CN103717748A - 鞘磷脂的测定方法和测定用试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于简便并且准确地测定样本中的鞘磷脂的方法和试剂盒。一种样本中的鞘磷脂的测定方法，其特征在于，使样本与不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。

Description

鞘磷脂的测定方法和测定用试剂盒
技术领域
本发明涉及鞘磷脂的测定方法和测定用试剂盒。
背景技术
在血液中含有高密度脂蛋白(以下简记为HDL)、低密度脂蛋白(以下简记为LDL)、极低密度脂蛋白(以下简记为VLDL)、乳糜微粒(以下简记为CM)等脂蛋白。各脂蛋白的胆固醇、甘油三酯、磷脂、蛋白质等构成成分的比例不同，在生物体内具有不同的作用。在脂蛋白中主要含有三种磷脂，即，磷脂酰胆碱(以下简记为PC)、溶血磷脂酰胆碱(以下简记为LPC)、鞘磷脂(以下简记为SM)。
在这三种磷脂中，PC和SM为主要的磷脂，分别占全部磷脂的约7成和约2成。已知SM蓄积在人和动物模型的粥样斑块(Atheroma)中。存在于人的动脉硬化斑块中的LDL，与血浆中的LDL相比，含有更多的SM(非专利文献1)。
另一方面，在人的临床研究中也显示出血浆中的SM和SM/PC比率是相对于缺血性心脏病而言独立的危险因素(非专利文献2～4)。
至今，作为SM的测定方法，报道了使用薄层色谱的方法和使用高效液相色谱的方法(非专利文献5)，但具有操作烦杂且测定需要长时间等缺点。另外，也报道了利用来源于细菌的鞘磷脂酶的酶测定法(专利文献1、非专利文献2)。本测定法为如下方法：将鞘磷脂通过细菌的鞘磷脂酶水解成磷酸胆碱和N-酰基鞘氨醇，将生成的磷酸胆碱通过碱性磷酸酶水解成胆碱，使生成的胆碱与胆碱氧化酶反应，测定生成的过氧化氢，由此，测定鞘磷脂。但是，本测定法具有因使用碱性磷酸酶而产生的对其他测定项目的测定的影响、鞘磷脂酶与SM一起同LPC反应的特异性等问题(非专利文献6)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2009-519713号公报
非专利文献
非专利文献1：Circulation,Vol.110(22),p.3465-3471(2004).
非专利文献2：Arterioscler Thromb Vasc Biol.,Vol.20,p.2614-2618(2000).
非专利文献3：Nutrition&Metabolism,Vol.3,p.5(2006).
非专利文献4：Am.J.Epidemiol.,Vol.163,p.903-912(2006).
非专利文献5：Dairy Sci.,Vol.88,p.482-488(2005).
非专利文献6：Biol.Pharm.Bull.Vol.27,p.1725-1729(2004).
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，提供用于简便并且准确地测定样本中的SM的方法和试剂盒。
用于解决问题的方法
本发明人为了解决上述问题而进行了深入的研究，发现，在选择性地测定含有PC、LPC和SM的样本中的SM的方法中，通过使用不与使LPC与溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶反应而生成的甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应但与SM反应的磷脂酶D，能够特异性地测定SM，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下的[1]～[17]。
[1]一种样本中的SM的测定方法，其特征在于，使样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。
[2]一种样本中的SM的测定方法，其特征在于，使样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。
[3]如[1]所述的方法，其中，在过氧化氢酶存在下进行样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶的反应，在过氧化氢酶抑制剂存在下进行样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶的反应。
[4]如[2]所述的方法，其中，在过氧化氢酶存在下进行样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶的反应，在过氧化氢酶抑制剂存在下进行样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶的反应。
[5]如[3]或[4]所述的方法，其中，过氧化氢酶抑制剂为叠氮化物。
[6]如[1]或[2]记载的方法，其中，在过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体中的一个存在下进行过氧化氢的消去，在过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体存在下进行过氧化氢的测定。
[7]如[1]～[5]中任一项所述的方法，在过氧化物酶和无色型色原体存在下进行过氧化氢的测定。
[8]如[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，不与SM和LPC反应而是与PC反应的磷脂酶D为来源于链霉菌(Streptomyces sp.)的磷脂酶D。
[9]如[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D为来源于色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)的磷脂酶D。
[10]一种样本中的SM测定用试剂盒，其特征在于，包含：含有不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶和过氧化氢酶的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D和过氧化氢酶抑制剂的第二试剂。
[11]一种样本中的鞘磷脂测定用试剂盒，其特征在于，包含：含有不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体中的一个的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D和氧化偶合发色型色原体中的另一个的第二试剂。
[12]一种样本中的鞘磷脂测定用试剂盒，其特征在于，包含：含有不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶和过氧化氢酶的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D和过氧化氢酶抑制剂的第二试剂。
[13]一种样本中的SM测定用试剂盒，其特征在于，包含：含有不与SM和LPC反应而是与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体中的一个的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D和氧化偶合发色型色原体中的另一个的第二试剂。
