)
  • Non-patent Document 6 Yoko Aoshima, Yasuhiko Ishida, Hirofumi Tani, Tamio Kamijo, Abstracts of the 52nd Annual Meeting of the Analytical Society of Japan P.230 Lecture No. 2K01 (Non-patent Document 6)
  • the ATP concentration is amplified by an enzymatic reaction of adenylate kinase and pyruvate kinase. This is because the target concentration of ATP is very small, from several tens of pico to several nanomol / 1, whereas the colorimeter does not have sufficient sensitivity originally, and the absorption of ATP itself is small. It is. Subsequently, pyruvate that produces an equivalent amount of the amplified ATP is reacted under pyruvate oxidase to generate peroxyhydrogen. Next, hydrogen peroxide and a hydrogen-donating color reagent (Trinder reagent) are reacted under peroxidase to produce a purple pigment. Finally, the ATP concentration in the sample is determined by measuring the purple shade with a colorimeter. However, this method also requires a measuring device and has a limit in terms of simply determining whether or not the reference value is satisfied. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a method and a method for easily determining ATP, which is a useful indicator substance in food hygiene inspections that solve the problems of the above-described technology, without a special measurement device.
  • the purpose is to provide a kit to be used.
  • the present inventors have determined whether the concentration is higher than a specific ATP concentration by appropriately selecting a coloring reagent.
  • the present inventors completed the present invention by discovering that it can be easily visually determined by developing a color for each color.
  • the color density changes as the ATP concentration increases, and this is characterized by the fact that the solution exhibits different colors (hue) above and below a certain ATP concentration.
  • the present invention is characterized in that the concentration of the boundary where the color difference occurs can be set according to the concentration of the reagent to be added and the reaction conditions so that it becomes the reference value for each sample.
  • the present invention is specifically as follows.
  • the present invention is as follows.
  • a method for analyzing adenosine triphosphate contained in a specimen comprising the following steps 1 to 4.
  • Step 1 mixing the specimen with adenosine monophosphate, phosphoenolpyruvate, adenylate kinase and pyruvate kinase and holding for a predetermined time;
  • Step 2 Step of adding acid and pyruvate oxidase to at least a part of the mixture obtained in Step 1 and holding for a predetermined time
  • Step 3 A step of adding an acid, iron (11), and a coloring reagent to at least a part of the mixture obtained in Step 2, and maintaining for a predetermined time, and
  • Step 4 A step of determining the concentration of adenosine triphosphate from the color mixture obtained in Step 3.
  • the color-developing reagent is xylenol orange, and adenosine triphosphate contained in the specimen.
  • Adenosine monophosphate reagent treated with avirase is used as adenosine monophosphate
  • a kit for analysis of adenosine triphosphate contained in a specimen comprising the following reagents 1 to 3. 1: adenosine monophosphate, phosphoenolpyruvate, adenylate kinase and pyruvate kinase,
  • kit according to any one of [9] to [13], which includes a container for mixing the specimen and the reagent and viewing the color development.
  • the method for analyzing adenosine triphosphate (ATP) contained in the specimen of the present invention includes the following steps 1 to 4.
  • Step 1 Mixing the specimen with adenosine monophosphate (AMP), phosphoenolpyruvate, adenylate kinase and pyruvate kinase and holding for a predetermined time
  • Step 2 at least one of the mixture obtained in Step 1 A step of storing acid and pyruvic acid oxidase in the part and holding for a predetermined time;
  • AMP adenosine monophosphate
  • Step 2 at least one of the mixture obtained in Step 1
  • Step 3 A step of adding an acid, iron (11), and a coloring reagent to at least a part of the mixture obtained in Step 2, and maintaining for a predetermined time, and
  • Step 4 Determining the concentration of adenosine triphosphate (ATP) from the color mixture obtained in Step 3
  • Step 1 a test sample should be tested to determine if adenosine triphosphate (ATP) is contained in excess of a given concentration, or if it is below a given concentration, and adenosine monophosphate (AMP), phosphoenolpyruvine. Acid, adenylate kinase and pyruvate kinase are mixed and held for a predetermined time.
  • ATP adenosine triphosphate
  • AMP adenosine monophosphate
  • Acid, adenylate kinase and pyruvate kinase are mixed and held for a predetermined time.
  • the specimen is not particularly limited as long as the number of bacteria contained in the specimen can be estimated from the concentration of adenosine triphosphate (ATP), but can be, for example, food.
  • foods include dairy products (milk, processed milk, cream, ice cream), unheat-treated products (saladas, raw vegetables), frozen fresh fish, and the like.
  • ATP adenosine triphosphate
  • the specimen may be a contaminant such as an instrument for food production.
  • the sample is, for example, a food
  • the food is first pulverized by an appropriate method to form a solution, and then a surfactant or the like is added as necessary to dissolve the bacterial cell membrane contained therein. Releases adenosine triphosphate (ATP) from bacteria.
  • the sample solution thus obtained can be used as a specimen.
  • the specimen is a contaminant such as an instrument for food production.
  • wipe the equipment with a suitable cloth or filter paper moistened with a buffer solution, etc., and wash in a test tube containing the buffer solution.
  • a dissolved sample solution can be prepared, and this sample solution can be used as a specimen.
  • the specimen thus prepared is mixed with adenosine monophosphate, phosphoenolpyruvate, adenylate kinase and pyruvate kinase and held for a predetermined time.
  • a pH buffer solution can be used, and the pH of the pH buffer solution is determined in consideration of the activities of adenylate kinase and pyruvate kinase, and is in the range of pH 7.5 to 8.0. It is preferable.
  • the pH buffer used in Step 1 is preferably a buffer that does not bind to iron ions when using an iron (-)-XO system in Step 3. Examples include, but are not limited to, Good Buffer (piperazine-1, 4-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), 2-hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPSO), etc. ).
  • Adenosine monophosphate, phosphoenolpyruvate, adenylate kinase, pH buffer, and pyruvate kinase are reacted at room temperature (eg, 10 to 30 ° C.) in a specimen.
  • room temperature eg, 10 to 30 ° C.
  • a method in which a mixture of one enzyme and another reagent is mixed and added to the sample, and then the other enzyme is added. can be taken.
  • the other two enzymes can be encapsulated.
  • the ATP amplification reaction may start if the enzyme or sample contains trace amounts of their substrates. Therefore, it is appropriate to add at least one of the enzymes last. In addition, it is possible to save the labor of adding a reagent by preparing a mixture in which one of the enzymes and another reagent are mixed in advance or a mixture in which a reagent other than the enzyme is mixed.
  • ADP was synthesized from ATP and AMP by the reaction of adenylate kinase shown in (1), and ADP and phosphine were synthesized by the reaction of pyruvate kinase shown in (2).
  • ATP and pyruvic acid are synthesized from phenolpyruvic acid. Therefore, when ATP is contained in the sample, the amount of ATP is amplified and pyruvic acid is vigorously accumulated by the reactions (1) and (2) above.
  • adenosine monophosphate for example, 4 X 10- 5 ⁇ 1 X 10-4 M range
  • Phosphorylase Hoe Nord pyruvic acid for example, 4 X 10- 5 ⁇ 6 X 10- 5 M range,
  • Adenylate kinase is, for example, in the range of 1.5 to 2.0 U / ml
  • Pyruvate kinase is, for example, in the range of 1.8-2.0 U / ml
  • the reactions (1) and (2) that is, step 1, are performed for a predetermined time, and this predetermined time is determined as follows.
  • a response curve as shown in Fig. 13 was created using different concentrations of ATP.
  • the time at the point where the crosses are taken as the reaction time.
  • the predetermined time in step 1 varies depending on the boundary concentration, but can be determined appropriately by the above method.
  • a commercially available adenosine monophosphate (AMP) reagent may contain a trace amount of ATP or ADP.
  • AMP adenosine monophosphate
  • the aviase treatment of the AMP reagent can be performed, for example, by adding aviase to a solution of the AMP reagent, incubating at 37 ° C., and then heating to inactivate the terrorismse.
  • AMP and 20 U of terrorismse are dissolved in about 20 ml of water and incubated at 37 ° C for 2 hours. Then heat at 95 ° C for 10 minutes, then cool to room temperature On the other hand, by diluting to 25 ml with water, an AMP aqueous solution treated with avirase can be obtained.
  • step 2 acid and pyruvate oxidase are added to at least a part of the mixture obtained in step 1 and held for a predetermined time.
  • step 2 the reaction shown in (1) of Scheme 1 is carried out to react with oxygen and Pi (phosphoric acid) by the action of pyruvic acid power pyruvic acid oxidase, the product of the reaction of (2), to form acetyl ether. Produces carbon dioxide and hydrogen peroxide.
  • the acid used in step 2 can be, for example, hydrochloric acid, but in addition to hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, or the like can be used.
  • the amount of acid added is suitably determined in Step 2 so that the pH of the pyruvate oxidase is maximized at pH 5.5-6.2.
  • the addition amount of pyruvate oxidase should be such that the reaction in step 2 is almost completed in a short time, and it is appropriate to select a low concentration of pyruvate from the viewpoint of saving the amount used.
  • the amount of oxidase can be, for example, in the range of 3-6 U / ml.
  • Step 2 can also be performed at room temperature (for example, 10 to 30 ° C.).
  • a pH buffer can also be used in step 2, and as in step 1, when an iron ( ⁇ ) -XO system is used in step 3, a buffer that does not bind to iron ions is desirable.
  • a buffer that does not bind to iron ions examples include, but are not limited to, Good buffer (piperazine-1, 4-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), 2-hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPSO). Etc.).
  • PEPSO 2-hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid
  • Etc. The reaction pH in step 2 is preferably 5.5 to 6.2, where pyruvate oxidase exhibits sufficient activity.
  • step 2 The reaction of (3), that is, step 2 is performed for a predetermined time, and this predetermined time is determined as follows. As shown in FIG. 11 obtained by the method shown in Reference Example 6, it is appropriate to set the time when the absorbance reaches the maximum value.
  • the predetermined time in step 2 is usually about 5 minutes, for example.
  • step 3 acid, iron (11), and a coloring reagent are added to at least a part of the mixture obtained in step 2 and held for a predetermined time.
  • the coloring reagent is not particularly limited as long as it causes a color change before and after the ATP concentration boundary value, which is a feature of the present invention. It can be Renol Orange, Chromazurol 3, Methylthymol Blue or Methylxylenol Blue.
  • Step 3 when xylenol orange is used as a color-developing reagent, the reactions (4), (5) and (5 ') in Scheme 1 proceed.
  • iron (III) [Fe 3+ ] reacts with xylenol orange to form a mononuclear xylenol orange-iron complex, and this mononuclear xylenol orange-iron complex and iron (m) [Fe 3+ ] Reacts to form a binuclear xylenol orange-iron complex.
  • chromazurol S When chromazurol S is used in place of xylenol orange, a mononuclear chromazurol S-iron complex and a binuclear chromazurol S-iron complex are formed.
  • methylthymol blue is used instead of xylenol orange
  • mononuclear methylthymol blue mono-iron complex and binuclear methylthymol blue mono-iron complex are formed.
  • methylxylenol blue is used instead of xylenol orange
  • mononuclear methylxylenol blue mono-iron complex and binuclear methylxylenol blue mono-iron complex are formed.
  • the acid used in Step 3 can be, for example, hydrochloric acid, but in addition to hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, and the like can also be used.
  • the iron (II) can be, for example, ferrous sulfate ammonium (Mole salt).
  • Step 3 can also be performed at room temperature (for example, 10 to 30 ° C.).
  • step 4 the concentration of adenosine triphosphate (ATP) in the color mixture obtained in step 3 is determined.
  • the chromogenic reagent is xylenol orange, depending on the ATP concentration contained in the sample, mononuclear xylenol orange-iron complex and dinuclear xylenol
  • the amount of orange-iron complex produced is determined.
  • the ATP concentration in the sample is higher than the predetermined boundary concentration, purple and yellow when it is lower, the color is different, and the ATP concentration level in the sample can be determined by visual observation.
  • the amount of bacteria in the sample can be ascertained.
  • the amount of mononuclear Chromazurol S-iron complex and binuclear Chromazurol S-Iron complex contained in the sample depends on the ATP concentration. Determined. When the ATP concentration in the sample is higher than the predetermined boundary concentration, it shows a different color, blue and when it is low, the color can be visually observed to determine the ATP concentration level in the sample. Further, it is possible to grasp the amount of bacteria in the sample.
