JPWO2010055916A1 - 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット - Google Patents

低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット Download PDF

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Abstract

検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;[b]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;及び、[d]ポリアニオンの存在下に反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。

Description

本発明は、検体中に含まれる低密度リポ蛋白(以下、LDLという)中のコレステロール(以下、LDL−Cと略記する。)の測定方法及び測定用キットに関する。
LDLは、末梢細胞にコレステロールを供給する役割を有し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の直接的因子である。LDL−Cの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の1つであり、分別定量することは臨床上有用である。
従来からのLDL−Cの定量方法は、超遠心法、電気泳動法、フリードワルド(Friedewald)式による演算方法などが挙げられる。
超遠心法は、リポ蛋白の比重の差を利用し、超遠心分離機を用いてLDLを分離したのち、そのコレステロール量を測定する方法である(非特許文献1)。
しかしながら、超遠心法による分離操作は煩雑で、迅速性、簡便性などの面で欠点がある。
電気泳動法は、リポ蛋白の電荷の差を利用し、アガロースゲルなどを支持体として分離する方法やリポ蛋白の粒子サイズの差を利用し、ポリアクリルアミドゲルを支持体として分離する方法などがある。しかしながら、電気泳動法は定量性に乏しく、簡便性、経済性などの面で問題がある。
フリードワルド式による演算方法では、総コレステロール(以下、T−Cと略記する。)、高密度リポ蛋白(以下、HDLという)中のコレステロール(以下、HDL−Cと略記する。)及び総トリグリセライド(以下、T−TGと略記する。)の測定値から、次の計算式に従いLDL−C量を算出する(非特許文献2)。
(LDL−C)=(T−C)−(HDL−C)−(T−TG)/5
しかしながら、この方法は、血清中のT−TGの含有量や食事の影響を受けるため、正確性に問題がある。
また近年、超遠心法などの分離操作を必要とせず、汎用の自動分析機装置に搭載可能なLDL−Cの定量方法も報告されている。
それらの中でLDL−Cを定量する方法としては、以下の方法が知られている。
LDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、被検試料中のHDL、超低密度リポ蛋白(以下、VLDLという)及びカイロミクロン中のコレステロールを消去する第1工程と、次いで、被検試料中の残存コレステロールを定量する第2工程とからなる被検試料中のLDL−Cの定量方法(特許文献1)。
血清に対し、ポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ばれる界面活性剤、並びにコレステロール測定用酵素試薬を添加し、リポ蛋白質のうちHDL中及びVLDL中のコレステロールを優先的に反応させた後に、残りのコレステロールの反応量を測定するLDL−Cの定量方法(特許文献2)。
生体試料に対し、ポリオキシエチレン誘導体とポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、並びにコレステロール測定用酵素を添加し、リポ蛋白質のうちLDL−Cを選択的に測定する方法(特許文献3)。
生体試料に対し、ジメチル−α−シクロデキストリン又は/及びポリ−β−シクロデキストリンの存在下で測定を行うことを特徴とする、LDL−Cの測定法(特許文献4)。
カイロミクロン、HDL、LDL、VLDLのいずれか1種以上を含む試料中のコレステロールを直接、選択的に測定する方法において、リン脂質、リン脂質類似基を含有する化合物の存在下、試料中のLDL−Cを定量する方法(特許文献5)。
しかしながら、検体中のLDL−Cをより簡便かつ正確に測定する方法及びキットが求められている。
特開平10−38888号公報 特開平9−313200号公報 WO00/17388パンフレット 特開平11−30617号公報 特開2002−202314号公報
アドバンスド・リピッド・リサーチ(Adv. Lipid Res.)、第6巻、1頁、1968年 クリニカル・ケミストリー(Clin. Chem.)、第18巻、499頁、1972年
本発明の目的は、検体中のLDL−Cを簡便かつ正確に測定するための方法、試薬及びキットを提供することにある。
本発明者らはLDL−Cの測定方法について鋭意検討を重ねた結果、特定の界面活性剤及びポリアニオンの存在下で、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを反応させることで、LDL以外のリポ蛋白質中のコレステロールを消去することなく、また、リポ蛋白質の物理的な分画操作を行うことなく、検体中のLDL−Cを簡便かつ正確に測定できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、下記(1)〜(31)に関する。
(1)検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;及び、
[d]ポリアニオン
の存在下に反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
(2)検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;及び、
[d]ポリアニオン
の存在下に反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
(3)検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
[b2]ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;及び、
[d]ポリアニオン
の存在下に反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
(4)第四級アンモニウム塩が、トリメチルアルキルアンモニウム塩又はベンジルジメチルアルキルアンモニウム塩である(1)〜(3)のいずれかに記載の測定方法。
(5)第三級アミンが、ジメチルアルキルアミンである(1)〜(3)のいずれかに記載の測定方法。
(6)生成する物質が、過酸化水素である(1)〜(5)のいずれかに記載の測定方法。
(7)過酸化水素の測定が、過酸化水素測定用試薬を用いて行われる(6)記載の測定方法。
(8)生成する物質が、還元型補酵素である(1)〜(5)のいずれかに記載の測定方法。
(9)還元型補酵素の測定が、還元型補酵素測定用試薬を用いて行われる(8)記載の測定方法。
(10)[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[d]ポリアニオン;及び、
コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
(11)[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[d]ポリアニオン;及び、
コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
(12)[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
[b2]ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[d]ポリアニオン;及び、
コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
(13)さらに、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素と検体との反応で生成する物質を測定する試薬を含有する、(10)〜(12)のいずれかに記載の測定用試薬。
(14)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素と検体との反応で生成する物質が、過酸化水素である、(13)記載の測定用試薬。
(15)[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[d]ポリアニオン;及び、
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
(16)[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[d]ポリアニオン;及び、
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
(17)[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
[b2]ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[d]ポリアニオン;及び、
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
(18)さらに、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素と検体との反応で生成する物質を測定する試薬を含有する、(15)〜(17)のいずれかに記載の測定用試薬。
(19)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素と検体との反応で生成する物質が、還元型補酵素である、(18)記載の測定用試薬。
(20)第四級アンモニウム塩が、トリメチルアルキルアンモニウム塩又はベンジルジメチルアルキルアンモニウム塩である(10)〜(19)のいずれかに記載の測定用試薬。
(21)第三級アミンが、ジメチルアルキルアミンである(10)〜(19)のいずれかに記載の測定用試薬。
(22)[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[d]ポリアニオン、
及び、コレステロールエステル加水分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む第一試薬、コレステロール酸化酵素を含む第二試薬を含有し、上記[a]〜[d]及びコレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
(23)[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[d]ポリアニオン、
及び、コレステロールエステル加水分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む第一試薬、コレステロール酸化酵素を含む第二試薬を含有し、上記[a]〜[d]及びコレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
(24)[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
[b2]ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[d]ポリアニオン、
及び、コレステロールエステル加水分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む第一試薬、コレステロール酸化酵素を含む第二試薬を含有し、上記[a]〜[d]及びコレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
(25)さらに、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有する(22)〜(24)のいずれかに記載の測定用キット。
(26)[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[d]ポリアニオン、
酸化型補酵素、及び、コレステロールエステル加水分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む第一試薬、コレステロール脱水素酵素を含む第二試薬を含有し、上記[a]〜[d]、酸化型補酵素及びコレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
(27)[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[d]ポリアニオン、
酸化型補酵素、及び、コレステロールエステル加水分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む第一試薬、コレステロール脱水素酵素を含む第二試薬を含有し、上記[a]〜[d]、酸化型補酵素及びコレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
(28)[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
[b2]ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[d]ポリアニオン、
酸化型補酵素、及び、コレステロールエステル加水分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む第一試薬、コレステロール脱水素酵素を含む第二試薬を含有し、上記[a]〜[d]、酸化型補酵素及びコレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定用キット。
(29)さらに、還元型補酵素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、(26)〜(28)のいずかに記載の測定用キット。
(30)第四級アンモニウム塩が、トリメチルアルキルアンモニウム塩又はベンジルジメチルアルキルアンモニウム塩である(22)〜(29)のいずれかに記載の測定用キット。
(31)第三級アミンが、ジメチルアルキルアミンである(22)〜(29)のいずれかに記載の測定用キット。
本発明により、検体中のLDL−Cを簡便かつ正確に測定するための方法、試薬及びキットが提供される。