[14]如[10]或[12]所述的试剂盒，其中，过氧化氢酶抑制剂为叠氮化物。
[15]如[10]、[12]或[14]所述的试剂盒，其中，过氧化物酶和无色型色原体分别包含在第一试剂和第二试剂中。
[16]如[10]～[15]中任一项所述的试剂盒，其中，不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D为来源于链霉菌(Streptomyces sp.)的磷脂酶D。
[17]如[10]～[16]中任一项所述的试剂盒，其中，不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D为来源于色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)的磷脂酶D。
发明效果
根据本发明，能提供用于简便并且准确地测定样本中的SM的方法和试剂盒。
附图说明
图1是表示实施例1的试剂盒(试剂盒A～F)的对SM、LPC和PC各磷脂的标准溶液的“吸光度”的图。纵轴表示吸光度(mAbs)，横轴表示各试剂盒(试剂盒A～F)。□表示SM，■表示PC，包围虚线表示LPC。
图2表示使用实施例2的试剂盒的测定与使用对照试剂盒的测定之间的相关图。纵轴表示通过使用实施例2的测定确定的样本中的SM浓度(mg/dL)，横轴表示通过使用对照试剂盒的测定确定的样本中的SM浓度(mg/dL)。
图3是表示使用实施例2的试剂盒的测定中的SM浓度与吸光度之间的关系的图。纵轴表示吸光度(mAbs)，横轴表示SM浓度(mg/dL)。具体实施方式
<SM的测定方法>
本发明的SM测定方法为不需要SM的分离操作的方法。
本发明的SM的测定方法为一种样本中的SM的测定方法，其特征在于，使样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。具体而言，可以列举包括下述步骤的方法。
(1)使样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶反应而生成过氧化氢、甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸的步骤；
(2)消去步骤(1)中生成的过氧化氢的步骤；
(3)使步骤(2)后的反应液中的SM与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶反应而生成过氧化氢的步骤；和
(4)测定步骤(3)中生成的过氧化氢的步骤。
作为上述步骤(1)中的样本，使用SM浓度已知的标准品，通过上述步骤进行测定，制作表示SM浓度与测定值之间的关系的标准曲线后，使用实际的样本，通过上述步骤进行测定，将所得到的测定值与预先制作的标准曲线进行对照，由此，能够确定样本中的SM浓度。
另外，作为步骤(3)中使用的胆碱氧化酶，可以为步骤(1)中使用的胆碱氧化酶，也可以为新添加的胆碱氧化酶。
将通过上述步骤进行的本发明的SM的测定方法的原理图示于表1。
Figure BDA0000462821420000081
上述方法的步骤(1)中，PC通过不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D而转换成胆碱，通过胆碱氧化酶而转换成过氧化氢。另外，LPC通过溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶而转换成甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸。步骤(1)中生成的过氧化氢在步骤(2)中被消去。本发明的测定方法中，过氧化氢的消去是指将由PC生成的过氧化氢转换成对SM的测定不产生影响的物质。过氧化氢的消去例如可以如下进行：使由PC生成的过氧化氢与过氧化氢酶反应而将过氧化氢转换成水，或者，使由PC生成的过氧化氢与过氧化物酶和后述的一对氧化偶合型色原体中的一个反应而转换成无色的物质。
接着，在步骤(3)中，通过不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D，SM转换成胆碱，胆碱进一步通过胆碱氧化酶而转换成过氧化氢。在此，步骤(2)中生成的甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸不与磷脂酶D反应，该磷脂酶D不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应，因此，由在反应液中残留的SM生成过氧化氢。由该SM生成的过氧化氢在步骤(4)中测定。
另外，本发明的SM的测定方法为一种样本中的SM的测定方法，其特征在于，使样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。具体而言，可以列举包括下述步骤的方法。
(1)使样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶反应而生成过氧化氢、还原型辅酶、甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸的步骤；
(2)消去步骤(1)中生成的过氧化氢的步骤；
(3)使步骤(2)后的反应液中的SM与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶和还原型辅酶氧化酶反应而生成过氧化氢和还原型辅酶的步骤；和
(4)测定步骤(3)中生成的过氧化氢的步骤。
作为上述步骤(1)中的样本，使用SM浓度已知的标准品，通过上述步骤进行测定，制作表示SM浓度与测定值之间的关系的标准曲线后，使用实际的样本，通过上述步骤进行测定，将所得到的测定值与预先制作的标准曲线进行对照，由此，能够确定样本中的SM浓度。
另外，作为步骤(3)中使用的胆碱脱氢酶、氧化型辅酶和还原型辅酶氧化酶，可以为步骤(1)中使用的胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶，也可以为新添加的胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶。
将通过上述步骤进行的本发明的SM的测定方法的原理图示于表2。
Figure BDA0000462821420000111
上述方法的步骤(1)中，PC通过不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D转换成胆碱，通过胆碱氧化酶、氧化型辅酶和还原型辅酶氧化酶转换成过氧化氢。另外，LPC通过溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶转换成甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸。步骤(1)中生成的过氧化氢在步骤(2)中被消去。本发明的测定方法中，过氧化氢的消去是指将由PC生成的过氧化氢转换成对SM的测定不产生影响的物质。过氧化氢的消去例如可以如下进行：使由PC生成的过氧化氢与过氧化氢酶反应而将过氧化氢转换成水，或者，使由PC生成的过氧化氢与过氧化物酶和后述的一对氧化偶合型色原体中的一个反应而转换成无色的物质。
