CN102209789B - 低密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法、测定用试剂及测定用试剂盒 - Google Patents

低密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法、测定用试剂及测定用试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使样品与(i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、或(ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合在[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；[b]选自由聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；和[d]聚阴离子的存在下反应，并测定该反应生成的物质或消耗的物质。

Description

低密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法、测定用试剂及测定用试剂盒
技术领域
本发明涉及样品中所含的低密度脂蛋白(以下称为LDL)中的胆固醇(以下简称为LDL-C)的测定方法及测定用试剂盒。
背景技术
LDL具有向外周细胞供给胆固醇的作用，是以冠状动脉硬化为代表的各种动脉硬化的直接因子。LDL-C的增加是动脉硬化疾病的主要危险因子之一，对其进行分类定量在临床上是有用的。
现有的LDL-C的定量方法可以举出超速离心法、电泳法、利用Friedewald公式的计算方法等。
超速离心法是利用脂蛋白的比重差，使用超速离心分离机分离LDL后，测定其胆固醇量的方法(非专利文献1)。
但是，利用超速离心法的分离操作繁杂，而且在快速性、简便性等方面存在缺点。
电泳法有利用脂蛋白的电荷差、以琼脂糖凝胶等作为支撑体进行分离的方法和利用脂蛋白的粒子尺寸差、以聚丙烯酰胺凝胶作为支撑体进行分离的方法等。但是，电泳法缺乏定量性，在简便性、经济性等方面存在问题。
在利用Friedewald公式的计算方法中，由总胆固醇(以下简称为T-C)、高密度脂蛋白(以下称为HDL)中的胆固醇(以下简称为HDL-C)和总甘油三酯(以下简称为T-TG)的测定值，按照以下的计算式算出LDL-C量(非专利文献2)。
(LDL-C)＝(T-C)-(HDL-C)-(T-TG)/5
但是，该方法受到血清中的T-TG含量和饮食的影响，因此准确性存在问题。
另外，近年来，还报道了不需要超速离心法等分离操作、可搭载于通用的自动分析仪装置上的LDL-C的定量方法。
其中，作为定量LDL-C的方法，已知以下方法。
一种被测试样中的LDL-C的定量方法，其中，包括：在作用于LDL以外的脂蛋白的表面活性剂的存在下，使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶发生作用，除去生成的过氧化氢，由此除去被测试样中的HDL、超低密度脂蛋白(以下称为VLDL)和乳糜微粒中的胆固醇的第一步骤；和接着定量被测试样中的残存胆固醇的第二步骤(专利文献1)。
一种LDL-C的定量方法，其中，在血清中添加选自聚氧乙烯亚烷基苯基醚和聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚的表面活性剂、以及胆固醇测定用酶试剂，使脂蛋白中的HDL中和VLDL中的胆固醇优先反应后，测定残留的胆固醇的反应量(专利文献2)。
一种选择性地测定LDL-C的方法，其中，在生物试样中添加聚氧乙烯衍生物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、以及胆固醇测定用酶，选择性地测定脂蛋白中的LDL-C(专利文献3)。
一种LDL-C的测定方法，其特征在于，在二甲基-α-环糊精和/或聚-β-环糊精的存在下对生物试样进行测定(专利文献4)。
一种试样中的LDL-C的定量方法，用于直接地、选择性地测定含有乳糜微粒、HDL、LDL、VLDL中的任意1种以上的试样中的胆固醇，其中，在磷脂、含有类磷脂基的化合物的存在下定量试样中的LDL-C(专利文献5)。
但是，还在寻求更简便且准确地测定样品中的LDL-C的方法和试剂盒。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平10-38888号公报
专利文献2：日本特开平9-313200号公报
专利文献3：WO00/17388小册子
专利文献4：日本特开平11-30617号公报
专利文献5：日本特开2002-202314号公报
非专利文献
非专利文献1：アドバンスド·リピツド·リサ一チ(Adv.Lipid Res.)、第6卷、第1页、1968年
非专利文献2：クリニカル·ケミストリ一(Clin.Chem.)、第18卷、第499页、1972年
发明内容
本发明的目的在于，提供用于简便且准确地测定样品中的LDL-C的方法、试剂及试剂盒。
本发明人对LDL-C的测定方法进行了专心研究，结果发现，通过在特定的表面活性剂和聚阴离子的存在下使样品与胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、或胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合反应，能够在不除去LDL以外的脂蛋白中的胆固醇、并且不进行脂蛋白的物理的级分分离操作的情况下简便且准确地测定样品中的LDL-C，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下(1)～(31)。
(1)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使样品与(i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、或(ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合在
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b]选自由聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；和
[d]聚阴离子
的存在下反应，并测定该反应生成的物质或消耗的物质。
(2)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使样品与(i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、或(ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合在
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；和
[d]聚阴离子
的存在下反应，并测定该反应生成的物质或消耗的物质。
(3)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使样品与(i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、或(ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合在
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[b2]选自由聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；和
[d]聚阴离子
的存在下反应，并测定该反应生成的物质或消耗的物质。
(4)如(1)～(3)中任一项所述的测定方法，其中，季铵盐为三甲基烷基铵盐或苄基二甲基烷基铵盐。
(5)如(1)～(3)中任一项所述的测定方法，其中，叔胺为二甲基烷基胺。
(6)如(1)～(5)中任一项所述的测定方法，其中，生成的物质为过氧化氢。
(7)如(6)所述的测定方法，其中，过氧化氢的测定使用过氧化氢测定用试剂进行。
(8)如(1)～(5)中任一项所述的测定方法，其中，生成的物质为还原型辅酶。
(9)如(8)所述的测定方法，其中，还原型辅酶的测定使用还原型辅酶测定用试剂进行。
(10)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，其特征在于，含有：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b]选自由聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]聚阴离子；及
胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶。
(11)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，其特征在于，含有：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]聚阴离子；及
胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶。
(12)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，其特征在于，含有：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[b2]选自由聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]聚阴离子；及
胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶。
(13)如(10)～(12)中任一项所述的测定用试剂，其中，还含有用于测定胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶与样品的反应生成的物质的试剂。
(14)如(13)所述的测定用试剂，其中，胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶与样品的反应生成的物质为过氧化氢。
(15)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，其特征在于，含有：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b]选自由聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]聚阴离子；及
胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶。
(16)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，其特征在于，含有：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]聚阴离子；及
胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶。
(17)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，其特征在于，含有：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[b2]选自由聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]聚阴离子；及
胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶。
(18)如(15)～(17)中任一项所述的测定用试剂，其中，还含有用于测定胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶与样品的反应生成的物质的试剂。
(19)如(18)所述的测定用试剂，其中，胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶与样品的反应生成的物质为还原型辅酶。
(20)如(10)～(19)中任一项所述的测定用试剂，其中，季铵盐为三甲基烷基铵盐或苄基二甲基烷基铵盐。
(21)如(10)～(19)中任一项所述的测定用试剂，其中，叔胺为二甲基烷基胺。