本発明による検体中のLDL−Cの測定法は、遠心分離などの物理的方法によるリポ蛋白の分画操作を必要としない方法である。また、LDL−Cの測定に先立って検体中のLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することなく、検体中のLDL−Cを測定する方法である。またLDL−Cの測定に先立って、検体中のLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを測定することなく、検体中のLDL−Cを測定する方法である。
本発明の測定方法の1態様は、検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;及び、
[d]ポリアニオン
の存在下に反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする方法である。
本発明の測定方法の別の態様は、検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;及び、
[d]ポリアニオン
の存在下に反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする方法である。
さらに、本発明の測定方法の別の態様は、検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
[a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
[b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
[b2]ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
[c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;及び、
[d]ポリアニオン
の存在下に反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする方法である。
いずれの態様においても、
[1]検体と酵素類との反応を、界面活性剤及びポリアニオンの共存下に行う工程;
[2]上記[1]の工程で生成する物質又は消費される物質を測定する工程;
[3]予め、既知濃度のLDL−Cを用いて作成された、LDL−C濃度と、該生成する物質又は該消費される物質由来の情報量との関係を表す検量線と、上記[2]での測定値とを相関付ける工程;及び、
[4]検体中のLDL−C濃度を決定する工程
を含む。ここで、検体との反応で用いられる酵素類とは、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせである。
本発明の測定方法において、検体と酵素類との反応で生成する物質としては、例えば過酸化水素、還元型補酵素等が挙げられ、検体と酵素類との反応で消費される物質としては、例えば酸素分子等が挙げられる。生成した過酸化水素は、例えば過酸化水素電極や後述の過酸化水素測定用試薬を用いて測定することができる。生成した還元型補酵素は、例えば還元型補酵素の吸光度を測定する方法や後述の還元型補酵素測定用試薬を用いる方法等が挙げられる。還元型補酵素の吸光度の測定において使用される波長は、300〜500nmが好ましく、330〜400nmがより好ましく、340nmが特に好ましい。消費される酸素分子は、例えば酸素電極を用いて測定することができる。
本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清等が挙げられ、血漿及び血清が好ましい。また、本発明の測定方法においては、健常人由来の検体のみならず、中性脂肪(TG)が高い高TG検体も使用することができる。
本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。
コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素の他、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。
市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステラーゼ(COE−311;東洋紡績社製)、リポプロテインリパーゼ(LPL−311;東洋紡績社製)、コレステロールエステラーゼIII(CHEIII;天野製薬社製)等が挙げられる。また、本発明においては、2種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修飾する基(化学修飾基)としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。
コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬(化学修飾剤)としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基又は構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基(N−ヒドロキシサクシンイミド基等)、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、1,3−プロパンスルトン、1,4−ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基又は構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル(α−ヨードエステル等)等が挙げられる。
化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とN−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトVFM−4101、サンブライトME−050AS、サンブライトDE−030AS(いずれも日油社製)、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトAKMシリーズ(例えば、サンブライトAKM−1510等)、サンブライトADMシリーズ、サンブライトACMシリーズ(いずれも日油社製)、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するEPOX−3400、M−EPOX−5000(いずれもSheawater Polymers社製)、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−N,N,N’,N’’,N’’−ペンタ無水二酢酸(DTPA anhydride;同仁化学研究所社製)等が挙げられる。
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができるが、本方法に限定されるものではない。まず、コレステロールエステル加水分解酵素をpH8.0以上の緩衝液(例えばHEPES緩衝液)に溶解し、0〜55℃で0.01〜500倍モル量の化学修飾剤を添加し、5分間〜5時間攪拌する。酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
本発明の測定方法におけるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のLDL−Cの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度は通常0.001〜800U/mLであり、0.01〜300U/mLが好ましい。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ(CHODI;協和発酵工業社製)、コレステロールオキシダーゼ(CHODI;キッコーマン社製)、コレステロールオキシダーゼ(CHO−CE;キッコーマン社製)、コレステロールオキシダーゼ(COO−321;東洋紡績社製)等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、2種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本発明の測定方法におけるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のLDL−Cの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度は通常0.001〜800U/mLであり、0.01〜300U/mLが好ましい。
本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒドロゲナーゼ等も用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼ“Amano” 5 (CHDH5;天野エンザイム社製)等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、2種類以上のコレステロール脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。コレステロール脱水素酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本発明の測定方法におけるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明のLDL−Cの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度は通常0.001〜800U/mLであり、0.01〜300U/mLが好ましい。
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、酸化型補酵素が使用される。酸化型補酵素としては、例えばNAD、NADP、チオ(thio)−NAD、チオ(thio)−NADP等が挙げられる。
本発明において用いられるポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル(以下、POE・POAアルキルアリールエーテルと略記する)におけるアルキルとしては例えばオクチル、ノニル、デシル、ドデシルなどが挙げられ、POE・POAアルキルアリールエーテルにおけるアリールとしてはフェニル等が挙げられる。POE・POAアルキルアリールエーテルにおけるPOE・POAの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー等が挙げられる。POE・POAアルキルアリールエーテルにおけるポリオキシアルキレン(POA)としては、ポリオキシエチレン以外のポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。POE・POAアルキルアリールエーテルの具体例としては、エマルゲンL40等(花王社製)、アクロネセスKP189R、アクロネセスKP189R−40、アクロネセスNP−189R(以上、日油社製)等が挙げられる。
ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物(以下、POE・POA縮合物と略記する)におけるPOE・POAの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー等が挙げられる。POE・POA縮合物におけるポリオキシアルキレン(POA)としては、ポリオキシエチレン以外のポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。ポリオキシアルキレン(POA)の分子量としては、500〜6000であり、好ましくは1500〜4000である。POE・POA縮合物の分子量としては、500〜12000であり、好ましくは1500〜8000である。
POE・POA縮合物の具体例としては、プルロニックL−121、プルロニックP−103、プルロニックF−108(以上、旭電化社製)、プロノンB−204、アクロネセスB−208(以上、日油社製)等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルケニルエーテル(以下、POEアルケニルエーテルと略記する)のアルケニルとしては、炭素数8〜30の例えば、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、エイコセニル、ヘンエイコセニル、ドコセニル、トリコセニル、テトラコセニル、ペンタコセニル、ヘキサコセニル、ヘプタコセニル、オクタコセニル、ノナコセニル、トリアコンテニル等が挙げられ、オレイルが好ましい。POEアルケニルエーテルのポリオキシエチレンのオキシエチレンの重合度としては、好ましくは2〜80であり、より好ましくは4〜60である。POEアルケニルエーテルの具体例としては、BLAUNON EN−1530、BLAUNON EN−1540、BLAUNON EN−1560(青木油脂社製)、ノニオンE−215、ノニオンE−230,ノニオンE−235、NOFABLE EAO−9020(以上、日油社製)等が挙げられる。
ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル(以下、POE分岐アルキルエーテルと略記する)の分岐アルキルとしては炭素数6〜30の例えば、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル、イソヘネイコシル、イソドデシル、イソトリコシル、イソテトラコシル、デシルテトラデシル、イソペンタコシル、イソヘキサコシル、ドデシルテトラデシル、イソヘプタコシル、イソオクタコシル、イソノナコシル、イソトリアコンシル等が挙げられ、炭素数16以上の分岐アルキルが好ましい。炭素数16以上の分岐アルキルとしては、例えばイソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル、イソヘネイコシル、イソドデシル、イソトリコシル、イソテトラコシル、デシルテトラデシル、イソペンタコシル、イソヘキサコシル、ドデシルテトラデシル、イソヘプタコシル、イソオクタコシル、イソノナコシル、イソトリアコンシル等が挙げられる。POE分岐アルキルエーテルのポリオキシエチレンのオキシエチレンの重合度としては、好ましくは2〜80であり、より好ましくは4〜60である。POE分岐アルキルエーテルの具体例としては、ノニオンIC235、ノニオンIC230、ノニオンIC235、ノニオンOD225、ノニオンOD230、ノニオンOD235(以上、日油社製)、EMALEX 1615、EMALEX 1625、EMALEX 1815、EMALEX 1820、EMALEX 1825、EMALEX OD−10、EMALEX OD−16、EMALEX OD−20、EMALEX OD−25、EMALEX OD−25JJ、EMALEX 2420、EMALEX 2425(以上、日本エマルジョン社製)等が挙げられる。
ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル(以下、POE・POA分岐アルキルエーテルと略記する)の分岐アルキルとしては、炭素数6〜30の例えば、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル、イソヘネイコシル、イソドデシル、イソトリコシル、イソテトラコシル、デシルテトラデシル、イソペンタコシル、イソヘキサコシル、ドデシルテトラデシル、イソヘプタコシル、イソオクタコシル、イソノナコシル、イソトリアコンシル等が挙げられ、イソテトラコシル、デシルテトラデシルが好ましい。POE・POA分岐アルキルエーテルにおけるPOE・POAの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー等が挙げられる。POE・POA分岐アルキルエーテルにおけるポリオキシアルキレン(POA)としては、ポリオキシエチレン以外のポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。POE・POA分岐アルキルエーテルの具体例としては、ユニルーブMT−0620B、ユニルーブ50MT−2200B、ユニルーブ20MT−2000B、ユニルーブMIL−0822B(以上、日油社製)、PEN−4620、PEN−4630(以上、日光ケミカルズ社製)等が挙げられる。
第四級アンモニウム塩としては、トリメチルアルキルアンモニウム塩、ベンジルジメチルアルキルアンモニウム塩等が挙げられる。
トリメチルアルキルアンモニウム塩のアルキルとしては炭素数6〜30の例えば、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル(ラウリル)、トリデシル、テトラデシル(ミリスチル)、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、ヘプタデシル、オクタデシル(ステアリル)、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル(ベヘニル)、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシルなど等が挙げられ、炭素数8〜20のアルキルが好ましい。炭素数8〜20のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル(ラウリル)、トリデシル、テトラデシル(ミリスチル)、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、ヘプタデシル、オクタデシル(ステアリル)、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。トリメチルアルキルアンモニウム塩の塩としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、水酸化物などが挙げられる。トリメチルアルキルアンモニウム塩としては、例えばn−オクチルトリメチルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム、n−ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、n−テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、トリメチルテトラデシルアンモニウムクロリド、トリメチルセチルアンモニウムクロリド、トリメチルステアリルアンモニウムクロリド等が挙げられ、その市販品としては、例えばカチオンBB、カチオンPB−40、カチオンPB−300、カチオンVB、カチオンFB、カチオンAT2−500(以上、日油社製)等が挙げられる。
ベンジルジメチルアルキルアンモニウム塩のアルキルとしては炭素数6〜30の例えば、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル(ラウリル)、トリデシル、テトラデシル(ミリスチル)、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、ヘプタデシル、オクタデシル(ステアリル)、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル(ベヘニル)、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシルなど等が挙げられ、炭素数8〜20のアルキルが好ましい。炭素数8〜20のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル(ラウリル)、トリデシル、テトラデシル(ミリスチル)、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、ヘプタデシル、オクタデシル(ステアリル)、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。ベンジルジメチルアルキルアンモニウム塩の塩としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、水酸化物などが挙げられる。ベンジルジメチルアルキルアンモニウム塩としては、ベンジルジメチルデシルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルラウリルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロリド水和物、ベンジルセチルジメチルアンモニウムクロリド水和物、ベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリド水和物等が挙げられ、その市販品としては、カチオンM2−100、カチオンF2−35R、カチオンF2−40E、カチオンF2−50(以上、日油社製)、モリミン10−B、モリミン12−B、モリミン14-B(以上、モーリン化学社製)等が挙げられる。
第三級アミンとしては、ジメチルアルキルアミン等が挙げられる。ジメチルアルキルアミンのアルキルとしては炭素数6〜30の例えば、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル(ラウリル)、トリデシル、テトラデシル(ミリスチル)、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、ヘプタデシル、オクタデシル(ステアリル)、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル(ベヘニル)、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシルなど等が挙げられ、炭素数8〜20のアルキルが好ましい。炭素数8〜20のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル(ラウリル)、トリデシル、テトラデシル(ミリスチル)、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、ヘプタデシル、オクタデシル(ステアリル)、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。ジメチルアルキルアミンの具体例としては、ジメチルオクチルアミン、ジメチルデシルアミン、ジメチルドデシルアミン、ジメチルテトラデシルアミン、ジメチルセチルアミン、ジメチルステアリルアミン等が挙げられ、その市販品としては、三級アミンBB、三級アミンFB、三級アミンABT(以上、日油社製)等が挙げられる。
第二級アミンとしては、メチルアルキルアミン等が挙げられる。メチルアルキルアミンのアルキルとしては炭素数6〜30の例えば、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル(ラウリル)、トリデシル、テトラデシル(ミリスチル)、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、ヘプタデシル、オクタデシル(ステアリル)、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル(ベヘニル)、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシルなど等が挙げられ、炭素数8〜20のアルキルが好ましい。炭素数8〜20のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル(ラウリル)、トリデシル、テトラデシル(ミリスチル)、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、ヘプタデシル、オクタデシル(ステアリル)、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。メチルアルキルアミンの具体例としては、メチルオクチルアミン、メチルデシルアミン、メチルドデシルアミン、メチルテトラデシルアミン、メチルセチルアミン、メチルステアリルアミン等が挙げられる。
第一級アミンとしては、アルキルアミン等が挙げられる。アルキルアミンのアルキルとしては炭素数6〜30の例えば、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル(ラウリル)、トリデシル、テトラデシル(ミリスチル)、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、ヘプタデシル、オクタデシル(ステアリル)、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル(ベヘニル)、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシルなど等が挙げられ、炭素数8〜20のアルキルが好ましい。炭素数8〜20のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル(ラウリル)、トリデシル、テトラデシル(ミリスチル)、ペンタデシル、ヘキサデシル(セチル)、ヘプタデシル、オクタデシル(ステアリル)、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。アルキルアミンの具体例としては、オクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミン、テトラデシルアミン、セチルアミン、ステアリルアミン等が挙げられ、アルキルアミンの市販品としては、アミンBB、アミンPB、アミンMB、アミンAB(以上、日油社製)等が挙げられる。
本発明のLDL−Cの測定方法において、[a]POE・POAアルキルアリールエーテルと、[b]POE・POA縮合物、POEアルケニルエーテル、POE分岐アルキルエーテル及びPOE・POA分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤(以下、界面活性剤bと記す)とを用いる場合、POE・POAアルキルアリールエーテル及び界面活性剤bの濃度としては、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、それぞれの界面活性剤について、通常0.0001〜20%であり、好ましくは0.001〜5%である。
本発明のLDL−Cの測定方法において、[a]POE・POAアルキルアリールエーテルと、[b1]POE・POA縮合物とを用いる場合、POE・POAアルキルアリールエーテル及びPOE・POA縮合物の濃度としては、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、それぞれの界面活性剤について、通常0.0001〜20%であり、好ましくは0.001〜5%である。
本発明のLDL−Cの測定方法において、[a]POE・POAアルキルアリールエーテルと、[b1]POE・POA縮合物と、[b2]POEアルケニルエーテル、POE分岐アルキルエーテル及びPOE・POA分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤(以下、界面活性剤b2と記す)とを用いる場合、POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物及び界面活性剤b2の濃度としては、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、それぞれの界面活性剤について、通常0.0001〜20%であり、好ましくは0.001〜5%である。
第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウム塩からなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤(以下、界面活性剤cと記す)の濃度としては、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、通常0.00001〜20%であり、好ましくは0.0001〜5%である。
ポリアニオンの具体例としては、デキストラン硫酸もしくはその塩、ヘパリンもしくはその塩、リンタングステン酸又はその塩、硫酸化シクロデキストリン又はその塩、硫酸化オリゴ糖又はその塩等が挙げられるが、デキストラン硫酸もしくはその塩が好ましい。デキストラン硫酸としては、例えば分子量が4万、8万、20万、50万、100万、200万等のデキストラン硫酸が挙げられる。硫酸化オリゴ糖としては、例えば硫酸化アガロース、硫酸化トレハロース、コンドロイチン硫酸等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。また、本発明においては、ポリアニオンを2種以上用いてもよい。本発明のLDL−Cの測定方法におけるポリアニオンの濃度としては、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、通常0.0005〜10%であり、好ましくは0.005〜1%である。
本発明において用いられる水性媒体は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等を含み、緩衝液が好ましい。
本発明のLDL−Cの測定方法におけるpHは、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とするpHであればいずれでもよいが、例えばpH4〜10が挙げられる。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するpHに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