接着，在步骤(3)中，通过不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D，SM转换成胆碱，胆碱进一步通过胆碱氧化酶而转换成过氧化氢。在此，步骤(2)中生成的甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸不与磷脂酶D反应，该磷脂酶D不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应，因此，由反应液中残留的SM生成过氧化氢。由该SM生成的过氧化氢在步骤(4)中测定。
在本发明的测定方法中，步骤(1)和步骤(2)可以阶段地进行，也可以同时进行，优选同时进行。步骤(1)和步骤(2)的反应温度通常为10～50℃，优选为20～40℃，反应时间通常为1～60分钟，优选为2～30分钟。
在步骤(2)中使用过氧化氢酶消去步骤(1)中生成的过氧化氢的情况下，步骤(3)的反应优选在过氧化氢酶抑制剂存在下进行。作为过氧化氢酶抑制剂，可以列举例如叠氮化物等。作为叠氮化物，可以列举例如叠氮化锂、叠氮化钠、叠氮化钾等。
在步骤(4)中，可以如下测定步骤(3)中生成的过氧化氢：使其与例如过氧化物酶和后述的无色型色原体或一对氧化偶合型色原体反应，并测定生成的色素的吸光度。特别是在使用过氧化物酶和一对氧化偶合型色原体中的一个进行步骤(1)中生成的过氧化氢的消去的情况下，在步骤(3)的反应中，优选添加另一个氧化偶合型色原体。该情况下，在步骤(4)中，可以如下测定步骤(3)中生成的过氧化氢：使该过氧化氢在过氧化物酶存在下与一对氧化偶合型色原体反应，并测定生成的色素的吸光度。
本发明的测定方法中，步骤(3)和步骤(4)可以阶段地进行，也可以同时进行，优选同时进行。步骤(3)和步骤(4)的反应温度通常为10～50℃，优选为20～40℃，反应时间通常为1～60分钟，优选为2～30分钟。
本发明的测定方法也可以应用于干化学和即时检验(POCT)，优选在后述的水性介质中进行。
另外，使由PC生成的过氧化氢与过氧化物酶和后述的氧化发色型色原体反应而转换成色素，测定反应液的吸光度(A1)，然后，使由SM生成的过氧化氢同样地转换成色素，测定反应液的吸光度(A2)，从吸光度(A2)中减去吸光度(A1)，由此，也可以测定SM。该方法中，也可以使用荧光物质[例如4-羟基苯乙酸、3-(4-羟苯基)丙酸、香豆素等]、发光物质(例如鲁米诺化合物、光泽精化合物等)代替氧化发色型色原体。在使用荧光物质的情况下，通过测定反应液的荧光强度，可以测定SM，另外，在使用发光物质的情况下，通过测定发光强度，可以测定SM。另外，通过用过氧化氢电极测定由PC生成的过氧化氢和由SM生成的过氧化氢，也可以测定SM。这些方法也包括在本发明的测定方法中。
另外，在使用过氧化氢酶进行步骤(2)中的过氧化氢的消去的情况下，在步骤(4)中，也可以如下测定步骤(3)中生成的过氧化氢：使该过氧化氢在过氧化氢酶抑制剂和过氧化物酶存在下与荧光物质或发光物质反应，并测定生成的荧光或发光的强度。作为荧光物质和发光物质，可以列举例如上述的荧光物质和发光物质。
作为本发明中的样本，可以列举例如全血、血浆、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、胰液等，优选血浆和血清。
作为本发明中的不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D，只要是与PC反应但既不与SM反应也不与LPC反应的磷脂酶D，则没有特别限制，可以列举例如来源于动物、植物或微生物的磷脂酶D、通过基因工程的方法制造的磷脂酶D等。作为来源于微生物的磷脂酶D，可以列举例如来源于Streptomyces sp.的磷脂酶D等。另外，作为磷脂酶D，也可以使用市售品。作为市售的磷脂酶D，可以列举例如磷脂酶D(PLDP；旭化成公司制)等。另外，本发明中，也可以组合使用2种以上的、不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D。
作为本发明中的溶血磷脂酶，只要具有相对于LPC的水解活性，则没有特别限制，可以列举例如来源于动物、植物或微生物的溶血磷脂酶、通过基因工程的方法制造的溶血磷脂酶等。另外，作为溶血磷脂酶，也可以使用市售品。作为市售的溶血磷脂酶，可以列举例如溶血磷脂酶(LYPL；旭化成公司制)等。
作为本发明中的单甘油脂肪酶，只要具有相对于LPC的水解活性，则没有特别限制，可以列举例如来源于动物、植物或微生物的单甘油脂肪酶、通过基因工程的方法制造的单甘油脂肪酶等。另外，作为单甘油脂肪酶，也可以使用市售品。作为市售的单甘油脂肪酶，可以列举例如单甘油脂肪酶(MGLP；旭化成公司制)等。
本发明中，也可以组合使用2种以上的、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶。
本反应的SM的测定方法中的、不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的SM的测定的浓度，则没有特别限制，通常为0.001～200000U/L，优选为0.005～100000U/L。
本反应的SM的测定方法中的溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的SM的测定的浓度，则没有特别限制，通常为0.001～200000U/L，优选为0.005～100000U/L。
作为本发明中的胆碱氧化酶，只要是具有将胆碱氧化而生成过氧化氢的能力的酶，则没有特别限制，可以使用例如来源于动物、植物或微生物的胆碱氧化酶，也可以使用通过基因工程的方法制造的胆碱氧化酶等。另外，也可以使用胆碱氧化酶(CLOD；协和发酵公司制)、胆碱氧化酶(CHO-301；东洋纺织公司制)等市售品。本发明中，也可以组合使用2种以上的胆碱氧化酶。
作为本反应的SM的测定方法中的胆碱氧化酶在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的SM的测定的浓度，则没有特别限制，通常为0.001～200000U/L，优选为0.005～20000U/L。
作为本发明中的不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D，只要是不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D，则没有特别限制，可以使用例如来源于动物、植物或微生物的磷脂酶D、具有磷脂酶D活性的脂蛋白脂肪酶，也可以使用通过基因工程的方法制造的磷脂酶D等。作为来源于微生物的磷脂酶D，可以列举例如来源于Streptomyces chromofuscus的磷脂酶D等。另外，作为不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D，也可以使用市售品。作为市售的、不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D，可以列举磷脂酶D(PLD；旭化成公司制)等。另外，本发明中，也可以组合使用2种以上的、不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D。
作为本反应的SM的测定方法中的不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的SM的测定的浓度，则没有特别限制，通常为0.001～500000U/L，优选为0.005～250000U/L。
作为本发明中的胆碱脱氢酶，只要是具有在氧化型辅酶存在下将胆碱氧化而生成还原型辅酶的能力的酶，则没有特别限制，可以使用例如来源于动物、植物或微生物的胆碱脱氢酶，也可以使用通过基因工程的方法制造的胆碱脱氢酶等。另外，本发明中，也可以组合使用2种以上的胆碱脱氢酶。
