WO2003104486A1 - トリグリセライドの選択的測定方法 - Google Patents

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正彦 岡田
知弘 齊藤
芳村　一
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株式会社シノテスト
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    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity

Definitions

  • Cholesterol and triglycerides are essential nutrients for living organisms. Because they are poorly soluble in water, they are wrapped in amphiphilic membranes (as lipoproteins) and are present in the blood.
  • Lipoproteins include chylomicron, very low density lipoprotein (VLDL), intermediate density lipoprotein (Intermediate density lipoprotein; IDL), and low density lipoprotein (L There are several types, such as ow density lipoprotein (LDL) and high density lipoprotein (HDL), which form a complex metabolic system.
  • VLDL very low density lipoprotein
  • IDL intermediate density lipoprotein
  • LDL low density lipoprotein
  • HDL high density lipoprotein
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, by selecting the selective reaction promoting substance described in WO 00 Z 611 12, more easily and accurately the test sample
  • the present inventors have found that triglycerides contained in lipoproteins having a very low specific gravity, intermediate lipoproteins, or lipoproteins contained therein can be selectively measured, thereby completing the present invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • the activity of the lipoprotein lipase present in the first step depends on the concentration of the surfactant, and the activity of the lipoprotein lipase present in the second step depends on the concentration of the surfactant.
  • reaction auxiliary substance is a polysaccharide or a derivative thereof, polyadione, a halogen ion, a metal ion or a lectin.
  • the second selection can be used to selectively react triglyceride contained in ultra-low density lipoprotein, intermediate density lipoprotein, low density lipoprotein and high density lipoprotein with lipoprotein lipase.
  • the triglyceride contained in the high-density lipoprotein and the low-density lipoprotein in the test sample shall be eliminated, and the triglyceride contained in chylomicron in the test sample shall not be involved in the measurement reaction.
  • the triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein and the intermediate-density lipoprotein in the test sample, or only the triglyceride contained in the ultra-low-density lipoprotein can be led to hydrogen peroxide or a reduced coenzyme for selective measurement. It is what was done.
  • a first-selective reaction promoting substance which is an ether compound or ester compound of a polyoxyalkylene that can selectively react triglyceride contained in low-density lipoprotein and high-density lipoprotein with lipoprotein lipase.
  • lipoprotein lipase and glycerol were used for hydrogen peroxide or reduced-type fermentation.
  • an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing glycerol By contacting an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing glycerol, triglycerides contained in the low-density lipoprotein and the high-density lipoprotein are selectively reacted with lipoprotein lipase to generate glycerol.
  • the produced glycerol is led to hydrogen peroxide or reduced coenzyme by a reaction with an enzyme that catalyzes a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from glycerol.
  • lipoprotein lipase and an enzyme that catalyzes a series of reactions for generating hydrogen peroxide or reduced coenzyme from glycerol are reacted, but first the first step is carried out.
  • the triglycerides contained in low-density lipoproteins and high-density lipoproteins have been eliminated, and triglycerides contained in ultra-low-density lipoproteins and intermediate-density lipoproteins or ultra-low-density lipoproteins react with lipoprotein lipase. To produce glycerol.
  • the triglyceride contained in the ultra-low density lipoprotein can be more selectively measured as compared with the triglyceride contained in the intermediate specific gravity lipoprotein.
  • lipoprotein lipase for example, those derived from microorganisms such as bacteria or fungi, those derived from animals such as humans, bushus or pests, those derived from plants, those prepared by genetic recombination, etc. Can be.
  • lipoprotein lipase whose activity is hardly dependent on the concentration of the surfactant, is characterized in that the enzyme activity increases sharply due to an increase in the concentration of the existing surfactant, and reaches almost a constant value.
  • a lipoprotein lipase whose enzyme activity hardly changes even when the concentration of the activator increases. Whether the enzyme activity increases when the concentration of the detergent is increased. It can be determined by measuring the degree or by observing the increase pattern.
  • a series of reactions for producing hydrogen peroxide or reduced coenzyme from glycerol in the present invention is glycerol produced by a reaction with lipoprotein lipase. Any reaction that can generate hydrogen peroxide or a reduced coenzyme from it may be used, and it may be one reaction or a plurality of reactions. Good.
  • Examples of the reduced coenzyme include nicotinamide adenine dinucleotide (reduced form) [NADH (reduced form)], nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced form) [NADPH (reduced form)] and the like. Can be.
  • the activity value of an enzyme differs depending on the activity measurement method. Further, even if the same activity measurement method and the same enzyme are used, they differ depending on the origin of the enzyme or the degree of purification. Therefore, enzyme activities outside the range of the enzyme activity values described above The value does not always mean that the effects of the present invention can be obtained.
  • the activity of catalase is inhibited so that it does not work. Must be prevented from being erased (disassembled).
  • the activity value of an enzyme differs depending on the activity measurement method. Further, even if the same activity measurement method and the same enzyme are used, they differ depending on the origin of the enzyme or the degree of purification. Therefore, just because the enzyme activity value is out of the range of the enzyme activity value described above, the effect of the present invention is not necessarily obtained.
  • the oxidizable substance include a chromogen produced by a Trinder reaction system. Examples of the chromogen produced by the Trinder reaction system include 4-aminoantipyrine, phenol or a derivative thereof, and an aniline derivative.
  • This dehydrogenase may be any dehydrogenase as long as it catalyzes a reaction using a reduced coenzyme as a coenzyme and using the reduced coenzyme as an oxidized coenzyme.
  • Examples of the dehydrogenase include lactate dehydrogenase, malate dehydrogenase, isoquenate dehydrogenase and the like.
  • the activity value that causes (or contains) this dehydrogenase depends on the origin of this dehydrogenase, or the mixing ratio of the first and second reagents when measuring with a two-reagent system. However, it cannot be said unconditionally, and it may be appropriately present (contained) in the reaction system of the first stage at an activity value suitable for the condition.
  • phenol Derivatives of phenol include, for example, 4-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2,4-dibromophenol, or 2,4,6-trichlorophenol. Mouth phenol or salts thereof can be mentioned.
  • Methods for deriving and measuring another signal from this reduced coenzyme include, for example, In the presence of aphorase or 1-methoxy-phenazine methosulfate, there may be mentioned a reaction of reducing a tetrazolium salt or the like to form a dye and measuring the dye.
  • the dextran sulfate or a derivative thereof preferably has a molecular weight in the range of 1,000 to 5,000, 0000, 0000, and has a molecular weight of 5, 000 to 1, 000, 000. Those in the range are particularly preferred.
  • the pH in the first step and the pH in the second step of the measurement method of the present invention are preferably in the range of pH 5 to 10, and more preferably in the range of pH 5.5 to 9.0.
  • the method for initiating the measurement reaction may be any method such as a method by adding a substrate or a substance essential for the measurement reaction, or a method by adding a test sample.
  • test sample put to be measured in a container suitable for the device and place it in the specified position.
  • reaction solution first stage reaction system
  • reaction cuvette first reagent in this reaction cell
  • the second reagent is dispensed into the reaction solution in the reaction cell (reaction cuvette) using a pipette (probe) or tube, mixed, and contacted to form the second stage reaction system. Then, the temperature is kept constant, and the second stage reaction is performed.
  • the ultra-low specific gravity lipoprotein and intermediate specific gravity in the test sample are obtained. It is obtained by calculating the concentration of triglyceride contained in lipoprotein or ultra-low density lipoprotein.
  • a first-selective reaction promoting substance that is an ether compound or an ester compound of polyoxyalkylene capable of selectively reacting triglyceride contained in low-density lipoprotein and high-density lipoprotein with liposide tin lipase Lipoprotein lipase, an enzyme that catalyzes a series of reactions that generate hydrogen peroxide or reduced coenzyme from glycerol, and an enzyme that catalyzes a reaction that converts hydrogen peroxide or reduced coenzyme to another substance And a reagent containing, if necessary, a substance involved in a reaction for deriving a signal from hydrogen peroxide or a reduced coenzyme.
  • triglyceride contained in high-density lipoprotein and low-density lipoprotein in test sample is eliminated during measurement of test sample, and triglyceride contained in force uromicron in test sample is measured.
  • triglyceride contained in force uromicron in test sample is measured.
  • the measurement can be selectively performed.