(22)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，其特征在于，包含第一试剂和含有胆固醇氧化酶的第二试剂，所述第一试剂含有选自由
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b]选自由聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]聚阴离子、和
胆固醇酯水解酶构成的组中的至少一种物质，
所述[a]～[d]和胆固醇酯水解酶分别包含在第一试剂和第二试剂的任一者或两者中。
(23)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，其特征在于，包含第一试剂和含有胆固醇氧化酶的第二试剂，所述第一试剂含有选自由
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]聚阴离子、和
胆固醇酯水解酶构成的组中的至少一种物质，
所述[a]～[d]和胆固醇酯水解酶分别包含在第一试剂和第二试剂的任一者或两者中。
(24)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，其特征在于，包含第一试剂和含有胆固醇氧化酶的第二试剂，所述第一试剂含有选自由
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[b2]选自由聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]聚阴离子、和
胆固醇酯水解酶构成的组中的至少一种物质，
所述[a]～[d]和胆固醇酯水解酶分别包含在第一试剂和第二试剂的任一者或两者中。
(25)如(22)～(24)中任一项所述的测定用试剂盒，其中，第一试剂和第二试剂的任一者或两者中还含有过氧化氢测定用试剂。
(26)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，其特征在于，包含第一试剂和含有胆固醇脱氢酶的第二试剂，所述第一试剂含有选自由
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b]选自由聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]聚阴离子、及
氧化型辅酶和胆固醇酯水解酶构成的组中的至少一种物质，
所述[a]～[d]、氧化型辅酶和胆固醇酯水解酶分别包含在第一试剂和第二试剂的任一者或两者中。
(27)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，其特征在于，包含第一试剂和含有胆固醇脱氢酶的第二试剂，所述第一试剂含有选自由
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]聚阴离子、及
氧化型辅酶和胆固醇酯水解酶构成的组中的至少一种物质，
所述[a]～[d]、氧化型辅酶和胆固醇酯水解酶分别包含在第一试剂和第二试剂的任一者或两者中。
(28)一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，其特征在于，包含第一试剂和含有胆固醇脱氢酶的第二试剂，所述第一试剂含有选自由
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[b2]选自由聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]聚阴离子、及
氧化型辅酶和胆固醇酯水解酶构成的组中的至少一种物质，
所述[a]～[d]、氧化型辅酶和胆固醇酯水解酶分别包含在第一试剂和第二试剂的任一者或两者中。
(29)如(26)～(28)中任一项所述的测定用试剂盒，其特征在于，第一试剂和第二试剂的任一者或两者中还含有还原型辅酶测定用试剂。
(30)如(22)～(29)中任一项所述的测定用试剂盒，其中，季铵盐为三甲基烷基铵盐或苄基二甲基烷基铵盐。
(31)如(22)～(29)中任一项所述的测定用试剂盒，其中，叔胺为二甲基烷基胺。
根据本发明，可以提供用于简便且准确地测定样品中的LDL-C的方法、试剂和试剂盒。
具体实施方式
本发明的样品中的LDL-C的测定方法是不需要利用离心分离等物理方法来进行脂蛋白的级分分离操作的方法。另外，本发明的测定方法是在LDL-C的测定之前不除去样品中的LDL以外的脂蛋白中的胆固醇的情况下测定样品中的LDL-C的方法。另外，本发明的测定方法是在LDL-C的测定之前不测定样品中的LDL以外的脂蛋白中的胆固醇的情况下测定样品中的LDL-C的方法。
本发明的测定方法的一个方式是具有如下特征的方法：使样品与(i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、或(ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合在
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b]选自由聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；和
[d]聚阴离子
的存在下反应，并测定该反应生成的物质或消耗的物质。
本发明的测定方法的另一方式是具有如下特征的方法：使样品与(i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、或(ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合在
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；和
[d]聚阴离子
的存在下反应，并测定该反应生成的物质或消耗的物质。
此外，本发明的测定方法的又一方式是具有如下特征的方法：使样品与(i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、或(ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合在
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[b2]选自由聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；和
[d]聚阴离子
的存在下反应，并测定该反应生成的物质或消耗的物质。
任何一种方式中均包括以下步骤：
[1]在表面活性剂和聚阴离子的共存下进行样品与酶类的反应的步骤；
[2]测定上述[1]的步骤中生成的物质或消耗的物质的步骤；
[3]使预先利用已知浓度的LDL-C制作的、表示LDL-C浓度和得自该生成的物质或该消耗的物质的信息量的关系的标准曲线与上述[2]中的测定值相关的步骤；和
[4]确定样品中的LDL-C浓度的步骤。在此，与样品的反应中使用的酶类是(i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、或(ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合。
本发明的测定方法中，作为样品与酶类的反应所生成的物质，例如可以举出过氧化氢、还原型辅酶等，作为样品与酶类的反应所消耗的物质，例如可以举出氧分子等。生成的过氧化氢可以使用例如过氧化氢电极或后述的过氧化氢测定用试剂进行测定。对于生成的还原型辅酶，例如可以举出测定还原型辅酶的吸光度的方法和使用后述的还原型辅酶测定用试剂的方法等。还原型辅酶的吸光度测定中使用的波长优选为300～500nm，更优选为330～400nm，特别优选340nm。消耗的氧分子可以使用例如氧电极进行测定。
作为本发明的测定方法中使用的样品，例如可以举出全血、血浆、血清等，优选血浆和血清。另外，本发明的测定方法中，不仅可以使用来自健康人的样品，也可以使用中性脂肪(TG)高的高TG样品。
作为本发明中的胆固醇酯水解酶，只要是具有水解胆固醇酯的能力的酶则没有特别限定，例如，除来自动物、植物或微生物的胆固醇酯酶、脂蛋白脂酶以外，还可以使用通过基因工程的方法制造的胆固醇酯酶、脂蛋白脂酶等。
作为胆固醇酯水解酶，除了无修饰的胆固醇酯水解酶以外，还可以使用经过化学修饰的胆固醇酯水解酶。另外，作为胆固醇酯水解酶，也可以使用市售品。
作为市售的胆固醇酯水解酶，可以举出：胆固醇酯酶(COE-311；东洋纺织公司制)、脂蛋白脂酶(LPL-311；东洋纺织公司制)、胆固醇酯酶III(CHEIII；天野制药公司制)等。另外，本发明中，也可以将两种以上的胆固醇酯水解酶组合使用。
胆固醇酯水解酶的化学修饰中，作为修饰该酶的基团(化学修饰基团)，例如可以举出：以聚乙二醇为主要成分的基团、以聚丙二醇为主要成分的基团、具有聚丙二醇和聚乙二醇的共聚物的基团、含有水溶性多糖类的基团、磺丙基、磺丁基、聚氨酯基、具有螯合功能的基团等，优选以聚乙二醇为主要成分的基团。作为水溶性多糖类，例如可以举出：葡聚糖、普鲁兰多糖、可溶性淀粉等。
作为用于对胆固醇酯水解酶进行化学修饰的试剂(化学修饰剂)，可以举出：同时具有上述化学修饰基团和可与酶的氨基、羧基、巯基等反应的官能团或结构的化合物等。作为可与酶中的氨基反应的官能团或结构，例如可以举出：羧基、活性酯基(N-羟基琥珀酰亚胺基等)、酸酐、酰氯化物、醛、环氧基、1，3-丙烷磺内酯、1，4-丁烷磺内酯等。作为可与酶中的羧基反应的官能团或结构，例如可以举出氨基等。作为与酶中的巯基具有反应性的基团或结构，例如可以举出：马来酰亚胺基、二硫化物、α-卤代酯(α-碘代酯等)等。
作为化学修饰剂，也可以使用市售品。作为市售的化学修饰剂，可以举出：具有以聚乙二醇为主要成分的基团和N-羟基琥珀酰亚胺基的Sunbright VFM-4101、Sunbright ME-050AS、Sunbright DE-030AS(均为日油公司制)、具有以聚亚烷基二醇为主要成分的基团和酸酐结构的Sunbright AKM系列(例如Sunbright AKM-1510等)、Sunbright ADM系列、Sunbright ACM系列(均为日油公司制)、具有以聚乙二醇为主要成分的基团和环氧基的EPOX-3400、M-EPOX-5000(均为SheawaterPolymers公司制)、包含具有螯合功能的基团和酸酐结构的二亚乙基三胺-N，N，N’，N”，N”-五乙酸二酐(DTPA anhydride；同仁化学研究所公司制)等。
胆固醇酯水解酶的化学修饰例如可以通过以下的方法进行，但并不限定于本方法。首先，将胆固醇酯水解酶溶解在pH8.0以上的缓冲液(例如HEPES缓冲液)中，在0～55℃下添加0.01～500倍摩尔量的化学修饰剂，搅拌5分钟～5小时。酶反应中，作为经过化学修饰的胆固醇酯水解酶，不仅可以使用该反应液本身，还可以使用根据需要利用超滤膜等将未反应的化学修饰剂等除去后而得到的物质。
作为本发明的测定方法中的胆固醇酯水解酶的浓度，只要是能够实施本发明的LDL-C测定的浓度，则没有特别限定，反应液中的浓度通常为0.001～800U/mL，优选为0.01～300U/mL。
作为本发明中的胆固醇氧化酶，只要是具有氧化胆固醇而生成过氧化氢的能力的酶，则没有特别限定，例如，除来自动物、植物或微生物的胆固醇氧化酶以外，还可以使用利用基因工程的方法制造的胆固醇氧化酶等，还可以使用胆固醇氧化酶(CHODI；协和发酵工业公司制)、胆固醇氧化酶(CHODI；KIKKOMAN公司制)、胆固醇氧化酶(CHO-CE；KIKKOMAN公司制)、胆固醇氧化酶(COO-321；东洋纺织公司制)等市售品。另外，本发明中，也可以组合使用两种以上的胆固醇氧化酶。
胆固醇氧化酶可以是无修饰的酶，也可以是经过化学修饰的酶。经过化学修饰的胆固醇氧化酶例如可以使用前述的化学修饰剂，通过前述的化学修饰方法来制造。
作为本发明的测定方法中的胆固醇氧化酶的浓度，只要是能够实施本发明的LDL-C测定的浓度，则没有特别限定。反应液中的浓度通常为0.001～800U/mL，优选为0.01～300U/mL。
作为本发明中的胆固醇脱氢酶，只要是具有在氧化型辅酶的存在下氧化胆固醇而生成还原型辅酶的能力的酶，则没有特别限定，例如，除来自动物、植物或微生物的胆固醇脱氢酶以外，还可以使用利用基因工程的方法制造的胆固醇脱氢酶等。也可以使用胆固醇脱氢酶“Amano”5(CHDH5；天野酶制品株式会社制)等市售品。另外，本发明中，也可以组合使用两种以上的胆固醇脱氢酶。胆固醇脱氢酶可以是无修饰的酶，也可以是经过化学修饰的酶。经过化学修饰的胆固醇脱氢酶例如可以使用前述的化学修饰剂，通过前述的化学修饰方法来制造。
作为本发明的测定方法中的胆固醇脱氢酶的浓度，只要是能够实施本发明的LDL-C测定的浓度，则没有特别限定，反应液中的浓度通常为0.001～800U/mL，优选为0.01～300U/mL。
