JP5534809B2 - 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法及び測定用キット - Google Patents
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Description
従来からのLDL−Cの定量方法は、超遠心法、電気泳動法、フリードワルド(Friedewald)式による演算方法などが挙げられる。
しかしながら、超遠心法による分離操作は煩雑で、迅速性、簡便性などの面で欠点がある。
電気泳動法は、リポ蛋白の電荷の差を利用し、アガロースゲルなどを支持体として分離する方法やリポ蛋白の粒子サイズの差を利用し、ポリアクリルアミドゲルを支持体として分離する方法などがある。しかしながら、電気泳動法は定量性に乏しく、簡便性、経済性などの面で問題がある。
(LDL−C)=(T−C)−(HDL−C)−(T−TG)/5
しかし、この方法は、血清中のT−TGの含有量や食事の影響を受けるため、正確性に問題がある。
それらの中でLDL−Cを定量する方法としては、以下の方法が知られている。
LDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、被検試料中のHDL、VLDL及びカイロミクロン中のコレステロールを消去する第1工程と、次いで、被検試料中の残存コレステロールを定量する第2工程とからなる被検試料中のLDL−Cの定量方法(特許文献1)。
生体試料に対し、ジメチル−α−シクロデキストリン又は/及びポリ−β−シクロデキストリンの存在下で測定を行うことを特徴とする、LDL−Cの測定法(特許文献4)。
(1) 以下の工程を順次行うことを特徴とする検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
[1]検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール酸化酵素を含有しない水性媒体中で反応させる工程;
[2]工程[1]で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる1種又は2種以上の界面活性剤及びコレステロール酸化酵素、要すれば、さらにコレステロールエステル加水分解酵素を添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール酸化酵素、要すればコレステロールエステル加水分解酵素と反応させる工程;及び、
[3]工程[2]の反応により生成する物質又は工程[2]の反応により消費される物質を測定する工程。
[1]検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール脱水素酵素を含有せず、要すれば酸化型補酵素を含有する水性媒体中で反応させる工程;
[2]工程[1]で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる1種又は2種以上の界面活性剤、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素、要すれば、さらにコレステロールエステル加水分解酵素及び酸化型補酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素、要すればコレステロールエステル加水分解酵素と反応させる工程;及び、
[3]工程[2]の反応により生成する物質又は工程[2]の反応により消費される物質を測定する工程。
(3) 工程[1]、工程[2]のいずれか又は両方の反応が、さらに、ポリアニオン存在下で行われる、(1)又は(2)記載の測定方法。
(5) コレステロールエステル加水分解酵素がさらに第二試薬に含有される(4)記載のキット。
(7) コレステロールエステル加水分解酵素がさらに第二試薬に含有される(6)記載のキット。
(8) ポリアニオンがさらに第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される(4)〜(7)のいずれかに記載のキット。
[1]検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール酸化酵素を含有しない水性媒体中で反応させる工程;
[2]工程[1]で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる1種又は2種以上の界面活性剤及びコレステロール酸化酵素、要すれば、さらにコレステロールエステル加水分解酵素を添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール酸化酵素、要すればコレステロールエステル加水分解酵素と反応させる工程;及び、
[3]工程[2]の反応により生成する物質又は工程[2]の反応により消費される物質を測定する工程。
[1]検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール脱水素酵素を含有せず、要すれば酸化型補酵素を含有する水性媒体中で反応させる工程;
[2]工程[1]で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる1種又は2種以上の界面活性剤、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素、要すれば、さらにコレステロールエステル加水分解酵素及び酸化型補酵素からなる群より選ばれる少なくとも1つを添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素、要すればコレステロールエステル加水分解酵素と反応させる工程;及び、
[3]工程[2]の反応により生成する物質又は工程[2]の反応により消費される物質を測定する工程。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ(CHODI;協和発酵工業社製)、コレステロールオキシダーゼ(CHODI;キッコーマン社製)、コレステロールオキシダーゼ(CO−CE;キッコーマン社製)、コレステロールオキシダーゼ(COO−321;東洋紡績社製)等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、2種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
本発明に用いられるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のLDL−Cの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で0.001〜800U/mLの濃度であることが好ましく、0.01〜300U/mLの濃度であることがより好ましい。
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、酸化型補酵素が使用される。酸化型補酵素としては、例えばNAD、NADP、チオ(thio)−NAD、チオ(thio)−NADP等が挙げられる。
POE分岐アルキルエーテルの具体例としては、ノイゲンTDS200D、ノイゲンTDS−500F、ノイゲンSD150、ノイゲンSD300(以上、第一工業製薬社製)、ノニオンIC235、ノニオンIC230、ノニオンIC235、ノニオンOD225、ノニオンOD230、ノニオンOD235(以上、日本油脂社製)、EMALEX 1615、EMALEX 1625、EMALEX 1815、EMALEX 1820、EMALEX 1825、EMALEX OD−10、EMALEX OD−16、EMALEX OD−20、EMALEX OD−25、EMALEX OD−25JJ、EMALEX 2420、EMALEX 2425(以上、日本エマルジョン社製)等が挙げられる。
POE・POA分岐アルキルエーテルのポリオキシエチレンのオキシエチレンの重合度としては、好ましくは2〜60であり、より好ましくは4〜40であり、ポリオキシアルキレンのオキシアルキレンの重合度としては、好ましくは1〜40であり、より好ましくは1〜20である。