グッドの緩衝剤としては、例えば2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis−Tris)、N−(2−アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、N−(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸(ACES)、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(BES)、3−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕−2−アミノエタンスルホン酸(TES)、2−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、3−〔N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ〕−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)(POPSO)、3−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、3−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔(H)EPPS〕、N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕グリシン(Tricine)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)グリシン(Bicine)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)、N−シクロヘキシル−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、N−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、0.001〜2.0mol/Lが好ましく、0.005〜1.0mol/Lがより好ましい。
本発明のLDL−Cの測定方法における反応温度は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする温度であれば特に制限はないが、10〜50℃が好ましく、30〜40℃がより好ましい。汎用の自動分析装置で設定される反応温度は通常37℃である。
本発明のLDL−Cの測定方法における反応時間は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする反応時間であれば特に制限はないが、1〜60分間が好ましく、2〜30分間がより好ましい。
本発明のLDL−Cの測定方法において、LDL−Cの測定は、例えば反応により生成した過酸化水素や還元型補酵素を測定することにより行う。また、反応において消費される酸素量を測定することにより行ってもよい。
生成した過酸化水素の量は、例えば過酸化水素電極や過酸化水素測定用試薬を用いて測定することができる。過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、発光等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化発色型色原体が挙げられる。検出可能な物質が発光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を測定することにより、測定することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応してフォトンを生じ、生じたフォトンを測定することにより、測定することができる。
酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。ロイコ型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、o−フェニレンジアミン、10−N−カルボキシメチルカルバモイル−3,7−ビス(ジメチルアミノ)−10H−フェノチアジン(CCAP)、10−N−メチルカルバモイル−3,7−ビス(ジメチルアミノ)−10H−フェノチアジン(MCDP)、N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4’−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA−64)、10−N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−3,7−ビス(ジメチルアミノ)−10H−フェノチアジン ナトリウム塩(DA−67)、4,4’−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン、ビス〔3−ビス(4−クロロフェニル)メチル−4−ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、2つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。2つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
カプラーとしては、例えば4−アミノアンチピリン(4−AA)、3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。
アニリン類としては、N−(3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(TOOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン(MAOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(DAOS)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(TOPS)、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(HDAOS)、N,N−ジメチル−3−メチルアニリン、N,N−ジ(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−アセチルエチレンジアミン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−4−フルオロ−3,5−ジメトキシアニリン(F−DAOS)、N−[2−(サクシニルアミノ)エチル]−2−メトキシ−5−メチルアニリン(MASE)、N−エチル−N−[2−(サクシニルアミノ)エチル]−2−メトキシ−5−メチルアニリン(Et−MASE)等が挙げられる。
フェノール類としては、フェノール、4−クロロフェノール、3−メチルフェノール、3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香酸(HTIB)等が挙げられる。
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてペルオキシダーゼを用いる場合は、1〜100kU/Lが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、過酸化水素の測定に適した濃度であれば特に制限はないが、0.01〜10g/Lが好ましい。
還元型補酵素の測定方法としては、例えば生成した還元型補酵素の吸光度を測定する方法、還元型補酵素測定用試薬を用いる方法等が挙げられる。還元型補酵素の吸光度を測定する方法における吸光度としては、300〜500nmが好ましく、330〜400nmがより好ましく、340nm付近が特に好ましい。還元型補酵素測定用試薬は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素等が挙げられる。検出可能な物質が色素の場合の還元型補酵素測定用試薬としては、例えばジアホラーゼ、電子キャリアー及び還元発色型色原体を含有する試薬が挙げられる。電子キャリアーとしては、例えば1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェート等が挙げられる。還元型補酵素測定用試薬として、ジアホラーゼ、電子キャリアー及び還元発色型色原体を含有する試薬を用いる場合には、還元発色型色原体が変換されて生成した色素を定量することにより、還元型補酵素を定量することができる。
還元発色型色原体としては、例えば3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウム ブロミド(MTT)、2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム モノナトリウム塩(WST−1)、2−(4−ヨードフェニル)−3−(2,4−ジニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム モノナトリウム塩(WST−3)等が挙げられる。
(LDL−C測定用試薬)
本発明のLDL−C測定用試薬は、本発明のLDL−C測定方法に用いることができ、保存、流通及び使用適したキットの形態を取ることができる。本発明のLDL−C測定用キットとしては、例えば2試薬系のキット、3試薬系のキット等が挙げられるが、第一試薬と第二試薬とからなる2試薬系のキットが好ましい。
本発明のLDL−C測定用試薬及び測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬又はキットを用いて検体中のLDL−Cを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。該水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。
本発明のLDL−C測定用試薬及び測定用キットにおいては、前述のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルケニルエーテル、POE分岐アルキルエーテル、POE・POA分岐アルキルエーテル、第四級アンモニウム塩、第三級アミン、第二級アミン、第一級アミン、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、還元型補酵素測定用試薬を用いることができる。
第一試薬と第二試薬とからなる2試薬系のLDL−C測定用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される。コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を用いるLDL−C測定に用いられる2試薬系のLDL−C測定用キットにおいては、コレステロール酸化酵素は第一試薬に含有されず、第二試薬に含有される。また、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を用いるLDL−C測定に用いられる2試薬系のLDL−C測定用キットにおいては、コレステロール脱水素酵素は第一試薬に含有されず、第二試薬に含有され、酸化型補酵素は第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される。
POE・POAアリールエーテルは、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、第二試薬に含有される態様が好ましい。
界面活性剤bは、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される。
第四級アンモニウム塩は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される。
第三級アミンは、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される。
第二級アミンは、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される。
第一級アミンは、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される。
ポリアニオンは第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される。
過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体の2つの化合物、すなわち、カプラーとアニリン類、又は、カプラーとフェノール類はそれぞれ別々の試薬に含有される態様が好ましい。還元性補酵素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよいが、第一試薬、第二試薬の両方に含有されることが好ましい。
本発明のLDL−C測定用試薬及び測定用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、シュークロース、塩化カルシウム等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類等が挙げられる。
以下に、本発明のLDL−C測定用試薬の具体的態様を記すが、本発明のLDL−C測定用試薬はこれらに限定されない。
・試薬1
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有する試薬。
・試薬2
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
・試薬3
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有する試薬。
・試薬4
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
・試薬5
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有する試薬。
・試薬6
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
・試薬7
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
・試薬8
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
・試薬9
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
・試薬10
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
・試薬11
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
・試薬12
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
以下に、本発明のLDL−C測定用キットの具体的態様を記すが、本発明のLDL−C測定用キットはこれらに限定されない。
・キット1
第一試薬
ポリアニオン
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット2
第一試薬
ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、コレステロール酸化酵素
・キット3
第一試薬
ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット4
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット5
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット6
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット7
第一試薬
ポリアニオン
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット8
第一試薬
ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロール酸化酵素
・キット9
第一試薬
ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット10
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット11
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット12
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット13
第一試薬
ポリアニオン
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット14
第一試薬
ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、コレステロール酸化酵素
・キット15
第一試薬
ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット16
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット17
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット18
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット19
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット20
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、コレステロール酸化酵素
・キット21
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット22
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット23
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット24
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット25
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット26
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロール酸化酵素
・キット27
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット28
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット29
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット30
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット31
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b2、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット32
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b2、界面活性剤c、コレステロール酸化酵素
・キット33
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b2、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット34
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b2、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット35
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b2、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット36
第一試薬
ポリアニオン、POE・POA縮合物、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b2、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット37
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット38
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、コレステロール酸化酵素
・キット39
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット40
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット41
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット42
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット43
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b2
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット44
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b2、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロール酸化酵素
・キット45
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b2、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット46
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b2、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット47
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b2、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット48
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b2、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット49
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット50
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、コレステロール酸化酵素
・キット51
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット52
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット53
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット54
第一試薬
ポリアニオン、界面活性剤b、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット55
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット56
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、コレステロール脱水素酵素
・キット57
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット58
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット59
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
・キット60
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット61
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット62
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロール脱水素酵素
・キット63
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット64
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット65
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
・キット66
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット67
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット68
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、コレステロール脱水素酵素
・キット69
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット70
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット71
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
・キット72
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤b2、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット73
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット74
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、コレステロール脱水素酵素
・キット75
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット76
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット77
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
・キット78
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット79
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット80
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロール脱水素酵素
・キット81
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット82
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット83
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
・キット84
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット85
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b2、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット86
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b2、界面活性剤c、コレステロール脱水素酵素
・キット87
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b2、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット88
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b2、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット89
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b2、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
・キット90
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、POE・POA縮合物、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b2、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット91
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット92
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、コレステロール脱水素酵素
・キット93
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット94
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット95
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