本发明的使用胆固醇脱氢酶的测定方法中，使用氧化型辅酶。作为氧化型辅酶，例如可以举出NAD、NADP、硫代-NAD、硫代-NADP等。
作为本发明中使用的聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚(以下简称为POE-POA烷基芳基醚)中的烷基，例如可以举出：辛基、壬基、癸基、十二烷基等，作为POE-POA烷基芳基醚中的芳基，可以举出苯基等。作为POE-POA烷基芳基醚中的POE-POA的聚合方式，没有特别限定，例如可以举出：嵌段聚合型、无规聚合型的聚合方式。作为嵌段聚合型，例如可以举出：二嵌段共聚物、三嵌段共聚物、四嵌段共聚物等。作为POE-POA烷基芳基醚中的聚氧化烯(POA)，可以举出聚氧乙烯以外的聚氧丙烯、聚氧丁烯等。作为POE-POA烷基芳基醚的具体例，可以举出：Emulgen L40等(花王公司制)、Acronecess KP189R、AcronecessKP189R-40、Acronecess NP-189R(以上为日油公司制)等。
作为聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物(以下简称为POE-POA缩合物)中的POE-POA的聚合方式，没有特别限定，例如可以举出：嵌段聚合型、无规聚合型的聚合方式。作为嵌段聚合型，例如可以举出：二嵌段共聚物、三嵌段共聚物、四嵌段共聚物等。作为POE-POA缩合物中的聚氧化烯(POA)，可以举出聚氧乙烯以外的聚氧丙烯、聚氧丁烯等。聚氧化烯(POA)的分子量为500～6000，优选为1500～4000。POE-POA缩合物的分子量为500～12000，优选为1500～8000。
作为POE-POA缩合物的具体例，可以举出：Pluronic L-121、Pluronic P-103、Pluronic F-108(以上为旭电化公司制)、Pronon B-204、Acronecess B-208(以上为日油公司制)等。
作为聚氧乙烯烯基醚(以下简称为POE烯基醚)的烯基，可以举出碳原子数8～30的烯基，例如辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、油烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、二十四碳烯基、二十五碳烯基、二十六碳烯基、二十七碳烯基、二十八碳烯基、二十九碳烯基、三十碳烯基等，优选油烯基。作为POE烯基醚的聚氧乙烯的氧乙烯的聚合度，优选为2～80，更优选为4～60。作为POE烯基醚的具体例，可以举出：BLAUNON EN-1530、BLAUNON EN-1540、BLAUNONEN-1560(青木油脂公司制)、Nonion E-215、Nonion E-230，NonionE-235、NOFABLE EAO-9020(以上为日油公司制)等。
作为聚氧乙烯支链烷基醚(以下简称为POE支链烷基醚)的支链烷基，可以举出碳原子数6～30的支链烷基，例如异己基、异庚基、异辛基、异壬基、异癸基、异十一烷基、异十二烷基、异十三烷基、异十四烷基、异十五烷基、异十六烷基、异十七烷基、异十八烷基、异十九烷基、异二十烷基、辛基十二烷基、异二十一烷基、异二十二烷基、异二十三烷基、异二十四烷基、癸基十四烷基、异二十五烷基、异二十六烷基、十二烷基十四烷基、异二十七烷基、异二十八烷基、异二十九烷基、异三十烷基等，优选碳原子数16以上的支链烷基。作为碳原子数16以上的支链烷基，例如可以举出：异十六烷基、异十七烷基、异十八烷基、异十九烷基、异二十烷基、辛基十二烷基、异二十一烷基、异二十二烷基、异二十三烷基、异二十四烷基、癸基十四烷基、异二十五烷基、异二十六烷基、十二烷基十四烷基、异二十七烷基、异二十八烷基、异二十九烷基、异三十烷基等。作为POE支链烷基醚的聚氧乙烯的氧乙烯的聚合度，优选为2～80，更优选为4～60。作为POE支链烷基醚的具体例，可以举出：Nonion IC235、Nonion IC230、NonionIC235、Nonion OD225、Nonion OD230、Nonion OD235(以上为日油公司制)、EMALEX 1615、EMALEX 1625、EMALEX 1815、EMALEX 1820、EMALEX 1825、EMALEX OD-10、EMALEX OD-16、EMALEX OD-20、EMALEX OD-25、EMALEX OD-25JJ、EMALEX 2420、EMALEX2425(以上为日本Emulsion公司制)等。
作为聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚(以下简称为POE-POA支链烷基醚)的支链烷基，可以举出碳原子数6～30的支链烷基，例如异己基、异庚基、异辛基、异壬基、异癸基、异十一烷基、异十二烷基、异十三烷基、异十四烷基、异十五烷基、异十六烷基、异十七烷基、异十八烷基、异十九烷基、异二十烷基、辛基十二烷基、异二十一烷基、异二十二烷基、异二十三烷基、异二十四烷基、癸基十四烷基、异二十五烷基、异二十六烷基、十二烷基十四烷基、异二十七烷基、异二十八烷基、异二十九烷基、异三十烷基等，优选异二十四烷基、癸基十四烷基。作为POE-POA支链烷基醚中的POE-POA的聚合方式，没有特别限定，例如可以举出嵌段聚合型、无规聚合型的聚合方式。作为嵌段聚合型，例如可以举出二嵌段共聚物、三嵌段共聚物、四嵌段共聚物等。作为POE-POA支链烷基醚中的聚氧化烯(POA)，可以举出聚氧乙烯以外的聚氧丙烯、聚氧丁烯等。作为POE-POA支链烷基醚的具体例，可以举出：Unilube MT-0620B、Unilube 50MT-2200B、Unilube20MT-2000B、Unilube MIL-0822B(以上为日油公司制)、PEN-4620、PEN-4630(以上为日光Chemicals公司制)等。
作为季铵盐，可以举出：三甲基烷基铵盐、苄基二甲基烷基铵盐等。
作为三甲基烷基铵盐的烷基，可以举出碳原子数6～30的烷基，例如己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山嵛基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等，优选碳原子数8～20的烷基。作为碳原子数8～20的烷基，例如可以举出：辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基等。作为三甲基烷基铵盐的盐，可以举出：氯化物、溴化物、碘化物、氢氧化物等。作为三甲基烷基铵盐，例如可以举出：正辛基三甲基氯化铵、癸基三甲基溴化铵、月桂基三甲基溴化铵、正十二烷基三甲基氯化铵、正十四烷基三甲基溴化铵、三甲基十四烷基氯化铵、三甲基鲸蜡基氯化铵、三甲基硬脂基氯化铵等，作为其市售品，例如可以举出：Cation BB、Cation PB-40、Cation PB-300、Cation VB、Cation FB、Cation AT2-500(以上为日油公司制)等。
作为苄基二甲基烷基铵盐的烷基，可以举出碳原子数6～30的烷基，例如己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山嵛基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等，优选碳原子数8～20的烷基。作为碳原子数8～20的烷基，例如可以举出：辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基等。作为苄基二甲基烷基铵盐的盐，可以举出：氯化物、溴化物、碘化物、氢氧化物等。作为苄基二甲基烷基铵盐，可以举出：苄基二甲基癸基溴化铵、苄基二甲基癸基氯化铵、苄基二甲基月桂基氯化铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵水合物、苄基鲸蜡基二甲基氯化铵水合物、苄基二甲基硬脂基氯化铵水合物等，作为其市售品，可以举出：Cation M2-100、Cation F2-35R、Cation F2-40E、CationF2-50(以上为日油公司制)、Morimin 10-B、Morimin 12-B、Morimin14-B(以上为Morin化学公司制)等。
作为叔胺，可以举出二甲基烷基胺等。作为二甲基烷基胺的烷基，可以举出碳原子数6～30的烷基，例如己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山嵛基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等，优选碳原子数8～20的烷基。作为碳原子数8～20的烷基，例如可以举出：辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基等。作为二甲基烷基胺的具体例，可以举出：二甲基辛胺、二甲基癸胺、二甲基十二烷基胺、二甲基十四烷基胺、二甲基鲸蜡基胺、二甲基硬脂基胺等，作为其市售品，可以举出：叔胺BB、叔胺FB、叔胺ABT(以上为日油公司制)等。
作为仲胺，可以举出甲基烷基胺等。作为甲基烷基胺的烷基，可以举出碳原子数6～30的烷基，例如己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山嵛基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等，优选碳原子数8～20的烷基。作为碳原子数8～20的烷基，例如可以举出：辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基等。作为甲基烷基胺的具体例，可以举出：甲基辛胺、甲基癸胺、甲基十二烷基胺、甲基十四烷基胺、甲基鲸蜡基胺、甲基硬脂基胺等。
作为伯胺，可以举出烷基胺等。作为烷基胺的烷基，可以举出碳原子数6～30的烷基，例如己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山嵛基)、二十三烷基、二十四烷基、二十五烷基、二十六烷基、二十七烷基、二十八烷基、二十九烷基、三十烷基等，优选碳原子数8～20的烷基。作为碳原子数8～20的烷基，例如可以举出：辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基等。作为烷基胺的具体例，可以举出：辛胺、癸胺、十二烷基胺、十四烷基胺、鲸蜡基胺、硬脂基胺等，作为烷基胺的市售品，可以举出：胺BB、胺PB、胺MB、胺AB(以上为日油公司制)等。
本发明的LDL-C的测定方法中，使用[a]POE-POA烷基芳基醚和[b]选自由POE-POA缩合物、POE烯基醚、POE支链烷基醚和POE-POA支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂(以下记为表面活性剂b)的情况下，作为POE-POA烷基芳基醚和表面活性剂b的浓度，只要是能够实施本发明的LDL-C的测定方法的浓度，则没有特别限定，对于各表面活性剂，通常为0.0001～20％，优选为0.001～5％。
本发明的LDL-C的测定方法中，使用[a]POE-POA烷基芳基醚和[b1]POE-POA缩合物的情况下，作为POE-POA烷基芳基醚和POE-POA缩合物的浓度，只要是能够实施本发明的LDL-C的测定方法的浓度，则没有特别限定，对于各表面活性剂，通常为0.0001～20％，优选为0.001～5％。
本发明的LDL-C的测定方法中，使用[a]POE-POA烷基芳基醚、[b1]POE-POA缩合物和[b2]选自由POE烯基醚、POE支链烷基醚和POE-POA支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂(以下记为表面活性剂b2)的情况下，作为POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物和表面活性剂b2的浓度，只要是能够实施本发明的LDL-C的测定方法的浓度，则没有特别限定，对于各表面活性剂，通常为0.0001～20％，优选为0.001～5％。
作为选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵盐构成的组中的1种以上表面活性剂(以下记为表面活性剂c)的浓度，只要是能够实施本发明的LDL-C的测定方法的浓度，则没有特别限定，通常为0.00001～20％，优选为0.0001～5％。