作为本反应的SM的测定方法中的胆碱脱氢酶在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的SM的测定的浓度，则没有特别限制，通常为0.001～200000U/L，优选为0.005～100000U/L。
作为使用胆碱脱氢酶的测定中使用的氧化型辅酶，可以列举例如NAD(P)+、thio-NAD(P)+等。作为通过胆碱脱氢酶的反应生成的还原型辅酶，可以列举例如NAD(P)H、thio-NAD(P)H等。
作为本发明的SM的测定方法中使用的氧化型辅酶在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的SM的测定的浓度，则没有特别限制，通常为0.01～400毫摩尔/升，优选为0.1～100毫摩尔/升。
作为本发明中的还原型辅酶氧化酶，只要是具有由通过胆碱脱氢酶的反应生成的还原型辅酶来生成过氧化氢的能力的酶，则没有特别限制，可以列举例如NAD(P)H氧化酶等。作为还原型辅酶氧化酶，也可以使用市售品。作为市售的还原型辅酶氧化酶，可以列举NADHoxidase(Cosmobio公司制)等。
作为本发明的SM的测定方法中使用的还原型辅酶氧化酶在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的SM的测定的浓度，则没有特别限制，通常为0.01～400000U/L，优选为0.02～200000U/L。
作为本发明的SM的测定方法中使用的过氧化氢酶，只要是能够将过氧化氢转换成水和氧分子的酶，则没有特别限制，可以使用例如来源于动物、植物或微生物的过氧化氢酶，也可以使用通过基因工程的方法制造的过氧化氢酶等。另外，作为过氧化氢酶，也可以使用市售品。作为市售的过氧化氢酶，可以列举过氧化氢酶(CAT；KIKKOMAN公司制)、过氧化氢酶(CAT―R；KIKKOMAN公司制)、过氧化氢酶牛肝脏来源(Sigma-Aldrich公司制)等。另外，本发明中，也可以组合使用2种以上的过氧化氢酶。
作为本发明的SM的测定方法中使用的过氧化氢酶在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的SM的测定的浓度，则没有特别限制，通常为0.001～1000000U/L，优选为0.01～500000U/L。
作为本发明中使用的水性介质，只要是能够进行本发明的SM的测定方法的水性介质，则没有特别限制，可以列举例如去离子水、蒸留水、缓冲液等，优选缓冲液。作为用于缓冲液的缓冲剂，可以列举例如三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、Good氏缓冲剂等。
作为Good氏缓冲剂，可以列举例如：2-吗啉代乙烷磺酸(MES)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N'-双(2-乙烷磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、3-吗啉代-2-羟基丙烷磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、3-吗啉代丙烷磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸(HEPES)、3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙烷磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙烷磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙烷磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙烷磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙烷磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙烷磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸(CAPS)等。缓冲液的浓度只要是适于测定的浓度，则没有特别限制，通常为0.001～2.0摩尔/升，优选为0.005～1.0摩尔/升。
作为本发明中使用的过氧化物酶，只要是能够进行本发明的SM的测定方法的过氧化物酶，则没有特别限制，可以列举例如来源于西洋山嵛菜的过氧化物酶等。
作为本发明的SM的测定方法中使用的过氧化物酶在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的SM的测定的浓度，则没有特别限制，通常为0.01～500000U/L，优选为1～200000U/L。
作为本发明中使用的SM的测定方法的无色型色原体，只要是能够进行本发明的SM的测定方法的无色型色原体，则没有特别限制。无色型色原体具有在过氧化物酶存在下与过氧化氢反应而单独生成色素的功能。
作为无色型色原体，可以列举例如：10-N-羧甲基氨甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4,4'-双(二甲氨基)二苯基胺钠盐(DA-64)、10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)、4,4'-双(二甲氨基)二苯基胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)等。
作为本发明的SM的测定方法中使用的无色型色原体在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的SM的测定的浓度，则没有特别限制，通常为0.001～5g/L，优选为0.01～1g/L。
作为本发明的SM的测定方法中使用的氧化偶合发色型色原体，只要是能够进行本发明的SM的测定方法的氧化偶合发色型色原体，则没有特别限制。氧化偶合发色型色原体具有在过氧化物酶存在下与过氧化氢反应而生成色素的功能。在生成该色素的反应中，可以使用一对氧化偶合发色型色原体的组合。另一方面，氧化偶合发色型色原体也具有在过氧化物酶存在下与过氧化氢反应而将过氧化氢转换成无色的物质的功能。在将该过氧化氢转换成无色的物质的反应中，可以仅使用一对氧化偶合发色型色原体中的一个。作为一对氧化偶合发色型色原体的组合，可以列举偶合剂与苯胺类的组合、偶合剂与酚类的组合。
作为偶合剂，可以列举例如4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮肼等。
作为苯胺类，可以列举：N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3.5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N,N-二甲基-3-甲基苯胺、N,N-二(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N'-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N'-乙酰基乙二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3,5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。