  • the first reagent of the measuring reagent of the present invention performs the first step of the measuring method of the present invention. (This first step is described in detail in “2. First step” of “1. Measurement method” above)
  • the first selective reaction accelerating substance contained in the first reagent of the measuring reagent of the present invention may be selected from “(1) First selective reaction accelerating substance” in “4. Selective reaction accelerating substance” in “1. As described in “Materials”.
  • adenosine triphosphate (ATP) and magnesium ion are required for catalysis by glycerol kinase. Therefore, when glycerol kinase is used, adenosine triphosphate and magnesium ion are present (or contained) in the first reagent.
  • the first reagent (or the first and second reagents) contains this oxidized coenzyme.
  • Substances involved in the reaction of deriving a signal from hydrogen peroxide or reduced coenzyme may be, if necessary, the first reagent and the second reagent of the measurement reagent of the present invention. Include it in the reagent or the first and second reagents.
  • Substances involved in the reaction to derive a signal from hydrogen peroxide or reduced coenzyme include, for example, peroxidase, chromogen in the Trinda reaction system (41-aminoantipyrine, phenol or a derivative thereof, Or aniline derivative), diaphorase, 1-methoxy-phenazine methosulfate, or tetrazolium salt.
  • reagent components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above to prepare a reagent having a pH of 6.0 (20 ° C).
  • reagent components were dissolved in pure water so as to have the concentrations described, respectively, to prepare a reagent having a pH of 6.0 (20 ° C.).
  • reaction cell reaction cuvette
  • reaction solution test sample and first and second reagents in this reaction cell (reaction cuvette) was The absorbance (main wavelength: 600 nm, sub-wavelength: 700 nm) of the test sample was measured as the measured value of this test sample.
  • the first reagent (reagent C) of the above-mentioned 2 (1) total triglyceride measurement reagent and the second reagent (reagent D) of the above 2 (2) total triglyceride measurement reagent are The triglyceride in each lipoprotein fraction prepared in the above 3 was measured.
  • each of the reagents used when the measuring reagent of the present invention (reagent A and reagent B) was used.
  • the concentration (measured value) of triglyceride contained in the test sample (lipoprotein fraction) is included in each test sample (lipoprotein fraction) when the total triglyceride measurement reagent (reagent C and reagent D) was used.
  • the value was calculated by dividing by the triglyceride concentration (measured value).
  • LDL Low density lipoprotein
  • the triglyceride contained in each of the lipoprotein fraction, the low-density lipoprotein fraction and the high-density lipoprotein fraction could not be measured in each case. 2 If the average number of moles of polyoxyethylene as the first selective reaction promoting substance is 11 [Emulgen 911], 11.2 [NP-1.1.2], 11.4 [NP -11.4], 11.5 [NP-11.5], and 11.6 [NP-11.6], the ultra-low density lipoprotein fraction And medium-density lipoprotein fractions, while triglycerides contained in the chylomicron fraction, low-density lipoprotein fraction, and high-density lipoprotein fraction were hardly measured. It can be seen that no or only a small measurement has been made.
  • the first selective reaction accelerating substance to be contained in the first reagent (reagent A) of the present invention is emulgen 911 (polyoxyethylene nonylphenyl ether having an average addition mole number of polyoxetylene of 11).
  • emulgen 911 polyoxyethylene nonylphenyl ether having an average addition mole number of polyoxetylene of 11.
  • the following is a description.
  • (1) When the average number of moles of polyoxyethylene added to the second selective reaction promoting substance is 10 [NP-10], it is included in the ultra-low-density lipoprotein fraction and the intermediate-density lipoprotein fraction. It can be seen that triglyceride was measured, whereas triglyceride contained in the chylomicron fraction, the
  • the first reagent (reagent C) of (1) of Example 1-2 was used.
  • CM chylomicron
  • LDL Low density lipoprotein
  • the first reagent (reagent C) of the above-mentioned 2 (1) total triglyceride measurement reagent and the second reagent (reagent D) of the above 2 (2) total triglyceride measurement reagent are The triglyceride in each lipoprotein fraction prepared in the above 3 was measured.
  • the concentration (measured value) of tridaliceride contained in each test sample (lipoprotein fraction) when the measurement reagents (reagent G and reagent H) of the present invention were used was measured using the total tridaliside measurement reagent (reagent C). And the value obtained by dividing by the concentration (measured value) of tridaliceride contained in each test sample (lipoprotein fraction) when the reagent D) was used.
  • Lipoprotein lipase VLDL very low density lipoprotein
  • LPL-314 (Toyobo) LDL Low density lipoprotein
  • R-1020 Polyoxyethylene nonylphenyl formaldehyde condensate (Nikko Chemicals) 0.1% (w / v)
  • reagent components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above to prepare a reagent having a temperature of 600 (20 ° C).
  • reagent components were dissolved in pure water so as to have the concentrations described, respectively, to prepare a reagent having a pH of 6.0 (20 ° C.).
  • reagent components were dissolved in pure water so as to have the respective concentrations described above to prepare a reagent having a pH of 6.0 (20 ° C).
  • each lipoprotein lipase was confirmed by measuring the amount of triglyceride in the ultra-low-density lipoprotein fraction prepared in 2 above using each reagent prepared in 1 above.
  • Table 6 shows the measured values [concentration of tridaliceride contained in the test sample (ultra-low-density lipoprotein fraction)] (measured values) obtained by each of the above measurements. As described above, the value divided by the other measured values was obtained.
  • LPL has higher enzyme activity than LP-BP.
  • LPL-311 has higher enzyme activity than LPL-314 at the same surfactant concentration.
  • LPL-314 is a lipoprotein lipase whose activity depends on the concentration of a surfactant
  • LPL-31 1 is a lipoprotein lipase whose activity is hardly dependent on the concentration of a surfactant.
  • LPL has higher enzyme activity than LP-BP.
  • LP-BP is a lipoprotein lipase whose activity depends on the concentration of the surfactant
  • LPL is a lipoprotein lipase whose activity hardly depends on the concentration of the surfactant.
  • LPL-31 1 has higher enzyme activity than LPL-314 at the same surfactant concentration.
  • LPL-314 is a lipoprotein lipase whose activity depends on the concentration of the surfactant
  • LPL-3111 is a lipoprotein lipase whose activity is hardly dependent on the concentration of the surfactant.
  • the method and reagent of the present invention for selectively measuring triglyceride contained in an ultra-low-density lipoprotein, an intermediate-density lipoprotein, or an ultra-low-density lipoprotein in a test sample include a separation operation using an ultracentrifuge. It does not require complicated operation, and can be applied to a general-purpose automatic analyzer, and can perform measurement more easily and accurately.