作为聚阴离子的具体例，可以举出：葡聚糖硫酸或其盐、肝素或其盐、磷钨酸或其盐、硫酸化环糊精或其盐、硫酸化寡糖或其盐等，优选葡聚糖硫酸或其盐。作为葡聚糖硫酸，例如可以举出分子量为4万、8万、20万、50万、100万、200万等的葡聚糖硫酸。作为硫酸化寡糖，例如可以举出：硫酸化琼脂糖、硫酸化海藻糖、硫酸软骨素等。作为盐，例如可以举出：钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、镁盐等。另外，本发明中，可以使用两种以上的聚阴离子。作为本发明的LDL-C的测定方法中的聚阴离子的浓度，只要是能够实施本发明的LDL-C的测定方法的浓度，则没有特别限定，通常为0.0005～10％，优选为0.005～1％。
本发明中使用的水性介质，只要是能够实施本发明的LDL-C的测定方法的水性介质，则没有特别限定，例如包括去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选缓冲液。
本发明的LDL-C的测定方法中的pH，只要是能够实施本发明的LDL-C的测定方法的pH，则可以为任意的pH，例如可以举出pH4～10。使用缓冲液作为水性介质时，优选使用符合设定的pH的缓冲剂。作为缓冲液中使用的缓冲剂，例如可以举出：三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、Good’s缓冲剂等。
作为Good’s缓冲剂，例如可以举出：2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N，N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、3-[N，N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N，N’-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等。
缓冲液的浓度只要是适合于测定的浓度，则没有特别限定，优选为0.001～2.0mol/L，更优选为0.005～1.0mol/L。
本发明的LDL-C的测定方法中的反应温度，只要是能够实施本发明的LDL-C的测定方法的温度，则没有特别限定，优选10～50℃，更优选30～40℃。常用的自动分析装置中设定的反应温度通常为37℃。
本发明的LDL-C的测定方法中的反应时间，只要是能够实施本发明的LDL-C的测定方法的反应时间，则没有特别限定，优选1～60分钟，更优选2～30分钟。
本发明的LDL-C的测定方法中，LDL-C的测定例如通过测定反应生成的过氧化氢或还原型辅酶而进行。另外，也可以通过测定反应中消耗的氧量而进行。
生成的过氧化氢的量例如可以使用过氧化氢电极或过氧化氢测定用试剂来进行测定。过氧化氢测定用试剂是用于将生成的过氧化氢转变为可检测的物质的试剂。作为可检测的物质，例如可以举出色素、发光等，优选色素。可检测的物质为色素时，过氧化氢测定用试剂含有氧化发色型色原体和过氧化物酶等过氧化活性物质。作为氧化发色型色原体，例如可以举出后述的氧化发色型色原体。可检测的物质为发光时，过氧化氢测定用试剂含有化学发光物质。作为化学发光物质，例如可以举出：鲁米诺、异鲁米诺、光泽精、吖啶酯等。
作为过氧化氢测定用试剂，使用含有氧化发色型色原体和过氧化物酶等过氧化活性物质的试剂时，过氧化氢可以通过在过氧化活性物质的存在下与氧化发色型色原体反应生成色素，测定生成的色素而进行测定。另外，使用含有化学发光物质的过氧化氢测定用试剂时，过氧化氢可以通过与化学发光物质反应而产生光子，测定产生的光子而进行测定。
作为氧化发色型色原体，例如可以举出：无色型色原体、氧化偶联发色型色原体等。无色型色原体是在过氧化氢和过氧化物酶等过氧化活性物质的存在下可单独转变为色素的物质。具体而言，可以举出：四甲基联苯胺、邻苯二胺、10-N-羧甲基氨基甲酰基-3，7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲基氨基)二苯胺钠盐(DA-64)、10-N-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)、4，4’-双(二甲基氨基)二苯胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺(BCMA)等。
氧化偶联发色型色原体是在过氧化氢和过氧化物酶等过氧化活性物质的存在下，由两种化合物氧化偶联而生成色素的物质。作为两种化合物的组合，可以举出：偶联剂和苯胺类的组合、偶联剂和酚类的组合等。
作为偶联剂，例如可以举出：4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙等。
作为苯胺类，可以举出：N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基-3-甲基苯胺、N，N-二(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰基乙二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3，5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)、N-[2-(琥珀酰基氨基)乙基]-2-甲氧基-5-甲基苯胺(MASE)、N-乙基-N-[2-(琥珀酰基氨基)乙基]-2-甲氧基-5-甲基苯胺(Et-MASE)等。
作为酚类，可以举出：苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
在过氧化氢的测定中，过氧化活性物质的浓度只要是适于测定的浓度则没有特别限定，使用过氧化物酶作为过氧化活性物质时，优选1～100kU/L。另外，氧化发色型色原体的浓度只要是适于过氧化氢的测定的浓度则没有特别限定，优选0.01～10g/L。
作为还原型辅酶的测定方法，例如可以举出：测定生成的还原型辅酶的吸光度的方法、使用还原型辅酶测定用试剂的方法等。作为测定还原型辅酶的吸光度的方法中的吸光度，优选300～500nm，更优选330～400nm，特别优选340nm左右。还原型辅酶测定用试剂是用于将生成的还原型辅酶转变为可检测的物质的试剂。作为可检测的物质，例如可以举出色素等。作为可检测的物质为色素时的还原型辅酶测定用试剂，例如可以举出含有硫辛酰胺脱氢酶、电子载体和还原发色型色原体的试剂。作为电子载体，例如可以举出：1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐等。作为还原型辅酶测定用试剂，使用含有硫辛酰胺脱氢酶、电子载体和还原发色型色原体的试剂时，通过对还原发色型色原体转变而生成的色素进行定量，可以定量还原型辅酶。
作为还原发色型色原体，例如可以举出：3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑溴化物(MTT)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四氮唑单钠盐(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四氮唑单钠盐(WST-3)等。
(LDL-C测定用试剂)
本发明的LDL-C测定用试剂可以用于本发明的LDL-C测定方法中，可以采用适于保存、流通和使用的试剂盒的形态。作为本发明的LDL-C测定用试剂盒，例如可以举出两试剂型的试剂盒、三试剂型的试剂盒等，优选由第一试剂和第二试剂构成的两试剂型的试剂盒。
本发明的LDL-C测定用试剂和测定用试剂盒可以为冷冻干燥的状态，也可以为溶解于水性介质中的状态。使用冷冻干燥的状态的试剂或试剂盒测定样品中的LDL-C时，将该试剂溶解于水性介质中来使用。作为该水性介质，例如可以举出前述的水性介质等。
在本发明的LDL-C测定用试剂和测定用试剂盒中，可以使用前述的胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶、POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、POE烯基醚、POE支链烷基醚、POE-POA支链烷基醚、季铵盐、叔胺、仲胺、伯胺、聚阴离子、过氧化氢测定用试剂、还原型辅酶测定用试剂。
在由第一试剂和第二试剂构成的两试剂型的LDL-C测定用试剂盒中，第一试剂、第二试剂的任一者或两者中含有胆固醇酯水解酶。在使用胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的LDL-C测定中使用的两试剂型的LDL-C测定用试剂盒中，第一试剂中不含有胆固醇氧化酶，第二试剂中含有胆固醇氧化酶。另外，在使用胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶和氧化型辅酶的LDL-C测定中使用的两试剂型的LDL-C测定用试剂盒中，第一试剂中不含有胆固醇脱氢酶，第二试剂中含有胆固醇脱氢酶，第一试剂、第二试剂的任一者或两者中含有氧化型辅酶。
第一试剂、第二试剂的任一者或两者中可以含有POE-POA芳基醚，优选在第二试剂中含有POE-POA芳基醚。
第一试剂、第二试剂的任一者或两者中含有表面活性剂b。
第一试剂、第二试剂的任一者或两者中含有季铵盐。
第一试剂、第二试剂的任一者或两者中含有叔胺。
第一试剂、第二试剂的任一者或两者中含有仲胺。
第一试剂、第二试剂的任一者或两者中含有伯胺。
第一试剂、第二试剂的任一者或两者中含有聚阴离子。
第一试剂、第二试剂的任一者或两者中可以含有过氧化氢测定用试剂，该试剂含有氧化偶联型色原体时，优选氧化偶联型色原体的两种化合物、即偶联剂和苯胺类、或偶联剂和酚类分别包含于不同的试剂中的方式。第一试剂、第二试剂的任一者或两者中可以含有还原性辅酶测定用试剂，优选在第一试剂、第二试剂两者中均含有还原性辅酶测定用试剂。
本发明的LDL-C测定用试剂和测定用试剂盒中，根据需要可以含有水性介质、稳定剂、防腐剂、影响物质除去剂、反应促进剂等。作为水性介质，例如可以举出前述的水性介质等。作为稳定剂，例如可以举出乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙等。作为防腐剂，例如可以举出叠氮化钠、抗生素等。作为影响物质除去剂，例如可以举出用于除去抗坏血酸的影响的抗坏血酸氧化酶等。作为反应促进剂，例如可以举出：辅脂肪酶、磷脂酶等酶、硫酸钠、氯化钠等盐类等。
以下记述本发明的LDL-C测定用试剂的具体方式，但本发明的LDL-C测定用试剂不限定于此。
·试剂1
含有POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、聚阴离子、胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的试剂。
·试剂2
含有POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、聚阴离子、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶和过氧化氢测定用试剂的试剂。
·试剂3
含有POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、聚阴离子、胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的试剂。
·试剂4
含有POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、聚阴离子、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶和过氧化氢测定用试剂的试剂。
·试剂5
含有POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、聚阴离子、胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的试剂。
·试剂6
含有POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、聚阴离子、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶和过氧化氢测定用试剂的试剂。
·试剂7
含有POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、聚阴离子、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的试剂。
·试剂8
含有POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、聚阴离子、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶和还原型辅酶测定用试剂的试剂。
·试剂9
