JPWO2013018609A1 - スフィンゴミエリンの測定方法及び測定用キット - Google Patents

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Abstract

検体中のスフィンゴミエリンを簡便かつ正確に測定するための方法、及び、キットを提供することにある。検体を、スフィンゴミエリン及びリゾホスファチジルコリンとは反応せず、ホスファチジルコリンとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、及び、コリン酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を消去し、次いで、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、スフィンゴミエリンとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、コリン酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中のスフィンゴミエリンの測定方法。

Description

本発明は、スフィンゴミエリンの測定方法及び測定用キットに関する。
血液中には、高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬと略記する）、低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬと略記する）、カイロミクロン（以下、ＣＭと略記する）等のリポ蛋白が含まれている。各リポ蛋白は、コレステロール、トリグリセライド、リン脂質、蛋白質等の構成成分の割合が異なっており、生体内で異なる作用を有する。リポ蛋白には、主に３種類のリン脂質、すなわち、ホスファチジルコリン（以下、ＰＣと略記する）、リゾホスファチジルコリン（以下、ＬＰＣと略記する）、スフィンゴミエリン（以下、ＳＭと略記する）が含まれている。
これら３種類のリン脂質の中では、ＰＣ及びＳＭが主要なリン脂質であり、それぞれ全リン脂質の約７割及び２割を占めている。ＳＭは、ヒト及び動物モデルのアテロームに蓄積することが知られている。ヒトの動脈硬化巣に存在するＬＤＬには、血漿中のＬＤＬと比べて、ＳＭが多量に含有されている（非特許文献１）。
一方、ヒトの臨床研究においても、血漿中のＳＭ、及びＳＭ／ＰＣ比率が、虚血性心疾患に対する独立した危険因子であることが示されている（非特許文献２〜４）。
これまでに、ＳＭの測定方法としては、薄層クロマトグラフィーを用いる方法や高速液体クロマトグラフィーを用いる方法（非特許文献５）が報告されているが、操作が煩雑で測定に長時間を要する等の欠点を有している。また、細菌由来のスフィンゴミリナーゼを利用した酵素的測定法も報告されている（特許文献１、非特許文献２）。本測定法は、スフィンゴミエリンを細菌のスフィンゴミエリナーゼにより、ホスホリルコリン及びｎ−アシルスフィンゴシンに加水分解し、生成したホスホリルコリンをアルカリ性ホスファターゼによりコリンに加水分解して、生成したコリンをコリンオキシダーゼと反応させ、生成した過酸化水素を測定することにより、スフィンゴミエリンを測定する方法である。しかしながら、本測定法は、アルカリ性ホスファターゼの使用に起因する、他の測定項目の測定への影響や、スフィンゴミエリナーゼがＳＭと共に、ＬＰＣにも反応するという特異性等の問題を有している（非特許文献６）。
特表２００９−５１９７１３号公報
Circulation, Vol. 110(22), p. 3465-3471 (2004). Arterioscler Thromb Vasc Biol., Vol. 20, p. 2614-2618 (2000). Nutrition & Metabolism, Vol. 3, p. 5 (2006). Am. J. Epidemiol., Vol. 163, p. 903-912 (2006). Dairy Sci., Vol. 88, p. 482-488 (2005). Biol. Pharm. Bull. Vol. 27, p. 1725-1729 (2004).
本発明の目的は、検体中のＳＭを簡便かつ正確に測定するための方法、及び、キットを提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行い、ＰＣ、ＬＰＣ及びＳＭを含有する検体中のＳＭを選択的に測定する方法において、ＬＰＣをリゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼと反応させて生成する、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応しないが、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤを用いることにより、ＳＭを特異的に測定することができることを見出して本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の[１]〜[１７]に関する。
［１］ 検体を、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、及び、コリン酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を消去し、次いで、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、コリン酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中のＳＭの測定方法。
［２］ 検体を、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、酸化型補酵素、コリン脱水素酵素、及び、還元型補酵素酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を消去し、次いで、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、酸化型補酵素、コリン脱水素酵素、及び、還元型補酵素酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中のＳＭの測定方法。
［３］ 検体と、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、及び、コリン酸化酵素との反応をカタラーゼの存在下に行い、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、コリン酸化酵素の反応をカタラーゼ阻害剤の存在下に行う、［１］記載の方法。
［４］ 検体と、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、酸化型補酵素、コリン脱水素酵素、及び、還元型補酵素酸化酵素との反応をカタラーゼの存在下に行い、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、酸化型補酵素、コリン脱水素酵素、及び、還元型補酵素酸化酵素の反応をカタラーゼ阻害剤の存在下に行う、［２］記載の方法。
［５］ カタラーゼ阻害剤が、アジ化物である［３］又は［４］記載の方法。
［６］ 過酸化水素の消去をペルオキシダーゼ、及び、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方の存在下に行い、過酸化水素の測定をペルオキシダーゼ、及び、一対の酸化カップリング発色型色原体の存在下に行う、［１］又は［２］記載の方法。
［７］ 過酸化水素の測定をペルオキシダーゼ、及び、ロイコ型色原体の存在下に行う、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［８］ ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤが、Streptomyces sp.由来のホスホリパーゼＤである、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤが、Streptomyces chromofuscus由来のホスホリパーゼＤである、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］ ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン酸化酵素、及び、カタラーゼを含む第１試薬と、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、カタラーゼ阻害剤を含む第２試薬とを含むことを特徴とする、検体中のＳＭ測定用キット。
［１１］ ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン酸化酵素、ペルオキシダーゼ、及び、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方を含む第１試薬と、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、酸化カップリング発色型色原体のもう一方を含む第２試薬とを含むことを特徴とする、検体中のスフィンゴミエリン測定用キット。