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Abstract

本発明は、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的にリポプロテインリパーゼと反応させることができるポリオキシアルキレンのエーテル化合物又はエステル化合物である第一選択的反応促進物質、リポプロテインリパーゼ、グリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素、及び過酸化水素又は還元型補酵素を他の物質に変える反応を触媒する酵素を含有する第１試薬と、超低比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的にリポプロテインリパーゼと反応させることができる第二選択的反応促進物質を含有する第２試薬とを含む、被検試料中の超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの選択的測定試薬；並びにこれを用いて被検試料中の超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に測定する方法に関する。

Description

明 細 書 トリグリセライドの選択的測定方法 技術分野
本発明は、 動脈硬化症の臨床診断に重要な、 超低比重リポ蛋白及び中間比重リ ポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に測定する ための方法及び試薬に関する。
本発明は、化学分野、生命科学分野及び医療分野等において重要なものであり、 特に臨床検査分野において重要なものである。 背景技術
コレステロールやトリグリセライドは生体にとって必須の栄養素である。 これ らは、 水に溶け難いため、 両親媒性の膜に包まれて （リポ蛋白として） 血液中に 存在している。
リポ蛋白には、 カイロミクロン、 超低比重リポ蛋白 （Ve r y L ow D e n s i t y L i p o p r o t e i n ; VLDL)、 中間比重リポ蛋白 （I n t e r me d i a t e De n s i t y L i p o p r o t e i n ; I DL),低比重リホ 蛋白 （L ow De n s i t y L i o r o t e i n ; LDL)、 高比重リポ蛋 白 （H i gh De n s i t y L i p o p r o t e i n ; HDL) などの種類が あり、 複雑な代謝系を形成している。
各リポ蛋白ともコレステロールとトリグリセライドを含有しているが、 超低比 重リポ蛋白と中間比重リポ蛋白に関してはトリグリセライドが主成分であり、 か つ動脈硬化症の発生に深く関わっている。 したがって、 超低比重リポ蛋白と中間 比重リポ蛋白のトリグリセライドを分別測定することは有用である。
動脈硬化症の発生に関与する諸要因を調べたいくつかの大規模追跡調査によれ ば、 低比重リポ蛋白コレステロールと、 血清中トリグリセライドの総量 （以下、 総卜リグリセライドと呼ぶ） は促進的に、 また高比重リポ蛋白コレステロールは 抑制的に作用することが証明されている。 トリダリセライドは低比重リポ蛋白と高比重リポ蛋白にはほとんどなく、 大部 分がカイロミクロン、 超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白に含まれている。 一方、 カイロミクロン中のトリグリセライドは動脈硬化症の危険因子ではない ことが示されている。
各種リポ蛋白を分別せずに総トリグリセライドを測定する方法はすでに存在し、 広く使われている （He n r y、 J. B.、 C l i n i c a l D i a gn o s i s and Man a g eme n t by L a b o r a t o r y Me t h o d、P h i l a d e l ph i a : W. B. S a u d e r s、 p p. 1 89— 204)。 これらの方法は、 血清中のトリグリセライドをまずリポプロテインリパーゼで グリセロールに分解し、 次にこれをグリセロールキナーゼでグリセ口一ルー 3— リン酸に変化させ、 更にグリセロール一 3—リン酸ォキシダ一ゼでジヒドロキシ アセトン一 3—リン酸に変え、 その時生成される過酸化水素をペルォキシダーゼ 系 （トリンダー反応系） で発色測定するものである。
また、 グリセ口一ルー 3—リン酸ォキシダーゼの代りにグリセロール— 3—リ ン酸デヒドロゲナ一ゼを作用させて、 生成した NADH (還元型補酵素） を測定 する方法もある。
これらは、 広く酵素的測定法と呼ばれている。
一方、 低比重リポ蛋白又は高比重リポ蛋白に特定の界面活性剤と添加剤を選択 的に作用させ、 そこに含まれるコレステロールを定量する方法もすでに知られて おり （例えば、 特開平 9— 313200号公報及び特開平 9一 285298号公 報）、 臨床検査などの目的で広く使われている。
従来、 超低比重リポ蛋白及び Z又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリダリセラ ィドを選択的に測定する方法は、 操作が繁雑な超遠心法が存在するだけであり、 操作が簡便な測定方法及び測定試薬は存在しなかった。
しかし、 本発明者の一人である岡田がこれを解決し、 超低比重リポ蛋白及び/ 又は中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に測定する方法及び 試薬を完成させた （WO 00/60112)o 発明の開示 本発明により解決しょうとする課題は、 より簡便かつ正確に、 被検試料中の超 低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリグ リセライドを選択的に測定することができる方法及び試薬の確立である。
より具体的には、 超遠心分離機による分離操作等の繁雑な操作を必要とせず、 汎用されている自動分析装置への適用が可能であって、 より簡便かつ正確に測定 を行うことができる、 超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リ ポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に測定する方法及び試薬を確立する ことである。
本発明者らは、 前記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 WO 0 0 Z 6 0 1 1 2に記載の選択的反応促進物質の選択により、 より簡便かつ正確に、 被検 試料中の超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含ま れる卜リグリセライドを選択的に測定することができることを見出し、 本発明を 完成するに至った。
即ち、 本発明は以下の発明を包含する。
( 1 ) 以下の第 1段階：
① 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に リポプロテインリパーゼと反応させることができるポリオキシアルキレンのエー テル化合物又はエステル化合物である第一選択的反応促進物質の存在下、 被検試 料にリポプロテインリパーゼ、 及びグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵 素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を接触させ反応させて、 低比重リポ蛋 白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補 酵素を生成させる ；
② 前記①の反応により生成した過酸化水素又は還元型補酵素を、 過酸化水素又 は還元型補酵素を他の物質に変える反応を触媒する酵素と反応させる； ③ 前記①及び②の反応により、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれる トリグリセライドを消去する ；
並びに、 以下の第 2段階：
① 前記第 1段階の後、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白 及び高比重リポ蛋白に含まれるトリダリセライドを選択的にリポプロテインリパ ーゼと反応させることができる第二選択的反応促進物質の存在下、 リポプロティ ンリパーゼ、 及びグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一 連の反応を触媒する酵素を反応させて、超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補 酵素を生成させる ；
② 前記①の反応により生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測る ； により、 被検試料中の超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リ ポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に測定する方法。
( 2 ) 第二選択的反応促進物質がポリオキシアルキレンのエーテル化合物又はェ ステル化合物である前記 （1 ) に記載の方法。
( 3 ) 第一選択的反応促進物質として用いるポリオキシアルキレンのエーテル化 合物又はエステル化合物のポリオキシアルキレンの平均付加モル数 mと、 第二選 択的反応促進物質として用いるポリオキシアルキレンのエーテル化合物又はエス テル化合物のポリォキシアルキレンの平均付加モル数 nとの比 m/ n力 s 1 . 1〜 1 . 2の範囲にある前記 （2 ) に記載の方法。
( 4 ) mが 7 . 7〜1 8の範囲にあり、 nが 7〜 1 5の範囲にある前記 （3 ) に 記載の方法。
( 5 ) mが 1 1〜 1 2の範囲にあり、 nが 1 0である前記 （3 ) に記載の方法。