含有POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、聚阴离子、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的试剂。
·试剂10
含有POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、聚阴离子、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶和还原型辅酶测定用试剂的试剂。
·试剂11
含有POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、聚阴离子、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的试剂。
·试剂12
含有POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、聚阴离子、胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶、胆固醇脱氢酶和还原型辅酶测定用试剂的试剂。
以下记述本发明的LDL-C测定用试剂盒的具体方式，但本发明的LDL-C测定用试剂盒不限定于此。
·试剂盒1
第一试剂
聚阴离子
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒2
第一试剂
聚阴离子、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、胆固醇氧化酶
·试剂盒3
第一试剂
聚阴离子、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒4
第一试剂
聚阴离子、过氧化氢测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒5
第一试剂
聚阴离子、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇氧化酶
·试剂盒6
第一试剂
聚阴离子、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒7
第一试剂
聚阴离子
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒8
第一试剂
聚阴离子、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇氧化酶
·试剂盒9
第一试剂
聚阴离子、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒10
第一试剂
聚阴离子、过氧化氢测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒11
第一试剂
聚阴离子、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇氧化酶
·试剂盒12
第一试剂
聚阴离子、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒13
第一试剂
聚阴离子
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒14
第一试剂
聚阴离子、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、胆固醇氧化酶
·试剂盒15
第一试剂
聚阴离子、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒16
第一试剂
聚阴离子、过氧化氢测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒17
第一试剂
聚阴离子、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇氧化酶
·试剂盒18
第一试剂
聚阴离子、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒19
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒20
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、胆固醇氧化酶
·试剂盒21
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒22
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、过氧化氢测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒23
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇氧化酶
·试剂盒24
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒25
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒26
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇氧化酶
·试剂盒27
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒28
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、过氧化氢测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒29
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇氧化酶
·试剂盒30
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒31
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b2、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒32
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b2、表面活性剂c、胆固醇氧化酶
·试剂盒33
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b2、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒34
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、过氧化氢测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b2、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒35
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b2、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇氧化酶
·试剂盒36
第一试剂
聚阴离子、POE-POA缩合物、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b2、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒37
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒38
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、胆固醇氧化酶
·试剂盒39
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒40
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b、过氧化氢测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒41
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇氧化酶
·试剂盒42
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒43
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b2
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒44
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b2、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇氧化酶
·试剂盒45
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b2、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒46
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b2、过氧化氢测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒47
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b2、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇氧化酶
·试剂盒48
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b2、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒49
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒50
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、胆固醇氧化酶
·试剂盒51
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒52
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b、过氧化氢测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒53
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇氧化酶
·试剂盒54
第一试剂
聚阴离子、表面活性剂b、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、过氧化氢测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶
·试剂盒55
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒56
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、胆固醇脱氢酶
·试剂盒57
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒58
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒59
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇脱氢酶
·试剂盒60
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒61
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒62
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇脱氢酶
·试剂盒63
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒64