  • the color of the mixture obtained in step 3 differs depending on whether the concentration of adenosine triphosphate contained in the specimen is higher or lower than the predetermined boundary concentration.
  • the amount of iron (II) is described in detail in Reference Example 4, but it should be at least twice that of the coloring reagent (xylenol orange). If the chromogenic reagent is Xylenol range, do not increase it more than twice, and purple will not appear.
  • the concentration of xylenol orange is set according to the concentration of hydrogen peroxide produced.
  • an equal concentration of peroxyhydrogen interferes with color development by oxidation to xylenol orange.
  • Xylenol orange concentration is good Mashiku ranges from 2 X 10- 6 ⁇ 6 X 10- 5 M. is.
  • the boundary concentration, more inspected, it is possible to raise and lower boundary concentration can be set by ATP 5 X 10- ⁇ ⁇ above.
  • xylenol orange is set within the applicable range.
  • the absorbance at the time when the color becomes purple for the first time when the hydrogen peroxide concentration is increased with respect to the set xylenol orange concentration is obtained.
  • the measurement wavelength is 585 nm, which corresponds to the purple absorption.
  • the wavelength at this time is also 585 nm.
  • step 2 is performed. Subsequently, for all ATP concentrations, the peroxyhydrogen concentration generated in step 2 is measured by the method in step 3 or by another method (colorimetric method, electrochemical measurement, etc.). The relationship between ATP concentration and hydrogen peroxide concentration is plotted as shown in Fig. 21. From this graph, obtain the peroxyhydrogen concentration corresponding to the ATP concentration that should be the boundary concentration. Since the hydrogen peroxide concentration and xylenol orange are equal and sometimes purple, the xylenol orange concentration is set to be equal to the hydrogen peroxide concentration. However, the reaction time is adjusted so that the desired hydrogen peroxide concentration is within the range of the applicable hydrogen peroxide concentration. If a similar graph is created for V and several reaction times, the reaction time within the applicable hydrogen peroxide concentration range can be easily determined.
  • the concentration ratio between xylenol orange and iron (II) ions is important for clear color development. Specifically, the molar ratio of xylenol orange: iron (II) ions is in the range of 50 to 200. so It is appropriate that the ratio is 1: 100. Color development is caused by the combination of iron (III) ions and xylenol orange, which are generated by oxidation with hydrogen peroxide in reactions (5) and (5 '). When one iron (III) ion is bonded to xylenol orange, it shows red, and when two are bonded, it shows purple. The change to purple occurs when the iron (III) ion concentration is approximately equal to the xylenol orange concentration.
  • the coloring reagent is Chromazurol 3, methylthymol blue, or methylxylenol blue
  • the relationship between the molar ratio of each coloring reagent and iron (II) ion is similar to that of xylenol orange.
  • step 3 it is appropriate that the amount of acid used is such that the pH is around 2.
  • the reaction pH in step 3 is preferably around 2. Above pH 3, it is not preferable to raise the pH because iron (II) ions are hydrolyzed and cannot participate in color development. Further, pH adjustment can be used in all the steps 1 to 4, in which case a pH buffer that does not form a complex with iron (III) and iron (III) ions is used.
  • a pH buffering agent for example, Good buffering agents (MES, ACES, etc.) are preferable.
  • the reactions (4), (5) and (5 '), ie, step 3, are performed for a predetermined time, and this predetermined time is determined as follows. As shown in FIG. 10 shown in Reference Example 5 to be described later, a curve of absorbance and time at 585 nm corresponding to the purple absorption is created, and the time when the absorbance reaches almost the maximum value is selected. That is, since this time is a time for complex formation, it is a time at which complex formation is almost completed. 5 minutes or more (for example, 5 to 20 minutes) is suitable for the predetermined time in step 3. 5 minutes is preferable from the viewpoint of reducing the force determination time.
  • the method of the present invention can be used for screening inspection of the degree of cleaning of foods and utensils in the middle of production at a food production site. That is, it can be used to exclude samples larger than the boundary concentration from the manufacturing process.
  • test result can be recorded and stored by photographing the color development with a digital camera or using an absorptiometer or a color measuring device.
  • the present invention includes a kit for analyzing adenosine triphosphate contained in a specimen, and this kit contains at least the following reagents 1 to 3.
  • Reagent 1 is a reagent used in step 1 of the analysis method. As described above, from the viewpoint of controlling the start of the ATP amplification reaction, for example, after mixing a mixture of one enzyme and another reagent together into a sample, the other enzyme is mixed. In the kit of the present invention, it is possible to take a method of collecting the two enzymes after adding a sample mixed with a reagent other than the enzyme and adding the mixture.
  • Reagent 1 consists of a pre-mixed one of the enzymes and the other reagent and two reagents of the other enzyme, or a mixture of two reagents other than the enzyme and two enzymes. It can consist of two reagents in a mixture.
  • pH buffer solution examples include Good buffer (piperazine-1, 4-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), 2-hydroxy-3-morpholinopropane sulfonic acid (MOPSO), etc. ) Can be used.
  • PEPES polybis (2-ethanesulfonic acid
  • MOPSO 2-hydroxy-3-morpholinopropane sulfonic acid
  • pH of the pH buffer solution can be It is appropriate to do the same as shown.
  • Reagent 2 is a reagent used in step 2 of the above analytical method, and is composed of an acid and pyruvate oxidase, and the acid can be hydrochloric acid, nitric acid or sulfuric acid.
  • the acid is suitably diluted to an appropriate concentration.
  • the pyruvate oxidase can be dissolved or dispersed as it is or in the same pH buffer solution as that of the reagent 1.
  • Reagent 3 is a reagent used in step 3 of the above analytical method, and also serves as an acid, iron (11), and coloring reagent.
  • the acid can be hydrochloric acid, nitric acid or sulfuric acid.
  • the acid is suitably diluted to an appropriate concentration.
  • the iron (II) can be, for example, ferrous sulfate ammonium (mole salt).
  • the coloring reagent can be xylenol orange, chromazrol s, methylthymol blue, or methylxylenol blue.
  • the acid, iron (11), and chromogenic reagent eg, xylenol orange
  • the kit of the present invention may include a color sample for color development when the concentration is higher and lower than the boundary concentration.
  • the color of the color sample for color development can be appropriately selected according to the type of iron (II) and color development reagent.
  • the kit of the present invention may contain instructions for the kit in addition to the reagents described above.
  • the adenosine monophosphate used in the kit of the present invention is preferably an avidin-treated adenosine monophosphate reagent, from the viewpoint that a lower concentration of ATP can be measured.
  • the kit of the present invention can include a container for mixing the specimen and the reagent and viewing the color development.
  • a container for mixing the specimen and the reagent and viewing the color development examples include a multititer plate. It can be a multi-titer plate. However, the color of the multititer plate is preferably white from the viewpoint of facilitating the observation of color development with the naked eye.
  • step 3 The reaction conditions in step 3 were examined only in step 3 for the purpose of providing an approximate guide.
  • the color development characteristics in step 3, ie, hydrogen peroxide-iron ( ⁇ ) - ⁇ system were investigated. And the ⁇ concentration and iron (II) solution constant, varying the peracid I ⁇ oxygen concentration in the range of 0 ⁇ 4 X 10- 5 ⁇ Fig. 1 left shows the absorption spectrum.
  • the pH at this time was set to 2.0 in consideration of the conditions under which the produced iron (III) ion can exist stably without being hydrolyzed and a complex can be formed.
  • Step 3 the iron (III) ion produced by oxidation forms a complex with XO, so the iron ( ⁇ ) - ⁇ system, which is considered to be the same condition as in Step 3, in principle, is shown on the right side of Fig. 1. . Measurements were made at different iron (III) concentrations with a constant soot concentration. In each case, the maximum absorption wavelengths are 433 nm and 585 nm, respectively, and the respective absorption maximum wavelengths correspond to the absorption of yellow and purple colors, respectively.
  • Absorbance at 585 nm is that the a maximum constant value 0.75 when the above 6 X 10- 5 Micromax is iron ( ⁇ ) - ⁇ complex system, Kasani ⁇ element - the iron ( ⁇ ) - ⁇ system over became Sani ⁇ hydrogen concentration 2 X 10- 5 Micromax more when maximum constant value 0.5.
  • the reason for the low absorbance in the peracid-hydrogen-iron ( ⁇ ) - ⁇ system is thought to be the reaction between hydrogen peroxide and iron ions, that is, the Fenton reaction affecting the complex. The Therefore, when carrying out the present invention, it is preferable to carry out in a range (peracid-hydrogen concentration) in which this influence does not appear strongly.
  • the inflection point appearing in FIG. 4 becomes the boundary condition for the color change because the color change to purple occurs at that point for the first time.
  • the solution prepared at this time was visually observed, and the hydrogen peroxide concentration when it was first recognized as purple was defined as the boundary concentration by visual observation.
  • Figures 5 and 6 show the relationship of the boundary hydrogen peroxide concentration to each XO concentration. At a certain XO concentration, it is yellow at the hydrogen peroxide concentration below the graph line and purple at the top.
  • XO concentration up to 1 X 10- 4 M is between the concentration of XO and Kasani ⁇ element was correlated slope 1. If XO concentration than 1 X 10- 4 M increases varied irregularly. Irregular changes have almost the same shape for both visual observation and absorbance measurement, so it can be said that they do not depend on the measurement method. From the above, Suitable for determine the constant is to 0 ⁇ 1 X 10- 4 M correlated with the XO and Kasani ⁇ oxygen concentration. However, the color change is clear, the bright color is obtained, XO concentration was when more than 2 X 10- 6 M.
  • the absorbance here is the absorbance at the inflection point at each XO concentration (measurement wavelength 585). The higher the absorbance is, the more vivid the color is developed. Therefore, the freshness of this absorbance force color development can be evaluated.
  • XO concentration 0 ⁇ 1.75 X 10- 4 M the concentration is higher the more the absorbance increases, XO concentration is 1.75 X 10- 4 M or more, the absorbance decreased.
  • the decrease in absorbance was due to the decomposition of XO and Fe (III) -XO complexes by hydrogen peroxide.
  • XO concentration is preferably up to 6 X 10- 5 M. From the above, XO concentration, 2 X 10 ⁇ 6 X 10- 5 M is preferred.
  • Step 3 Based on the above examination, the conditions of Step 3 were newly examined in a reaction system in which Steps 1 to 3 were combined. The operation was performed according to the following scheme.
  • the pH buffer used in Steps 1 and 2 was examined. Phosphoric acid and citrate were combined with iron in Step 3 to inhibit the color development reaction, so that good color development was not obtained. Good results were obtained when N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES) was used without binding to iron.
  • the pH buffer used in Steps 1 and 2 is preferably a buffer that does not bind to iron ions when the iron ( ⁇ ) - ⁇ system is used in Step 3. That Examples include, but are not limited to, Good buffering agents such as piperazine-1, 4-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), 2-hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPSO), etc. can give.
  • Phosphoric acid and citrate was contained in the sample, it is necessary to block them by adding aluminum ions or the like.
  • reaction pH in Step 1 is preferably 7.5 to 8.0.
  • reaction pH in Step 2 is preferably 5.5 to 6.2, which shows sufficient activity of pyruvate oxidase.
  • step 3 when performing a series of reactions of step 1-3, the iron (II) concentration of above, such a good color can be obtained ChikaraTsuta.
  • the ATP, AMP, and enzyme produced by the amplification reaction bind to iron (II) ions or iron (III) ions, resulting in a shortage of iron ions necessary for color development. It is expected to interfere with the oxidation of iron (II) by hydrogen. Therefore, in order to optimize the iron (II) concentration, in the conditions of the reaction composition Te to base until step 1-3 are present, the iron (II) concentration 1 X 10- 4 ⁇ 4 X 10- 3 Absorbance at 585 nm was measured in the M range.
  • Iron (II) concentration may be in the range of 1 X 10- 3 ⁇ 4 X 10- 4 M , but in the embodiment, the application of the 2 X 10- 3 M.
  • the iron (II) concentration is 50 to 200 times that of xylenol orange.
  • step 2 phosphoenolpyruvate (PEP) was converted to 100% pyruvate in step 1
  • a solution was prepared by adding pyruvic acid at the same concentration as PEP instead of PEP.
  • steps 2 and 3 were performed, and the absorbance at 585 nm was measured.
  • the reaction time of step 2 was 5 minutes.
  • the absorbance became the maximum constant for about 300 seconds or more.