( 6 ) 第一選択的反応促進物質として用いるポリオキシアルキレンのエーテル化 合物又はエステル化合物が、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキルエーテル、 ポ リオキシアルキレンの分岐鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレンの直鎖ァ ルキルフエニルエーテル、 ポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルフエニルエー テル、 ポリオキシアルキレンの直鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレンの分 岐鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキル置換安息香酸エステ ル、 及びポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキル置換安息香酸エステルからなる 群より選ばれる少なくとも 1種である前記 （1 ) 〜 （5 ) のいずれかに記載の方 法。
( 7 ) 第二選択的反応促進物質が、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキルエーテ ル、 ポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレンの 直鎖アルキルフエニルエーテル、 ポリォキシアルキレンの分岐鎖アルキルフエ二 ルエーテル、 ポリオキシアルキレンの直鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレ ンの分岐鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキル置換安息香酸 エステル、 及びポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキル置換安息香酸エステルか らなる群より選ばれる少なくとも 1種のポリオキシアルキレンのエーテル化合物 又はエステル化合物である前記 （1) 〜 （6) のいずれかに記載の方法。
(8) ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンである前記 （1) 〜 （7) の いずれかに記載の方法。
(9) 第一選択的反応促進物質が、 ポリオキシエチレンの平均付加モル数 mが 1 ；!〜 12の範囲にあるポリオキシエチレンノニルフエニルエーテルであり、 第二 選択的反応促進物質が、 ポリオキシエチレンの平均付加モル数 nが 10のポリオ キシエチレンノニルフエニルエーテルである前記 （1) 〜 （8) のいずれかに記 載の方法。
(10) 第 1段階及び Z又は第 2段階において、 反応補助物質を存在させる前記 (1) 〜 （9) のいずれかに記載の方法。
(1 1) 反応補助物質が、 多糖類若しくはその誘導体、 ポリア二オン、 ハロゲン イオン、 金属イオン又はレクチンである前記 （10) に記載の方法。
(12) 第 1段階に存在させるリポプロテインリパーゼが、 その活性が界面活性 剤の濃度に依存するものであり、 第 2段階に存在させるリポプロティンリパーゼ が、 その活性が界面活性剤の濃度に依存し難いものである前記 （1) 〜 （1 1) のいずれかに記載の方法。
(13) 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択 的にリポプロテインリパーゼと反応させることができるポリオキシアルキレンの エーテル化合物又はエステル化合物である第一選択的反応促進物質、 リポプロテ インリパーゼ、 グリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連 の反応を触媒する酵素、 及び過酸化水素又は還元型補酵素を他の物質に変える反 応を触媒する酵素を含有する第 1試薬と、
超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含 まれるトリグリセライドを選択的にリポプロテインリパーゼと反応させることが できる第二選択的反応促進物質を含有する第 2試薬とを含む、 被検試料中の超低 比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリ セライドの選択的測定試薬。
(14) 第 1試薬及び 又は第 2試薬が、 更に過酸化水素又は還元型補酵素から シグナルを導き出す反応にかかわる物質を含有する前記 （1 3) に記載の試薬。
(15) 第二選択的反応促進物質がポリオキシアルキレンのエーテル化合物又は エステル化合物である前記 （1 3) 又は （14) に記載の試薬。
(16) 第一選択的反応促進物質として用いるポリオキシアルキレンのエーテル 化合物又はエステル化合物のポリオキシアルキレンの平均付加モル数 mと、 第二 選択的反応促進物質として用いるポリオキシアルキレンのエーテル化合物又はェ ステル化合物のポリォキシアルキレンの平均付加モル数 nとの比 m/ nが 1. 1 〜1. 2の範囲にある前記 （1 5) に記載の試薬。
(17) mが 7. 7〜1 8の範囲にあり、 n力 7〜1 5の範囲にある前記 （1 6) に記載の試薬。
(18) mが 1 1〜 12の範囲にあり、 nが 10である前記 （ 16 ) に記載の試 薬。
(19) 第一選択的反応促進物質として用いるポリオキシアルキレンのエーテル 化合物又はエステル化合物が、 ポリォキシアルキレンの直鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレンの直鎖 アルキルフエニルエーテル、 ポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルフエニルェ 一テル、 ポリオキシアルキレンの直鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレンの 分岐鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキル置換安息香酸エス テル、 及びポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキル置換安息香酸エステルからな る群より選ばれる少なくとも 1種である前記 （1 3) 〜 （18) のいずれかに記 載の試薬。
(20) 第二選択的反応促進物質が、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキルエー テル、 ポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレン の直鎖アルキルフエニルエーテル、 ポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルフエ エルエーテル、 ポリオキシアルキレンの直鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキ レンの分岐鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキル置換安息香 酸エステル、 及びポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキル置換安息香酸エステル からなる群より選ばれる少なくとも 1種のポリオキシアルキレンのエーテル化合 物又はエステル化合物である前記 （13) 〜 （1 9) のいずれかに記載の試薬。 (2 1) ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンである前記 （1 3) 〜 （2 0) のいずれかに記載の試薬。
(22) 第一選択的反応促進物質が、 ポリオキシエチレンの平均付加モル数 mが 1 1〜12の範囲のポリオキシエチレンノニルフエニルエーテルであり、 第二選 択的反応促進物質が、 ポリオキシエチレンの平均付加モル数 nが 10のポリオキ シエチレンノエルフエニルエーテルである前記 (1 3) 〜 (2 1) のいずれかに 記載の試薬。
(23) 第 1試薬及び Z又は第 2試薬が、 更に反応補助物質を含有する前記 （1 3) 〜 （22) のいずれかに記載の試薬。
(24) 反応補助物質が、 多糖類若しくはその誘導体、 ポリア二オン、 ハロゲン イオン、 金属イオン又はレクチンである前記 （23) に記載の試薬。
(25) 第 1試薬に含有されるリポプロテインリパーゼが、 その活性が界面活性 剤の濃度に依存するものであり、 第 2試薬に含有されるリポプロテインリパーゼ が、 その活性が界面活性剤の濃度に依存し難いものである前記 （1 3) 〜 （24) のいずれかに記載の試薬。
以下、 本発明を詳細に説明する。
I . 測定方法
1. 測定方法 ·総論
本発明の被検試料中の超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重 リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に測定する方法は、 以下の第 1段 階及び第 2段階の操作により行う。
第 1段階：
① 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に リポプロテインリパーゼと反応させることができるポリォキシアルキレンのエー テル化合物又はエステル化合物である第一選択的反応促進物質の存在下、 被検試 料にリポプロテインリパ一ゼ、 及びグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵 素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を接触させ反応させて、 低比重リポ蛋 白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補 酵素を生成させる。
② 前記①の反応により生成した過酸化水素又は還元型補酵素を、 過酸化水素又 は還元型補酵素を他の物質に変える反応を触媒する酵素と反応させる。
③ 前記①及び②の反応により、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれる トリグリセライドを消去する。
第 2段階：
① 前記第 1段階の後、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白 及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的にリポプロテインリパ ーゼと反応させることができる第二選択的反応促進物質の存在下、 リポプロティ ンリパーゼ、 及びグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一 連の反応を触媒する酵素を反応させて、超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補 酵素を生成させる。