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒65
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇脱氢酶
·试剂盒66
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒67
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒68
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、胆固醇脱氢酶
·试剂盒69
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒70
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒71
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇脱氢酶
·试剂盒72
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂b2、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒73
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒74
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、胆固醇脱氢酶
·试剂盒75
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒76
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、还原型辅酶测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒77
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇脱氢酶
·试剂盒78
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒79
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒80
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇脱氢酶
·试剂盒81
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒82
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、还原型辅酶测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒83
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇脱氢酶
·试剂盒84
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒85
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b2、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒86
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b2、表面活性剂c、胆固醇脱氢酶
·试剂盒87
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b2、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒88
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、还原型辅酶测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b2、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒89
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b2、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇脱氢酶
·试剂盒90
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、POE-POA缩合物、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b2、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒91
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒92
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、胆固醇脱氢酶
·试剂盒93
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒94
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b、还原型辅酶测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒95
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇脱氢酶
·试剂盒96
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒97
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b2
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒98
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b2、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇脱氢酶
·试剂盒99
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b2、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒100
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b2、还原型辅酶测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒101
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b2、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇脱氢酶
·试剂盒102
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b2、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒103
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒104
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、胆固醇脱氢酶
·试剂盒105
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒106
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b、还原型辅酶测定用试剂
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
·试剂盒107
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇脱氢酶
·试剂盒108
第一试剂
聚阴离子、氧化型辅酶、表面活性剂b、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶
第二试剂
POE-POA烷基芳基醚、表面活性剂b、表面活性剂c、还原型辅酶测定用试剂、胆固醇酯水解酶、胆固醇脱氢酶
以下通过实施例对本发明进行更详细的说明，但这些实施例并不限定本发明的范围。需要说明的是，在本实施例和比较例中，使用下述制造商的试剂、酶和表面活性剂。
试剂
MOPS(同仁化学研究所公司制)
DOSE(Daito Chemix公司制)
硫酸钠(关东化学公司制)
葡聚糖硫酸钠(分子量50万)(Amersham公司制)
磷钨酸(Nacalai Tesque公司制)
4-氨基安替比林(琦京化成公司制)
酶
过氧化物酶(东洋纺织公司制)
CHO-CE(胆固醇氧化酶；KIKKOMAN公司制)
LPL-311(胆固醇酯水解酶；东洋纺织公司制)
表面活性剂
Nymeen S-220(聚氧乙烯十八烷基胺；日油公司制)
Nymeen L-207(聚氧乙烯十二烷基胺；日油公司制)
乙二胺EO40PO40(乙二胺聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物；日油公司制)
POE-POA烷基芳基醚
Emulgen L40(花王公司制)
Acronecess KP189R(日油公司制)
Acronecess KP189R-40(日油公司制)
POE-POA缩合物
Pluronic L121(旭电化公司制)
Acronecess B208(日油公司制)
POE烯基醚
BLAUNONEN-1540(青木油脂公司制)
BLAUNONEN-1530(青木油脂公司制)
Nonion E-230(日油公司制)
POE支链烷基醚
Nonion OD235(日油公司制)
POE-POA支链烷基醚
PEN-4620(日光Chemicals公司制)
PEN-4630(日光Chemicals公司制)
季铵盐
正辛基三甲基氯化铵(东京化成工业公司制)
癸基三甲基溴化铵(东京化成工业公司制)
月桂基三甲基氯化铵(Nacalai Tesque公司制)
三甲基十四烷基氯化铵(东京化成工业公司制)
十六烷基三甲基氯化铵(Nacalai Tesque公司制)
三甲基硬脂基氯化铵(东京化成工业公司制)
苄基二甲基十四烷基氯化铵水合物(东京化成工业公司制)
苄基鲸蜡基二甲基氯化铵水合物(东京化成工业公司制)
苄基二甲基硬脂基氯化铵水合物(东京化成工业公司制)
Cation BB(日油公司制)
Cation M2-100(日油公司制)
Morimin 10B(Morin化学公司制)
Morimin 12B(Morin化学公司制)
叔胺
叔胺BB(日油公司制)
N，N-二甲基正癸基胺(东京化成工业公司制)
伯胺
胺BB(日油公司制)
胺PB(日油公司制)
胺MB(日油公司制)
实施例
[实施例1]
制备包含以下的第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Aa1～Aa16)。
第一试剂(试剂A)
第二试剂(试剂a1～a16)
表面活性剂c[其种类(化合物名或制品名)和浓度如表1所示]
[比较例1]
制备包含以下的第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂a0)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Aa0)。
第一试剂(试剂A)
第二试剂(试剂a0)
[实施例2]
使用实施例1和比较例1的各试剂盒，按照以下的顺序测定30个人血清样品中的LDL-C。
(1)标准曲线的制作
以生理盐水(LDL-C浓度：0.0mg/dL)和血清(LDL-C浓度：140mg/dL)作为标准溶液，使用实施例1和比较例1的各试剂盒，分别利用日立7170S型自动分析装置，制作表示LDL-C浓度与“吸光度”之间的关系的标准曲线。
这里的“吸光度”表示基于以下的反应中测定的两个吸光度(E1和E2)，由E2减去E1所得的值。
向反应皿中添加标准溶液(3μL)和第一试剂(0.15mL)，在37℃下加热5分钟，在主波长600nm、副波长700nm处测定反应液的吸光度(E1)，接着，在该反应液中添加第二试剂(0.05mL)，再在37℃下加热5分钟，在主波长600nm、副波长700nm处测定反应液的吸光度(E2)。