・キット96
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット97
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b2
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット98
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b2、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロール脱水素酵素
・キット99
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b2、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット100
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b2、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット101
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b2、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
・キット102
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b2、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット103
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット104
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、コレステロール脱水素酵素
・キット105
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット106
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
・キット107
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
・キット108
第一試薬
ポリアニオン、酸化型補酵素、界面活性剤b、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、界面活性剤b、界面活性剤c、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例及び比較例においては、下記メーカーの試薬、酵素及び界面活性剤を使用した。
試薬
MOPS(同仁化学研究所社製)
DOSE(ダイトーケミックス社製)
硫酸ナトリウム(関東化学社製)
デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万)(アマシャム社製)
リンタングステン酸(ナカライテスク社製)
4−アミノアンチピリン(埼京化成社製)
酵素
ペルオキシダーゼ(東洋紡績社製)
CHO−CE(コレステロール酸化酵素;キッコーマン社製)
LPL−311(コレステロールエステル加水分解酵素;東洋紡績社製)
界面活性剤
ナイミーンS−220(ポリオキシエチレンオクタデシルアミン;日油社製)
ナイミーンL−207(ポリオキシエチレンドデシルアミン;日油社製)
エチレンジアミンEO40PO40(エチレンジアミンポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物;日油社製)
POE・POAアルキルアリールエーテル
エマルゲンL40(花王社製)
アクロネセスKP189R(日油社製)
アクロネセスKP189R−40(日油社製)
POE・POA縮合物
プルロニックL121(旭電化社製)
アクロネセスB208(日油社製)
POEアルケニルエーテル
BLAUNON EN−1540(青木油脂社製)
BLAUNON EN−1530(青木油脂社製)
ノニオンE−230(日油社製)
POE分岐アルキルエーテル
ノニオンOD235(日油社製)
POE・POA分岐アルキルエーテル
PEN−4620(日光ケミカルズ社製)
PEN−4630(日光ケミカルズ社製)
四級アンモニウム塩
n−オクチルトリメチルアンモニウムクロリド(東京化成工業社製)
デシルトリメチルアンモニウムブロミド(東京化成工業社製)
塩化ラウリルトリメチルアンモニウム(ナカライテスク社製)
トリメチルテトラデシルアンモニウムクロリド(東京化成工業社製)
塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム(ナカライテスク社製)
トリメチルステアリルアンモニウムクロリド(東京化成工業社製)
ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロリド水和物(東京化成工業社製)
ベンジルセチルジメチルアンモニウムクロリド水和物(東京化成工業社製)
ベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリド水和物(東京化成工業社製)
カチオンBB(日油社製)
カチオンM2−100(日油社製)
モリミン10B(モーリン化学社製)
モリミン12B(モーリン化学社製)
第三級アミン
三級アミンBB(日油社製)
N,N−ジメチル−nーデシルアミン(東京化成工業社製)
第一級アミン
アミンBB(日油社製)
アミンPB(日油社製)
アミンMB(日油社製)
[実施例1]
以下の第一試薬(試薬A)及び第二試薬(試薬a)からなるLDL−C測定用キット(キットAa1〜Aa16)を調製した。
第一試薬(試薬A)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.5 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬a1〜a16)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
エマルゲンL40 7 g/L
プルロニックL121 3 g/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
界面活性剤c [第1表にその種類(化合物名又は製品名)と濃度を示す]
[比較例1]
以下の第一試薬(試薬A)及び第二試薬(試薬a0)からなるLDL−C測定用キット(キットAa0)を調製した。
第一試薬(試薬A)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.5 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬a0)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
エマルゲンL40 7 g/L
プルロニックL121 3 g/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
[実施例2]
実施例1及び比較例1の各キットを用いて、ヒト血清30検体中のLDL−Cを以下の手順により測定した。
(1)検量線の作成
標準液として、生理食塩水(LDL−C濃度:0.0mg/dL)及び血清(LDL−C濃度:140mg/dL)を、実施例1及び比較例1の各キットを用いて、それぞれ日立7170S形自動分析装置により、LDL−C濃度と「吸光度」との間の関係を示す検量線を作成した。
ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された2つの吸光度(E1及びE2)を基に、E2からE1を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液(3μL)と第一試薬(0.15mL)とを添加し37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E1)を主波長600nm、副波長700nmで測定し、次いで、この反応液に第二試薬(0.05mL)を添加しさらに37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E2)を主波長600nm、副波長700nmで測定した。
(2)ヒト血清検体と実施例1及び比較例1の各キットとの反応による当該検体における「吸光度」の測定
(1)の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用いる以外は(1)の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、当該検体に対する「吸光度」を測定した。
(3)ヒト血清検体中のLDL−C濃度の決定
(2)で測定出した「吸光度」と、(1)で作成した検量線とから、各検体中のLDL−C濃度を決定した。
次いで、キットとして市販のLDL−C測定用キットであるデタミナーL LDL−C(協和メデックス社製)を用いて、検体として同じヒト血清30検体を用いて、上記と同様の手順により、それぞれの検体中のLDL−Cを測定した。
実施例1及び比較例1の各キットを用いた測定と、デタミナーL LDL−Cキットとを用いた測定との間の相関係数を第1表に示す。
[実施例3]
本発明のLDL−C測定用キットが高TG血清に適用できるか否かを検討した。正常血清および高TG血清(TG 1000mg/dL以上)から超遠心法を用いて比重1.006から1.063に存在するLDLを分取した。分取したLDLを、コレステロール量が100mg/dLになるように調節し、実施例1及び比較例1の各キットを用いて、実施例2と同様の方法により測定した。更に、以下の式(I)
Figure 2010055916
を用いて、LDL−C測定値における高TG血清の正常血清に対する測定値比を算出した。ここで、測定値比が1に近い程、高TG血清中のLDL−Cが正確に測定できることを意味する。測定値比を第1表に記す。
Figure 2010055916
第1表より、四級アンモニウム塩、第三級アミン又は第一級アミンを含有するキット(キットAa1〜Aa16)を用いた測定においては、界面活性剤cを含有しないキット(キットAa0)を用いた測定に比較して、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との間に、より良い相関関係が認められることが判明した。
更に、四級アンモニウム塩、第三級アミン又は第一級アミンを含有するキット(キットAa1〜Aa16)を用いた測定においては、界面活性剤cを含有しないキット(キットAa0)を用いた測定に比較して、測定値比が高く、しかも、より1に近いことが判明した。従って、本発明のキットを用いることにより、高TG検体においても、LDL−Cを正確に測定できることが判明した。
[比較例2]
以下の第一試薬(試薬A)及び第二試薬(試薬b1〜b3)からなるLDL−C測定用キット(Ab1)を調製した。
第一試薬(試薬A)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.5 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬b1〜b3)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
エマルゲンL40 7 g/L
プルロニックL121 3 g/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
界面活性剤 (第2表にその種類と濃度を示す)
[比較例3]
キットとして、比較例2のAb1〜Ab3それぞれのキットを用いて、検体として、実施例2で使用した検体と同じヒト血清30検体を用いて、実施例2と同様の方法により、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との相関係数を算出した。その結果を第2表に示す。
Figure 2010055916
第2表より、第四級アンモニウム塩、第三級アミン又は第一級アミンを含有するキット(キットAa1〜Aa16)を用いた測定においては、含窒素ポリオキシエチレン系界面活性剤を含有する比較例2のキット(キットAb1〜Ab3)を用いた測定に比較して、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との間に、より良い相関関係が認められることが判明した。
[実施例4]
以下の第一試薬(試薬B)及び第二試薬(試薬a3)からなるLDL−C測定用キット(キットBa3)を調製した。
第一試薬(試薬B)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
リンタングステン酸 0.5 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬a3)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
エマルゲンL40 7 g/L
プルロニックL121 3 g/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
塩化ラウリルトリメチルアンモニウム 0.06 g/L
[比較例4]
以下の第一試薬(試薬C)及び第二試薬(試薬a3)からなるLDL−C測定用キット(キットCa3)を調製した。
第一試薬(試薬C)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬a3)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
エマルゲンL40 7 g/L
プルロニックL121 3 g/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
塩化ラウリルトリメチルアンモニウム 0.06 g/L
[実施例5]
キットとして、実施例1のAa3、実施例4のBa3、比較例4のCa3のキットを用いて、検体として、実施例2で使用した検体と同じヒト血清30検体を用いて、実施例2と同様の方法により、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との相関係数を算出した。その結果を第3表に示す。
Figure 2010055916
第3表より、ポリアニオンを含有するキット(キットAa3、Ba3)を用いた測定においては、ポリアニオンを含有しない比較例4のキット(キットCa3)を用いた測定に比較して、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との間に、より良い相関関係が認められることが判明した。
[実施例6]
以下の第一試薬(試薬A)及び第二試薬(試薬c1、d1、d2、e1、e2)からなるLDL−C測定用キット(Ac1、Ad1、Ad2、Ae1、Ae2)を調製した。