  • this reaction time was 20 minutes, but the reaction rate increased and the reaction time became shorter because the iron ion concentration was increased. From the above, the reaction time of step 3 when performing a series of operations of steps 1 to 3 was 5 minutes.
  • step 2 the reaction time with pyruvate oxidase in step 2 was examined.
  • ATP was amplified enough for absorbance measurement, and then the reaction of step 2 was performed at various times.
  • ATP initial concentration was 5 X 10- 5 M.
  • Absorbance reached a maximum at about 5 minutes, so the reaction time in Step 2 was 5 minutes. The results are shown in FIG.
  • AMP is known to contain trace amounts of ATP or ADP!
  • AMP concentration was optimized. Changing the AMP concentration can change the reaction rate and control the shape of the amplification curve. At this time, in order to discriminate ATP above a specific concentration, the amplification curve needs to have the following conditions.
  • FIG. 14 shows the relationship between the absorbance difference ⁇ A and the AMP concentration.
  • [ATP] 5 X 10- 4 M Compared. Absorbance difference is most increased in 5 X 10- 5 M, then became almost constant.
  • FIG. 15 shows the relationship between the time difference At and the AMP concentration. The farther the curve containing the blank and ATP is, the more accurate the measurement is. The lower the AMP concentration, the greater the time difference.
  • Fig. 16 shows the relationship between reaction time and AMP concentration.
  • the reaction time is short Natsuta.
  • the PEP concentration was optimized in the same way as the AMP concentration optimization. Therefore, the AM P concentration of 5 X 10- 5 M- constant was measured response curves of PEP concentrations varied in the range of 1 X 10- 4 M ⁇ 1 X 10- 3 M. The results are shown in FIG. When PEP concentrations forces IX 10- 4 M, it is amplified 120 minutes, but the amplification reaction specific rise was such observed Chikaratsu, in 2.5 X 10- 4 M or higher response curve was observed. For the obtained reaction curves, the absorbance difference ( ⁇ ) was almost constant. Also, the time difference between the two ATP concentration (At), as shown in FIG. 17 was convex a maximum at 5 X 10- 4 M. From the above, and the optimum concentration of PEP with 5 X 10- 4 M.
  • amplification curves were measured by changing the initial concentration of ATP.
  • ATP concentration 0 or 2.0 X 10- 10 M,, 5.0 X 10- 10 M, 5.0 X 10- 9 M solution 500 mu 1 to 2.0 X 10- 2
  • Micromax adenosine monophosphate 500 ⁇ 1, 0.01 ⁇ phosphorylase Hoe Nord pyruvate Add 500 ⁇ l, 37.2 U / ml adenylate kinase 500 ⁇ 1, 0.2 ⁇ ⁇ buffer 7.5 ml, 37.3 U / ml pyruvate kinase 500 1 and react at 25 ° C for 45 minutes.
  • ATP was amplified.
  • FIG. 19 shows color development for each reaction time when ATP was amplified.
  • ATP analysis was performed using a sample in which Escherichia coli (KT1008) at a known concentration was added to mineral water (from France). Three types of samples were prepared as follows.
  • E. coli 1 such that 1 X 10 6 cells / ml
  • E. coli was first cultured until the logarithmic growth phase, and then the culture solution was removed and suspended in a pH buffer solution. The concentration of E. coli in the suspension is about 1 ⁇ 10 9 cells / ml.
  • a sample was prepared by adding this suspension to mineral water to a total volume of 2 ml. The sample was sonicated with a soaker to disrupt the E. coli cells contained in the sample. This was used in place of the ATP solution and reacted under the same conditions as in Example 1. The result is shown in FIG. Sample 1 was yellow, Sample 2 was light purple, and Sample 3 was purple.
  • Example 2 Experiments similar to Example 2 were performed using milk with a known concentration of E. coli as a sample. Three types of samples were prepared as follows.
  • Step 1 E. coli added to milk so that the bacterial concentration in the reaction mixture is 1 X 10 6 cells / ml
  • an E. coli suspension (about IX 10 9 cells / ml) was first prepared in the same manner as in Example 2. This suspension and milk were mixed to make a total volume of 1 ml. To this, 0.5 ml of a 25% trichloroacetic acid solution was added to disrupt cells of E. coli and deproteinize milk. After standing for 5 minutes, centrifugation (10000 X g, 5 minutes) was performed. After adding sodium hydroxide solution and pH buffer to 0.2 ml of the supernatant to adjust the pH to around 7, the total volume was adjusted to 2 ml. ATP analysis of this solution was performed. However, in this example, the reaction time in Step 1 was approximately twice as long as that in Example 1. This is presumed to be due to enzyme inhibition by triclonal acetic acid.
  • the method of the present invention is applicable to examination of various food-related samples including bacteria.
  • FIG. 1 Absorption spectra of hydrogen peroxide-iron ( ⁇ ) - ⁇ system (left) and iron ( ⁇ ) - ⁇ system (right).
  • FIG. 8 Change in absorbance over time at various hydrogen peroxide concentrations.
  • [Fe 2+ ] 4 X 10— 5 M;
  • [XO] 2 X 10— 5 M; pH 2.0.
  • FIG. 9 Relationship between iron (II) concentration and absorbance in the presence of reaction components.
  • Color reaction: [XO] 2 X 10— 5 M; pH 2.0, 25 ° C; 15 min.
  • [ATP] 5 X 10— 4 M;
  • [AMP] 10 ⁇ M; AK ⁇ 1.9 U / ml;
  • [ACE S] 0.15 M; PK, 1.9 U / ml; pH 7.8.
  • [Fig. 11] Enzymatic reaction with pyruvate oxidase.
  • Step 2 PVOD, 6.0 U / ml; 0 min, 2 min, 5 min, 10 min, 15 min ⁇ 20 min, 25 min, 30 min; 25 ° C; pH 5.8.
  • Step 2 PVOD ⁇ 6.0 U / ml; 5 min; 25 ° C; pH 5.8.
  • FIG. 15 Relationship between time difference At and AMP concentration.
  • Step 2 PVOD, 6.0 U / ml; 5 min; 25 ° C; pH 5.8
  • FIG. 18 is an ATP amplification curve obtained in Example 1.
  • Step 2 PVOD, 6.0 U / ml; 5 min; 25 ° C; pH 5.5.
  • FIG. 20 shows the relationship between reaction time and absorbance at different ATP concentrations.
  • FIG. 21 shows the relationship between ATP concentration and hydrogen peroxide concentration.
  • E. coli concentration (in order from top): Sample 1, 0 pieces / ml; Sample 2, 5 X 10 5 pieces / ml; Sample 3, 1 X 10 6 pieces / ml
  • E. coli concentration (from top to bottom): Sample 1, 0 pieces / ml; Sample 2, 5 X 10 5 pieces / ml; Sample 3, 1 X 10 6 pieces / ml

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Abstract