(2)利用人血清样品与实施例1和比较例1的各试剂盒的反应测定该样品的“吸光度”
使用人血清样品代替(1)的标准曲线的制作中使用的标准溶液，除此以外，利用与(1)的“吸光度”的计算方法同样的方法，测定该样品的“吸光度”。
(3)人血清样品中的LDL-C浓度的确定
由(2)中测得的“吸光度”和(1)中制作的标准曲线确定各样品中的LDL-C浓度。
接着，作为试剂盒，使用市售的LDL-C测定用试剂盒即DeterminerL LDL-C(协和梅迪克斯公司制)，作为样品，使用30个人血清样品，按照与上述同样的顺序，测定各样品中的LDL-C。
使用实施例1和比较例1的各试剂盒进行的测定与使用DeterminerL LDL-C试剂盒进行的测定之间的相关系数示于表1。
[实施例3]
研究本发明的LDL-C测定用试剂盒是否能够适用于高TG血清。从正常血清和高TG血清(TG 1000mg/dL以上)中，利用超速离心法分取在1.006～1.063的比重范围内存在的LDL。调节分取的LDL使胆固醇量为100mg/dL，使用实施例1和比较例1的各试剂盒，按照与实施例2同样的方法进行测定。进而，使用下式(I)：
算出高TG血清的LDL-C测定值与正常血清的测定值比。这里，测定值比越接近1，表明越能够准确地测定高TG血清中的LDL-C。测定值比记载在表1中。
表1
由表1可知，使用含有季铵盐、叔胺或伯胺的试剂盒(试剂盒Aa1～Aa16)的测定，同使用不含有表面活性剂c的试剂盒(试剂盒Aa0)的测定相比，与使用Determiner L LDL-C的测定之间存在更好的相关关系。
另外可知，使用含有季铵盐、叔胺或伯胺的试剂盒(试剂盒Aa1～Aa16)的测定，与使用不含有表面活性剂c的试剂盒(试剂盒Aa0)的测定相比，测定值比更高，而且更接近于1。因此可知，通过使用本发明的试剂盒，即使是高TG样品也能够准确地测定LDL-C。
[比较例2]
制备包含以下的第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂b1～b3)的LDL-C测定用试剂盒(Ab1)。
第一试剂(试剂A)
第二试剂(试剂b1～b3)
表面活性剂(其种类和浓度示于表2)
[比较例3]
作为试剂盒，使用比较例2的Ab1～Ab3各试剂盒，作为样品，使用与实施例2中使用的样品相同的30个人血清样品，通过与实施例2同样的方法，计算与使用Determiner L LDL-C的测定的相关系数。其结果示于表2。
表2
由表2可知，使用含有季铵盐、叔胺或伯胺的试剂盒(试剂盒Aa1～Aa16)的测定，同使用含有含氮聚氧乙烯类表面活性剂的比较例2的试剂盒(试剂盒Ab1～Ab3)的测定相比，与使用Determiner L LDL-C的测定之间存在更好的相关关系。
[实施例4]
制备包含以下的第一试剂(试剂B)和第二试剂(试剂a3)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Ba3)。
第一试剂(试剂B)
第二试剂(试剂a3)
[比较例4]
制备包含以下的第一试剂(试剂C)和第二试剂(试剂a3)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Ca3)。
第一试剂(试剂C)
MOPS(pH7.2)    20mmol/L
硫酸钠         2g/L
DOSE           0.3g/L
过氧化物酶     10kU/L
第二试剂(试剂a3)
[实施例5]
作为试剂盒，使用实施例1的Aa3、实施例4的Ba3、比较例4的Ca3试剂盒，作为样品，使用与实施例2中使用的样品相同的30个人血清样品，通过与实施例2同样的方法，计算与使用Determiner LLDL-C的测定的相关系数。其结果示于表3。
表3
由表3可知，使用含有聚阴离子的试剂盒(试剂盒Aa3、Ba3)的测定，同使用不含有聚阴离子的比较例4的试剂盒(试剂盒Ca3)的测定相比，与使用Determiner L LDL-C的测定之间存在更好的相关关系。
[实施例6]
制备包含以下的第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂c1、d1、d2、e1、e2)的LDL-C测定用试剂盒(Ac1、Ad1、Ad2、Ae1、Ae2)。
第一试剂(试剂A)
第二试剂(试剂c1、d1、d2、e1、e2)
表面活性剂(其种类和浓度示于表4)
[比较例5]
制备包含以下的第一试剂(试剂A)和第二试剂(试剂f1、f2、g1、g2)的LDL-C测定用试剂盒(Af1、Af2、Ag1、Ag2)。
第一试剂(试剂A)
第二试剂(试剂f1、f2、g1、g2)
表面活性剂(其种类和浓度示于表4)
[实施例7]
作为试剂盒，使用实施例6的试剂盒(试剂盒Ac1、Ad1、Ad2、Ae1、Ae2)、比较例5的试剂盒(试剂盒Af1、Af2、Ag1、Ag2)各试剂盒，作为样品，使用与实施例2中使用的样品相同的30个人血清样品，通过与实施例2同样的方法，计算与使用Determiner L LDL-C的测定的相关系数。其结果示于表4。
表4
由表4可知，使用实施例6的试剂盒(试剂盒Ac1、Ad1、Ad2、Ae1、Ae2)的测定，同使用不含有表面活性剂b的比较例5的试剂盒(试剂盒Af1、Af2)和不含有POE-POA烷基芳基醚的比较例5的试剂盒(试剂盒Ag1、Ag2)的测定相比，与使用Determiner L LDL-C的测定之间存在更好的相关关系。
[实施例8]
制备包含以下的第一试剂(试剂D)和第二试剂(试剂h1)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Dh1)。
第一试剂(试剂D)
第二试剂(试剂h1)
[实施例9]
制备包含以下的第一试剂(试剂E)和第二试剂(试剂h1)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Eh1)。
第一试剂(试剂E)
第二试剂(试剂h1)
[实施例10]
制备包含以下的第一试剂(试剂F)和第二试剂(试剂i1)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Fi1)。
第一试剂(试剂F)
第二试剂(试剂i1)
[实施例11]
制备包含以下的第一试剂(试剂F)和第二试剂(试剂j1)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Fj1)。
第一试剂(试剂F)
第二试剂(试剂j1)
[实施例12]
制备包含以下的第一试剂(试剂G)和第二试剂(试剂i1)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Gi1)。
第一试剂(试剂G)
第二试剂(试剂i1)
[实施例13]
制备包含以下的第一试剂(试剂G)和第二试剂(试剂j1)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Gj1)。
第一试剂(试剂G)
第二试剂(试剂j1)
[实施例14]
制备包含以下的第一试剂(试剂H)和第二试剂(试剂i1)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Hi1)。
第一试剂(试剂H)
第二试剂(试剂i1)
[实施例15]
制备包含以下的第一试剂(试剂H)和第二试剂(试剂j1)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Hj1)。
第一试剂(试剂H)
第二试剂(试剂j1)
[实施例16]
制备包含以下的第一试剂(试剂H)和第二试剂(试剂k1)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Hk1)。
第一试剂(试剂H)
第二试剂(试剂k1)
[实施例17]
制备包含以下的第一试剂(试剂I)和第二试剂(试剂l1)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Il1)。
第一试剂(试剂I)
第二试剂(试剂l1)
[实施例18]
制备包含以下的第一试剂(试剂J)和第二试剂(试剂m1)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Jm1)。
第一试剂(试剂J)
第二试剂(试剂m1)
[实施例19]
作为试剂盒，使用实施例8～18所述的各试剂盒，作为样品，使用与实施例2中使用的样品相同的30个人血清样品，通过与实施例2同样的方法进行测定，确定各样品中的LDL-C的浓度。同样，对于相同的样品，使用Determiner L LDL-C进行测定，确定各样品中的LDL-C的浓度。接着，计算使用实施例8～18的各试剂盒的测定与使用Determiner L LDL-C的测定之间的相关系数。其结果示于表5。
表5
  试剂盒   相关系数
  Dh1   0.991
  Eh1   0.992
  Fi1   0.987
  Fj1   0.997
  Gi1   0.987
  Gj1   0.997
  Hi1   0.988
  Hj1   0.997
  Hk1   0.994
  Il1   0.982
  Jm1   0.987
由表5可知，对于第一试剂中含有POE-POA缩合物、POE烯基醚、POE支链烷基醚或POE-POA支链烷基醚的试剂盒，与使用Determiner L LDL-C的测定之间也存在非常好的相关关系。
[实施例20]
制备包含以下的第一试剂(试剂K)和第二试剂(试剂n1～n4)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Kn1～Kn4)。
第一试剂(试剂K)
第二试剂(试剂n1～n4)
表面活性剂c(其种类和浓度示于表6)
[实施例21]
制备包含以下的第一试剂(试剂L)和第二试剂(试剂o1～o5)的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Lo1～Lo5)。
第一试剂(试剂L)
第二试剂(试剂o1～5)
表面活性剂c(其种类和浓度示于表6)
[实施例22]
作为试剂盒，使用实施例20和实施例21的各试剂盒，作为样品，使用与实施例2中使用的样品相同的30个人血清样品，通过与实施例2同样的方法进行测定，确定各样品中的LDL-C的浓度。同样，对于相同的样品，使用Determiner L LDL-C进行测定，确定各样品中的LDL-C的浓度。接着，计算使用实施例20和21的各试剂盒的测定与使用Determiner L LDL-C的测定之间的相关系数。其结果示于表6。
表6
由表6可知，对于含有POE-POA烷基芳基醚、POE-POA缩合物和表面活性剂c的试剂盒，与使用Determiner L LDL-C的测定之间也存在非常好的相关关系。
[实施例23]
制备包含以下的第一试剂和第二试剂的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Mp1、Aq1、Mr1)。
第一试剂(试剂M或试剂A)
第二试剂(试剂p1、q1、r1)
[比较例6]
制备包含以下的第一试剂和第二试剂的LDL-C测定用试剂盒(试剂盒Mp0、Aq0、Mr0)。
第一试剂(试剂M或试剂A)
第二试剂(试剂p0、q0、r0)
[实施例24]
作为试剂盒，使用实施例23的试剂盒(试剂盒Mp1、Aq1、Mr1)和比较例6的试剂盒(试剂盒Mp0、Aq0、Mr0)各试剂盒，作为样品，使用30个人血清样品(与实施例2中使用的样品不同的样品)，通过与实施例2同样的方法，计算与使用Determiner L LDL-C的测定的相关系数。其结果示于表7。
表7
由表7可知，使用实施例23的试剂盒(试剂盒Mp1、Aq1、Mr1)的测定，同使用不含有表面活性剂c的比较例6的试剂盒(试剂盒Mp0、Aq0、Mr0)的测定相比，与使用Determiner L LDL-C的测定之间存在更好的相关关系。
产业实用性
根据本发明，可以提供对代谢综合症、动脉硬化等的诊断有用的LDL-C的测定方法、测定用试剂和测定用试剂盒。

Claims (31)

1.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)在[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b]选自由聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；和
[d]葡聚糖硫酸或其盐
的共存下进行样品与(i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、或(ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合的反应的步骤；