作为酚类，可以列举苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
作为本发明的SM的测定方法中使用的氧化偶合发色型色原体在反应液中的浓度，只要是能够进行本发明的SM的测定的浓度，则没有特别限制，通常为0.001～5g/L，优选为0.01～1g/L。
<SM测定用试剂盒>
本发明的SM测定用试剂盒用于本发明的SM的测定方法。作为本发明的SM测定用试剂盒，可以列举例如双试剂型试剂盒、三试剂型试剂盒等，优选由第一试剂和第二试剂构成的双试剂型试剂盒。
本发明的SM测定用试剂盒可以为冷冻干燥后的状态，也可以为溶于水性介质后的状态。使用冷冻干燥后的状态的试剂盒测定样本中的SM的情况下，可在测定前溶解到水性介质中后使用。作为水性介质，可以列举例如上述的水性介质等。
在本发明的SM测定用试剂盒中，可以使用上述的不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶、不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化氢酶、过氧化氢酶抑制剂、无色型色原体、氧化偶合发色型色原体。
在由第一试剂和第二试剂构成的双试剂型SM测定用试剂盒中，不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D包含在第一试剂中。溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶包含在第一试剂中。不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D包含在第二试剂中。胆碱氧化酶包含在第一试剂中，但在第二试剂中也可以含有。胆碱脱氢酶包含在第一试剂中，但在第二试剂中也可以含有。氧化型辅酶包含在第一试剂中，但在第二试剂中也可以含有。还原型辅酶氧化酶包含在第一试剂中，但在第二试剂中也可以含有。过氧化氢酶包含在第一试剂中。过氧化氢酶抑制剂包含在第二试剂中。过氧化物酶包含在第一试剂中，但在第二试剂中也可以含有。无色型色原体包含在第二试剂中。在过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体中的一个存在下进行过氧化氢的消去的情况下，一对氧化偶合发色型色原体中的一个包含在第一试剂中。在过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体存在下进行过氧化氢的测定的情况下，优选一对氧化偶合发色型色原体中的一个包含在第一试剂中、另一个包含在第二试剂中的方式。
本发明的SM测定用试剂盒中的不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D在第一试剂中的浓度通常为0.002～400000U/L，优选为0.01～200000U/L。在冷冻干燥后的状态的SM测定用试剂盒中，不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D在第一试剂中的含量为用水性介质溶解后的状态下的浓度达到通常0.002～400000U/L、优选0.01～200000U/L的含量。
本发明的SM测定用试剂盒中的溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶在第一试剂中的浓度通常为0.002～400000U/L，优选为0.01～200000U/L。在冷冻干燥后的状态的SM测定用试剂盒中，溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶在第一试剂中的含量为用水性介质溶解后的状态下的浓度达到通常0.002～400000U/L、优选0.01～200000U/L的含量。
本发明的SM测定用试剂盒中的胆碱氧化酶在第一试剂中的浓度通常为0.002～400000U/L，优选为0.01～200000U/L。在冷冻干燥后的状态的SM测定用试剂盒中，胆碱氧化酶在第一试剂中的含量为用水性介质溶解后的状态下的浓度达到通常0.002～400000U/L、优选0.01～200000U/L的含量。
本发明的SM测定用试剂盒中的不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D在第二试剂中的浓度通常为0.004～800000U/L，优选为0.02～400000U/L。在冷冻干燥后的状态的SM测定用试剂盒中，不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D在第二试剂中的含量为用水性介质溶解后的状态下的浓度达到通常0.004～800000U/L、优选0.02～400000U/L的含量。
本发明的SM测定用试剂盒中的胆碱脱氢酶在第一试剂中的浓度通常为0.002～400000U/L，优选为0.01～200000U/L。在冷冻干燥后的状态的SM测定用试剂盒中，胆碱脱氢酶在第一试剂中的含量为用水性介质溶解后的状态下的浓度达到通常0.002～400000U/L、优选0.01～200000U/L的含量。
本发明的SM测定用试剂盒中的氧化型辅酶在第一试剂中的浓度通常为0.02～800毫摩尔/升，优选为0.2～200毫摩尔/升。在冷冻干燥后的状态的SM测定用试剂盒中，氧化型辅酶在第一试剂中的含量为用水性介质溶解后的状态下的浓度达到通常0.02～800毫摩尔/升、优选0.2～200毫摩尔/升的含量。
本发明的SM测定用试剂盒中的还原型辅酶氧化酶在第一试剂中的浓度通常为0.02～800000U/L，优选为0.04～400000U/L。在冷冻干燥后的状态的SM测定用试剂盒中，还原型辅酶氧化酶在第一试剂中的含量为用水性介质溶解后的状态下的浓度达到通常0.02～800000U/L、优选0.04～400000U/L的含量。
本发明的SM测定用试剂盒中的过氧化氢酶在第一试剂中的浓度通常为0.002～1500000U/L，优选为0.02～750000U/L。在冷冻干燥后的状态的SM测定用试剂盒中，过氧化氢酶在第一试剂中的含量为用水性介质溶解后的状态下的浓度达到通常0.002～1500000U/L、优选0.02～750000U/L的含量。
本发明的SM测定用试剂盒中的过氧化物酶在第一试剂中的浓度通常为0.01～500000U/L，优选为1～200000U/L。在冷冻干燥后的状态的SM测定用试剂盒中，过氧化物酶在第一试剂中的含量为用水性介质溶解后的状态下的浓度达到通常0.01～500000U/L、优选1～200000U/L的含量。
本发明的SM测定用试剂盒中的无色型色原体在第二试剂中的浓度通常为0.002～7.5g/L，优选为0.02～1.5g/L。在冷冻干燥后的状态的SM测定用试剂盒中，无色型色原体在第二试剂中的含量为用水性介质溶解后的状态下的浓度达到通常0.002～7.5g/L、优选0.02～1.5g/L的含量。
本发明的SM测定用试剂盒中的氧化偶合发色型色原体在第一试剂和第二试剂中的浓度通常为0.002～7.5g/L，优选为0.02～1.5g/L。在冷冻干燥后的状态的SM测定用试剂盒中，氧化偶合发色型色原体在第一试剂和第二试剂中的含量为用水性介质溶解后的状态下的浓度达到通常0.002～7.5g/L、优选0.02～1.5g/L的含量。