以下の工程1～4を含む、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析方法。工程１:前記検体とアデノシンモノリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼとを混合し、所定時間保持する工程、工程２:工程1で得た混合物の少なくとも一部に酸およびピルビン酸オキシダーゼを加えて所定時間保持する工程、工程３:工程2で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄(II)、および発色試薬を加えて所定時間保持する工程、および工程４、工程3で得た混合物の色からアデノシン三リン酸の濃度を判定する工程。検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析用キット。食品衛生検査における有用な指標物質であるATPを、特別な測定装置なしに一目するだけで簡便に判定できる方法を提供する。

Description

明 細 書
検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析方法
技術分野
[0001] 本発明は、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析方法に関する。特に、本発 明は、アデノシン三リン酸の濃度を目視で判定する方法に関する。さらに詳細には、 食品製造現場などの衛生試験などにおいて、食品に含まれる細菌数を、アデノシン 三リン酸を指標物質として測定する際、細菌力 抽出したアデノシン三リン酸の濃度 レベルの判定に有用な簡易判定法に関するものである。
背景技術
[0002] 近年、食品の安全に関する関心が高まってきており、簡便かつ迅速に検査する方 法が求められている。これまでの衛生試験は、採取した細菌を培養したのち、コ口- 一を計数する方法が用いられてきた。この方法は、培養方法の選択により菌種を同 定して、計数することができるが、培養するための設備と技術さらに一日以上の培養 時間が必要であった。そのため、試験結果を製造工程に迅速に反映させるためには 用いられていなかった。
[0003] 一方、細菌の代わりにアデノシン三リン酸 (ATP)を、ホタル生物発光反応を利用し て測定する方法がある。
1. E. W. Chappelle, G.V. Levin, Biochemical Medicine 2 41-52 1968 Use of the firef ly bioluminescent reaction for rapid detection and counting of bacteria. (非特許文献 1)
2. Arne Lundin, Methods in Enzymology, Volume 305， 2000, Pages 346-370 (Use of firefly luciferase in atp- related assays of biomass, enzymes, and metabolites) (非特 許文献 2)
[0004] 食品製造環境において検出される ATPは、おもに細菌と食品残さに由来しており、 細菌由来の ATPはそのまま食中毒などの原因になる可能性を示し、食品残さ由来の ATPはその食品残さが細菌の繁殖源になる可能性を示す。また、サンプル中の細菌 数と ATP濃度の間には相関があることも知られている。 本間茂，食品と開発， Vol.31 pages 22-25 1997(非特許文献 3)
Stanley PE, Mcし arthy BJ, bmither R, editors. ATP luminescence: rapid metnods in microbiology. Oxford: Blackwell scientific Publications; 1989 pages 175— 181(非特許 文献 4)
[0005] この方法を用いると、培養なしに迅速に測定することができるため、 ATPは現在清 浄度の指標物質として注目されている。しかし、この方法は、迅速に結果が得られる ものの、高価な専用機器が必要であった。また、安価な測定器も提供されているが、 微量の ATPを高感度に測定するには感度的に不十分とされていた。
[0006] 実際の現場では、製品がそれに定められた基準値を満たしているかどうかを知るだ けでよいことも多ぐそのためには必ずしも高価な装置は必要ではない。しかし、上記 の方法以外に ATPを測定する方法はな力つた。
[0007] 一方、上記測定器よりも安価な測定器として比色計がある。そこで、本発明者らは、 ATPの比色法を開発して 、る。
1.石田晃彦，青島陽子，谷博文，上舘民夫，第 63回分析化学討論会講演要旨集 p .92講演番号 2F05(非特許文献 5)
2.青島陽子，石田晃彦，谷博文，上舘民夫， 日本分析化学会第 52年会講演要旨集 P.230講演番号 2K01 (非特許文献 6)
3.石田晃彦，青島陽子，谷博文，上舘民夫，第 65回分析化学討論会講演要旨集 p .68講演番号 D2022(非特許文献 7)
[0008] この方法は、まず、 ATP濃度を、アデニル酸キナーゼとピルビン酸キナーゼの酵素 反応により増幅する。これは、 ATPの対象濃度が数十ピコ〜数ナノ mol/1と非常に微 量であるのに対して、比色計がもともとそれに十分な感度をもたず、 ATP自体の吸収 も小さいからである。続いて、増幅された ATPと当量生成するピルビン酸をピルビン酸 ォキシダーゼのもとで反応させることにより、過酸ィ匕水素を生成させる。次に、過酸ィ匕 水素と水素供与系呈色試薬（トリンダー試薬)をペルォキシダーゼのもとで反応させ、 紫色の色素を生成させる。最終的に、紫色の濃淡を比色計で測定することにより、試 料中の ATP濃度を決定する。しかし、この方法においても、測定装置が必要であり、 基準値を満たしているかどうかを簡便に判定するという点では限界があった。 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] そこで本発明は、上記技術のもつ課題を解決すベぐ食品衛生検査における有用 な指標物質である ATPを、特別な測定装置なしに一目するだけで簡便に判定できる 方法およびこの方法に使用するキットを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、上記問題点を解決するため判定方法について検討を重ねた結果、 発色試薬を適切に選択することにより、特定の ATP濃度に対して、それよりも濃度が 高いか低いかを色別で発色させて、簡便に目視で判定できることを見出し、本発明を 完成するに至った。すなわち、 ATP濃度の増加に伴って、色の濃淡が変化するので はなぐある ATP濃度を境界にその上下で溶液が、異なる色 (色相)を呈することを特 徴とする方法である。さらに、色の違いが生じる境界の濃度を試料ごとの基準値とな るように、加える試薬濃度等や反応条件により設定可能であることを特徴とする。本発 明は、具体的には以下の通りである。
[0011] 本発明は以下の通りである。
[1]以下の工程 1〜4を含む、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析方法。
工程 1:前記検体とアデノシンモノリン酸、ホスホェノールピルビン酸、アデニル酸キナ ーゼおよびピルビン酸キナーゼとを混合し、所定時間保持する工程、
工程 2:工程 1で得た混合物の少なくとも一部に酸およびピルビン酸ォキシダーゼをカロ えて所定時間保持する工程、
工程 3:工程 2で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄 (11)、および発色試薬を加えて 所定時間保持する工程、および
工程 4:工程 3で得た混合物の色カゝらアデノシン三リン酸の濃度を判定する工程。
[2]前記発色試薬がキシレノールオレンジ、クロマズロール3、メチルチモールブルー またはメチルキシレノールブルーである [1]に記載の方法。
[3]工程 2および 3で用いる酸が塩酸である [1ほたは [2]に記載の方法。
[4]工程 1〜4を室温 (10〜30°C)で行う [1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]前記発色試薬がキシレノールオレンジであり、検体中に含まれるアデノシン三リン 酸濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程 3で得た混合物が紫を呈 し、低いときには黄を呈するように、条件を設定する [1]に記載の方法。
[6]前記発色試薬カ^ロマズロール Sであり、検体中に含まれるアデノシン三リン酸濃 度力 あら力じめ定めた境界濃度よりも高いときに工程 3で得た混合物が青を呈し、 低いときには橙を呈するように、条件を設定する [1]に記載の方法。
[7]工程 3で得た混合物の色を目？見観察して、検体中に含まれるアデノシン三リン酸 の濃度が、あら力じめ定めた境界濃度より高いか、低いかを判定する [5]または [6]に 記載の方法。
[8]アデノシンモノリン酸として、アビラーゼ処理したアデノシンモノリン酸試薬を用いる
[I]〜[7]の 、ずれかに記載の方法。
[9]以下の試薬 1〜3を含む、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析用キット。 1:アデノシンモノリン酸、ホスホェノールピルビン酸、アデ-ル酸キナーゼおよびピル ビン酸キナーゼ、
2:酸およびピルビン酸ォキシダーゼ、並びに
3:酸、鉄 (11)、および発色試薬
[10]前記発色試薬がキシレノールオレンジ、クロマズロール3、メチルチモールブルー またはメチルキシレノールブルーである [9]に記載のキット。
[I I]境界濃度より高 ヽ場合および低 ヽ場合の発色の色見本を含む [9]または [10]に 記載のキット。
[12]キットの説明書を含む [9]〜[11]のいずれかに記載のキット。
[13]アデノシンモノリン酸力、アビラーゼ処理したアデノシンモノリン酸試薬である [9]
〜[12]の!、ずれかに記載のキット。
[14]検体および試薬を混合し、発色を見るための容器を含む [9]〜[13]のいずれかに 記載のキット。
[15]前記容器がマルチタイタープレートである [14]に記載のキット。
本発明の方法によれば、微量の ATPを目視で簡便に判定することが可能となるた め、コスト的な問題力も高価な測定器の導入が難しかった現場でも衛生検査を容易 に行うことが可能となり、衛生検査の普及に貢献することが可能である。 発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明の検体中に含まれるアデノシン三リン酸 (ATP)の分析方法は、以下の工程 1 〜4を含む。
工程 1:前記検体とアデノシンモノリン酸 (AMP)、ホスホェノールピルビン酸、アデ-ル 酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼとを混合し、所定時間保持する工程、 工程 2:工程 1で得た混合物の少なくとも一部に酸およびピルビン酸ォキシダーゼをカロ えて所定時間保持する工程、
工程 3:工程 2で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄 (11)、および発色試薬を加えて 所定時間保持する工程、および
工程 4:工程 3で得た混合物の色カゝらアデノシン三リン酸 (ATP)の濃度を判定する工程
[0014] これらの各工程について以下の反応スキームを参照して説明する。尚、以下のスキ ームでは、発色試薬としてキシレノールオレンジを用いた反応を示し、キシレノールォ レンジを XOと略記する。発色試薬としてキシレノールオレンジの代りに、例えば、クロ マズロール Sを用い場合には、（5)および (5，)にお ヽて単核キシレノールオレンジ-鉄錯 体および複核キシレノールオレンジ-鉄錯体の代りに、単核クロマズロール S -鉄錯体 および複核クロマズロール S -鉄錯体が形成される。
[0015] [化 1]
アデ-ル¾キナーゼ
(1) ATP + AMP > 2ADP
丄程程稈4上工 aB丁 23—
酸キナーゼ
(2) ADP + ホスホエノー ATP + 酸, ーゼ
(3) 酸 + (X + Pi ァセチルリン酸 + C02 + H.02
¾0.十 2Fe2- 十 2H+ 2Fe3—十 2H20
(5) Fe3+ +キシレノー .オレンジ >単核キシレノールオレンジ-鉄錯体 (5') Fe3+ + 亥鉄錯体 ールオレンジ-鉄錯体 目視判定 工程と反応スキーム
Figure imgf000008_0001
[0016] (工程 1)
工程 1では、アデノシン三リン酸 (ATP)が所定濃度を超えて含まれている力、あるい は所定濃度を下回っているかを試験すべき検体と、アデノシンモノリン酸 (AMP)、ホス ホェノールピルビン酸、アデ-ル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼとを混合し、 所定時間保持する。
[0017] 前記検体は、アデノシン三リン酸 (ATP)の濃度から、検体に含まれる細菌数を推定 できるものであれば、特に制限はないが、例えば、食品であることができる。食品とし ては、例えば、乳製品（牛乳，加工乳，クリーム， アイスクリーム）、未加熱処理製品 (サ ラダ，生野菜)、冷凍鮮魚類等を挙げることができる。但し、これらは単なる例示であり 、これらに限定される意図はない。また、前記検体は、食品製造用の器具等の汚染 物質であることちできる。
[0018] 検体が、例えば、食品の場合、まず、食品を適当な方法で粉砕し溶液状にしたのち 、必要に応じて、界面活性剤等を加えてそこに含まれる細菌の細胞膜を溶解し、ァ デノシン三リン酸 (ATP)を細菌内から放出させる。このように得られた試料溶液を検 体として使用できる。また、検体が食品製造用の器具等の汚染物質であり、本発明の 方法により、器具等の汚染度を判定する場合は、緩衝液等で湿らせた適当な布また はろ紙で器具を拭い、緩衝液を含む試験管の中で洗うことにより、細菌など汚染物が 溶解した試料液を調製することができ、この試料液を検体として使用できる。