第一試薬(試薬A)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.5 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬c1、d1、d2、e1、e2)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
界面活性剤 (第4表にその種類と濃度を示す)
[比較例5]
以下の第一試薬(試薬A)及び第二試薬(試薬f1、f2、g1、g2)からなるLDL−C測定用キット(Af1、Af2、Ag1、Ag2)を調製した。
第一試薬(試薬A)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.5 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬f1、f2、g1、g2)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
界面活性剤 (第4表にその種類と濃度を示す)
[実施例7]
キットとして、実施例6のキット(キットAc1、Ad1、Ad2、Ae1、Ae2)、比較例5のキット(キットAf1、Af2、Ag1、Ag2)の各キットを用いて、検体として、実施例2で使用した検体と同じヒト血清30検体を用いて、実施例2と同様の方法により、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との相関係数を算出した。その結果を第4表に示す。
Figure 2010055916
第4表より、実施例6のキット(キットAc1、Ad1、Ad2、Ae1、Ae2)を用いた測定においては、界面活性剤bを含まない比較例5のキット(キットAf1、Af2)、及び、POE・POAアルキルアリールエーテルを含まない比較例5のキット(キットAg1、Ag2)を用いた測定に比較して、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との間に、より良い相関関係が認められることが判明した。
[実施例8]
以下の第一試薬(試薬D)及び第二試薬(試薬h1)からなるLDL−C測定用キット(キットDh1)を調製した。
第一試薬(試薬D)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1.0 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
PEN−4620 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬h1)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
アクロネセスKP189R−40 8 g/L
プルロニックL121 3 g/L
カチオンBB 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
LPL−311 1.0 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
[実施例9]
以下の第一試薬(試薬E)及び第二試薬(試薬h1)からなるLDL−C測定用キット(キットEh1)を調製した。
第一試薬(試薬E)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1.0 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
PEN−4630 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬h1)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
アクロネセスKP189R−40 8 g/L
プルロニックL121 3 g/L
カチオンBB 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
LPL−311 1.0 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
[実施例10]
以下の第一試薬(試薬F)及び第二試薬(試薬i1)からなるLDL−C測定用キット(キットFi1)を調製した。
第一試薬(試薬F)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1.0 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
BLAUNON EN−1530 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬i1)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R−40 5 g/L
プルロニックL121 5 g/L
カチオンBB 0.3 g/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
[実施例11]
以下の第一試薬(試薬F)及び第二試薬(試薬j1)からなるLDL−C測定用キット(キットFj1)を調製した。
第一試薬(試薬F)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1.0 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
BLAUNON EN−1530 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬j1)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 9 g/L
プルロニックL121 5 g/L
カチオンBB 0.3 g/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
[実施例12]
以下の第一試薬(試薬G)及び第二試薬(試薬i1)からなるLDL−C測定用キット(キットGi1)を調製した。
第一試薬(試薬G)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1.0 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ノニオンE−230 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬i1)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R−40 5 g/L
プルロニックL121 5 g/L
カチオンBB 0.3 g/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
[実施例13]
以下の第一試薬(試薬G)及び第二試薬(試薬j1)からなるLDL−C測定用キット(キットGj1)を調製した。
第一試薬(試薬G)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1.0 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ノニオンE−230 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬j1)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 9 g/L
プルロニックL121 5 g/L
カチオンBB 0.3 g/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
[実施例14]
以下の第一試薬(試薬H)及び第二試薬(試薬i1)からなるLDL−C測定用キット(キットHi1)を調製した。
第一試薬(試薬H)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1.0 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ノニオンOD230 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬i1)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R−40 5 g/L
プルロニックL121 5 g/L
カチオンBB 0.3 g/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
[実施例15]
以下の第一試薬(試薬H)及び第二試薬(試薬j1)からなるLDL−C測定用キット(キットHj1)を調製した。
第一試薬(試薬H)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1.0 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ノニオンOD230 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬j1)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 9 g/L
プルロニックL121 5 g/L
カチオンBB 0.3 g/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
[実施例16]
以下の第一試薬(試薬H)及び第二試薬(試薬k1)からなるLDL−C測定用キット(キットHk1)を調製した。
第一試薬(試薬H)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1.0 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ノニオンOD230 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬k1)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 9 g/L
プルロニックL121 5 g/L
トリメチルデシルアンモニウムクロリド 0.5 g/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
[実施例17]
以下の第一試薬(試薬I)及び第二試薬(試薬l1)からなるLDL−C測定用キット(キットIl1)を調製した。
第一試薬(試薬I)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1.0 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
アクロネセスB208 1.3 g/L
LPL311 0.4 kU/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬l1)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
アクロネセスKP189R−40 5 g/L
カチオンBB 0.1 g/L
CHO−CE 1.0 kU/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
[実施例18]
以下の第一試薬(試薬J)及び第二試薬(試薬m1)からなるLDL−C測定用キット(キットJm1)を調製した。
第一試薬(試薬J)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1.0 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
アクロネセスB208 1 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬m1)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
アクロネセスKP189R−40 7 g/L
プルロニックL121 3 g/L
カチオンBB 0.2 g/L
CHO−CE 1.0 kU/L
LPL311 1.2 kU/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
[実施例19]
キットとして、実施例8〜18記載の各キットを用いて、検体として、実施例2で使用した検体と同じヒト血清30検体を用いて、実施例2と同様の方法により測定を行い、各検体中のLDL−Cの濃度を決定した。同様に、同じ検体について、デタミナーL LDL−Cを用いて測定を行い、各検体中のLDL−Cの濃度を決定した。次いで、実施例8〜18の各キットを用いた測定と、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との間の相関係数を算出した。その結果を第5表に示す。
Figure 2010055916
第5表より、第一試薬にPOE・POA縮合物、POEアルケニルエーテル、POE分岐アルキルエーテル又はPOE・POA分岐アルキルエーテルを含有するキットにおいても、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との間に、非常によい相関関係が認められることが判明した。
[実施例20]
以下の第一試薬(試薬K)及び第二試薬(試薬n1〜n4)からなるLDL−C測定用キット(キットKn1〜Kn4)を調製した。
第一試薬(試薬K)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1.0 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
アクロネセスB208 1 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
LPL311 0.4 kU/L
第二試薬(試薬n1〜n4)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
アクロネセスKP189R−40 7 g/L
プルロニックL121 3 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
界面活性剤c(第6表にその種類と濃度を示す)
[実施例21]
以下の第一試薬(試薬L)及び第二試薬(試薬o1〜o5)からなるLDL−C測定用キット(キットLo1〜Lo5)を調製した。
第一試薬(試薬L)
MOPS(pH6.5) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.75 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬o1〜5)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 13 g/L
プルロニックL121 7 g/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 2.0 kU/L