［１２］ ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素、及び、カタラーゼを含む第１試薬と、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、カタラーゼ阻害剤を含む第２試薬とを含むことを特徴とする、検体中のスフィンゴミエリン測定用キット。
［１３］ ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素、ペルオキシダーゼ、及び、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方を含む第１試薬と、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、スフィンゴミエリンとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、酸化カップリング発色型色原体のもう一方を含む第２試薬とを含むことを特徴とする、検体中のＳＭ測定用キット。
［１４］ カタラーゼ阻害剤が、アジ化物である［１０］又は［１２］記載のキット。
［１５］ ペルオキシダーゼとロイコ型色原体が、それぞれ、第１試薬及び第２試薬の別々の試薬に含まれる、［１０］、［１２］又は［１４］記載のキット。
［１６］ ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤが、Streptomyces sp.由来のホスホリパーゼＤである、［１０］〜［１５］のいずれかに記載のキット。
［１７］ グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤが、Streptomyces chromofuscus由来のホスホリパーゼＤである、［１０］〜［１６］のいずれかに記載のキット。
本発明により、検体中のＳＭを簡便かつ正確に測定するための方法及びキットが提供される。
実施例１のキット（キットＡ〜Ｆ）におけるＳＭ、ＬＰＣ及びＰＣの各リン脂質の標準液に対する「吸光度」を示す図である。縦軸は吸光度(mAbs)を、横軸は各キット（キットＡ〜Ｆ）を表す。□はＳＭを、■はＰＣを、囲み点線はＬＰＣを表す。 実施例２のキットを用いた測定と、対照キットを用いた測定との間の相関図を示す。縦軸は実施例２を用いた測定により決定された検体中のＳＭ濃度(mg/dL)を、横軸は対照キットを用いた測定により決定された検体中のＳＭ濃度(mg/dL)を表す。 実施例２のキットを用いた測定における、ＳＭ濃度と吸光度との間の関係を示すグラフである。縦軸は吸光度(mAbs)を、横軸はＳＭ濃度(mg/dL)を表す。
＜ＳＭの測定方法＞
本発明のＳＭ測定方法は、ＳＭの分離操作を必要としない方法である。
本発明のＳＭの測定方法は、検体を、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、及び、コリン酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を消去し、次いで、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、コリン酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中のＳＭの測定方法である。具体的には、下記の工程を含む方法が挙げられる。
（１）検体を、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、及び、コリン酸化酵素と反応させ、過酸化水素、グリセロール−３−ホスホリルコリン、及び、遊離脂肪酸を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した過酸化水素を消去する工程；
（３）工程（２）後の反応液中のＳＭを、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、コリン酸化酵素と反応させ、過酸化水素を生成させる工程；及び、
（４）工程（３）で生成した過酸化水素を測定する工程。
上記工程（１）における検体として、ＳＭ濃度が既知である標準品を用いて、上記工程により測定を行い、ＳＭ濃度と測定値との間の関係を示す検量線を作成した後、実際の検体を用いて、上記工程により測定を行い、得られた測定値を先に作成した検量線に照らし合わせることにより、検体中のＳＭ濃度を決定することができる。
また、工程（３）で使用されるコリン酸化酵素としては、工程（１）で使用されるコリン酸化酵素でも、あらたに添加されるコリン酸化酵素でもよい。
上記工程による本発明のＳＭの測定方法の原理図を第１表に示す。
Figure 2013018609
上記方法の工程（１）において、ＰＣは、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤによりコリンに変換され、コリン酸化酵素により過酸化水素に変換される。また、ＬＰＣは、リゾホスホリパーゼ又はモノグリセロリパーゼによりグリセロール−３−ホスホリルコリンと遊離脂肪酸に変換される。工程（１）で生成した過酸化水素は、工程（２）において消去される。本発明の測定方法において、過酸化水素の消去とは、ＰＣから生成した過酸化水素を、ＳＭの測定に影響を及ぼさない物質に変換することを意味する。過酸化水素の消去は、例えばＰＣから生成した過酸化水素をカタラーゼと反応させ、過酸化水素を水に変換することによって、あるいは、ＰＣから生成した過酸化水素をペルオキシダーゼと後述の一対の酸化カップリング型色原体の一方と反応させて無色の物質に変換することによって行うことができる。
次に、工程（３）において、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤにより、ＳＭはコリンに変換され、コリンはさらにコリン酸化酵素により過酸化水素に変換される。ここで、工程（２）で生じたグリセロール−３−ホスホリルコリンと遊離脂肪酸は、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤとは反応しないため、反応液中に残存するＳＭから過酸化水素が生じることになる。このＳＭから生じた過酸化水素が工程（４）で測定される。
また、本発明のＳＭの測定方法は、検体を、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、酸化型補酵素、コリン脱水素酵素、及び、還元型補酵素酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を消去し、次いで、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、酸化型補酵素、コリン脱水素酵素、及び、還元型補酵素酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中のＳＭの測定方法である。具体的には、下記の工程を含む方法が挙げられる。
（１）検体を、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、酸化型補酵素、コリン脱水素酵素、及び、還元型補酵素酸化酵素と反応させ、過酸化水素、還元型補酵素、グリセロール−３−ホスホリルコリン、及び、遊離脂肪酸を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した過酸化水素を消去する工程；
（３）工程（２）後の反応液中のＳＭを、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、酸化型補酵素、コリン脱水素酵素、及び、還元型補酵素酸化酵素と反応させ、過酸化水素及び還元型補酵素を生成させる工程；及び、
（４）工程（３）で生成した過酸化水素を測定する工程。
上記工程（１）における検体として、ＳＭ濃度が既知である標準品を用いて、上記工程により測定を行い、ＳＭ濃度と測定値との間の関係を示す検量線を作成した後、実際の検体を用いて、上記工程により測定を行い、得られた測定値を先に作成した検量線に照らし合わせることにより、検体中のＳＭ濃度を決定することができる。
また、工程（３）で使用されるコリン脱水素酵素、酸化型補酵素、及び、還元型補酵素酸化酵素としては、工程（１）で使用されるコリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素でも、あらたに添加されるものでもよい。
上記工程による本発明のＳＭの測定方法の原理図を第２表に示す。
Figure 2013018609
上記方法の工程（１）において、ＰＣは、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤによりコリンに変換され、コリン酸化酵素、酸化型補酵素及び還元型補酵素酸化酵素により過酸化水素に変換される。また、ＬＰＣは、リゾホスホリパーゼ又はモノグリセロリパーゼによりグリセロール−３−ホスホリルコリンと遊離脂肪酸に変換される。工程（１）で生成した過酸化水素は、工程（２）において消去される。本発明の測定方法において、過酸化水素の消去とは、ＰＣから生成した過酸化水素を、ＳＭの測定に影響を及ぼさない物質に変換することを意味する。過酸化水素の消去は、例えばＰＣから生成した過酸化水素をカタラーゼと反応させ、過酸化水素を水に変換することによって、あるいは、ＰＣから生成した過酸化水素をペルオキシダーゼと後述の一対の酸化カップリング型色原体の一方と反応させて無色の物質に変換することによって行うことができる。