[0019] このように調製した検体を、アデノシンモノリン酸、ホスホェノールピルビン酸、アデ -ル酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼと混合し、所定時間保持する。この際、さ らに pH緩衝液を用いることができ、この pH緩衝液の pHは、アデニル酸キナーゼ、お よびピルビン酸キナーゼの活性を考慮して決定され、 pH7.5〜8.0の範囲であることが 好ましい。また、工程 1で用いる pH緩衝剤は、工程 3で鉄 (Π)- XO系を用いる場合は、 鉄イオンと結合しない緩衝剤が望ましい。その例として、限定されるものではないが、 グッド緩衝剤（ピペラジン- 1、 4-ビス (2-エタンスルホン酸) (PIPES)、 2-ヒドロキシ- 3-モ ルフォリノプロパンスルホン酸 (MOPSO)など）があげられる。
[0020] 尚、リン酸およびクェン酸は、工程 3において、鉄と結合し発色反応を阻害するため 良好な発色が得られない、という実験結果が得られている。そこで、試料中にリン酸 やクェン酸が含まれる場合は、アルミニウムイオンなどを添加することでそれらを封鎖 することが適当である。
[0021] アデノシンモノリン酸、ホスホェノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼ、 pH緩衝液 、およびピルビン酸キナーゼは、検体にカ卩えて室温 (例えば、 10〜30°C)で反応させる 。 ATPの増幅反応の開始を制御するという観点からは、例えば、酵素の一方とほかの 試薬をあらカゝじめ混合したものを試料にカ卩えたあとに、もう一方の酵素を加えるという 方法を取ることができる。あるいは、酵素以外の試薬をあら力じめ混合したものを試料 に加えたあとに、もう 2つの酵素をカ卩えるという方法を取ることもできる。二つの酵素を はじめに試料に加えると、酵素や試料などにそれらの基質が微量に含まれている場 合、 ATPの増幅反応が開始してしまうおそれがある。そのため、少なくとも一方の酵素 を最後に加えることが適当である。また、酵素の一方とほかの試薬をあらかじめ混合 したもの、あるいは酵素以外の試薬をあらカゝじめ混合したものを準備しておくことで、 試薬添加の手間を省くこともできる。
[0022] 上記スキーム 1に示すように、（1)で示すアデニル酸キナーゼの反応により、 ATPおよ び AMPから ADPが合成され、（2)に示すピルビン酸キナーゼの反応により、 ADPとホス ホェノールピルビン酸とから、 ATPとピルビン酸が合成される。したがって、検体中に ATPが含まれている場合、上記 (1)および (2)の反応により、 ATPの量が増幅され、力 つピルビン酸が蓄積される。
[0023] アデノシンモノリン酸、ホスホェノールピルビン酸、アデニル酸キナーゼ、およびピ ルビン酸キナーゼの添加量は、後述する参考例 8に挙げたパラメーター At、 t およ
1/2 び Δ Aを用いて，境界濃度の前後の判別した!/、二つの濃度の曲線が図 13のように 離れるような条件を選ぶことが適当である。 Atは、吸光度が吸光度差の 1/2に到達す るまでの時間差であり、 t は、ブランク試料 ([ATP] = 0 M)の吸光度が吸光度差の 1
1/2 0
/2に到達するまでの時間であり、 ΔΑは、ベースラインと最大吸光度の差である。
[0024] 但し、アデノシンモノリン酸は、例えば、 4 X 10—5〜1 X 10—4 Mの範囲、
ホスホェノールピルビン酸は、例えば、 4 X 10— 5〜6 X 10— 5 Mの範囲、
アデ-ル酸キナーゼは、例えば、 1.5〜2.0 U/mlの範囲、
ピルビン酸キナーゼは、例えば、 1.8〜2.0 U/mlの範囲、
とすることができる。
[0025] (1)および (2)の反応、即ち工程 1は、所定時間行うが、この所定時間は、以下のよう に決定される。参考例 8で示すように、異なる濃度の ATPを用いて図 13のような反応 曲線を作成し、その図において、はじめて紫色を示す吸光度を通る水平線と境界濃 度としょうとする ATP濃度の曲線が交わった点の時間を反応時間とする。工程 1の所 定時間は、境界濃度によって変化するが、上記方法で適宜決定できる。
[0026] 尚、市販のアデノシンモノリン酸 (AMP)試薬には微量の ATPまたは ADPが含まれる ことがある。このような AMPをそのまま用いて本発明の方法を実施すると、参考例 7で 示すように、より低濃度の ATPを測定できない場合がある。そこで、含まれる微量の A TPまたは ADPを分解するために、巿販のアデノシンモノリン酸 (AMP)試薬をアビラ一 ゼで処理することが好ましい。 AMP試薬のアビラーゼ処理は、例えば、 AMP試薬の溶 液にアビラーゼを添カ卩し、 37°Cでインキュベートし、その後、加熱してアビラ一ゼを不 活性ィ匕することで行うことができる。より具体的には、例として、 AMP溶液 25 mlを調製 する場合について述べると、 AMPおよびアビラーゼ 20 Uを約 20 mlの水に溶解し、 37 °Cで 2時間インキュベーションする。その後、 95°Cで 10分加熱し、次いで、室温まで冷 却して、水で 25 mlに希釈することで、アビラーゼで処理した AMP水溶液が得られる。
[0027] (工程 2)
工程 2では、工程 1で得た混合物の少なくとも一部に酸およびピルビン酸ォキシダ ーゼを加えて所定時間保持する。工程 2では、スキーム 1の (3)で示す反応により、 (2) の反応の生成物であるピルビン酸力 ピルビン酸ォキシダーゼの作用により、酸素お よび Pi (リン酸)と反応して、ァセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生成す る。
[0028] 工程 2で用いる酸は、例えば、塩酸であることができるが塩酸以外に、硝酸、硫酸等 を用いることちでさる。
[0029] 酸の添カ卩量は、工程 2でピルビン酸ォキシダーゼの活性が最大となる pH 5.5-6.2 になるように決定することが適当である。ピルビン酸ォキシダーゼの添加量は、工程 2 の反応が短時間でほぼ終了するような値で、かつ使用量を節約する見地からその中 で低濃度のものを選択することが適当であり、ピルビン酸ォキシダーゼの量は、例え ば、 3〜6 U/mlの範囲とすることができる。工程 2も室温 (例えば、 10〜30°C)で行うこと ができる。
[0030] 工程 2でも pH緩衝剤を用いることができ、工程 1と同様に、工程 3で鉄 (Π)- XO系を用 いる場合は、鉄イオンと結合しない緩衝剤が望ましい。その例として、限定されるもの ではないが、グッド緩衝剤（ピペラジン- 1、 4-ビス (2-エタンスルホン酸) (PIPES)、 2-ヒド 口キシ- 3-モルフォリノプロパンスルホン酸 (MOPSO)など）があげられる。工程 2におけ る反応 pHは、ピルビン酸ォキシダーゼが十分な活性を示す 5.5〜6.2が好まし 、。
[0031] (3)の反応、即ち工程 2は、所定時間行うが、この所定時間は、以下のように決定さ れる。参考例 6に示す方法により得られる図 11で示すように、吸光度が最大値に到達 した時間とすることが適当である。工程 2の所定時間は、通常、例えば、 5分間程度と することができる。
[0032] (工程 3)
工程 3では、工程 2で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄 (11)、および発色試薬を 加えて所定時間保持する。発色試薬は、本発明の特徴とする ATPの濃度の境界値 の前後で色の変化を生ずるような試薬であれば、特に限定されないが、例えば、キシ レノールオレンジ、クロマズロール3、メチルチモールブルーまたはメチルキシレノー ルブルーであることができる。
[0033] 工程 3では、発色試薬としてキシレノールオレンジを用いる場合、スキーム 1における (4)、（5)および (5')の反応が進行する。（4)では、（3)の反応の生成物である過酸ィ匕水素 と鉄 (II)[Fe2+]が、酸性条件下 (H+イオンの存在下)で、反応して鉄 (III)[Fe3+]が生成する 。次いで、鉄 (III)[Fe3+]とキシレノールオレンジとが反応し、単核キシレノールオレンジ -鉄錯体が生成し、さらにこの単核キシレノールオレンジ-鉄錯体と鉄 (m)[Fe3+]とが反 応して複核キシレノールオレンジ-鉄錯体が生成する。
[0034] キシレノールオレンジに代わって、クロマズロール Sを用いる場合には、単核クロマ ズロール S -鉄錯体および複核クロマズロール S -鉄錯体が形成される。キシレノール オレンジに代わって、メチルチモールブルーを用いる場合には、単核メチルチモー ルブル一-鉄錯体および複核メチルチモールブル一-鉄錯体が形成される。キシレノ ールオレンジに代わって、メチルキシレノールブルーを用いる場合には、単核メチル キシレノールブル一-鉄錯体および複核メチルキシレノールブル一-鉄錯体が形成さ れる。
[0035] 工程 3で用いる酸は、例えば、塩酸であることができるが塩酸以外に、硝酸、硫酸等 を用いることもできる。また、鉄 (II)は、例えば、硫酸第一鉄アンモ-ゥム (モール塩） 等であることができる。工程 3も室温 (例えば、 10〜30°C)で行うことができる。
[0036] (工程 4)
工程 4では、工程 3で得た混合物の色カゝらアデノシン三リン酸 (ATP)の濃度を判定す る。工程 3における (4)、（5)および (5')の反応により、検体に含まれていた ATP濃度に 応じて、発色試薬がキシレノールオレンジの場合、単核キシレノールオレンジ-鉄錯 体および複核キシレノールオレンジ-鉄錯体の生成量が決まる。これにより、検体中 の ATP濃度があらかじめ定めた境界濃度よりも高いとき紫、低いとき黄と、異なる色を 呈し、これを目視観察することで検体中の ATP濃度レベルを判定することができる。さ らにそれにより、検体中の細菌量を把握することもできる。
[0037] 発色試薬としてクロマズロール Sを用いた場合、検体に含まれて 、た ATP濃度に応 じて、単核クロマズロール S-鉄錯体および複核クロマズロール S-鉄錯体の生成量が 決まる。そして、検体中の ATP濃度があらかじめ定めた境界濃度よりも高いとき青、低 いとき橙と、異なる色を呈し、これを目視観察することで検体中の ATP濃度レベルを 判定することができる。さらにそれにより、検体中の細菌量を把握することもできる。
[0038] 発色試薬としてメチルチモールブルーまたはメチルキシレノールブルーを用いた場 合にも、検体中の ATP濃度があらかじめ定めた境界濃度よりも高いときと低いときとで 、異なる色を呈し、これを目視観察することで検体中の ATP濃度レベルを判定するこ とができる。さらにそれにより、検体中の細菌量を把握することもできる。
[0039] 本発明の方法においては、検体中に含まれるアデノシン三リン酸濃度が、あらかじ め定めた境界濃度よりも高いときと低いときとで、工程 3で得た混合物が呈する色が異 なるように、条件を設定する。より具体的には、主に、（3)により生成する過酸ィ匕水素 の濃度と工程 3で用いる発色試薬の濃度を設定する。したがって、工程 3における酸 は、工程 3における pHを調節するために加え、その pHは生成する鉄 (III)イオンが加 水分解を受けずに安定して存在でき、かつ錯体が生成できる条件を考慮して決定す る。詳細は、後述する参考例 1に記述する。鉄 (II)の量は、参考例 4に詳述するが、 少なくとも発色試薬 (キシレノールオレンジ)の 2倍とする。発色試薬がキシレノールォ レンジの場合、 2倍以上にしな 、と紫色が現れな 、。
[0040] 発色試薬の決定方法は、参考例 2に詳細に記述するが、第 1には、図 5または 6に 示すように、過酸ィ匕水素濃度と発色試薬の間に直線的相関がある範囲に限定される 。さらに、発色が濃すぎ、薄すぎない濃度で行う。具体的には、発色試薬との直線的 相関がある範囲（例えば、 2 X 10— 6〜6 X 10— 5 M)になるように設定することが適当 である。（図 5及び 6参照）
[0041] 発色試薬がキシレノールオレンジである場合についてより具体的に説明する。境界 値を挟んで異なる色への発色は、判別しょうとする濃度の ATPから反応式 (3)により 生成する過酸ィヒ水素の濃度とキシレノールオレンジの濃度を等濃度に設定すること で達成できる。
[0042] キシレノールオレンジ濃度は、生成する過酸化水素の濃度に応じて設定するが、 1
X 10— 4 M以下が好ましい。それ以上では、それと等濃度の過酸ィ匕水素がキシレノー ルオレンジに対する酸化によって発色を妨害する。キシレノールオレンジ濃度は、好 ましくは 2 X 10— 6〜6 X 10— 5 Mの範囲である。です。また、境界濃度は、検査対象に より、上下させることが可能であり、境界濃度は ATP 5 X 10— ω Μ以上で設定可能で ある。
[0043] さらに、境界濃度を上下する方法について以下に具体的に説明する。境界濃度を 上下する方法には、主に、以下の 2通りがある。
[0044] 1.キシレノールオレンジ濃度を固定し，反応時間を設定する方法
まず、キシレノールオレンジを上記の適用可能な範囲で設定する。さらに、設定した キシレノールオレンジ濃度に対して、過酸化水素濃度が増加したとき初めて紫色に なるときの吸光度を求める。測定波長は，紫色の吸収に相当する波長 585 nmとする。 続いて、境界濃度とすべき ATP濃度で工程 1の反応を行わせる。工程 1の反応液の一 部を 5〜15分ごとに採取し、工程 2〜3を行って吸光度を測定する。このときの波長も 5 85 nmとする。反応時間に対して吸光度をとつて、図 18 (あるいは図 20)のような曲線 を作成する。作成した曲線から、紫色に相当する吸光度に達するまでに要した時間 を決定し、これを工程 1における反応時間とする。なお、様々な ATP濃度で同様にし て曲線を作成しておくと、容易に反応時間を設定することができる。
[0045] 2.反応時間を固定し、キシレノールオレンジ濃度を設定する方法
まず、様々な ATP濃度で工程 1の反応を特定の時間行ったのち、工程 2を行う。続 いて、すべての ATP濃度について、工程 2で発生する過酸ィ匕水素濃度を工程 3による 方法または別の方法 (比色法、電気化学的測定など)で測定する。 ATP濃度と過酸 化水素濃度の関係を、図 21に示すようなグラフにする。このグラフから、境界濃度とす べき ATP濃度に対応する過酸ィ匕水素濃度を求める。過酸ィ匕水素濃度とキシレノール オレンジが等し 、とき紫になるので、その過酸化水素濃度と等しくなるようにキシレノ ールオレンジ濃度を設定する。ただし、求める過酸化水素濃度が上述の適用可能な 過酸化水素濃度の範囲内にあるように反応時間を調節する。 V、くつかの反応時間に おいて、同様のグラフを作成しておくと、適用可能な過酸化水素濃度範囲に入る反 応時間を容易に定めることができる。