② 前記①の反応により生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測る。
以上の操作により、 被検試料中の高比重リポ蛋白及び低比重リポ蛋白に含まれ るトリグリセライドを消去し、 また被検試料中のカイロミクロンに含まれるトリ グリセライドを測定反応にはかかわらせないことにより、 被検試料中の超低比重 リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセラ ィドのみを過酸化水素又は還元型補酵素に導いて選択的に測定が行えるようにし たものである。
2 . 第 1段階
本発明の測定方法における第 1段階では、 次の反応を行う。
① 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に リポプロテインリパーゼと反応させることができるポリオキシアルキレンのエー テル化合物又はエステル化合物である第一選択的反応促進物質の存在下、 被検試 料にリポプロテインリパーゼ、 及びグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵 素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を接触させることにより、 低比重リポ 蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的にリポプロテイン リパーゼと反応させてグリセロールを生成させる。 ， そして、 この生成したグリセロールを、 グリセロールより過酸化水素又は還元 型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素による反応によって、 過酸化水 素又は還元型補酵素に導く。
② 前記①の反応により生成した過酸化水素又は還元型補酵素を、 過酸化水素又 は還元型補酵素を他の物質に変える反応を触媒する酵素と反応させることにより、 反応系に過酸化水素又は還元型補酵素が存在しないようにする。
③ 前記①及び②の反応により、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれる トリグリセライドを他の物質に変えてしまうことにより、 これらを反応系より消 去する。
3 . 第 2段階
本発明の測定方法における第 2段階では、 次の反応を行う。
① 第 1段階の後、 この第 1段階の反応系において、 超低比重リポ蛋白、 中間比 重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを 選択的にリポプロテインリパーゼと反応させることができる第二選択的反応促進 物質を接触させる。
そして、 この第二選択的反応促進物質の存在下、 リポプロテインリパーゼ、 及 びグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒 する酵素を反応させるが、 先に第 1段階で低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に 含まれるトリグリセライドは消去されているので、 超低比重リポ蛋白及び中間比 重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライドがリポプロティ ンリパーゼと反応してグリセ口一ルが生成する。
更に、 この生成したグリセロールを、 グリセロールより過酸化水素又は還元型 補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素による反応によって、 過酸化水素 又は還元型補酵素に導く。
② 前記①の反応により生成した過酸化水素又は還元型補酵素を、 直接測るか、 又はこれらより別のシグナルを導き出すことにより測る。 4 . 選択的反応促進物質
( 1 ) 第一選択的反応促進物質
本発明における第一選択的反応促進物質は、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋 白に含まれるトリグリセライドを選択的にリポプロテインリパーゼと反応させる ことができる物質である。
即ち、 この第一選択的反応促進物質の存在下では、 リポプロテインリパーゼに よるリポ蛋白中のトリグリセライドからグリセロールを生じさせる反応は、 低比 重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドに対して選択的に進 むものである。
この第一選択的反応促進物質としては、 ポリオキシアルキレンのエーテル化合 物又はエステル化合物が用いられる。
前記のポリオキシアルキレンのエーテル化合物としては、 ポリオキシアルキレ ンの直鎖アルキルエーテル (例えば、 ポリオキシエチレンォクチルエーテル、 ポ リオキシエチレンノニルエーテル、 ポリオキシエチレンラウリルェ一テル、 ポリ ォキシエチレンセチルエーテル、 ポリオキシエチレンステアリルエーテル、 ポリ ォキシエチレンォレイルエーテル、ポリオキシエチレンベへニルエーテル）、ポリ ォキシアルキレンの分岐鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレンの直鎖アル キルフエニルエーテル（例えば、ポリォキシエチレンォクチルフエ二ルェ一テル、 . ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル、 ポリオキシエチレンラウリルフエ ニルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルフエニルエーテル）、又はポリオキ シアルキレンの分岐鎖アルキルフエニルエーテルが好適である。
また、 前記のポリオキシアルキレンのエステル化合物としては、 ポリオキシァ ルキレンの直鎖脂肪酸エステル （例えば、 ラウリン酸ポリオキシアルキレン、 ス テアリン酸ポリオキシアルキレン、 ォレイン酸ポリオキシアルキレン、 ヤシ油脂 肪酸ポリオキシアルキレン）、ポリオキシアルキレンの分岐鎖脂肪酸エステル、ポ リオキシアルキレンの直鎖アルキル置換安息香酸エステル （例えば、 ォクチル安 息香酸ポリオキシエチレン、 ノニル安息香酸ポリオキシエチレン、 ラウリル安息 香酸ポリオキシエチレン、ステアリル安息香酸ポリオキシエチレン）、又はポリオ キシアルキレンの分岐鎖アルキル置換安息香酸エステルが好適である。 特に、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキルフエニルエーテル、 又はポリオキ シアルキレンの分岐鎖アルキルフエ二ルェ一テルが好適である。
前記のポリオキシアルキレンの直鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレン の分岐鎖アルキルエーテル、 ポリォキシアルキレンの直鎖アルキルフエ二ルェ一 テル、 ポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルフエニルエーテル、 ポリオキシァ ルキレンの直鎖アルキル置換安息香酸エステル、 及びポリオキシアルキレンの分 岐鎖アルキル置換安息香酸エステルにおける直鎖アルキル基及び分岐鎖アルキル 基、 並びにポリオキシアルキレンの直鎖脂肪酸エステル、 及びポリオキシアルキ レンの分岐鎖脂肪酸エステルにおける直鎖脂肪酸及び分岐鎖脂肪酸は、 特に制限 はないが、 炭素数が 7〜3 0のものが好適である。
前記のボリォキシアルキレンのエーテル化合物又はエステル化合物におけるポ リオキシアルキレン基は、 ポリオキシエチレン基であることが好適である。 前記の第一選択的反応促進物質は、 1種類のものを使用する 〔存在 （含有） さ せる〕 だけではなく、 2種以上のものを使用しても 〔存在 （含有） させても〕 よ レ^
前記の第一選択的反応促進物質を存在 （又は含有） させる濃度は、 この第一選 択的反応促進物質の種類、 トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を 生成させる一連の反応を触媒する酵素の種類及び由来、 被検試料中のリポ蛋白に 含まれるトリグリセライドの濃度、 又は 2試薬系などで測定を行う場合の第 1試 薬と第 2試薬などの混合比率等により異なるので、 一概には言えず、 適宜その条 件に適した濃度で存在 （含有） させればよいが、 通常は、 0 . 0 0 5〜5 %の濃 度で存在 （含有） させればよく、 0 . 0 1〜2 %の濃度で存在 （含有） させるこ とが好適であり、 特に 0 . 0 5〜1 %の濃度で存在 （含有） させることが好適で ある。
( 2 ) 第二選択的反応促進物質
本発明における第二選択的反応促進物質は、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ 蛋白、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的 にリポプロテインリパーゼと反応させることができる物質である。
即ち、 この第二選択的反応促進物質の存在下では、 リポプロテインリパーゼに よるリポ蛋白中のトリグリセライドからグリセロールを生じさせる反応は、 超低 比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれ るトリグリセライドに対して選択的に進むものである。
この第二選択的反応促進物質としては、 ポリオキシアルキレンのエーテル化合 物又はエステル化合物が好適である。
前記のポリオキシアルキレンのエーテル化合物としては、 ポリオキシアルキレ ンの直鎖アルキルエーテル (例えば、 ポリオキシエチレンォクチルエーテル、 ポ リオキシエチレンノニルエーテル、 ポリォキシェチレンラウリルエーテル、 ポリ ォキシエチレンセチルエーテル、 ポリオキシエチレンステアリルエーテル、 ポリ ォキシアルキレンの分岐鎖アルキルエーテル、 ポリォキシアルキレンの直鎖アル キルフエニルエーテル（例えば、ポリォキシエチレンォクチルフエ二ルエーテル、 ポリォキシエチレンノニルフエニルエーテル、 ポリオキシエチレンラウリルフエ ニルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルフエ二ルェ一テル）、又はポリオキ シアルキレンの分岐鎖アルキルフエ二ルェ一テルが好適である。