次に、工程（３）において、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤにより、ＳＭはコリンに変換され、コリンはさらにコリン酸化酵素により過酸化水素に変換される。ここで、工程（２）で生じたグリセロール−３−ホスホリルコリンと遊離脂肪酸は、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤとは反応しないため、反応液中に残存するＳＭから過酸化水素が生じることになる。このＳＭから生じた過酸化水素が工程（４）で測定される。
本発明の測定方法において、工程（１）と工程（２）は、段階的に行うことも、同時に行うこともできるが、同時に行うことが好ましい。工程（１）と工程（２）の反応温度は、通常、10〜50℃であり、20〜40℃が好ましく、反応時間は、通常、1〜60分間であり、2〜30分間が好ましい。
工程（２）において、工程（１）で生成した過酸化水素をカタラーゼを用いて消去する場合、工程（３）の反応はカタラーゼ阻害剤の存在下で行うことが好ましい。カタラーゼ阻害剤としては、例えばアジ化物等が挙げられる。アジ化物としては、例えばアジ化リチウム、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム等が挙げられる。
工程（４）において、工程（３）で生成した過酸化水素は、例えばペルオキシダーゼと、後述のロイコ型色原体又は一対の酸化カップリング型色原体と反応させ、生成した色素の吸光度を測定することにより測定することができる。特に、工程（１）で生成した過酸化水素の消去を、ペルオキシダーゼと一対の酸化カップリング型色原体の一方とを用いて行う場合には、工程（３）の反応において、もう一方の酸化カップリング型色原体を添加することが好ましい。この場合、工程（３）で生成した過酸化水素は、工程（４）において、当該過酸化水素を、ペルオキシダーゼ存在下、一対の酸化カップリング型色原体と反応させ、生成した色素の吸光度を測定することにより、測定することができる。
本発明の測定方法において、工程（３）と工程（４）は、段階的に行うことも、同時に行うこともできるが、同時に行うことが好ましい。工程（３）と工程（４）の反応温度は、通常、10〜50℃であり、20〜40℃が好ましく、反応時間は、通常、1〜60分間であり、2〜30分間が好ましい。
本発明の測定方法は、ドライケミストリーやポイントオブケアテスティング(POCT)にも適用できるが、後述の水性媒体中で行われることが好ましい。
尚、ＰＣから生成した過酸化水素をペルオキシダーゼと後述の酸化発色型色原体と反応させて色素に変換し、反応液の吸光度（Ａ１）を測定した後、ＳＭから生成した過酸化水素を同様に色素に変換し、反応液の吸光度（Ａ２）を測定し、吸光度（Ａ２）から吸光度（Ａ１）を差し引くことにより、ＳＭを測定することもできる。この方法において、酸化発色型色原体の代わりに、蛍光物質［例えば、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等］、発光物質（例えば、ルミノール化合物、ルシゲニン化合物等）を用いることもできる。蛍光物質を用いた場合には、反応液の蛍光強度を、また、発光物質を用いた場合には、発光強度を測定することにより、ＳＭを測定することができる。また、ＰＣから生成した過酸化水素と、ＳＭから生成した過酸化水素とを過酸化水素電極で測定することにより、ＳＭを測定することもできる。これらの方法も本発明の測定方法に含まれる。
さらに、工程（２）における過酸化水素の消去をカタラーゼを用いて行う場合、工程（３）で生成した過酸化水素は、工程（４）において、当該過酸化水素を、カタラーゼ阻害剤及びペルオキシダーゼ存在下、蛍光物質又は発光物質と反応させ、生成した蛍光又は発光の強度を測定することによって測定することもできる。蛍光物質及び発光物質としては、例えば前述の蛍光物質及び発光物質が挙げられる。
本発明における検体としては、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、血漿及び血清が好ましい。
本発明におけるＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤとしては、ＰＣとは反応するが、ＳＭにもＬＰＣにも反応しないホスホリパーゼＤであれば特に限定はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のホスホリパーゼＤ、遺伝子工学的な手法により製造されるホスホリパーゼＤ等が挙げられる。微生物由来のホスホリパーゼＤとしては、例えばStreptomyces sp.由来のホスホリパーゼＤ等が挙げられる。また、ホスホリパーゼＤとしては市販品を使用することもできる。市販のホスホリパーゼＤとしては、例えばホスホリパーゼＤ（ＰＬＤＰ；旭化成社製）等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上の、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤを組み合わせて用いることもできる。
本発明におけるリゾホスホリパーゼとしては、ＬＰＣに対する加水分解活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のリゾホスホリパーゼ、遺伝子工学的な手法により製造されるリゾホスホリパーゼ等が挙げられる。また、リゾホスホリパーゼとして、市販品を使用することもできる。市販のリゾホスホリパーゼとしては、例えばリゾホスホリパーゼ（ＬＹＰＬ；旭化成社製）等が挙げられる。
本発明におけるモノグリセロリパーゼとしては、ＬＰＣに対する加水分解活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のモノグリセロリパーゼ、遺伝子工学的な手法により製造されるモノグリセロリパーゼ等が挙げられる。また、モノグリセロリパーゼとして、市販品を使用することもできる。市販のモノグリセロリパーゼとしては、例えばモノグリセロリパーゼ（ＭＧＬＰ；旭化成社製）等が挙げられる。
本発明においては、２種類以上の、リゾホスホリパーゼ又はモノグリセロリパーゼを組み合わせて用いることもできる。
本反応のＳＭの測定方法における、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤの反応液中の濃度は、本発明のＳＭの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.001〜200,000 U/Lであり、0.005〜100,000 U/Lが好ましい。
本反応のＳＭの測定方法におけるリゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼの反応液中の濃度は、本発明のＳＭの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.001〜200,000 U/Lであり、0.005〜100,000 U/Lが好ましい。
本発明におけるコリン酸化酵素としては、コリンを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコリンオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコリンオキシダーゼ等も用いることができる。また、コリンオキシダーゼ（ＣＬＯＤ；協和発酵社製）、コリンオキシダーゼ（ＣＨＯ−３０１；東洋紡績社製）等の市販品を用いることもできる。本発明においては、２種類以上のコリン酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
本反応のＳＭの測定方法におけるコリン酸化酵素の反応液中の濃度としては、本発明のＳＭの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.001〜200,000 U/Lであり、0.005〜20,000 U/Lが好ましい。
本発明におけるグリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤとしては、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤであれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＤ活性を有するリポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるホスホリパーゼＤ等も用いることができる。微生物由来のホスホリパーゼＤとしては、例えばStreptomyces chromofuscus由来のホスホリパーゼＤ等が挙げられる。また、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤとしては市販品を使用することもできる。市販の、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤとしては、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ；旭化成社製）等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上の、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤを組み合わせて用いることもできる。