[0046] キシレノールオレンジと鉄 (II)イオンの濃度比の設定は、明瞭な発色のために重要 であり、具体的には、キシレノールオレンジ:鉄 (II)イオンのモル比が 50〜200の範囲で あることが適当であり、特に 1 : 100であることが好ましい。なお、発色は、反応 (5)およ び (5')において、過酸ィ匕水素に酸ィ匕されて生じた鉄 (III)イオンとキシレノールオレンジ が結合することで起きる。キシレノールオレンジに 1個の鉄 (III)イオンが結合したとき赤 色を呈し、 2個結合したとき紫色を呈する。紫色への変化は、鉄 (III)イオンの濃度がキ シレノールオレンジ濃度とほぼ等濃度になったとき起きる。
[0047] 発色試薬がクロマズロール3、メチルチモールブルー、またはメチルキシレノールブ ルーである場合、各発色試薬と鉄 (II)イオンとのモル比の関係は、キシレノールオレン ジと同程度である。
[0048] さらに工程 3において、酸の使用量は、 pHが 2前後となるとすることが適当である。
[0049] 工程 3における反応 pHは、 2前後が好ましい。 pH 3以上では、鉄 (II)イオンが加水分 解して発色に関与できなくなるので、 pHをあげることは好ましくない。また、工程 1〜4 のすベての工程において、 pH調節を用いることができ、その場合、鉄 (Π)および鉄 (III) イオンと錯体を形成しない pH緩衝剤を用いる。そのような pH緩衝剤としては、例えば 、グッド緩衝剤（MES、 ACESなど）が好ましい。
[0050] (4)、（5)および (5')の反応、即ち工程 3は、所定時間行うが、この所定時間は、以下の ように決定される。後述する参考例 5に示す図 10のように、紫色の吸収に相当する 58 5nmでの吸光度と時間の曲線を作成し、吸光度がほぼ最大値に到達した時間を選ぶ 。すなわち、この時間は錯体形成のための時間であるので、錯体形成がほぼ終了す る時間とする。工程 3の所定時間は、 5分以上 (例えば、 5〜20分)が適している力 判 定時間を短縮する観点からは 5分が好ま U、。
[0051] 本発明では、前記のように、目視での判定が可能である。しかし、工程 3で得た混合 物の色を比色計や色彩測定器を用いて測定することで、数値データとして記録する ことも可能である。このようにして得られる測定値は ATP濃度と相関がある。
[0052] 本発明の方法は、食品製造現場において、製造途中の食品、器具の洗浄度のスク リー-ング的検査に利用できる。すなわち、境界濃度よりも大きな試料を製造過程か ら排除するのに利用できる。
[0053] 試料ごとの手順としては、食品であれば、まず、適当な方法で粉砕し溶液状にした のち、界面活性剤等を加えてそこに含まれる細菌の細胞膜を溶解し、 ATPを細菌内 カゝら放出させる。また、器具の汚染度を判定する場合は、緩衝液等で湿らせた適当 な布またはろ紙で器具を拭い、緩衝液を含む試験管の中で洗うことにより、細菌など 汚染物が溶解した試料液を調製する。これらの試料を多穴プレートに移し、本発明の 方法にしたがって試薬を順に滴下し、最終的に現れる発色を目視観察することで、そ の試料の汚染度あるいは洗浄度を判定する。ただし、試料によって、汚染の許容値 あるいは基準値が異なるので、試薬濃度または反応条件によりそれらを調節しておく 必要がある。
[0054] 検査結果を記録する必要がある場合は、デジタルカメラでその発色を撮影するか、 吸光光度計や色彩測定器を利用することにより、検査結果を記録保存することができ る。
[0055] [分析用キット]
本発明は、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析用キット包含し、このキット は、少なくとも以下の試薬 1〜3を含む。
1 :アデノシンモノリン酸、ホスホェノールピルビン酸、アデ-ル酸キナーゼおよびピル ビン酸キナーゼ、
2 :酸およびピルビン酸ォキシダーゼ、並びに
3 :酸、鉄 (Π)、および発色試薬
[0056] 試薬 1は、上記分析方法の工程 1に使用される試薬である。前述のように、 ATPの増 幅反応の開始を制御するという観点からは、例えば、酵素の一方とほかの試薬をあら 力じめ混合したものを試料にカ卩えたあとに、もう一方の酵素をカ卩えるという方法、また は酵素以外の試薬をあら力じめ混合したものを試料に加えたあとに、もう 2つの酵素 をカロえるという方法を取ることができるので、本発明のキットにおいては、試薬 1は、酵 素の一方とほかの試薬をあらかじめ混合したものと、他方の酵素の 2つの試薬、また は、酵素以外の試薬をあらカゝじめ混合したものと 2つの酵素の混合物の 2つの試薬か らなることができる。これらの試薬は、例えば、 pH緩衝液に溶解または分散したもので あることが適当である。 pH緩衝液用の緩衝剤としては、例えば、グッド緩衝剤（ピペラ ジン- 1、 4-ビス (2-エタンスルホン酸) (PIPES)、 2-ヒドロキシ- 3-モルフォリノプロパンス ルホン酸 (MOPSO)など）を用いることができる。また、 pH緩衝液の pHは前述の方法で 示したと同様にすることが適当である。
[0057] 試薬 2は、上記分析方法の工程 2に用いる試薬であり、酸およびピルビン酸ォキシ ダーゼからなり、酸は、塩酸、硝酸または硫酸であることができる。酸は、適当な濃度 に希釈したものであることが適当である。また、ピルビン酸ォキシダーゼは、そのまま 、または、試薬 1と同様の pH緩衝液に溶解または分散したものであることができる。
[0058] 試薬 3は、上記分析方法の工程 3に用いる試薬であり、酸、鉄 (11)、および発色試薬 力もなる。酸は、塩酸、硝酸または硫酸であることができる。酸は、適当な濃度に希釈 したものであることが適当である。鉄 (II)は、例えば、硫酸第一鉄アンモ-ゥム (モー ル塩)等であることができる。また、発色試薬はキシレノールオレンジ、クロマズロール s、メチルチモールブルーまたはメチルキシレノールブルーであることができる。酸、 鉄 (11)、および発色試薬 (例えば、キシレノールオレンジ)は、あら力じめ混合しておく ことができる。
[0059] 本発明のキットは、上記試薬類に加えて、境界濃度より高い場合および低い場合の 発色の色見本を含むことができる。発色の色見本の色は、鉄 (II)および発色試薬の種 類に応じて適宜選択できる。
[0060] 本発明のキットは、上記試薬類に加えて、キットの説明書を含むこともできる。
[0061] 本発明のキットに用いるアデノシンモノリン酸は、アビラーゼ処理したアデノシンモノ リン酸試薬であることが、より低濃度の ATPを測定できるという観点力も好ましい。
[0062] 本発明のキットは、検体および試薬を混合し、発色を見るための容器を含むことが でき、そのような容器としては、マルチタイタープレートを挙げることができ、例えば、 9 6穴のマルチタイタープレートであることができる。但し、マルチタイタープレートは、発 色を肉眼で観察しやす ヽと 、う観点から、色は白色であることが好ま 、。
実施例
[0063] 以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
[0064] 参考例 1
工程 3の反応条件について、おおよその目安をつける目的で、工程 3のみで検討を 行った。まず、工程 3すなわち過酸ィ匕水素-鉄 (Π)-ΧΟ系での発色特性を調べた。 ΧΟ 濃度および鉄 (II)溶液を一定にして、 0〜 4 X 10— 5 Μの範囲で過酸ィ匕水素濃度を変 化させたときの吸収スペクトルを図 1左に示す。このときの pHは、生成する鉄 (III)ィォ ンが加水分解を受けずに安定して存在でき、かつ錯体が生成できる条件を考慮して 、 2.0とした。工程 3では、酸化されて生成する鉄 (III)イオンと XOが錯体を形成するた め、原理的には工程 3と同様の条件と考えられる鉄 (ΠΙ)-ΧΟ系を図 1右に示す。 ΧΟ濃 度を一定にして、鉄 (III)濃度を変えて測定した。いずれの場合の極大吸収波長も 433 nmおよび 585 nmであり、それぞれの吸収極大波長はそれぞれ黄色および紫系統の 色の吸収に対応する。 585 nmにおける吸光度は、鉄 (ΠΙ)-ΧΟ錯体系では 6 X 10— 5 Μ 以上のとき最大一定値 0.75をとるのに対して、過酸ィ匕水素-鉄 (Π)-ΧΟ系では過酸ィ匕 水素濃度 2 X 10— 5 Μ以上のとき最大一定値 0.5となった。過酸ィ匕水素-鉄 (Π)-ΧΟ系 で吸光度が低くなつた原因は、過酸化水素と鉄イオンの反応、すなわちフェントン反 応が ΧΟゃ錯体に対して影響しているものと推察される。したがって、本発明を実施す るときは、この影響が強く出ない範囲 (過酸ィ匕水素濃度)で行うのが好ましい。
[0065] また、過酸ィ匕水素- ΧΟ-鉄 (II)系および鉄 (ΠΙ)-ΧΟの色調にっ 、ては、紫色側で両 者の色調で異なった。結果を図 2および 3に示す。図 2に示す鉄 (ΠΙ)-ΧΟ系では青紫 色であつたが、図 3に示す過酸ィ匕水素- ΧΟ-鉄 (II)系では紫色であった。しかし、この 色調の差異は、色の違いで判別することに関しては問題とはならな力つた。
[0066] 参考例 2
過酸化水素による鉄 (Π)イオンの酸化反応の量論関係を検討した。そのために、 ΧΟ 濃度および鉄 (II)濃度を一定とし過酸化水素濃度を 0〜 6 X 10—5 Μに変化させて、 585 nmの吸光度を測定した。また、比較のため、鉄 (ΠΙ)-ΧΟ系において、 ΧΟ濃度を 一定として、鉄 (III)標準液を 0〜 7 X 10— 5 Μの範囲で変化させて 585 nmの吸光度を 測定した。これらの結果を図 4に示す。鉄 (ΠΙ)-ΧΟ系では、 [Fe(III)]/[XO] = 1.6付近で 屈曲し、過酸ィ匕水素-鉄 (Π)-ΧΟ系では、 [Η 0 ]/[ΧΟ] = 0.8付近で屈曲した。屈曲点
2 2
が整数でないのは、用いた発色試薬の純度が低いためである。したがって、純度が 高ければ、それぞれ 2及び 1で屈曲するはずである。屈曲点以降では、いずれもすべ て紫または青紫色となった。このことは、いずれの系においても屈曲点で、すべての ΧΟが複核錯体 Fe1" (xo)錯体を生成したことを示している。さらに、過酸化水素が鉄 (I
2
I)を鉄 (III)に酸ィ匕するため、過酸化水素と鉄 (II)の反応比は 1： 2であるといえる。この 結果は、（4)の反応式を支持している。過酸ィ匕水素- XO-鉄 (II)系で最大一定となる吸 光度が、鉄 (III)- XO系でのそれよりも低くなつたのは、上述したようにフェントン反応 力 ¾0ゃ錯体に対して影響しているためと推察される。
[0067] 図 4にあらわれる屈曲点は、その点で紫色への色変化が初めて生じたため、色変化 の境界条件となる。この屈曲点を与える過酸ィ匕水素濃度は、 [Fe(II)]/[XO] = 2を保 ちながら XO濃度を変えると、それに応じて変化する。そこで、 [Fe(II)]/[XO] = 2となる ような様々な XOおよび Fe(II)濃度で、屈曲点を与える過酸ィ匕水素濃度 (境界過酸ィ匕 水素濃度)を決定した。また、このとき調製した溶液を目視観察し、初めて紫色と認め たときの過酸化水素濃度を、目視観察による境界濃度とした。各 XO濃度に対する境 界過酸化水素濃度の関係を図 5および 6に示す。ある XO濃度において、グラフの線 より下側の過酸化水素濃度では黄色、上側では紫色である。
[0068] 目視観察および吸光度測定のいずれにおいても、 XO濃度が 1 X 10— 4 Mまでは、 XOと過酸ィ匕水素の濃度の間には傾き 1の相関があった。 1 X 10— 4 Mより XO濃度が 高くなると、不規則に変化した。不規則な変化は、目視観察および吸光度測定ともに ほぼ同じ形状であるため、測定方法に依存するものではないといえる。以上から、判 定に適しているのは、 XOと過酸ィ匕水素濃度に相関のある 0〜 1 X 10— 4 Mまでである 。ただし、色の変化が明瞭で、鮮やかな発色が得られるのは、 XO濃度が 2 X 10— 6 M 以上のときであった。
[0069] さらに、 XO濃度と発色の鮮やかさまたは色の濃さの関係を溶液の吸光度をもとに 検討した。結果を図 7に示す。ここでの吸光度は、各 XO濃度での屈曲点の吸光度（ 測定波長 585應)である。吸光度が高いほど、発色が鮮やかであるため、この吸光度 力 発色の鮮ゃ力さが評価できる。 XO濃度が 0〜 1.75 X 10— 4 Mでは、濃度が高く なるほど吸光度が高くなり、 XO濃度が 1.75 X 10— 4 M以上では、吸光度が減少した。 吸光度が減少したのは、過酸ィ匕水素により XOおよび Fe(III)-XO錯体が分解されたた めである。しかし、吸光度が高い場合でも、色が濃くなりすぎるため、色の判別がしに くくなつた。したがって、 XO濃度は、 6 X 10— 5 Mまでが好ましい。以上から、 XO濃度 は、 2 X 10 〜6 X 10—5 Mが好ましい。
[0070] 工程 3の反応に必要な時間を調べた。 [Fe2+] = 4 X 10— 5 M、 [XO] = 2 X 10— 5 Mとし て、 4種類の過酸ィ匕水素濃度で測定した反応曲線を図 8に示す。鉄 (III)と XOとの反応 は迅速であるため、この経時変化は、おもに過酸化水素による鉄 (II)の酸化反応を反 映していると考えることができる。過酸ィ匕水素濃度が高い (2 X 10— 5 M以上)と、最高 吸光度に達する時間は短くなつた。 2 X 10— 6 Mでは、およそ 1200秒で吸光度が一 定となった。ただし、 900秒でも発色は十分と判断できたことから、工程 3を単独で行 う場合の時間は 15分以上とした。
[0071] 上述の検討をもとに、工程 1から 3までを組み合わせた反応系で工程 3の条件をあ らためて検討した。操作は下記のスキームのように行った。
[化 2]
15ml Centrifuqe tube
0〜 1 x 10-8 M ATP, 500 μΙ
Figure imgf000020_0001
0〜 20 mM AMP (treated with apyrase), 500 μΙ
ATP 10 mM PEP in 10 mM MgS04! 500 μΙ