POE・POA分岐アルキルエーテルの具体例としては、ユニルーブMIL−0822B(以上、日本油脂社製)等が挙げられる。
POE・POA縮合物におけるポリオキシアルキレン(POA)の分子量としては、好ましくは500〜6000であり、より好ましくは1500〜4000である。
なお、本発明に用いられるPOE・POA縮合物におけるPOE・POAの重合様式としてはとくに制限はなく、例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー等が挙げられる。
POE・POA縮合物の具体例としては、プルロニックL−121、プルロニックP−103、プルロニックF−108(以上、旭電化社製)、プロノンB−204、プロノンB−208(以上、日本油脂社製)等が挙げられる。
POE・POAアルキルアリールエーテルにおけるポリオキシアルキレン(POA)としては、ポリオキシエチレン以外のポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。
POE・POAアルキルアリールエーテルの具体例としては、エマルゲンL40等(花王社製)等が挙げられる。
化合物Aの濃度としては、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が0.0001〜20%であることが好ましく、0.001〜5%がより好ましい。
本発明のLDL−Cの測定方法におけるpHはLDL−Cの定量を妨げない範囲であればいずれでもよいが、設定するpHに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
本発明のLDL−Cの測定方法のための反応温度は、本発明のLDL−Cの測定方法を可能とする温度であれば特に制限はないが、10〜50℃が好ましく、30〜40℃がより好ましい。汎用の自動分析装置での設定は通常37℃である。
本発明のLDL−Cの測定においては、工程[1]は、例えば10〜50℃、好ましくは30〜40℃で、1〜60分間、好ましくは2〜30分間行う。工程[2]は、例えば10〜50℃、好ましくは30〜40℃で、1〜60分間、好ましくは2〜30分間行う。
カプラーとしては、例えば4−アミノアンチピリン(4−AA)、3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてペルオキシダーゼを用いる場合は、1〜100kU/Lが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、0.01〜10g/Lが好ましい。
本発明のLDL−C測定用キットは、本発明のLDL−C測定方法に用いることができ、保存、流通及び使用適した形態である。本発明のLDL−C測定用キットとしては、例えば2試薬系のキット、3試薬系のキット等が挙げられるが、第一試薬と第二試薬とからなる2試薬系が好ましい。
ポリアニオンは第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されてもよい。
本発明のLDL−C測定用キットとしては、例えば以下の態様のキットが挙げられるがこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット2
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、過酸化水素測定用試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット3
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット4
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、過酸化水素測定用試薬、ポリオニオン
第二試薬
コレステロール酸化酵素、過酸化水素測定用試薬、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール酸化酵素、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット6
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール酸化酵素、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット7
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール酸化酵素、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット8
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリオニオン
第二試薬
コレステロール酸化酵素、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット9
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット10
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット11
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット12
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット14
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット15
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット16
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット18
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット19
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット20
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定試薬、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット22
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット23
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット24
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット26
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット27
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット28
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット30
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット31
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物A(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
キット32
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、ポリアニオン
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、化合物A、ポリアニオン(要すれば、コレステロールエステル加水分解酵素)
試薬
MOPS(同仁化学研究所社製)
MES(同仁化学研究所社製)
EMSE(ダイトーケミックス社製)
硫酸ナトリウム(関東化学社製)
デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万)(フルカ社製)
4−アミノアンチピリン(埼京化成社製)
イントラリピッド20%(TERUMO社製)
酵素
ペルオキシダーゼ(東洋紡績社製)
CHODI(コレステロール酸化酵素;キッコーマン社製)
LPL−311(コレステロールエステル加水分解酵素;東洋紡績社製)
ノニオンK220(POEラウリルエーテル;日本油脂社製)
ニッコールBC−20TX(POEセチルエーテル;ニッコール社製)
ノニオンS220(POEステアリルエーテル;日本油脂社製)
ニッコールBB−20(POEベヘニルエーテル;ニッコール社製)
ナイミーンL207(POEドデシルアミン;日本油脂社製)
ポリスターA1060(高分子型陰イオン;日本油脂社製)
ノニオンLT−211(POEソルビタンモノラウレート;日本油脂社製)
化合物A
POE分岐アルキルエーテル
ノイゲンTDS200D(第一工業製薬社製)
ノイゲンSD150 (第一工業製薬社製)
ノニオンIC235(日本油脂社製)
EMALEX OD25(日本エマルジョン社製)
EMALEX OD25JJ(日本エマルジョン社製)
ノニオンOD235(日本油脂社製)
EMALEX 2425(日本エマルジョン社製)
EMALEX 1625(日本エマルジョン社製)
POE・POA分岐アルキルエーテル
ユニルーブMIL−0822B(日本油脂社製)
POE・POP縮合物
プルロニックL121(旭電化社製)
POE・POAアルキルアリールエーテル
エマルゲンL40(花王社製)
第一試薬(試薬A)
MES(pH6.2) 20 mmol/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
EMSE 0.3 g/L
LPL−311 0.5 kU/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬a1〜a7)
MOPS(pH6.8) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
CHODI 3.0 kU/L
化合物A [第1表の化合物A(第二試薬)の欄に示す種類と濃度]
以下の第一試薬(試薬A)及び第二試薬(試薬a0)からなるLDL−C測定用キット(キットAa0)を調製した。
第一試薬(試薬A)
MES(pH6.2) 20 mmol/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
EMSE 0.3 g/L
LPL−311 0.5 kU/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬a0)
MOPS(pH6.8) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
CHODI 3.0 kU/L
(1)検量線の作成
標準液として、生理食塩水(LDL−C濃度:0.0mg/dL)及び血清(LDL−C濃度:122mg/dL)を、実施例1及び比較例1の各キットを用いて、それぞれ日立7170S形自動分析装置により、LDL−C濃度と「吸光度」との間の関係を示す検量線を作成した。
ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された2つの吸光度(E1及びE2)を基に、E2からE1を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液(2μL)と第一試薬(0.15mL)とを添加し37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E1)を主波長600nm、副波長700nmで測定し、次いで、この反応液に第二試薬(0.05mL)を添加しさらに37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E2)を主波長600nm、副波長700nmで測定した。
(1)の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用いる以外は(1)の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、当該検体に対する「吸光度」を測定した。
(3)ヒト血清検体中のLDL−C濃度の決定
(2)で測定出した「吸光度」と、(1)で作成した検量線とから、各検体中のLDL−C濃度を決定した。
実施例1及び比較例1の各キットと、デタミナーL LDL−Cキットとを用いた測定との間の相関係数を第1表に示す。
第一試薬(試薬B)
MES(pH6.2) 20 mmol/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
EMSE 0.3 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1 g/L
LPL−311 0.5 kU/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬a1,a2,a5,a12)
MOPS(pH6.8) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
CHODI 3.0 kU/L
化合物A [第2表の化合物A(第二試薬)の欄に示す種類と濃度]
以下の第一試薬(試薬B)及び第二試薬(試薬a0)からなるLDL−C測定用キット(Ba0)を調製した。
第一試薬(試薬B)
MES(pH6.2) 20 mmol/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
EMSE 0.3 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1 g/L
LPL−311 0.5 kU/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬a0)
MOPS(pH6.8) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
CHODI 3.0 kU/L
第一試薬(試薬C)
MOPS(pH6.5) 20 mmol/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1 g/L
EMSE 0.3 g/L
LPL−311 0.5 kU/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬a3,a7〜a11)
MOPS(pH6.8) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
CHODI 3.0 kU/L
化合物A [第3表の化合物A(第二試薬)の欄に示す種類と濃度]
以下の第一試薬(試薬C)及び第二試薬(試薬b1〜b4)からなるキット(キットCb1〜Cb4)を調製した。
第一試薬(試薬C)
MOPS(pH6.5) 20 mmol/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1 g/L
EMSE 0.3 g/L
LPL−311 0.5 kU/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬b1〜b4)
MOPS(pH6.8) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
CHODI 3.0 kU/L
界面活性剤 [第4表の界面活性剤の欄に示す種類と濃度]
次いで、キットとして、LDL−C測定用キットであるデタミナーL LDL−C(協和メデックス社製)を用いて、検体として同じヒト血清40検体を用いて、同様の手順により、それぞれの検体中のLDL−Cを測定した。
以下の第一試薬(試薬C)及び第二試薬(試薬b5〜b7)からなるキット(キットCb5〜Cb7)を調製した。
第一試薬(試薬C)
MOPS(pH6.5) 20 mmol/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1 g/L