本反応のＳＭの測定方法におけるグリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤの反応液中の濃度としては、本発明のＳＭの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.001〜500,000 U/Lであり、0.005〜250,000 U/Lが好ましい。
本発明におけるコリン脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコリンを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコリンデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコリン脱水素酵素等も用いることができる。また、本発明においては、２種類以上のコリン脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。
本反応のＳＭの測定方法におけるコリン脱水素酵素の反応液中の濃度としては、本発明のＳＭの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.001〜200,000 U/Lであり、0.005〜100,000 U/Lが好ましい。
コリン脱水素酵素を用いた測定において使用される酸化型補酵素としては、例えばNAD(P)＋、thio-NAD(P)＋等が挙げられる。コリン脱水素酵素の反応により生成する還元型補酵素としては、例えばNAD(P)H、thio-NAD(P)H等が挙げられる。
本発明のＳＭの測定方法に用いられる酸化型補酵素の反応液中の濃度としては、本発明のＳＭの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.01〜400 mmol/Lであり、0.1〜100 mmol/Lが好ましい。
本発明における還元型補酵素酸化酵素としては、コリン脱水素酵素の反応により生成する還元型補酵素から過酸化水素を生成させる能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えばNAD(P)H酸化酵素等が挙げられる。還元型補酵素酸化酵素としては、市販品を使用することもできる。市販の還元型補酵素酸化酵素としては、NADH oxidase（コスモ・バイオ社製）等が挙げられる。
本発明のＳＭの測定方法に用いられる還元型補酵素酸化酵素の反応液中の濃度としては、本発明のＳＭの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.01〜400,000 U/Lであり、0.02〜200,000 U/Lが好ましい。
本発明のＳＭの測定方法に用いられるカタラーゼとしては、過酸化水素を水と酸素分子に変換し得る酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のカタラーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるカタラーゼ等も用いることができる。また、カタラーゼとしては、市販品を使用することもできる。市販のカタラーゼとしては、カタラーゼ（ＣＡＴ；キッコーマン社製）、カタラーゼ（ＣＡＴ―Ｒ；キッコーマン社製）、カタラーゼ ウシ肝臓由来（シグマ・アルドリッチ社製）等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上のカタラーゼを組み合わせて用いることもできる。
本発明のＳＭの測定方法に用いられるカタラーゼの反応液中の濃度としては、本発明のＳＭの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.001〜1,000,000 U/Lであり、0.01〜500,000 U/Lが好ましい。
本発明において使用される水性媒体としては、本発明のＳＭの測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
グッドの緩衝剤としては、例えば2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ビス（2-ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、N-（2-アセトアミド）イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン-N,N’-ビス（2-エタンスルホン酸）(PIPES)、N-（2-アセトアミド）-2-アミノエタンスルホン酸(ACES)、3-モルホリノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）-2-アミノエタンスルホン酸(BES)、3-モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、N-〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕-2-アミノエタンスルホン酸(TES)、2-〔4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、3-〔N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）アミノ〕-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N-〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン-N,N’-ビス（2-ヒドロキシプロパンスルホン酸）(POPSO)、3-〔4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル〕-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、3-〔4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル〕プロパンスルホン酸[(H)EPPS]、N-〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン(Tricine)、N,N-ビス（2-ヒドロキシエチル）グリシン(Bicine)、N-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)、N-シクロヘキシル-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、通常、0.001〜2.0 mol/Lであり、0.005〜1.0 mol/Lが好ましい。
本発明において使用されるペルオキシダーゼとしては、本発明のＳＭの測定方法を可能とするペルオキシダーゼであれば特に制限はなく、例えば西洋わさび由来のペルオキシダーゼ等が挙げられる。
本発明のＳＭの測定方法に用いられるペルオキシダーゼの反応液中の濃度としては、本発明のＳＭの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.01〜500,000 U/Lであり、1〜200,000 U/Lが好ましい。
本発明のＳＭの測定方法に用いられるロイコ型色原体としては、本発明のＳＭの測定方法を可能とするロイコ型色原体であれば特に制限はない。ロイコ型色原体は、ペルオキシダーゼの存在下、過酸化水素と反応して、単独で色素を生成する機能を有する。
ロイコ型色原体としては、例えば10-N-カルボキシメチルカルバモイル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン(CCAP)、10-N-メチルカルバモイル-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン(MCDP)、N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-4,4’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA-64)、10-N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-3,7-ビス（ジメチルアミノ）-10H-フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)、4,4’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔3-ビス（4-クロロフェニル）メチル-4-ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。
本発明のＳＭの測定方法に用いられるロイコ型色原体の反応液中の濃度としては、本発明のＳＭの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.001〜5 g/Lであり、0.01〜1 g/Lが好ましい。