また、 前記のポリオキシアルキレンのエステル化合物としては、 ポリオキシァ ルキレンの直鎖脂肪酸エステル （例えば、 ラウリン酸ポリオキシアルキレン、 ス テアリン酸ポリオキシアルキレン、 ォレイン酸ポリオキシアルキレン、 ヤシ油脂 肪酸ポリオキシアルキレン）、ポリオキシアルキレンの分岐鎖脂肪酸エステル、ポ リオキシアルキレンの直鎖アルキル置換安息香酸エステル （例えば、 ォクチル安 息香酸ポリオキシエチレン、 ノニル安息香酸ポリオキシエチレン、 ラウリル安息 香酸ポリオキシエチレン、ステアリル安息香酸ポリオキシエチレン）、又はポリオ キシアルキレンの分岐鎖アルキル置換安息香酸エステルが好適である。
特に、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキルフエニルエーテル、 又はポリオキ シアルキレンの分岐鎖アルキルフエ二ルェ一テルが好適である。
前記のポリォキシアルキレンの直鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレン の分岐鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキルフエニルエー テル、 ポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルフエニルエーテル、 ポリオキシァ ルキレンの直鎖アルキル置換安息香酸エステル、 及びポリオキシアルキレンの分 岐鎖アルキル置換安息香酸エステルにおける直鎖アルキル基及び分岐鎖アルキル 基、 並びにポリオキシアルキレンの直鎖脂肪酸エステル、 及びポリオキシアルキ レンの分岐鎖脂肪酸エステルにおける直鎖脂肪酸及び分岐鎖脂肪酸は、 特に制限 はないが、 炭素数が 7〜 3 0のものが好適である。
前記のポリオキシアルキレンのエーテル化合物又はエステル化合物におけるポ リオキシアルキレン基は、 ポリオキシエチレン基であることが好適である。 前記の第二選択的反応促進物質は、 1種類のものを使用する 〔存在 （含有） さ せる〕 だけではなく、 2種以上のものを使用しても 〔存在 （含有） させても〕 よ い。
前記の第二選択的反応促進物質を存在 （又は含有） させる濃度は、 この第二選 択的反応促進物質の種類、 トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を 生成させる一連の反応を触媒する酵素の種類及び由来、 被検試料中のリポ蛋白に 含まれるトリグリセライドの濃度、 又は 2試薬系などで測定を行う場合の第 1試 薬と第 2試薬などの混合比率等により異なるので、 一概には言えず、 適宜その条 件に適した濃度で存在 （含有） させればよいが、 通常は、 0 . 0 0 5〜5 %の濃 度で存在 （含有） させればよく、 0 . 0 1〜2 %の濃度で存在 （含有） させるこ とが好適であり、 特に 0 . 0 5〜1 %の濃度で存在 （含有） させることが好適で ある。
なお、 本発明においては、 第 2段階における第二選択的反応促進物質の組成及 び濃度と、 第 1段階における第一選択的反応促進物質の組成及び濃度は、 全く同 一とならないようにしなくてはならない。
( 3 ) 選択的反応促進物質のポリオキシアルキレンの平均付加モル数
前記の第一選択的反応促進物質であるポリオキシアルキレンのエーテル化合物 又はエステル化合物のポリオキシアルキレンの平均付加モル数が mであり、 前記 の第二選択的反応促進物質であるポリオキシアルキレンのエーテル化合物又はェ ステル化合物のポリオキシアルキレンの平均付加モル数が nであるときに、 mと nの比 m/ nは 1 . 1〜1 . 2の範囲にあることが好適である。
前記の mと nの比 m/ nが 1 . 1〜1 . 2の範囲にあり、 かつ、 mが 7 . 7〜 1 8の範囲にあり、 nが 7〜1 5の範囲にあることがより好適である。 mが 1 1 〜1 2の範囲にあり、 nが 1 0であることが特に好適である。
更に、 前記の第一選択的反応促進物質が、 ポリオキシエチレンの平均付加モル 数 mが 1 1〜1 2の範囲のポリオキシエチレンノニルフエニルエーテルであり、 前記の第二選択的反応促進物質が、 ポリオキシエチレンの平均付加モル数 nが 1 0のポリオキシエチレンノニルフエ二ルェ一テルであることが特に好適である。 なお、 前記の mの値を大きくする程、 中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセ ライドに比して超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、 より選択的に 測定することができる。
また、 前記の mの値を小さくする程、 超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセ ライドに比して中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、 より選択的に 測定することができる。
そして、 前記の mと nの比 m/ nを大きくする程、 中間比重リポ蛋白に含まれ るトリグリセライドに比して超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを、 より選択的に測定することができる。
このように、 前記の mの値、 又は前記の mZ nを適宜設定することにより、 測 定の目的に応じて、 選択性を変化させることができる。
5 . トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる反応
( 1 ) トリグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる反応 本発明の測定方法において、 第 1段階及び第 2段階における、 ト 1 ]
ドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる反応は、 リポプ
ゼにより触媒される反応、 及びグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を 生成させる一連の反応よりなる。
( 2 ) リポプロテインリパーゼにより触媒される反応
本発明におけるリポプロテインリパーゼにより触媒される反応は、 被検試料中 のリポ蛋白のトリグリセライドにリポプ口ティンリパーゼを接触させ作用させる ことにより、 このトリグリセライドを 1分子のグリセロールと 3分子の脂肪酸に 加水分解する反応である。
このリポプロテインリパーゼは、 卜リグリセライドを 1分子のグリセロールと 3分子の脂肪酸に加水分解する反応を触媒するものであれば、 いかなるものでも よい。
このリポプロテインリパーゼは、 例えば、 細菌若しくはカビなどの微生物由来 のもの、 ヒト、 ブ夕若しくはゥシなどの動物由来のもの、 植物由来のもの、 又は 遺伝子組換え法により調製したもの等を用いることができる。
リポプロテインリパーゼを存在 （又は含有） させる活性値については、 リポプ ロティンリパーゼの由来、 第一選択的反応促進物質若しくは第二選択的反応促進 物質の種類、 又は 2試薬系などで測定を行う場合の第 1試薬と第 2試薬などの混 合比率等により異なるので、 一概には言えず、 適宜その条件に適した活性値で存 在 （含有） させればよい。
通常、 リポプロテインリパーゼは、 1〜1 0， 0 0 0 , 0 0 0単位 1の活性 値で存在 （含有） させることが好ましく、 1 0 0〜1 , 0 0 0， 0 0 0単位/ 1 の活性値で存在 （含有） させることがより好ましい。
本来、 酵素の活性値は、 活性測定方法により異なるものであり、 また、 同じ活 性測定方法、 同じ酵素であっても、 その酵素の由来、 あるいは精製度等により異 なるものでもある。 よって、 先に記載した酵素の活性値の範囲を外れる酵素活性 値だからといって、必ずしも本発明の効果が得られないとは限らないものである。 第 1段階に存在させるリポプロティンリパーゼは、 その活性が界面活性剤の濃 度に依存するものであることが好ましい。 第 2段階に存在させるリポプロティン リパーゼは、 その活性が界面活性剤の濃度に依存し難いものであることが好まし い。
なお、 その活性が界面活性剤の濃度に依存するリポプロテインリパーゼとは、 存在する界面活性剤の濃度の増加に従ってその酵素活性が増加してゆくリポプロ ティンリパーゼをいう。
また、 その活性が界面活性剤の濃度に依存し難いリポプロテインリパーゼとは 、 存在する界面活性剤の濃度の増加によりその酵素活性が急激に増加してほぼ一 定値に達してしまい、 それ以上界面活性剤の濃度が増加しても酵素活性がほとん ど変化しないリポプロテインリパーゼをいう。 ゼであるかは、 存在させる界面活性剤の濃度を増加させたときの酵素活性の増加 度を測定すること、 又は増加パターンを観測することにより判別することができ る。
なお、 この判別の方法の一例として、 後述する 「実験例」 に示した測定方法に よっても判別を行うことができる。
例えば、 この 「実験例」 記載の方法により得られた測定値を、 その活性が界面 活性剤の濃度に依存し難いリポプロテインリパーゼ （例えば、 L P L又は L P L 一 3 1 1 ) を含有させたときの測定値で除した値が、 0 . 5以下の場合はその活 性が界面活性剤の濃度に依存するリポプロテインリパーゼと判定し、 0 . 5を超 えた場合はその活性が界面活性剤の濃度に依存し難いリポプロテインリパーゼと 判定することができる。
なお、 前記の界面活性剤としては、 例えば、 非イオン性界面活性剤、 陰イオン 性界面活性剤、 陽イオン性界面活性剤、 又は両性界面活性剤等を挙げることがで き、 特に非ィォン性界面活性剤等を挙げることができる。
この非イオン性界面活性剤としては、 例えば、 ポリオキシアルキレンのエーテ ル化合物又はエステル化合物等を挙げることができ、 特にボリォキシアルキレン の分岐鎖アルキルエーテル又はポリオキシアルキレンのアルキルフエニルホルム アルデヒド縮合物等を挙げることができる。
また、 その活性が界面活性剤の濃度に依存するリポプロテインリパーゼとして は、 例えば、 「L P— B P」 （旭化成）、 又は 「： L P L— 3 1 4」 （東洋紡績） 等を 挙げることができる。
その活性が界面活性剤の濃度に依存し難いリポプロテインリパーゼとしては、 例えば、 「L P L」 （旭化成）、 又は 「L P L _ 3 1 1」 （東洋紡績） 等を挙げるこ とができる。」