amplification
37.2 U / ml adenylate kinase, 500 μΙ
reaction
0.2 ACES ( pH 7.8 ), 7.5 ml
37.3 U / ml pyruvate kinase, 500 μΙ
L- Reaction (Thermostat bath at 25°C, 0〜 75 min)
680 μΙ
Figure imgf000020_0002
2 HCI ' 35 μΙ
2 ml J x 10—2 M Fe2+ , 800 μΙ
1 10-3 M XO , 80 μΙ
Water 1085 μΙ
Mixing (25°C,5min)
Measurement of visual observation and absorbance (reference, water)
[0072] 参考例 3
工程 1および工程 2で用いる pH緩衝剤にっ 、て検討した。リン酸およびクェン酸は 、工程 3において、鉄と結合し発色反応を阻害するため良好な発色が得られな力つた 。鉄と結合しな 、N- (2—ァセトアミド) -2-アミノエタンスルホン酸 (ACES)を用いたとき は良好に結果を得ることができた。以上から、工程 1および 2で用いる pH緩衝剤は、 工程 3で鉄 (Π)-ΧΟ系を用いる場合は、鉄イオンと結合しない緩衝剤が望ましい。その 例として、限定されるものではないが、グッド緩衝剤（ピペラジン- 1、 4-ビス (2-エタンス ルホン酸) (PIPES)、 2-ヒドロキシ- 3-モルフォリノプロパンスルホン酸 (MOPSO)など）が あげられる。また、試料中に上記のリン酸やクェン酸が含まれる場合は、アルミニウム イオンなどを添加することでそれらを封鎖することが必要である。
なお、工程 1における反応 pHは 7.5〜8.0が好ましぐ工程 2における反応 pHは、ピ ルビン酸ォキシダーゼが十分な活性を示す 5.5〜6.2が好ましい。
[0073] 参考例 4
工程 3において、 [XO] = 2 X 10—5 Mとして、工程 1〜3の一連の反応を行ったとき、 上述の鉄 (II)濃度では、良好な発色が得られな力つた。増幅反応によりもたらされる A TP、 AMP,および酵素が、鉄 (II)イオンまたは鉄 (III)イオンと結合することで発色に必 要な鉄イオンが不足して、発色を妨害したり、過酸化水素による鉄 (II)の酸化反応を 妨害したりすることが予想される。そこで、鉄 (II)濃度の最適化を行うために、工程 1〜 3までのすベて反応構成物が存在する条件で、鉄 (II)濃度を 1 X 10— 4〜 4 X 10— 3 M の範囲で、 585 nmの吸光度を測定した。その結果を、図 9に示す。図 9〖こ示されるよう に、吸光度は 2 X 10—3 Mで最大となった。鉄 (II)濃度は、 1 X 10—3〜 4 X 10— 4 Mの 範囲であればよいが、実施例では、 2 X 10— 3 Mを適用した。なお、この鉄 (II)濃度は、 キシレノールオレンジの 50〜200倍である。
[0074] 参考例 5
次に、上記の定めた鉄 (II)濃度で発色反応時間の検討をした。そのために、工程 1 でホスホェノールピルビン酸（PEP)が 100%ピルビン酸に変換されたと仮定し、工程 1 の反応液として、 PEPの代わりにそれと同濃度のピルビン酸を加えた溶液を調製した 。これを用いて、工程 2及び 3を行い、 585 nmの吸光度を測定した。このとき、工程 2 の反応時間を 5分とした。結果を図 10に示す。図 10に示すように、吸光度は約 300秒 以上で最大一定となった。工程 3のみの実験ではこの反応時間は 20分であつたが、 鉄イオン濃度を高くしたために反応速度が大きくなり、反応時間が短くなつた。以上 から、工程 1〜3の一連の操作を行うときの工程 3の反応時間は 5分とした。
[0075] 参考例 6
次に、工程 2におけるピルビン酸ォキシダーゼによる反応時間を検討した。実験は 、吸光度測定に十分なほどに ATPが増幅されたとみなせる 50分間増幅させたのち、 さまざまな時間で工程 2の反応を行った。 ATP初期濃度は 5 X 10— 5 Mとした。吸光度 は、反応時間が 5分でほぼ最大値に到達したため、工程 2における反応時間は 5分と した。結果を図 11に示す。
[0076] 参考例 7
AMPのアビラーゼ処理
市販の AMPには微量の ATPまたは ADPが含まれることが知られて!/、る。この AMPをそ のまま用いた場合、 ATP濃度を 0 Mと 5 X 10— 8 M、 5 X 10— 7 Mでとして実験すると、図 12(A)のように [ATP] = 0 Mと 5 X 10— 8 Mで曲線が重なる。より低濃度の ATPを測定す ることは不可能である。そこで、この微量の ATPまたは ADPを分解するために、 AMPを アビラーゼで処理した。 AMPのアビラーゼ処理を行うと、図 12(B)のように [ATP] = 0 M と [ATP] = 5 X 10— 8 Mとで反応速度に違いをみることができた。
[0077] 参考例 8
AMP濃度
AMP濃度の最適化を行った。 AMP濃度を変えると、反応速度を変化させ、増幅曲 線の形状を制御することができる。このとき、特定の濃度以上の ATPを判別するには 、増幅曲線が以下の条件を備える必要がある。
(1)ベースラインと最大吸光度の差 ( ΔΑ)が大きいこと。吸光度差が大きいほど、発色 が鮮明で、測定誤差を小さくすることができる。発色の変化の大きさを評価でき、吸光 度差が大き 、ほど判定しやす 、ことになる。
(2)二つの ATP濃度において、それぞれの吸光度が吸光度差の 1/2に到達するまで の時間差 ( At)が大きいこと。 2本の増幅曲線が離れているほど、精度よく判別すること ができる。
(3)ブランク試料 ([ATP] = 0 M)の吸光度が吸光度差の 1/2に到達するまでの時間 (t
0
1/2)が長すぎないこと。
以上のパラメーターを図 13のように定義して、様々な AMP濃度で測定した増幅曲線 をもとにグラフを作成した。
[0078] 図 14に吸光度差 Δ Aと AMP濃度の関係を示す。ブランクと [ATP] = 5 X 10— 4 Mで 比較した。吸光度差は、 5 X 10— 5 Mで一番大きくなり、その後ほぼ一定となった。
[0079] 図 15に、時間差 Atと AMP濃度の関係を示す。ブランクと ATPを含む曲線が離れて いるほど、精度よく測定できる。 AMP濃度が低いほうが時間差は大きくなつた。
[0080] 図 16に反応時間と AMP濃度の関係を示す。 AMP濃度が 1 X 10— 4 M以降では、ほ ぼ一定で、 AMP濃度が高いほうが反応時間は短くなつた。
[0081] 以上から、 AMPの最適濃度は 1 X 10— 4 M付近が好ましいと判断した。そこで、この 濃度付近でさらに AMP濃度について検討した結果、ブランクとの開き、再現性から実 施例では 5 X 10— 5 M AMPを採用した。
[0082] 参考例 9
PEP濃度
AMP濃度の最適化と同様の手法で、 PEP濃度の最適化を行った。そのために、 AM P濃度を 5 X 10—5 M—定とし、 PEP濃度を 1 X 10— 4 M〜 1 X 10— 3 Mの範囲で変化 させて反応曲線を測定した。結果を図 17に示す。 PEP濃度力 I X 10— 4 Mのとき、 120 分間増幅しても、増幅反応特有の立ち上がりは観察されな力つたが、 2.5 X 10— 4 M 以上では反応曲線が観察された。得られた反応曲線については、どれも吸光度差（ ΔΑ)はほぼ一定であった。また、二つの ATP濃度の時間差 ( At)については、図 17に 示すように、 5 X 10— 4 Mで最大値をとつた。以上から、 PEPの最適濃度を 5 X 10— 4 M とした。
[0083] 実施例 1
以上の結果に基づいて、 ATPの初期濃度を変えて増幅曲線を測定した。 ATP濃度 0、または 2.0 X 10— 10 M、 5.0 X 10— 10 M、 5.0 X 10— 9 Mの溶液 500 μ 1に 2.0 X 10— 2 Μアデノシンモノリン酸 500 μ 1、 0.01 Μホスホェノールピルビン酸 500 μ 1、 37. 2 U/mlアデ-ル酸キナーゼ 500 μ 1、 0.2 Μ ρΗ緩衝剤 7.5 ml、 37.3 U/mlピルビン酸 キナーゼ 500 1をカ卩えて、 25°Cで 45分間反応させて ATPを増幅した。この混合液の 1 mlを分取し、これに 2 M塩酸 58 μ 1、 6.4 U/mlピルビン酸ォキシダーゼ 942 μ 1をカロ えて、 5分間反応させた。そののち、 0.035 Μ塩酸、 4 Χ 10—3 Μ鉄 (II)イオン、 4 X 10" 5 Μキシレノールオレンジを含む混合溶液 2 mlを加えて 5分間反応させた。その結果 、 ATP濃度 0 Mの試料では黄色、 2.0 X 10— ω Μでは赤、 5 X 10— ω Μ以上では紫色を 呈した。
[0084] すなわち、この反応条件を用いたとき、 5 X 10"10 Mの ATP濃度を境界値として、色 の違いで微量の ATP濃度を判定することが可能であった。所定の時間ごとに 585 の吸光度を測定して得られた反応曲線を図 18に示す。 ATPの初期濃度に応じて明 瞭に曲線が離れて 、ることがわ力る。
[0085] 図 19に、 ATPを増幅したときの反応時間ごとの発色を示す。 ATPの増幅反応時間が 45分のとき、 [ATP] = 0 Mでは黄色、 [ATP] = 5 X 10_1° M以上では紫色を呈した。こ のことは、初期 ATP濃度 5 X 10— ω Μを境界濃度として目視判定ができることを示し ている。
[0086] 測定値の再現性を検討した。 ATPが 0 Mと 5 X 10— 9 Mでは、変動係数はそれぞれ 1 5% 13%となり、多くの反応を組み合わせていることを考慮すると、妥当な再現性であ ると考える。
[0087] [表 1]
吸光度測定の再現性
Abs at 585 nm
[ ATP ]。
Run 0 M 5 nM
1 0.093 0.346
2 0.088 0.292
3 0.086 0.345
4 0.120 0.390
5 0.1 13 0.281
Average 0.100 0.331
SD 0.015 0.045
CV 15% 13%
[0088] 実施例 2
ミネラルウォーター（フランス産）に既知濃度の大腸菌（KT1008株）を添加した試料 を用いて ATP分析を行った。試料を以下のように 3種類調製した。
1. 0.2 M Hepes緩衝剤を含むミネラルウォーター
2.工程 1の反応混合物中で菌濃度が 5 X 105個/ mlとなるように大腸菌を 1に添加し たもの
3.工程 1の反応混合物中で菌濃度が 1 X 106個/ mlとなるように大腸菌を 1に添加し たもの [0089] 試料調製に際しては，まず大腸菌を対数増殖期まで培養したあと、培養液を除き p H緩衝液に懸濁した。懸濁液中の大腸菌濃度は約 1 X 109個/ mlである。この懸濁液 を全量 2 mlとなるようにミネラルウォーターに添加したものを試料とした。試料に含ま れる大腸菌の細胞破砕のために，ソ-ケ一ターで試料を超音波処理した。これを AT P溶液の代わりに用いて実施例 1と同条件で反応を行った。その結果を図 22に示す。 試料 1では黄色、試料 2ではうす紫、試料 3では紫色を呈した。
[0090] 超音波処理によりほぼ完全に細胞が破砕されたと仮定して、工程 1における試料 1 および、 2、 3の ATP濃度を大腸菌濃度から見積もると、それぞれ 0、および、 5 X 10— 5 M、 1 X 10"10 Mである。各試料の呈色は ATP標準を用いた実施例 1と同様であるから 、この結果は大腸菌から抽出した ATPにおいても本発明により判定できることを示し ている。
[0091] 実施例 3
既知濃度の大腸菌を添加した牛乳を試料として、実施例 2と同様の実験を行った。 試料を以下のように 3種類調製した。
1.牛乳のみ
2.工程 1の反応混合物中で菌濃度が 5 X 105個/ mlとなるように大腸菌を牛乳に添カロ したもの
3.工程 1反応混合物中で菌濃度が 1 X 106個/ mlとなるように大腸菌を牛乳に添加し たもの
[0092] 試料調製に際しては、実施例 2と同様にまず大腸菌懸濁液 (約 I X 109個/ ml)を調 製した。この懸濁液と牛乳を混合し全量 1 mlとしたものを試料とした。これに 25%トリ クロ口酢酸溶液 0.5 mlを添加して、大腸菌の細胞破砕および牛乳の除タンパクを行つ た。 5分間静置したのち、遠心分離（10000 X g、 5分)を行った。上清 0.2 mlに水酸ィ匕 ナトリウム溶液と pH緩衝液を加えて pH 7付近に調整したのち、全量を 2 mlとした。この 溶液の ATP分析を行った。ただし、本例においては、工程 1で実施例 1の約 2倍の反 応時間が必要であった。これはトリクロ口酢酸による酵素阻害のためと推測される。
[0093] 実験結果は図 23に示す。試料 1、 2、 3でそれぞれ黄色、紫、紫色を呈した。ほぼ完 全に細胞が破砕されたと仮定して、試料 1および、 2、 3を用いたときの ATP濃度を見 積もると、それぞれ 0、および、 5 X 10 M、 1 X 10"10 Mである。したがって、本例におい ても ATP濃度に応じた呈色が得られたと判断できる。
産業上の利用可能性
[0094] 本発明の方法は、細菌を含む様々な食品関連試料の検査に適用可能である。
図面の簡単な説明
[0095] [図 1]過酸ィ匕水素-鉄 (Π)-ΧΟ系（左）および鉄 (ΠΙ)-ΧΟ系（右）の吸収スペクトル。過酸 化水素-鉄 (Π)-ΧΟ系： [ΧΟ] = 2 X 10—5； [Fe2+] = 4 X 10— 5； H 0 濃度 (585 nmにおい て下から順に)： 0、 1 X 10 M、 2 X 10 M、 6 X 10— 6 M、 8 X 10— 6 M、 1 X 10— 5 M、 2 X 10— 5 M、 2.5 X 10— 5 M、 3 X 10— 5 M、 4 X 10— 5 M、 6 X 10— 5 M、 pH 2.0 .鉄 (III)- XO系： [XO] = 2 X 10— 5 M; Fe(III)濃度 0、 4 X 10— 6 M、 6 X 10— 6 M、 1 X 10— 5 M、 1.5 X 10— 5 M、 2 X 10— 5 M、 2.5 X 10— 5 M、 3 X 10— 5 M、 4 X 10— 5 M 、 pH 2.0.