在本发明的SM测定用试剂盒中，根据需要可以含有水性介质、稳定剂、防腐剂、干扰物质的影响抑制剂、反应促进剂、表面活性剂等。作为水性介质，可以列举例如上述的水性介质等。作为稳定剂，可以列举例如：乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙、甘氨酸、谷氨酸钠、色氨酸等。作为防腐剂，可以列举例如叠氮化钠、抗生素、BIOACE等。作为干扰物质的影响抑制剂，可以列举例如：用于抑制抗坏血酸的影响的抗坏血酸氧化酶、用于抑制胆红素的影响的亚铁氰化物等。作为反应促进剂，可以列举例如共脂肪酶等酶、硫酸钠、氯化钠等盐类等。作为表面活性剂，可以列举例如非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、两性表面活性剂等。作为非离子型表面活性剂，可以列举例如聚氧乙烯系表面活性剂等。
以下，记载了本发明的SM测定用试剂盒的具体方式，但本发明的SM测定用试剂盒不限于这些。
试剂盒1
第一试剂
不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶
第二试剂
不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、过氧化氢酶抑制剂、无色型色原体
试剂盒2
第一试剂
不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶
第二试剂
不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、胆碱氧化酶、过氧化氢酶抑制剂、无色型色原体
试剂盒3
第一试剂
不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶
第二试剂
不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、过氧化氢酶抑制剂、无色型色原体
试剂盒4
第一试剂
不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶
第二试剂
不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化氢酶抑制剂、无色型色原体
试剂盒5
第一试剂
不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶、一对氧化偶合发色型色原体中的一个
第二试剂
不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、一对氧化偶合发色型色原体中的另一个
试剂盒6
第一试剂
不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶、一对氧化偶合发色型色原体中的一个
第二试剂
不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、胆碱氧化酶、一对氧化偶合发色型色原体中的另一个
试剂盒7
第一试剂
不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化物酶、一对氧化偶合发色型色原体中的一个
第二试剂
不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、一对氧化偶合发色型色原体中的另一个
试剂盒8
第一试剂
不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化物酶、一对氧化偶合发色型色原体中的一个
第二试剂
不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶、一对氧化偶合发色型色原体中的另一个
试剂盒9
第一试剂
不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶、一对氧化偶合发色型色原体中的一个
第二试剂
不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、过氧化物酶、一对氧化偶合发色型色原体中的另一个
试剂盒10
第一试剂
不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶、一对氧化偶合发色型色原体中的一个
第二试剂
不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、胆碱氧化酶、过氧化物酶、一对氧化偶合发色型色原体中的另一个
试剂盒11
第一试剂
不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化物酶、一对氧化偶合发色型色原体中的一个
第二试剂
不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、过氧化物酶、一对氧化偶合发色型色原体中的另一个
试剂盒12
第一试剂
不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化物酶、一对氧化偶合发色型色原体中的一个
第二试剂
不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化物酶、一对氧化偶合发色型色原体中的另一个
以下，通过实施例更加详细地说明本发明，这些实施例对本发明的范围没有任何限定。另外，在本实施例和参考例中，使用下述制造商的试剂和酶。
PIPES(同仁化学研究所公司制)、EMSE(ダイトーケミックス公司制)、氯化钙二水合物(和光纯药工业公司制)、4-AA(埼京化成公司制)、过氧化物酶(POD；东洋纺织公司制)、过氧化氢酶(KIKKOMAN公司制)、CLOD(胆碱氧化酶；协和发酵公司制)、叠氮化钠(和光纯药工业公司制)、MGLP(单甘油脂肪酶；旭化成公司制)、PLDP(旭化成公司制)、PLD(旭化成公司制)、磷脂酰胆碱(Sigma-Aldrich公司制)、溶血磷脂酰胆碱(Sigma-Aldrich公司制)、SM(Sigma-Aldrich公司制)、TritonX-100(聚氧乙烯系表面活性剂：Sigma-Aldrich公司制)。
实施例1
对于PC、LPC和SM各磷脂，通过以下的方法研究对(1)PLDP、(2)PLD和(3)MGLP各酶的反应性。
<试剂盒>
制备表3所示的、由以下的第一试剂和第二试剂构成的试剂盒(试剂盒A～F)。
Figure BDA0000462821420000281
表3
Figure BDA0000462821420000291
<样本>
使用生理盐水、SM标准溶液(SM浓度：100mg/dL)、PC标准溶液(PC浓度：100mg/dL)、LPC标准溶液(LPC浓度：100mg/dL)作为样本。
<使用试剂盒A的测定～对标准溶液的吸光度>
作为样本，使用生理盐水(磷脂：0.0mg/dL)和SM标准溶液，作为试剂盒，使用试剂盒A，通过日立7170S型自动分析机，利用以下的方法确定对SM标准溶液的“吸光度”。
向反应池中添加生理盐水(2.5μL)和第一试剂(240μL)，在37℃下加热5分钟，在主波长600nm、副波长700nm处测定该反应液的吸光度(E1生理盐水)，接着，向该反应液中添加第二试剂(80μL)，进一步在37℃下加热5分钟，然后，在主波长600nm、副波长700nm处测定反应液的吸光度(E2生理盐水)。将从E2生理盐水减去E1生理盐水后得到的值作为ΔE生理 盐水。
作为样本，使用SM标准溶液代替生理盐水，除此以外，与上述进行同样的反应，从E2SM减去E1SM，得到ΔESM。如式(I)所示，将从ΔESM减去上述ΔE生理盐水而得到的值作为对SM标准溶液的“吸光度”(A)。