( 3 ) グリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応 本発明におけるグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一 連の反応は、 リポプロテインリパーゼによる反応により生成したグリセロールか ら過酸化水素又は還元型補酵素を生成させることができる反応であれば、 どのよ うなものでもよく、 一つの反応からなるものでもよく、 また、 複数の反応からな るものであってもよい。 なお、 還元型補酵素としては、 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド （還元 型） 〔N AD H (還元型）〕、 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 （還元 型） 〔N A D P H (還元型）〕 等を挙げることができる。
このグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応と しては、 例えば、 グリセロールとアデノシン三リン酸 （A T P ) をグリセロール キナーゼの触媒作用によりグリセロール一 3—リン酸とアデノシン二リン酸 （A D P ) に変え、 更にこのグリセロール— 3—リン酸をグリセロール一 3 _リン酸 ォキシダーゼの触媒作用によりジヒドロキシアセトン— 3—リン酸に変えるとと もに過酸化水素を生じさせる、 一連の反応を挙げることができる。
また、 他の例として、 グリセロールとアデノシン三リン酸 （A T P ) をグリセ ロールキナーゼの触媒作用によりグリセ口一ルー 3—リン酸とアデノシン二リン 酸 （A D P ) に変え、 更にこのグリセロール— 3—リン酸をニコチンアミドアデ ニンジヌクレオチド （酸化型） 〔N A D +〕 の存在下、 グリセ口一ルー 3—リン酸 デヒドロゲナーゼの触媒作用によりジヒドロキシァセトンリン酸に変えるととも にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド （還元型） 〔NAD H〕 を生じさせる、 一連の反応等をも挙げることができる。
本発明の方法において、 グリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成 させる一連の反応を触媒する酵素は、 グリセロールより過酸化水素又は還元型補 酵素を生成させる一連の反応を触媒するものであればいかなるものでもよいが、 例えば、 グリセロールキナーゼ及びグリセロール一 3—リン酸ォキシダ一ゼの組 み合わせ、 又はグリセロールキナーゼ及びグリセロール一 3—リン酸デヒドロゲ ナーゼの組み合わせ等を挙げることができる。
これらの酵素は、 例えば、 細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、 ヒト、 プ夕若しくはゥシなどの動物由来のもの、 植物由来のもの、 又は遺伝子組換え法 により調製したもの等を用いることができる。
これらの酵素を存在 （又は含有） させる活性値については、 酵素の種類及び由 来、 第一選択的反応促進物質若しくは第二選択的反応促進物質の種類、 又は 2試 薬系などで測定を行う場合の第 1試薬と第 2試薬などの混合比率等により異なる ので、 一概には言えず、 適宜その条件に適した活性値で存在 （含有） させればよ い。
なお、 グリセロールキナ一ゼは、 通常、 0. 01〜500， 000単位 1の 活性値で存在 （含有） させることが好ましく、 1 0〜10， 000単位 1の活 性値で存在 （含有） させることが特に好ましい。
また、 グリセロール— 3—リン酸ォキシダ一ゼは、 通常、 1〜500， 000 単位 1の活性値で存在 （含有） させることが好ましく、 100〜 50, 000 単位 Z 1の活性値で存在 （含有） させることが特に好ましい。
本来、 酵素の活性値は、 活性測定方法により異なるものであり、 また、 同じ活 性測定方法、 同じ酵素であっても、 その酵素の由来、 あるいは精製度等により異 なるものでもある。 よって、 先に記載した各酵素の活性値の範囲を外れる酵素活 性値だからといって、 必ずしも本発明の効果が得られないとは限らないものであ る。
なお、 グリセロールキナーゼによる触媒反応には、 アデノシン三リン酸 （AT P) 及びマグネシウムイオンが必要である。 よって、 グリセロールキナーゼを用 いる場合には、 第 1段階及び第 2段階の反応系にアデノシン三リン酸及びマグネ シゥムイオンを存在 （又は含有） させる。
このアデノシン三リン酸としては、 遊離の酸又は塩の形態等のものを用いれば よく、 このアデノシン三リン酸又はその塩を存在 （含有） させる濃度は、 通常、 0. 00 1〜50 gZ 1が好ましく、 0. 0 1〜 10 gZ 1が特に好ましい。 また、 このマグネシウムイオンとしては、 例えば、 ハロゲンイオン又は有機酸 などとの塩の形態等のものを用いればよく、 通常、 0. 00 1〜100mMの濃 度で存在 （含有） させることが好ましく、 0. 01〜5 OmMの濃度で存在 （含 有） させることが特に好ましい。
そして、 グリセロール一 3—リン酸デヒドロゲナーゼによる触媒反応には、 二 コチンアミドアデニンジヌクレオチド （酸化型） 〔NAD+〕、 ニコチンアミドア デニンジヌクレオチドリン酸 （酸化型） 〔NADP+ (酸化型）〕 等の酸化型補酵 素が必要であるので、 第 1段階及び第 2段階の反応系にこの酸化型補酵素を存在 (又は含有） させる。
6. 過酸化水素又は還元型補酵素を他の物質に変える反応 本発明の測定方法の第 1段階においては、 第一選択的反応促進物質の存在下、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライドより過酸化水素 又は還元型補酵素を生成させ、 更にこの過酸化水素又は還元型補酵素を他の物質 に変える。
この一連の反応により、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグ リセライドの消去を行う。
この過酸化水素又は還元型補酵素を他の物質に変える反応は、 過酸化水素又は 還元型補酵素を他の物質に変えることができる反応であれば、 どのようなもので もよく、 一つの反応からなるものでもよく、 また、 複数の反応からなるものであ つてもよい。
( 1 ) 過酸化水素を他の物質に変える反応
① 力夕ラーゼによる反応
この過酸化水素を他の物質に変える反応としては、 例えば、 力タラ一ゼによる 触媒反応により、 2分子の過酸化水素を 2分子の水と 1分子の酸素に分解する反 応等を挙げることができる。
この力夕ラーゼは、 2分子の過酸化水素を 2分子の水と 1分子の酸素に分解す る反応を触媒するものであれば、 いかなるものでもよい。
このカタラーゼは、例えば、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、ヒト、 プタ若しくはゥシなどの動物由来のもの、 植物由来のもの、 又は遺伝子組換え法 により調製したもの等を用いることができる。
力タラ—ゼを存在 （又は含有） させる活性値については、 力夕ラーゼの由来、 又は 2試薬系などで測定を行う場合の第 1試薬と第 2試薬などの混合比率等によ り異なるので、 一概には言えず、 適宜その条件に適した活性値で第 1段階の反応 系に存在 （含有） させればよい。
通常、 力夕ラーゼは、 1 0 0単位 / 1以上の活性値で存在 （含有） させること が好ましい。
本来、 酵素の活性値は、 活性測定方法により異なるものであり、 また、 同じ活 性測定方法、 同じ酵素であっても、 その酵素の由来、 あるいは精製度等により異 なるものでもある。 よって、 先に記載した酵素の活性値の範囲を外れる酵素活性 値だからといって、必ずしも本発明の効果が得られないとは限らないものである。 なお、 第 1段階において生成した過酸化水素をカタラーゼにより消去した後、 第 2段階においてはカタラーゼの活性を阻害して働かないようにして、 第 2段階 で生成した過酸化水素が力タラ一ゼにより消去 （分解） されないようにする必要 がある。
これは、 アジ化ナトリウムなどの力夕ラーゼの活性を阻害する物質を、 第 2段 階において存在 （又は含有） させることにより、 達成することができる。
② ペルォキシダーゼによる反応
この過酸化水素を他の物質に変える反応の他の例として、ペルォキシダーゼ（P O D ) による触媒反応により、 過酸化水素と被酸化性物質 （トリンダ一反応系に よる色原体など） から酸化物質を生成させる反応等を挙げることができる。
このペルォキシダーゼは、 過酸化水素と被酸化性物質とを反応させ、 酸化物質 を生成させて、 過酸化水素を消費する反応を触媒するものであれば、 いかなるも のでもよい。
このペルォキシダーゼは、例えば、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、 ヒ卜、 ブタ若しくはゥシなどの動物由来のもの、 西洋ヮサビなどの植物由来のも の、 又は遺伝子組換え法により調製したもの等を用いることができる。
ペルォキシダ一ゼを存在 （又は含有） させる活性値については、 ペルォキシダ —ゼの由来、 又は 2試薬系などで測定を行う場合の第 1試薬と第 2試薬などの混 合比率等により異なるので、 一概には言えず、 適宜その条件に適した活性値で第 1段階の反応系に存在 （含有） させればよい。
通常、 ペルォキシダーゼは、 3 0単位 / 1以上の活性値で存在 （含有） させる ことが好ましい。
本来、 酵素の活性値は、 活性測定方法により異なるものであり、 また、 同じ活 性測定方法、 同じ酵素であっても、 その酵素の由来、 あるいは精製度等により異 なるものでもある。 よって、 先に記載した酵素の活性値の範囲を外れる酵素活性 値だからといって、必ずしも本発明の効果が得られないとは限らないものである。 被酸化性物質としては、 例えば、 トリンダー反応系による色原体等を挙げるこ とができる。 このトリンダー反応系による色原体としては、 例えば、 4ーァミノアンチピリ ン、 フエノール若しくはその誘導体、 又はァニリン誘導体等を挙げることができ る。
なお、 4ーァミノアンチピリンとフエノール若しくはその誘導体の両方、 又は 4ーァミノアンチピリンとァニリン誘導体の両方を、 第 1段階の反応系において 共存させると、 生成した過酸化水素及びペルォキシダーゼにより発色してしまう ので、 共存しないよう、 いずれか一方のみを存在 （含有） させるようにすること が好ましい。