本発明のＳＭの測定方法に用いられる酸化カップリング発色型色原体としては、本発明のＳＭの測定方法を可能とする酸化カップリング発色型色原体であれば特に制限はない。酸化カップリング発色型色原体は、ペルオキシダーゼの存在下、過酸化水素と反応して色素を生成する機能を有する。この色素を生成する反応においては、一対の酸化カップリング発色型色原体の組み合わせが用いられる。一方、酸化カップリング発色型色原体は、ペルオキシダーゼの存在下、過酸化水素と反応して過酸化水素を無色の物質に変換する機能をも有する。この過酸化水素を無色の物質に変換する反応においては、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方のみが用いられる。一対の酸化カップリング発色型色原体の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせが挙げられる。
カプラーとしては、例えば4-アミノアンチピリン(4-AA)、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。
アニリン類としては、N-（3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メチルアニリン(TOOS)、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3.5-ジメチルアニリン(MAOS)、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン(DAOS)、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3-メチルアニリン(TOPS)、N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン(HDAOS)、N,N-ジメチル-3-メチルアニリン、N,N-ジ（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン、N-エチル-N-（3-スルホプロピル）-3,5-ジメチルアニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）アニリン、N-エチル-N-（3-メチルフェニル）-N’-サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N-エチル-N-（3-メチルフェニル）-N’-アセチルエチレンジアミン、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-4-フルオロ-3,5-ジメトキシアニリン(F-DAOS)等が挙げられる。
フェノール類としては、フェノール、4-クロロフェノール、3-メチルフェノール、3-ヒドロキシ-2,4,6-トリヨード安息香酸(HTIB)等が挙げられる。
本発明のＳＭの測定方法に用いられる酸化カップリング発色型色原体の反応液中の濃度としては、本発明のＳＭの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.001〜5 g/Lであり、0.01〜1 g/Lが好ましい。
＜ＳＭ測定用キット＞
本発明のＳＭ測定用キットは、本発明のＳＭの測定方法に使用される。本発明のＳＭ測定用キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられるが、第１試薬と第２試薬とからなる２試薬系のキットが好ましい。
本発明のＳＭ測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態のキットを用いて検体中のＳＭを測定する場合には、測定前に水性媒体に溶解して使用される。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。
本発明のＳＭ測定用キットにおいては、前述のＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン酸化酵素、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、酸化型補酵素、コリン脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、カタラーゼ、カタラーゼ阻害剤、ロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体を用いることができる。
第１試薬と第２試薬とからなる２試薬系のＳＭ測定用キットにおいては、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤは、第１試薬に含まれる。リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼは、第１試薬に含まれる。グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤは第２試薬に含まれる。コリン酸化酵素は、第１試薬に含まれるが、さらに第２試薬に含まれてもよい。コリン脱水素酵素は、第１試薬に含まれるが、さらに第２試薬に含まれてもよい。酸化型補酵素は、第１試薬に含まれるが、さらに第２試薬に含まれてもよい。還元型補酵素酸化酵素は、第１試薬に含まれるが、さらに第２試薬に含まれてもよい。カタラーゼは、第１試薬に含まれる。カタラーゼ阻害剤は、第２試薬に含まれる。ペルオキシダーゼは、第１試薬に含まれるが、さらに第２試薬に含まれてもよい。ロイコ型色原体は、第２試薬に含まれる。過酸化水素の消去を、ペルオキシダーゼ、及び、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方の存在下に行う場合、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方は、第１試薬に含まれる。過酸化水素の測定を、ペルオキシダーゼ、及び、一対の酸化カップリング発色型色原体の存在下に行う場合、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方は、第１試薬に含まれ、もう一方は、第２試薬に含まれる態様が好ましい。
本発明のＳＭ測定用キットにおけるＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤの第１試薬中の濃度は、通常、0.002〜400,000 U/Lであり、0.01〜200,000 U/Lが好ましい。凍結乾燥された状態のＳＭ測定用キットにおいては、ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤの第１試薬中の含量は、水性媒体で溶解された状態での濃度が、通常、0.002〜400,000 U/L、好ましくは0.01〜200,000 U/Lとなる含量である。
本発明のＳＭ測定用キットにおけるリゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼの第１試薬中の濃度は、通常、0.002〜400,000 U/Lであり、0.01〜200,000 U/Lが好ましい。凍結乾燥された状態のＳＭ測定用キットにおいては、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼの第１試薬中の含量は、水性媒体で溶解された状態での濃度が、通常、0.002〜400,000 U/L、好ましくは0.01〜200,000 U/Lとなる含量である。
本発明のＳＭ測定用キットにおけるコリン酸化酵素の第１試薬中の濃度は、通常、0.002〜400,000 U/Lであり、0.01〜200,000 U/Lが好ましい。凍結乾燥された状態のＳＭ測定用キットにおいては、コリン酸化酵素の第１試薬中の含量は、水性媒体で溶解された状態での濃度が、通常、0.002〜400,000 U/L、好ましくは0.01〜200,000 U/Lとなる含量である。
本発明のＳＭ測定用キットにおけるグリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤの第２試薬中の濃度は、通常、0.004〜800,000 U/Lであり、0.02〜400,000 U/Lが好ましい。凍結乾燥された状態のＳＭ測定用キットにおいては、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤの第２試薬中の含量は、水性媒体で溶解された状態での濃度が、通常、0.004〜800,000 U/L、好ましくは0.02〜400,000 U/Lとなる含量である。
本発明のＳＭ測定用キットにおけるコリン脱水素酵素の第１試薬中の濃度は、通常、0.002〜400,000 U/Lであり、0.01〜200,000 U/Lが好ましい。凍結乾燥された状態のＳＭ測定用キットにおいては、コリン脱水素酵素の第１試薬中の含量は、水性媒体で溶解された状態での濃度が、通常、0.002〜400,000 U/L、好ましくは0.01〜200,000 U/Lとなる含量である。