EMSE 0.3 g/L
LPL−311 0.5 kU/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬b5〜b7)
MOPS(pH6.8) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
CHODI 3.0 kU/L
界面活性剤 [第6表の界面活性剤の欄に示す種類と濃度]
比較例4のキットを用いて、ヒト血清40検体中のLDL−Cを実施例2と同様な方法により測定した。
次いで、キットとして、LDL−C測定用キットであるデタミナーL LDL−C(協和メデックス社製)を用いて、検体として実施例6で用いたヒト血清40検体を用いて、同様の手順により、それぞれの検体中のLDL−Cを測定した。
比較例としてキットCb5〜Cb7を用いた測定と、デタミナーL LDL−Cを用いた測定との間の相関係数を第6表に示す。
第一試薬(試薬C)
MOPS(pH6.5) 20 mmol/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1 g/L
EMSE 0.3 g/L
LPL−311 0.5 kU/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬a3、a4、a6、a7)
MOPS(pH6.8) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
CHODI 3.0 kU/L
化合物A [第7表の化合物A(第二試薬)の欄に示す種類と濃度]
以下の、コレステロールエステル加水分解酵素を含有しない第一試薬(試薬D)及びコレステロールエステル加水分解酵素を含有する第二試薬(試薬d1、d2、d3、d4)からなるLDL−C測定用キット(キットDd1、Dd2、Dd3、Dd4)を調製した。
第一試薬(試薬D)
MOPS(pH6.5) 20 mmol/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
デキストラン硫酸ナトリウム 1 g/L
EMSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬(試薬d1、d2、d3、d4)
MOPS(pH6.8) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
LPL−311 1.5 kU/L
CHODI 3.0 kU/L
化合物A [第8表の化合物A(第二試薬)の欄に示す種類と濃度]
Claims (11)
- 以下の工程を順次行うことを特徴とする検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
[1]検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール酸化酵素を含有しない水性媒体中で反応させる工程;
[2]工程[1]で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる1種又は2種以上の界面活性剤及びコレステロール酸化酵素を添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール酸化酵素と反応させる工程;及び、
[3]工程[2]の反応により生成する物質又は工程[2]の反応により消費される物質を測定する工程。 - 以下の工程を順次行うことを特徴とする検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
[1]検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール酸化酵素を含有しない水性媒体中で反応させる工程;
[2]工程[1]で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる1種又は2種以上の界面活性剤及びコレステロール酸化酵素、さらにコレステロールエステル加水分解酵素を添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール酸化酵素及びコレステロールエステル加水分解酵素と反応させる工程;及び、
[3]工程[2]の反応により生成する物質又は工程[2]の反応により消費される物質を測定する工程。 - 以下の工程を順次行うことを特徴とする検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
[1]検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール脱水素酵素を含有しない水性媒体中で反応させる工程;
[2]工程[1]で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる1種又は2種以上の界面活性剤、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素と反応させる工程;及び、
[3]工程[2]の反応により生成する物質又は工程[2]の反応により消費される物質を測定する工程。 - 以下の工程を順次行うことを特徴とする検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
[1]検体とコレステロールエステル加水分解酵素とを、コレステロール脱水素酵素を含有しない水性媒体中で反応させる工程;
[2]工程[1]で得られる反応液に、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる1種又は2種以上の界面活性剤、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素、さらにコレステロールエステル加水分解酵素を添加して共存させ、該反応液中のコレステロールを、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、及び、コレステロールエステル加水分解酵素と反応させる工程;及び、
[3]工程[2]の反応により生成する物質又は工程[2]の反応により消費される物質を測定する工程。 - 工程[1]の水性媒体が、酸化型補酵素を含有する水性媒体である、請求項3又は4記載の測定方法。
- 工程[1]、工程[2]のいずれか又は両方の反応が、さらに、ポリアニオン存在下で行われる、請求項1〜5のいずれかに記載の測定方法。
- コレステロールエステル加水分解酵素を含有し、コレステロール酸化酵素を含有しない第一試薬と、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる1種又は2種以上の界面活性剤及びコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定するためのキット。
- コレステロールエステル加水分解酵素がさらに第二試薬に含有される請求項7記載のキット。
- コレステロールエステル加水分解酵素を含有し、コレステロール脱水素酵素を含有しない第一試薬と、ポリオキシエチレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン分岐アルキルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物及びポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルからなる群より選ばれる1種又は2種以上の界面活性剤及びコレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定するためのキット。
- コレステロールエステル加水分解酵素がさらに第二試薬に含有される請求項9記載のキット。
- ポリアニオンがさらに第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有される請求項7〜10のいずれかに記載のキット。
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