对SM标准溶液的“吸光度”(A)=ΔESM-ΔE生理盐水   (I)
分别使用PC标准溶液和LPC标准溶液代替SM标准溶液，同样地进行操作，确定对PC标准溶液的“吸光度”(A)和对LPC标准溶液的“吸光度”(A)。
<使用试剂盒B～F的测定～对标准溶液的吸光度>
分别使用试剂盒B～F代替试剂盒A，确定各试剂盒的对各标准溶液的“吸光度”。将各试剂盒的对各标准溶液的“吸光度”示于图1。
由图1判断如下。首先，在使用试剂盒A的情况下，对于任意一种磷脂均没有得到“吸光度”，因此可知，任意一种磷脂都不与胆碱氧化酶反应。由使用试剂盒B的反应可知，PLDP与PC发生特异性反应，生成胆碱。由使用试剂盒C的反应可知，PLD与任意一种磷脂都发生反应，生成胆碱。
由使用试剂盒D的反应可知，对于任意一种磷脂，通过与MGLP的反应都不生成胆碱。
在使用试剂盒E的情况下，可知仅PC生成胆碱。由与使用试剂盒B的反应的比较可知，PC不与MGLP反应，而与PLDP反应，生成胆碱。另外可知，由LPC没有得到“吸光度”，因此，通过LPC与MGLP的反应生成的甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸不与PLDP反应，没有生成胆碱。
由使用试剂盒F的反应可知，在PC和SM的情况下，生成胆碱。由与使用试剂盒C的反应的比较可知，PC和SM不与MGLP反应，而与PLD反应，生成胆碱。另一方面可知，由LPC没有得到“吸光度”，因此，LPC与MGLP反应而生成的甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸不与PLD反应，没有生成胆碱。
因此判明，通过使PLDP作用于包含PC、LPC和SM的样本，仅PC与PLDP反应，将生成的胆碱转换成过氧化氢后消去的同时，使MGLP作用于残留的LPC和SM，然后，使PLD发挥作用，由此，仅LPC与MGLP反应，生成的甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸不与PLD反应，因此，仅样本中的SM与PLD反应，生成胆碱，测定通过该胆碱生成的过氧化氢，由此能够仅对SM进行测定。
实施例2
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的SM测定用试剂盒。
Figure BDA0000462821420000311
实施例3
作为实施例2的测定用试剂盒和对照试剂盒，使用鞘磷脂检测试剂盒(Sphingomyelin Assay Kit)(Cayman Chemical Company公司制)，按照以下顺序确定人血清28个样本的各样本中的SM浓度。
(1)标准曲线的制作
作为标准溶液，使用生理盐水(SM：0.0mg/dL)和判断SM浓度为35.0mg/dL的标准血清，作为试剂盒，使用实施例2的试剂盒，通过日立7170S型自动分析机，制作表示SM浓度与“吸光度”的关系的标准曲线。
在此，所述“吸光度”表示以在以下的反应中测定的2个吸光度(E1和E2)为基础并从E2减去E1而得到的值。
向反应池中添加标准溶液(2.5μL)和第一试剂(240μL)，在37℃下加热5分钟，在主波长600nm、副波长700nm处测定该反应液的吸光度(E1)，接着，向该反应液中添加第二试剂(80μL)，进一步在37℃下加热5分钟后，在主波长600nm、副波长700nm处测定反应液的吸光度(E2)。
(2)利用人血清样本的“吸光度”的测定
在(1)的标准曲线制作中，使用人血清样本(28个样本)代替标准溶液，除此以外，与(1)的“吸光度”计算方法进行同样的操作，测定该样本的各样本中的“吸光度”。
(3)人血清样本中的SM浓度的确定
由(2)中测定的“吸光度”和(1)中制作的标准曲线，测定各样本中的SM浓度。
(4)利用对照试剂盒的SM浓度的确定
根据对照试剂盒的使用说明书，使用对照试剂盒，同样确定人血清28个样本中的SM浓度。
由通过使用对照试剂盒的测定确定的各样本中的SM浓度(x)和通过使用实施例2的试剂盒的测定确定的各样本中的SM浓度(y)，对使用对照试剂盒的测定与使用实施例2的试剂盒的测定之间的相关性进行研究，结果，得到图2所示的相关图。如该相关图所示，在x与y之间，式(II)所示的关系成立，相关系数(r)达到0.8445，判明了两个测定之间具有良好的相关关系。
y=1.1911*x-2.2176   (II)
实施例4
使用SM标准溶液(SM浓度：100mg/dL)，制备10个阶段的稀释系列，对于各稀释样本，通过与实施例3同样的方法，测定吸光度。将该结果示于图3。
由图3可知，通过使用实施例2的试剂盒的测定，在SM浓度与吸光度之间得到非常良好的直线性。
实施例5
使用实施例2的试剂盒，研究相对于SM的特异性。作为样本，使用生理盐水、SM标准溶液(SM浓度：100mg/dL)、PC标准溶液(PC浓度：100mg/dL)、LPC标准溶液(LPC浓度：100mg/dL)，通过实施例3的方法，测定对各样本的“吸光度”。
另一方面，使用作为磷脂测定用试剂盒的“デタミナーL PL”(协和梅迪克斯公司制)代替实施例2的试剂盒，通过与实施例3同样的方法，测定对各样本的“吸光度”。将测定结果示于表4。
表4
Figure BDA0000462821420000341
由表4可知，在使用“デタミナーL PL”的测定中，SM、PC、LPC所有磷脂都发生了反应，但在使用实施例2的试剂盒的测定中，仅SM发生了反应。因此确认，实施例2的试剂盒为特异性地测定SM的试剂盒。
产业上的可利用性
根据本发明，能提供对动脉硬化等的诊断有效的血液中的SM的测定方法和测定用试剂盒。

Claims (17)

1.一种样本中的鞘磷脂的测定方法，其特征在于，使样本与不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。
2.一种样本中的鞘磷脂的测定方法，其特征在于，使样本与不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。
3.如权利要求1所述的方法，其中，在过氧化氢酶存在下进行样本与不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶的反应，在过氧化氢酶抑制剂存在下进行样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶的反应。
4.如权利要求2所述的方法，其中，在过氧化氢酶存在下进行样本与不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶的反应，在过氧化氢酶抑制剂存在下进行样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶的反应。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中，过氧化氢酶抑制剂为叠氮化物。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中，在过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体中的一个存在下进行过氧化氢的消去，在过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体存在下进行过氧化氢的测定。