本発明のＳＭ測定用キットにおける酸化型補酵素の第１試薬中の濃度は、通常、0.02〜800 mmol/Lであり、0.2〜200 mmol/Lが好ましい。凍結乾燥された状態のＳＭ測定用キットにおいては、酸化型補酵素の第１試薬中の含量は、水性媒体で溶解された状態での濃度が、通常、0.02〜800 mmol/L、好ましくは0.2〜200 mmol/Lとなる含量である。
本発明のＳＭ測定用キットにおける還元型補酵素酸化酵素の第１試薬中の濃度は、通常、0.02〜800,000 U/Lであり、0.04〜400,000 U/Lが好ましい。凍結乾燥された状態のＳＭ測定用キットにおいては、還元型補酵素酸化酵素の第１試薬中の含量は、水性媒体で溶解された状態での濃度が、通常、0.02〜800,000 U/L、好ましくは0.04〜400,000 U/Lとなる含量である。
本発明のＳＭ測定用キットにおけるカタラーゼの第１試薬中の濃度は、通常、0.002〜1,500,000 U/Lであり、0.02〜750,000 U/Lが好ましい。凍結乾燥された状態のＳＭ測定用キットにおいては、カタラーゼの第１試薬中の含量は、水性媒体で溶解された状態での濃度が、通常、0.002〜1,500,000 U/L、好ましくは0.02〜750,000 U/Lとなる含量である。
本発明のＳＭ測定用キットにおけるペルオキシダーゼの第１試薬中の濃度は、通常、0.01〜500,000 U/Lであり、1〜200,000 U/Lが好ましい。凍結乾燥された状態のＳＭ測定用キットにおいては、ペルオキシダーゼの第１試薬中の含量は、水性媒体で溶解された状態での濃度が、通常、0.01〜500,000 U/Lであり、1〜200,000 U/Lとなる含量である。
本発明のＳＭ測定用キットにおけるロイコ型色原体の第２試薬中の濃度は、通常、0.002〜7.5 g/Lであり、0.02〜1.5 g/Lが好ましい。凍結乾燥された状態のＳＭ測定用キットにおいては、ロイコ型色原体の第２試薬中の含量は、水性媒体で溶解された状態での濃度が、通常、0.002〜7.5 g/L、好ましくは0.02〜1.5 g/Lとなる含量である。
本発明のＳＭ測定用キットにおける酸化カップリング発色型色原体の第１試薬及び第２試薬中の濃度は、通常、0.002〜7.5 g/Lであり、0.02〜1.5 g/Lが好ましい。凍結乾燥された状態のＳＭ測定用キットにおいては、酸化カップリング発色型色原体の第１試薬及び第２試薬中の含量は、水性媒体で溶解された状態での濃度が、通常、0.002〜7.5 g/L、好ましくは0.02〜1.5 g/Lとなる含量である。
本発明のＳＭ測定用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、干渉物質の影響抑制剤、反応促進剤、界面活性剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えば例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、グリシン、グルタミン酸ナトリウム、トリプトファン等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質、バイオエース等が挙げられる。干渉物質の影響抑制剤としては、例えばアスコルビン酸の影響抑制のためのアスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンの影響抑制のためのフェロシアン化物等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレン系界面活性剤等が挙げられる。
以下に、本発明のＳＭ測定用キットの具体的態様を記すが、本発明のＳＭ測定用キットはこれらに限定されない。
・キット１
第１試薬
ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン酸化酵素、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ
第２試薬
グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、カタラーゼ阻害剤、ロイコ型色原体
・キット２
第１試薬
ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン酸化酵素、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ
第２試薬
グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、コリン酸化酵素、カタラーゼ阻害剤、ロイコ型色原体
・キット３
第１試薬
ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ
第２試薬
グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、カタラーゼ阻害剤、ロイコ型色原体
・キット４
第１試薬
ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ
第２試薬
グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、コリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素、カタラーゼ阻害剤、ロイコ型色原体
・キット５
第１試薬
ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン酸化酵素、ペルオキシダーゼ、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方
第２試薬
グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、一対の酸化カップリング発色型色原体のもう一方
・キット６
第１試薬
ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン酸化酵素、ペルオキシダーゼ、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方
第２試薬
グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、コリン酸化酵素、一対の酸化カップリング発色型色原体のもう一方
・キット７
第１試薬
ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素、ペルオキシダーゼ、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方
第２試薬
グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、一対の酸化カップリング発色型色原体のもう一方
・キット８
第１試薬
ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素、ペルオキシダーゼ、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方
第２試薬
グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、コリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素、一対の酸化カップリング発色型色原体のもう一方
・キット９
第１試薬
ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン酸化酵素、ペルオキシダーゼ、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方
第２試薬
グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、ペルオキシダーゼ、一対の酸化カップリング発色型色原体のもう一方
・キット１０
第１試薬
ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン酸化酵素、ペルオキシダーゼ、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方
第２試薬
グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、コリン酸化酵素、ペルオキシダーゼ、一対の酸化カップリング発色型色原体のもう一方
・キット１１
第１試薬
ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素、ペルオキシダーゼ、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方
第２試薬
グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、ペルオキシダーゼ、一対の酸化カップリング発色型色原体のもう一方
・キット１２
第１試薬
ＳＭ及びＬＰＣとは反応せず、ＰＣとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素、ペルオキシダーゼ、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方
第２試薬
グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、ＳＭとは反応するホスホリパーゼＤ、コリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素、ペルオキシダーゼ、一対の酸化カップリング発色型色原体のもう一方
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例および参考例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製）、ＥＭＳＥ（ダイトーケミックス社製）、塩化カルシウム２水和物（和光純薬工業社製）、４−ＡＡ（埼京化成社製）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ；東洋紡績社製）、カタラーゼ（キッコーマン社製）、ＣＬＯＤ（コリン酸化酵素；協和発酵社製）、アジ化ナトリウム（和光純薬工業社製）、ＭＧＬＰ（モノグリセロールリパーゼ；旭化成社製）、ＰＬＤＰ（旭化成社製）、ＰＬＤ（旭化成社製）、ホスファチジルコリン（シグマ・アルドリッチ社製）、リゾホスファチジルコリン（シグマ・アルドリッチ社製）、ＳＭ（シグマ・アルドリッチ社製）、トリトンＸ−１００（ポリオキシエチレン系界面活性剤：シグマ・アルドリッチ社製）。
ＰＣ、ＬＰＣ及びＳＭの各リン脂質について、(1)ＰＬＤＰ、(2)ＰＬＤ、及び、(3)ＭＧＬＰの各酵素に対する反応性を、以下の方法により検討した。
＜キット＞
第３表に示す、以下の第１試薬及び第２試薬からなるキット（キットＡ〜Ｆ）を調製した。
第１試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０） １５ ｇ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００ ０．０５ ｇ／Ｌ
ＭＧＬＰ
第２試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．５） １５ ｇ／Ｌ
４−ＡＡ ０．５ ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．２ ｇ／Ｌ
ＰＯＤ ２０ ｋＵ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物 ０．３ ｇ／Ｌ
ＣＬＯＤ ３０ ｋＵ／Ｌ
ＰＬＤＰ又はＰＬＤ
Figure 2013018609
＜検体＞
生理食塩水、ＳＭ標準液（ＳＭ濃度：100 mg/dL）、ＰＣ標準液（ＰＣ濃度：100 mg/dL）、ＬＰＣ標準液（ＬＰＣ濃度：100 mg/dL）を検体として用いた。
＜キットＡを用いる測定〜標準液に対する吸光度＞
検体として、生理食塩水（リン脂質：0.0 mg/dL）と、ＳＭ標準液とを用いて、キットとして、キットＡを用いて、日立７１７０Ｓ型自動分析機により、ＳＭ標準液に対する「吸光度」を以下の方法により決定した。
反応セルへ生理食塩水(2.5μL)と第１試薬(240μL)とを添加し、37℃で5分間加温し、その反応液の吸光度(E1生食)を主波長600 nm、副波長700 nmで測定し、次いで、この反応液に第２試薬(80μL)を添加し、さらに37℃で5分間加温した後に、反応液の吸光度(E2生食)を主波長600 nm、副波長700 nmで測定した。E2生食からE1生食を差し引いた値をΔE生食とした。
検体として、生理食塩水の代わりにＳＭ標準液を用いる以外は上記と同様の反応を行い、E2ＳＭからE1ＳＭを差し引き、ΔEＳＭとした。式（Ｉ）に示す様に、ΔEＳＭから上記のΔE生食を差し引いて得られる値をＳＭ標準液に対する「吸光度」（Ａ）とした。
Figure 2013018609
ＳＭ標準液の代わりに、ＰＣ標準液、及び、ＬＰＣ標準液をそれぞれ用いて、同様にして、ＰＣ標準液に対する「吸光度」（Ａ）、及び、ＬＰＣ標準液に対する「吸光度」（Ａ）を決定した。
＜キットＢ〜Ｆを用いる測定〜標準液に対する吸光度＞
キットＡの代わりに、キットＢ〜Ｆをそれぞれ用いて、各キットにおける各標準液に対する「吸光度」を決定した。各キットにおける各標準液に対する「吸光度」を図１に示す。
図１から、以下のことが判明した。先ず、キットＡを用いた場合、いずれのリン脂質についても「吸光度」が得られなかったことから、いずれのリン脂質も、コリン酸化酵素とは反応しないことが分かった。キットＢを用いた反応から、ＰＬＤＰは、ＰＣに特異的に反応し、コリンを生成することが分かった。キットＣを用いた反応から、ＰＬＤは、いずれのリン脂質とも反応し、コリンを生成することが分かった。
キットＤを用いた反応から、いずれのリン脂質についても、ＭＧＬＰとの反応によりコリンを生成しないことが分かった。
キットＥを用いた場合、ＰＣのみが、コリンを生成することが分かった。キットＢを用いた反応との比較から、ＰＣはＭＧＬＰとは反応せず、ＰＬＤＰと反応し、コリンを生成するものと考えられた。また、ＬＰＣからは「吸光度」が得られなかったため、ＬＰＣとＭＧＬＰとの反応により生成するグリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸は、ＰＬＤＰとは反応せず、コリンを生成しないことが分かった。
キットＦを用いる反応から、ＰＣとＳＭの場合には、コリンを生成することが分かった。キットＣを用いた反応との比較から、ＰＣとＳＭは、ＭＧＬＰとは反応せず、ＰＬＤと反応し、コリンを生成するものと考えられた。一方、ＬＰＣからは「吸光度」が得られなかったため、ＬＰＣがＭＧＬＰと反応して生成するグリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸は、ＰＬＤとは反応せず、コリンを生成しないことが分かった。
従って、ＰＣ、ＬＰＣ及びＳＭを含む検体にＰＬＤＰを作用させることにより、ＰＣのみがＰＬＤＰと反応し、生成したコリンを過酸化水素に変換して消去すると共に、残存するＬＰＣとＳＭにＭＧＬＰを作用させた後にＰＬＤを作用させることにより、ＬＰＣのみがＭＧＬＰと反応し、生成したグリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸がＰＬＤと反応しないため、検体中のＳＭのみがＰＬＤと反応してコリンを生成し、当該コリンより生成した過酸化水素を測定することにより、ＳＭのみを測定することができることが判明した。
以下の第１試薬及び第２試薬からなるＳＭ測定用キットを調製した。
第１試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．２５） １５ ｇ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
カタラーゼ ３００ ｋＵ／Ｌ
ＰＬＤＰ １０ ｋＵ／Ｌ
ＭＧＬＰ １０ ｋＵ／Ｌ
ＣＬＯＤ １０ ｋＵ／Ｌ
トリトンＸ−１００ ０．０５ ｇ／Ｌ
第２試薬
ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．５） １５ ｇ／Ｌ
４−ＡＡ ０．５ ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．２ ｇ／Ｌ
ＰＯＤ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＰＬＤ ４ ｋＵ／Ｌ
ＣＬＯＤ １０ ｋＵ／Ｌ
塩化カルシウム２水和物 ０．３ ｇ／Ｌ
トリトンＸ−１００ ８ ｇ／Ｌ
実施例２の測定用キット、及び、対照キットとして、Sphingomyelin Assay Kit（Cayman Chemical Company社製）を用いて、ヒト血清２８検体の各検体中のＳＭ濃度を以下の手順により決定した。
（１）検量線の作成
標準液として、生理食塩水（ＳＭ：0.0 mg/dL）と、ＳＭ濃度が35.0 mg/dLであることが判明している標準血清とを用いて、キットとして、実施例２のキットを用いて、日立７１７０Ｓ型自動分析機により、ＳＭ濃度と「吸光度」との関係を示す検量線を作成した。
ここで記す「吸光度」とは、以下の反応で測定された２つの吸光度（E1及びE2）を基に、E2からE1を差し引くことによって得られる値を表す。
反応セルへ標準液(2.5μL)と第１試薬(240μL)とを添加し、37℃で5分間加温し、その反応液の吸光度(E1)を主波長600 nm、副波長700 nmで測定し、次いで、この反応液に第２試薬(80μL)を添加し、さらに37℃で5分間加温した後に、反応液の吸光度(E2)を主波長600 nm、副波長700 nmで測定した。
（２）ヒト血清検体における「吸光度」の測定
（１）の検量線作成において、標準液の代わりにヒト血清検体（28検体）を用いる以外は、（１）の「吸光度」算出方法と同様の操作を行い、当該検体の各検体における「吸光度」を測定した。
（３）ヒト血清検体中のＳＭ濃度の決定
（２）で測定した「吸光度」と、（１）で作成した検量線とから、各検体中のＳＭ濃度を測定した。
（４）対照キットによるＳＭ濃度の決定
対照キットの使用説明書に従い、対照キットを用いて、同じヒト血清２８検体中のＳＭ濃度を決定した。
対照キットを用いた測定により決定された各検体中のＳＭ濃度（ｘ）と、実施例２のキットを用いた測定により決定された各検体中のＳＭ濃度（ｙ）とから、対照キットを用いた測定と実施例２のキットとを用いた測定との間の相関を検討したところ、図２に示す相関図が得られた。この相関図が示す様に、ｘとｙとの間には、式（ＩＩ）に示す関係が成り立ち、相関係数(r)は0.8445となり、両測定間に良好な相関関係があることが判明した。