[図 2]鉄 (III)- XO系の色変化。鉄 (III)濃度（左から)： 0、 4 X 10— 6 M、 6 X 10— 6 M、 1 X 10— 5 M、 1.5 X 10— 5 M、 2 X 10— 5 M、 2.5 X 10— 5 M、 3 X 10— 5 M、 4 X 10— 5 M
[図 3]過酸ィ匕水素- XO-鉄 (II)系の色変化。過酸ィ匕水素濃度 (左から)： 0 M、 4.0 X 10" 6 M、 6.0 X 10— 6 M、 1.0 X 10— 5 M、 1.5 X 10— 5 M、 2.0 X 10— 5 M、 2.5 X 10— 5 M、 3.0 X 10— 5 M、 4.0 X 10— 5 M、 6.0 X 10— 5 M。
[図 4]各反応系の化学量論。 [XO] = 2 X 10— 5 M; [Fe2+] = 4 X 10— 5 M; pH 2.0. (參) 過酸ィ匕水素- XO-鉄 (Π)系、 （〇）鉄 (III)- XO系.
[図 5]目視観察により決定した XOと境界過酸ィ匕水素の濃度関係。
[図 6]吸光度により決定した XOと境界過酸ィヒ水素の濃度関係。
[図 7]XO濃度と吸光度の関係。 pH 2.0. [Fe2+] = 2 X [XO]
[図 8]各種過酸ィ匕水素濃度における吸光度の時間変化。 [Fe2+] = 4 X 10— 5 M; [XO] = 2 X 10— 5 M; pH 2.0.
[図 9]反応構成物の存在下での鉄 (II)濃度と吸光度の関係。酵素反応： [Pyruvate] = 5 X 10—4 M; PVOD、 3 U/ml; pH 5.8; 5min; 25°C.発色反応： [XO] = 2 X 10— 5 M; p H 2.0、 25°C; 15 min. [ATP] = 5 X 10— 4 M; [AMP] = 10 ^ M; AKゝ 1.9 U/ml; [ACE S] = 0.15 M; PK、 1.9 U/ml; pH 7.8.
[図 10]発色反応における吸光度の時間変ィ匕。工程 1: [AMP] = 1 X 10— 4 M、 [Pyruvat e] = 5 X 10— 5 M、 AK 1.9 U/ml, PK 1.9 U/ml, [ACES] = 0.15 M、 [ATP] = 5 X 1 o
0— 5 M、 pH 7.8.工程 2: [PVOD] = 6.0 U m\ 5 min、 25°C、 pH 5.8。工程 3: [XO] = 2 X 10— 5 M、 [Fe2+] = 2 X 10— 3 M、 25°C、 pH 2.0、 0 - 1200 s
[図 11]ピルビン酸ォキシダーゼによる酵素反応。工程 1: [AMP] = 1 X 10 M; [Pyru vate]、 5.0 X 10— 5 M; AK、 1.9 U/ml; PK、 1.9 U/ml; [ACES] = 0.15 M; [ATP] = 5.
o
0 X 10— 5 M; pH 7.8; 50 min。 工程 2: PVOD, 6.0 U/ml; 0 min、 2 min、 5 min、 10 min, 15 minゝ 20 min、 25 min、 30 min; 25°C; pH 5.8.工程 3: [XO] = 2 X 10— 5 M; [Fe2+] = 2 X 10— 3 M; 25°C; pH 2.0; 5 min.
[図 12]AMPをアビラーゼで処理しないときとしたときの ATPの増幅曲線。右 AMPをァ ピラーゼで処理しないとき工程 1: [AMP] = 1 X 10—3 M; [PEP] = 5 X 10— 4 M; AK、 1
.9 U/ml; PK、 1.9 U/ml; [ACES] = 0.15 M; pH 7.8. [ATP] :〇、 0 M;△、 5 X 10— o
8 M;口、 5 X 10—7 M.工程 2: PVOD, 6.0 U/ml, 5 min、 25。C、 pH 5.8.工程 3: [X
01 = 2 X 10— 5 M; [Fe2+] = 2 X 10— 3 M; 5 min; 25°C; pH 2.0.右 AMPをアビラーゼ で処理したとき 工程 1: [AMP] = 5 X 10— 5 M、 [PEP] = 5 X 10— 4 M、 AK、 1.9 U/m
1、 PK 1.9 U/ml、 [ACES] = 0.15 M、 [ATP] = 0 M、 0—75 minゝ pH 7.8. [ATP] ：〇 o o
、 0 M;△、 5 X 10—8 M;□、 5 X 10—7 M.工程 2: [PVOD] = 6.0 U/ml, 5 min、 25 。C、 pH 5.8.工程 3: [XO] = 2 X 10— 5 M、 [Fe2+] = 2 X 10— 3 M、 5 min、 25。C、 pH 2. 0.
[図 13]増幅曲線のモデル。 (1)、 吸光度差 ( Δ A); (2)、 時間差（A t ); (3)、 反応 時間 t 。
[図 14]吸光度差 Δ Aと AMP濃度の関係。工程 1: [ATP] = 5 X 10— 4 M; [PEP] = 5 X
10 M; AK、 1.9 U/ml; PK 1.9 U/ml, [ACES] = 0.15 M; [ATP] = 0 M、 5 X 10— 4 o
M; 0-75 min; pH 7.8.工程 2: PVODゝ 6.0 U/ml; 5 min; 25°C; pH 5.8.工程 3: [XO] = 2 X 10— 5 M; [Fe21 = 2 X 10— 3 M; 5 min; 25°C; pH 2.0.
[図 15]時間差 A tと AMP濃度の関係。
圆 16]反応時間 t と AMP濃度の関係。 [図 17]時間差 A tと PEP濃度の関係。工程 1: [AMP] = 5 X 10 M; AK、 1.9 U/ml;
PK 1.9 U/ml、 [ACES] = 0.15 M; [ATP] = 0 M、 5 X 10— 4 M; 0 - 75 min; pH 7.8.
o
工程 2: PVOD、 6.0 U/ml; 5 min; 25°C; pH 5.8.工程 3: [XO] = 2 X 10— 5 M; [Fe2+] = 2 X 10— 3 M; 5 min; 25°C; pH 2.0.
[図 18]実施例 1で得られた ATPの増幅曲線。 工程 1 : [AMP] = 5 X 10— 5 M; [PEP] = 5
X 10 M; AKゝ 1.9 U/ml; PK 1.9 U/ml, [ACES] = 0.15 M; [ATP] = 0 M; 0min、 o
5 min、 15 min、 30 min、 45 min、 60 min、 75 min; pH 7.8.工程 2: PVOD、 6.0 U/ ml; 5 min; 25°C; pH 5.5.工程 3: [XO] = 2 X 10— 5 M; [Fe2+] = 2 X 10— 3 M; 5 min; 2 5°C; pH 2.0.
[図 19]各反応時間での 0 M (上）と 5 X 10— ω M (下）の発色。工程 1:反応時間（左か ら右へ)： 0min、 5 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 75 min; pH 7.8. [AMP] = 5 X 10— 5 M; [PEP] = 5 X 10— 4 M; AK、 1.9 U/ml; PK、 1.9 U/ml, [ACES] = 0.15 M.工程 2: PVOD、 6.0 U/ml; 5 min; 25°C; pH 5.5.工程 3: [XO] = 2 X 10— 5 M; [F e2+] = 2 X 10— 3 M; 5 min; 25°C; pH 2.0.
[図 20]異なる ATP濃度における反応時間と吸光度との関係を示す。
[図 21]ATP濃度と過酸化水素濃度の関係を示す。
圆 22]大腸菌を添加したミネラルウォーター中の ATP分析結果。大腸菌濃度 (上から 順に）：試料 1, 0個/ ml;試料 2, 5 X 105個/ ml ;試料 3, 1 X 106個/ ml
圆 23]大腸菌を添加した牛乳中の ATP分析結果。 大腸菌濃度 (上から順に）：試料 1 , 0個/ ml;試料 2, 5 X 105個/ ml;試料 3, 1 X 106個/ ml

Claims

請求の範囲
[1] 以下の工程 1〜4を含む、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析方法。
工程 1:前記検体とアデノシンモノリン酸、ホスホェノールピルビン酸、アデニル酸キナ ーゼおよびピルビン酸キナーゼとを混合し、所定時間保持する工程、
工程 2:工程 1で得た混合物の少なくとも一部に酸およびピルビン酸ォキシダーゼを加 えて所定時間保持する工程、
工程 3:工程 2で得た混合物の少なくとも一部に酸、鉄 (11)、および発色試薬を加えて 所定時間保持する工程、および
工程 4:工程 3で得た混合物の色カゝらアデノシン三リン酸の濃度を判定する工程。
[2] 前記発色試薬がキシレノールオレンジ、クロマズロール3、メチルチモールブルーまた はメチルキシレノールブルーである請求項 1に記載の方法。
[3] 工程 2および 3で用いる酸が塩酸である請求項 1または 2に記載の方法。
[4] 工程 1〜4を室温 (10〜30°C)で行う請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の方法。
[5] 前記発色試薬がキシレノールオレンジであり、検体中に含まれるアデノシン三リン酸 濃度が、あらかじめ定めた境界濃度よりも高いときに工程 3で得た混合物が紫を呈し
、低いときには黄を呈するように、条件を設定する請求項 1に記載の方法。
[6] 前記発色試薬がクロマズロール Sであり、検体中に含まれるアデノシン三リン酸濃度
1S あら力じめ定めた境界濃度よりも高いときに工程 3で得た混合物が青を呈し、低い ときには橙を呈するように、条件を設定する請求項 1に記載の方法。
[7] 工程 3で得た混合物の色を目？見観察して、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の濃 度力 あら力じめ定めた境界濃度より高いか、低いかを判定する請求項 5または 6に 記載の方法。
[8] アデノシンモノリン酸として、アビラーゼ処理したアデノシンモノリン酸試薬を用いる請 求項 1〜7のいずれか 1項に記載の方法。
[9] 以下の試薬 1〜3を含む、検体中に含まれるアデノシン三リン酸の分析用キット。
1:アデノシンモノリン酸、ホスホェノールピルビン酸、アデ-ル酸キナーゼおよびピル ビン酸キナーゼ、
2:酸およびピルビン酸ォキシダーゼ、並びに 3:酸、鉄 (Π)、および発色試薬
[10] 前記発色試薬がキシレノールオレンジ、クロマズロール3、メチルチモールブルーまた はメチルキシレノールブルーである請求項 9に記載のキット。
[11] 境界濃度より高い場合および低い場合の発色の色見本を含む請求項 9または 10に 記載のキット。
[12] キットの説明書を含む請求項 9〜11のいずれ力 1項に記載のキット。
[13] アデノシンモノリン酸力 アビラーゼ処理したアデノシンモノリン酸試薬である請求項 9
〜12のいずれ力 1項に記載のキット。
[14] 検体および試薬を混合し、発色を見るための容器を含む請求項 9〜13のいずれか 1 項に記載のキット。
[15] 前記容器がマルチタイタープレートである請求項 14に記載のキット。
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