(2)测定步骤(1)的反应中生成的物质或消耗的物质的步骤；
(3)使预先利用已知浓度的低密度脂蛋白中的胆固醇制作的、表示低密度脂蛋白中的胆固醇浓度和得自该生成的物质或该消耗的物质的信息量的关系的标准曲线与上述(2)中的测定值相关的步骤；以及
(4)确定样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇浓度的步骤。
2.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)在[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；和
[d]葡聚糖硫酸或其盐
的共存下进行样品与(i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、或(ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合的反应的步骤；
(2)测定步骤(1)的反应中生成的物质或消耗的物质的步骤；
(3)使预先利用已知浓度的低密度脂蛋白中的胆固醇制作的、表示低密度脂蛋白中的胆固醇浓度和得自该生成的物质或该消耗的物质的信息量的关系的标准曲线与上述(2)中的测定值相关的步骤；以及
(4)确定样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇浓度的步骤。
3.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)在[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[b2]选自由聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；和
[d]葡聚糖硫酸或其盐
的共存下进行样品与(i)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶的组合、或(ii)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶的组合的反应的步骤；
(2)测定步骤(1)的反应中生成的物质或消耗的物质的步骤；
(3)使预先利用已知浓度的低密度脂蛋白中的胆固醇制作的、表示低密度脂蛋白中的胆固醇浓度和得自该生成的物质或该消耗的物质的信息量的关系的标准曲线与上述(2)中的测定值相关的步骤；以及
(4)确定样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇浓度的步骤。
4.如权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其中，季铵盐为三甲基烷基铵盐或苄基二甲基烷基铵盐。
5.如权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其中，叔胺为二甲基烷基胺。
6.如权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其中，生成的物质为过氧化氢。
7.如权利要求6所述的测定方法，其中，过氧化氢的测定使用过氧化氢测定用试剂进行。
8.如权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其中，生成的物质为还原型辅酶。
9.如权利要求8所述的测定方法，其中，还原型辅酶的测定使用还原型辅酶测定用试剂进行。
10.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，在权利要求1所述的测定方法中使用，其特征在于，含有：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b]选自由聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]葡聚糖硫酸或其盐；及
胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶。
11.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，在权利要求2所述的测定方法中使用，其特征在于，含有：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]葡聚糖硫酸或其盐；及
胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶。
12.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，在权利要求3所述的测定方法中使用，其特征在于，含有：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[b2]选自由聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]葡聚糖硫酸或其盐；及
胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶。
13.如权利要求10～12中任一项所述的测定用试剂，其中，还含有用于测定胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶与样品的反应生成的物质的试剂。
14.如权利要求13所述的测定用试剂，其中，胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶与样品的反应生成的物质为过氧化氢。
15.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，在权利要求1所述的测定方法中使用，其特征在于，含有：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b]选自由聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]葡聚糖硫酸或其盐；及
胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶。
16.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，在权利要求2所述的测定方法中使用，其特征在于，含有：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]葡聚糖硫酸或其盐；及
胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶。
17.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂，在权利要求3所述的测定方法中使用，其特征在于，含有：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[b2]选自由聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；
[d]葡聚糖硫酸或其盐；及
胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶。
18.如权利要求15～17中任一项所述的测定用试剂，其中，还含有用于测定胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶与样品的反应生成的物质的试剂。
19.如权利要求18所述的测定用试剂，其中，胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶与样品的反应生成的物质为还原型辅酶。
20.如权利要求10～12或15～17中任一项所述的测定用试剂，其中，季铵盐为三甲基烷基铵盐或苄基二甲基烷基铵盐。
21.如权利要求10～12或15～17中任一项所述的测定用试剂，其中，叔胺为二甲基烷基胺。
22.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，在权利要求1所述的测定方法中使用，其特征在于，包含下述第一试剂和第二试剂：
含有[d]葡聚糖硫酸或其盐的第一试剂；
含有下述成分的第二试剂：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b]选自由聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；和
胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶。
23.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，在权利要求2所述的测定方法中使用，其特征在于，包含下述第一试剂和第二试剂：
含有[d]葡聚糖硫酸或其盐的第一试剂；
含有下述成分的第二试剂：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；和
胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶。
24.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，在权利要求3所述的测定方法中使用，其特征在于，包含下述第一试剂和第二试剂：
含有[d]葡聚糖硫酸或其盐及[b2]选自由聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂的第一试剂；
含有下述成分的第二试剂：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；和
胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶。
25.如权利要求22～24中任一项所述的测定用试剂盒，其中，第一试剂和第二试剂的任一者或两者中还含有过氧化氢测定用试剂。
26.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，在权利要求1所述的测定方法中使用，其特征在于，包含下述第一试剂和第二试剂：
含有[d]葡聚糖硫酸或其盐的第一试剂；
含有下述成分的第二试剂：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b]选自由聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；及
胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶。
27.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，在权利要求2所述的测定方法中使用，其特征在于，包含下述第一试剂和第二试剂：
含有[d]葡聚糖硫酸或其盐的第一试剂；
含有下述成分的第二试剂：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；及
胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶。
28.一种样品中的低密度脂蛋白中的胆固醇测定用试剂盒，在权利要求3所述的测定方法中使用，其特征在于，包含下述第一试剂和第二试剂：
含有[d]葡聚糖硫酸或其盐及[b2]选自由聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯支链烷基醚和聚氧乙烯-聚氧化烯支链烷基醚构成的组中的1种以上表面活性剂的第一试剂；
含有下述成分的第二试剂：
[a]聚氧乙烯-聚氧化烯烷基芳基醚；
[b1]聚氧乙烯-聚氧化烯缩合物；
[c]选自由伯胺、仲胺、叔胺和季铵构成的组中的1种以上表面活性剂；及
胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶。
29.如权利要求26～28中任一项所述的测定用试剂盒，其特征在于，第一试剂和第二试剂的任一者或两者中还含有还原型辅酶测定用试剂。
30.如权利要求22～24或26～28中任一项所述的测定用试剂盒，其中，季铵盐为三甲基烷基铵盐或苄基二甲基烷基铵盐。
31.如权利要求22～24或26～28中任一项所述的测定用试剂盒，其中，叔胺为二甲基烷基胺。
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