Figure 2013018609
ＳＭ標準液（ＳＭ濃度：100 mg/dL）を用いて10段階の希釈系列を調製し、各希釈検体について実施例３と同様の方法により、吸光度を測定した。その結果を図３に示す。
図３から明らかな様に、実施例２のキットを用いる測定により、ＳＭ濃度と吸光度との間に非常に良好な直線性が得られることが分かった。
実施例２のキットを用いて、ＳＭに対する特異性を検討した。検体として、生理食塩水、ＳＭ標準液（ＳＭ濃度：100 mg/dL）、ＰＣ標準液（ＰＣ濃度：100 mg/dL）、ＬＰＣ標準液（ＬＰＣ濃度：100 mg/dL）を用いて、実施例３の方法により、各検体に対する「吸光度」を測定した。
一方、実施例２のキットの代わりに、リン脂質測定用キットである「デタミナーＬ ＰＬ」（協和メデックス社製）を用いて、実施例３と同様の方法により、各検体に対する「吸光度」を測定した。測定結果を第４表に示す。
Figure 2013018609
第４表より明らかな様に、「デタミナーＬ ＰＬ」を用いた測定においては、ＳＭ、ＰＣ、ＬＰＣの全てのリン脂質が反応したが、実施例２のキットを用いた測定においては、ＳＭのみが反応した。従って、実施例２のキットは、ＳＭを特異的に測定するキットであることが確認された。
本発明により、動脈硬化等の診断に有効な血液中のＳＭの測定方法、及び、測定用キットが提供される。

Claims (17)

  1. 検体を、スフィンゴミエリン及びリゾホスファチジルコリンとは反応せず、ホスファチジルコリンとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、及び、コリン酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を消去し、次いで、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、スフィンゴミエリンとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、コリン酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中のスフィンゴミエリンの測定方法。
  2. 検体を、スフィンゴミエリン及びリゾホスファチジルコリンとは反応せず、ホスファチジルコリンとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、酸化型補酵素、コリン脱水素酵素、及び、還元型補酵素酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を消去し、次いで、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、スフィンゴミエリンとは反応するホスホリパーゼＤ、酸化型補酵素、コリン脱水素酵素、及び、還元型補酵素酸化酵素と反応させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中のスフィンゴミエリンの測定方法。
  3. 検体と、スフィンゴミエリン及びリゾホスファチジルコリンとは反応せず、ホスファチジルコリンとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、及び、コリン酸化酵素との反応をカタラーゼの存在下に行い、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、スフィンゴミエリンとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、コリン酸化酵素の反応をカタラーゼ阻害剤の存在下に行う、請求項１記載の方法。
  4. 検体と、スフィンゴミエリン及びリゾホスファチジルコリンとは反応せず、ホスファチジルコリンとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、酸化型補酵素、コリン脱水素酵素、及び、還元型補酵素酸化酵素との反応をカタラーゼの存在下に行い、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、スフィンゴミエリンとは反応するホスホリパーゼＤ、酸化型補酵素、コリン脱水素酵素、及び、還元型補酵素酸化酵素の反応をカタラーゼ阻害剤の存在下に行う、請求項２記載の方法。
  5. カタラーゼ阻害剤が、アジ化物である請求項３又は４記載の方法。
  6. 過酸化水素の消去をペルオキシダーゼ、及び、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方の存在下に行い、過酸化水素の測定をペルオキシダーゼ、及び、一対の酸化カップリング発色型色原体の存在下に行う、請求項１又は２記載の方法。
  7. 過酸化水素の測定をペルオキシダーゼ、及び、ロイコ型色原体の存在下に行う、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  8. スフィンゴミエリン及びリゾホスファチジルコリンとは反応せず、ホスファチジルコリンとは反応するホスホリパーゼＤが、Streptomyces sp.由来のホスホリパーゼＤである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、スフィンゴミエリンとは反応するホスホリパーゼＤが、Streptomyces chromofuscus由来のホスホリパーゼＤである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. スフィンゴミエリン及びリゾホスファチジルコリンとは反応せず、ホスファチジルコリンとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン酸化酵素、及び、カタラーゼを含む第１試薬と、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、スフィンゴミエリンとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、カタラーゼ阻害剤を含む第２試薬とを含むことを特徴とする、検体中のスフィンゴミエリン測定用キット。
  11. スフィンゴミエリン及びリゾホスファチジルコリンとは反応せず、ホスファチジルコリンとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン酸化酵素、ペルオキシダーゼ、及び、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方を含む第１試薬と、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、スフィンゴミエリンとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、酸化カップリング発色型色原体のもう一方を含む第２試薬とを含むことを特徴とする、検体中のスフィンゴミエリン測定用キット。
  12. スフィンゴミエリン及びリゾホスファチジルコリンとは反応せず、ホスファチジルコリンとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素、及び、カタラーゼを含む第１試薬と、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、スフィンゴミエリンとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、カタラーゼ阻害剤を含む第２試薬とを含むことを特徴とする、検体中のスフィンゴミエリン測定用キット。
  13. スフィンゴミエリン及びリゾホスファチジルコリンとは反応せず、ホスファチジルコリンとは反応するホスホリパーゼＤ、リゾホスホリパーゼ若しくはモノグリセロリパーゼ、コリン脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素、ペルオキシダーゼ、及び、一対の酸化カップリング発色型色原体の一方を含む第１試薬と、グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、スフィンゴミエリンとは反応するホスホリパーゼＤ、及び、酸化カップリング発色型色原体のもう一方を含む第２試薬とを含むことを特徴とする、検体中のスフィンゴミエリン測定用キット。
  14. カタラーゼ阻害剤が、アジ化物である請求項１０又は１２記載のキット。
  15. ペルオキシダーゼとロイコ型色原体が、それぞれ、第１試薬及び第２試薬の別々の試薬に含まれる、請求項１０、１２又は１４記載のキット。
  16. スフィンゴミエリン及びリゾホスファチジルコリンとは反応せず、ホスファチジルコリンとは反応するホスホリパーゼＤが、Streptomyces sp.由来のホスホリパーゼＤである、請求項１０〜１５のいずれかに記載のキット。
  17. グリセロール−３−ホスホリルコリン及び遊離脂肪酸とは反応せず、スフィンゴミエリンとは反応するホスホリパーゼＤが、Streptomyces chromofuscus由来のホスホリパーゼＤである、請求項１０〜１６のいずれかに記載のキット。
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