界面活性剤c(第6表にその種類と濃度を示す)
[実施例22]
キットとして、実施例20及び実施例21の各キットを用いて、検体として、実施例2で使用した検体と同じヒト血清30検体を用いて、実施例2と同様の方法により測定を行い、各検体中のLDL−Cの濃度を決定した。同様に、同じ検体について、デタミナーL LDL−Cを用いて測定を行い、各検体中のLDL−Cの濃度を決定した。次いで、実施例20及び21の各キットを用いた測定と、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との間の相関係数を算出した。その結果を第6表に示す。
Figure 2010055916
第6表より、POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物及び界面活性剤cを含有するキットにおいても、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との間に、非常によい相関関係が認められることが判明した。
[実施例23]
以下の第一試薬及び第二試薬からなるLDL−C測定用キット(キットMp1、Aq1、Mr1)を調製した。
第一試薬(試薬M又は試薬A)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.5 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
界面活性剤b2 (第7表にその種類と濃度を示す)
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬p1、q1、r1)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
POE・POAアルキルアリールエーテル (第7表にその種類と濃度を示す)
界面活性剤b1 (第7表にその種類と濃度を示す)
界面活性剤b2 (第7表にその種類と濃度を示す)
界面活性剤c (第7表にその種類と濃度を示す)
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
[比較例6]
以下の第一試薬及び第二試薬からなるLDL−C測定用キット(キットMp0、Aq0、Mr0)を調製した。
第一試薬(試薬M又は試薬A)
MOPS(pH7.2) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.5 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
界面活性剤b2 (第7表にその種類と濃度を示す)
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬p0、q0、r0)
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
POE・POAアルキルアリールエーテル (第7表にその種類と濃度を示す)
界面活性剤b1 (第7表にその種類と濃度を示す)
界面活性剤b2 (第7表にその種類と濃度を示す)
LPL−311 1.5 kU/L
CHO−CE 1.0 kU/L
[実施例24]
キットとして、実施例23のキット(キットMp1、Aq1、Mr1)、及び、比較例6のキット(キットMp0、Aq0、Mr0)の各キットを用いて、検体として、ヒト血清30検体(実施例2で使用した検体とは異なる検体)を用いて、実施例2と同様の方法により、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との相関係数を算出した。その結果を第7表に示す。
Figure 2010055916
第7表より、実施例23のキット(キットMp1、Aq1、Mr1)を用いた測定においては、界面活性剤cを含まない比較例6のキット(キットMp0、Aq0、Mr0)を用いた測定に比較して、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との間に、より良い相関関係が認められることが判明した。
本発明により、メタボリックシンドロームや動脈硬化等の診断に有用なLDL−Cの測定方法、測定用試薬及び測定用キットが提供される。

Claims (31)

  1. 検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
    [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;及び、
    [d]ポリアニオン
    の存在下に反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
  2. 検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
    [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;及び、
    [d]ポリアニオン
    の存在下に反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
  3. 検体と、(i)コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素の組み合わせ、又は、(ii)コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素の組み合わせとを、
    [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
    [b2]ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;及び、
    [d]ポリアニオン
    の存在下に反応させ、該反応で生成する物質又は消費される物質を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
  4. 第四級アンモニウム塩が、トリメチルアルキルアンモニウム塩又はベンジルジメチルアルキルアンモニウム塩である請求項1〜3のいずれかに記載の測定方法。
  5. 第三級アミンが、ジメチルアルキルアミンである請求項1〜3のいずれかに記載の測定方法。
  6. 生成する物質が、過酸化水素である請求項1〜5のいずれかに記載の測定方法。
  7. 過酸化水素の測定が、過酸化水素測定用試薬を用いて行われる請求項6記載の測定方法。
  8. 生成する物質が、還元型補酵素である請求項1〜5のいずれかに記載の測定方法。
  9. 還元型補酵素の測定が、還元型補酵素測定用試薬を用いて行われる請求項8記載の測定方法。
  10. [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [d]ポリアニオン;及び、
    コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
  11. [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [d]ポリアニオン;及び、
    コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
  12. [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
    [b2]ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [d]ポリアニオン;及び、
    コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
  13. さらに、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素と検体との反応で生成する物質を測定する試薬を含有する、請求項10〜12のいずれかに記載の測定用試薬。
  14. コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素と検体との反応で生成する物質が、過酸化水素である、請求項13記載の測定用試薬。
  15. [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [d]ポリアニオン;及び、
    コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
  16. [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [d]ポリアニオン;及び、
    コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
  17. [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
    [b2]ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [d]ポリアニオン;及び、
    コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
  18. さらに、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素と検体との反応で生成する物質を測定する試薬を含有する、請求項15〜17のいずれかに記載の測定用試薬。
  19. コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素と検体との反応で生成する物質が、還元型補酵素である、請求項18記載の測定用試薬。
  20. 第四級アンモニウム塩が、トリメチルアルキルアンモニウム塩又はベンジルジメチルアルキルアンモニウム塩である請求項10〜19のいずれかに記載の測定用試薬。
  21. 第三級アミンが、ジメチルアルキルアミンである請求項10〜19のいずれかに記載の測定用試薬。
  22. [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [d]ポリアニオン、
    及び、コレステロールエステル加水分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む第一試薬、コレステロール酸化酵素を含む第二試薬を含有し、上記[a]〜[d]及びコレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
  23. [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [d]ポリアニオン、
    及び、コレステロールエステル加水分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む第一試薬、コレステロール酸化酵素を含む第二試薬を含有し、上記[a]〜[d]及びコレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
  24. [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
    [b2]ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [d]ポリアニオン、
    及び、コレステロールエステル加水分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む第一試薬、コレステロール酸化酵素を含む第二試薬を含有し、上記[a]〜[d]及びコレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
  25. さらに、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有する請求項22〜24のいずれかに記載の測定用キット。
  26. [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [d]ポリアニオン、
    酸化型補酵素、及び、コレステロールエステル加水分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む第一試薬、コレステロール脱水素酵素を含む第二試薬を含有し、上記[a]〜[d]、酸化型補酵素及びコレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
  27. [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [d]ポリアニオン、
    酸化型補酵素、及び、コレステロールエステル加水分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む第一試薬、コレステロール脱水素酵素を含む第二試薬を含有し、上記[a]〜[d]、酸化型補酵素及びコレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
  28. [a]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル;
    [b1]ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物;
    [b2]ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテルからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [c]第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン及び第四級アンモニウムからなる群より選ばれる1つ以上の界面活性剤;
    [d]ポリアニオン、
    酸化型補酵素、及び、コレステロールエステル加水分解酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを含む第一試薬、コレステロール脱水素酵素を含む第二試薬を含有し、上記[a]〜[d]、酸化型補酵素及びコレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定用キット。
  29. さらに、還元型補酵素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、請求項26〜28のいずかに記載の測定用キット。
  30. 第四級アンモニウム塩が、トリメチルアルキルアンモニウム塩又はベンジルジメチルアルキルアンモニウム塩である請求項22〜29のいずれかに記載の測定用キット。
  31. 第三級アミンが、ジメチルアルキルアミンである請求項22〜29のいずれかに記載の測定用キット。
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