7.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，在过氧化物酶和无色型色原体存在下进行过氧化氢的测定。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D为来源于链霉菌(Streptomyces sp.)的磷脂酶D。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D为来源于色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)的磷脂酶D。
10.一种样本中的鞘磷脂测定用试剂盒，其特征在于，包含：含有不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶和过氧化氢酶的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D和过氧化氢酶抑制剂的第二试剂。
11.一种样本中的鞘磷脂测定用试剂盒，其特征在于，包含：含有不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体中的一个的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D和氧化偶合发色型色原体中的另一个的第二试剂。
12.一种样本中的鞘磷脂测定用试剂盒，其特征在于，包含：含有不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶和过氧化氢酶的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D和过氧化氢酶抑制剂的第二试剂。
13.一种样本中的鞘磷脂测定用试剂盒，其特征在于，包含：含有不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、胆碱脱氢酶、氧化型辅酶、还原型辅酶氧化酶、过氧化物酶和一对氧化偶合发色型色原体中的一个的第一试剂；以及含有不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D和氧化偶合发色型色原体中的另一个的第二试剂。
14.如权利要求10或12所述的试剂盒，其中，过氧化氢酶抑制剂为叠氮化物。
15.如权利要求10、12或14所述的试剂盒，其中，过氧化物酶和无色型色原体分别包含在第一试剂和第二试剂中。
16.如权利要求10～15中任一项所述的试剂盒，其中，不与鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱反应而与磷脂酰胆碱反应的磷脂酶D为来源于链霉菌(Streptomyces sp.)的磷脂酶D。
17.如权利要求10～16中任一项所述的试剂盒，其中，不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与鞘磷脂反应的磷脂酶D为来源于色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)的磷脂酶D。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106404683A (zh) * 2015-07-27 2017-02-15 山东博科生物产业有限公司 一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法
CN109827915A (zh) * 2019-03-12 2019-05-31 闫宏涛 一种测定磷含量的双组分检测剂
CN111982841A (zh) * 2020-07-06 2020-11-24 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种游离脂肪酸检测试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101356283A (zh) * 2005-12-15 2009-01-28 纽约州立大学研究基金会 用于测量血浆和组织鞘磷脂和磷脂酰胆碱的酶促方法
JP2009023897A (ja) * 2006-12-27 2009-02-05 Nippon Shokubai Co Ltd ヘテロポリオキソメタレート化合物およびその製造方法
CN101896620A (zh) * 2007-10-10 2010-11-24 电化生研株式会社 定量测定小而密ldl胆固醇的方法和试剂盒

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4141792A (en) * 1976-08-19 1979-02-27 Hiroaki Hayashi Composition and method for the quantitative determination of phospholipids
JP3464234B2 (ja) * 1992-12-28 2003-11-05 日本化薬株式会社 酵素固定化用担体および固定化酵素
JPH06197793A (ja) * 1992-12-28 1994-07-19 Nippon Kayaku Co Ltd 微量成分の定量法
JPH0923897A (ja) * 1995-07-13 1997-01-28 Nippon Kayaku Co Ltd Ｄ−ソルビトールの測定方法およびそのリアクター
WO2001080903A1 (en) * 2000-04-19 2001-11-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Detection and treatment of atherosclerosis based on plasma sphingomyelin concentration

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101356283A (zh) * 2005-12-15 2009-01-28 纽约州立大学研究基金会 用于测量血浆和组织鞘磷脂和磷脂酰胆碱的酶促方法
JP2009023897A (ja) * 2006-12-27 2009-02-05 Nippon Shokubai Co Ltd ヘテロポリオキソメタレート化合物およびその製造方法
CN101896620A (zh) * 2007-10-10 2010-11-24 电化生研株式会社 定量测定小而密ldl胆固醇的方法和试剂盒

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106404683A (zh) * 2015-07-27 2017-02-15 山东博科生物产业有限公司 一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法
CN109827915A (zh) * 2019-03-12 2019-05-31 闫宏涛 一种测定磷含量的双组分检测剂
CN111982841A (zh) * 2020-07-06 2020-11-24 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种游离脂肪酸检测试剂盒

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