トリンダー反応系による色原体の詳細については、 後の 「7 . 過酸化水素又は 還元型補酵素の測定」 の 「（1 ) 過酸化水素」 に記載した。
( 2 ) 還元型補酵素を他の物質に変える反応
還元型補酵素を他の物質に変える反応としては、 例えば、 この還元型補酵素を 補酵素とする脱水素酵素による触媒反応により、 この還元型補酵素を酸化型補酵 素とする反応等を挙げることができる。
この脱水素酵素は、 還元型補酵素を補酵素とし、 この還元型補酵素を酸化型補 酵素とする反応を触媒するものであれば、 いかなるものでもよい。 この脱水素酵 素としては、 例えば、 乳酸脱水素酵素、 リンゴ酸脱水素酵素、 イソクェン酸脱水 素酵素等を挙げることができる。
この脱水素酵素としては、例えば、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、 ヒト、 ブタ若しくはゥシなどの動物由来のもの、 植物由来のもの、 又は遺伝子組 換え法により調製したもの等を用いることができる。
この脱水素酵素を存在 （又は含有） させる活性値については、 この脱水素酵素 の由来、 又は 2試薬系などで測定を行う場合の第 1試薬と第 2試薬などの混合比 率等により異なるので、 一概には言えず、 適宜その条件に適した活性値で第 1段 階の反応系に存在 （含有） させればよい。
7 . 過酸化水素又は還元型補酵素の測定
本発明の測定方法の第 2段階においては、 第二選択的反応促進物質の存在下、 超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリ グリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させ、 更にこの過酸化水素 又は還元型補酵素を測る。
この一連の反応により、 被検試料の超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれていたトリグリセライドの測定を行う。
この第 2段階において生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測る方法は、 前 記のグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応によ り生成した過酸化水素又は還元型補酵素の量又は存否を測ることができる方法で あれば、 いかなる方法であってもよい。
例えば、 生成した過酸化水素又は還元型補酵素から、 何かしらのシグナルを導 き出す方法等を挙げることができる。
( 1 ) 過酸化水素
過酸化水素を測るには、 過酸化水素電極等により過酸化水素自体を測ってもよ く、又は過酸化水素から別のシグナルを導き出し、このシグナルを測ってもよい。 この過酸化水素から別のシグナルを導き出して測る方法としては、 例えば、 ぺ ルォキシダーゼ （P O D ) の存在下、 色原体を酸化させ色素を生成させて、 この 生成した色素の吸光度などを測定する、 トリンダー反応系を利用する反応等を挙 げることができる。
ペルォキシダ一ゼは、 例えば、 細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの、 ヒ ト、ブ夕若しくはゥシなどの動物由来のもの、西洋ヮサビなどの植物由来のもの、 又は遺伝子組換え法により調製したもの等を用いることができる。
このペルォキシダ一ゼを存在 （又は含有） させる活性値は、 通常、 3 0単位 Z 1以上とすることが好ましい。
トリンダー反応系における色原体としては、 例えば、 4一ァミノアンチピリン とフエノール若しくはその誘導体との組み合わせ、 又は 4—ァミノアンチピリン とァニリン誘導体との組み合わせ等を挙げることができる。
4—ァミノアンチピリンは、 通常、 0 . 0 0 1〜5 0 g Z lの濃度で存在 （又 は含有） させることが好ましく、 0 . 0 1〜1 O g Z lの濃度で存在 （含有） さ せることが特に好ましい。
フエノ.一ルの誘導体としては、 例えば、 4 _クロ口フエノール、 2， 4ージク ロロフエノール、 2， 4 _ジブロモフエノール、 若しくは 2， 4， 6—トリクロ 口フエノール、 又はこれらの塩等を挙げることができる。
ァニリン誘導体としては、 例えば、 N— （2—ヒドロキシー 3—スルホプロピ ル） 一 3， 5—ジメトキシァニリン （HDAOS)、 N— （3—スルホプロピル） - 3 , 5—ジメトキシァニリン （HDAP S)、 N—ェチルマ N— （2—ヒドロキ シ _ 3 _スルホプロピル） 一 3， 5—ジメトキシァニリン （DAOS)、 N—ェチ ルー N— (3 _スルホプロピル) — 3， 5—ジメトキシァニリン (DAP S), N ーェチルー N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 一 3 , 5—ジメトキシ 一 4一フルォロア二リン（FDAO S)、 N—ェチルー N—（3—スルホプロピル） 一 3, 5—ジメトキシー 4一フルォロア二リン （FDAPS)、 N_ (2—力ルポ キシェチル） 一 N—ェチルー 3, 5—ジメトキシァニリン （CEDB)、 N—ェチ ル— N— (2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル) 一 3—メトキシァニリン （A DOS), N—ェチルー N— (3—スルホプロピル) 一 3—メトキシァニリン （A DP S)、 N—ェチル— N—（2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル）ァニリン（A LOS)、 N—ェチルー N— (3一スルホプロピル) ァニリン （ALP S)、 N— (3—スルホプロピル) ァニリン (HAL P S)、 N—ェチルー N— (2—ヒドロ キシ— 3—スルホプロピル) 一 3 , 5—ジメチルァニリン （MAO S)、 N—ェチ ル _N_ (3—スルホプロピル） 一 3, 5—ジメチルァニリン （MAP S)、 N— ェチルー N— （2—ヒドロキシ _ 3—スルホプロピル） _ 3—メトキシァニリン (TOO S)、 N- (2—力ルポキシェチル) 一 N—ェチルー 3—メチルァニリン ( £ 8)、若しくは1^— (2—力ルポキシェチル） —N—ェチルー 3—メトキ シァニリン （CEMO)、 又はこれらの塩等を挙げることができる。
これらのフエノール若しくはその誘導体、 又はァニリン誘導体は、 通常、 0. 00 1〜50 1の濃度で存在 （又は含有） させることが好ましく、 0. 01 〜10 gZ lの濃度で存在 （含有） させることが特に好ましい。
(2) 還元型補酵素
還元型補酵素を測ることは、 還元型補酵素自体を 340 nmなどにおける吸光 度を測ることなどにより測ってもよく、 又は還元型補酵素から別のシグナルを導 き出し、 このシグナルを測ってもよい。
この還元型補酵素から別のシグナルを導き出し測る方法としては、 例えば、 ジ ァホラーゼ又は 1—メトキシ—フエナジンメトサルフェートなどの存在下、 テト ラゾリゥム塩などを還元させ色素を生成させて、 これを測る反応等を挙げること ができる。
8 . 反応補助物質
( 1 ) 反応補助物質
本発明の測定方法では、 第 1段階及び/又は第 2段階において、 反応補助物質 を存在 （又は含有） させてもよい。
この反応補助物質の存在 （含有） により、 第一選択的反応促進物質及びノ又は 第二選択的反応促進物質の選択的反応促進の働きを高めることができる。
反応補助物質の具体例として、 多糖類若しくはその誘導体、 ポリア二オン、 ハ ロゲンイオン、 金属イオン、 レクチン等を挙げることができる。
これらの反応補助物質は、 複数種類のものを組み合わせて、 存在 （又は含有） させてもよい。
( 2 ) 多糖類又はその誘導体
多糖類としては、 単糖が数個以上脱水縮合して生じた糖質を挙げることができ 、 例えば、 シクロデキストリン ( C D ) , デキストラン、 又はへパリン等を挙げる ことができる。
多糖類の誘導体としては、 前記多糖類の水素若しくは水酸基などの官能基が、 ヒドロキシプロピル基、 ヒドロキシブチル基、 ダルコシル基、 マルトシル基、 ジ ェチルアミノェチル基、 メチル基若しくはェチリデン基などの脂肪族炭化水素基 、 シクロプロピル基などの脂環式炭化水素基、 フエニル基、 ベンジル基若しくは ベンジリデン基などの芳香族炭化水素基、 メトキシ基若しくはフエノキシ基など のエーテル基、 ァセトキシ基若しくはベンゾイロキシ基などのエステル基、 ァセ チル基、 プロピオニル基若しくはベンゾィル基などのァシル基、 スルフヒドリル 基、 スルホ基、 スルホニル基、 力ルポキシル基、 アミノ基、 イミノ基、 二トリル 基、 カルポニル基、 ォキソ基、 水酸基、 又はニトロ基等で置換されたもの等を挙 げることができる。
更に、 多糖類の誘導体としては、 前記多糖類又は前記置換体の架橋物等を挙げ ることができる。 シクロデキストリンとしては、 α—シクロデキストリン （ 一C D )、 β—シク ロデキストリン （ 3— C D)、 アーシクロデキストリン （ァ— C D ) 等を挙げるこ とができる。
また、シクロデキストリン誘導体としては、例えば、 α—シクロデキストリン、 ]3—シクロデキストリン又は τーシクロデキストリンの水酸基が、 ヒドロキシプ 口ピル基、 ヒドロキシブチル基、 ダルコシル基、 マルトシル基、 ベンジル基、 若 しくはスルホニル基などで置換されたもの、 又はこれらのシクロデキストリン若 しくはその誘導体の架橋物等を挙げることができる。
シクロデキストリンとしては、 )3—シクロデキス卜リン又はアーシクロデキス トリンが好ましく、 シクロデキストリン誘導体としては、 ）3—シクロデキストリ ン若しくはアーシクロデキストリンの水酸基などが置換されたもの、 又は |8—シ クロデキストリン若しくはアーシクロデキストリンの架橋物が好ましい。
デキストランサルフェイト若しくはその誘導体は、 分子量が 1 , 0 0 0〜5， 0 0 0， 0 0 0の範囲のものが好ましく、 分子量が 5， 0 0 0〜1， 0 0 0 , 0 0 0の範囲のものが特に好ましい。
この多糖類又はその誘導体を存在 （又は含有） させる濃度は、 その種類、 第一 選択的反応促進物質及び Z又は第二選択的反応促進物質の種類及び濃度、 卜リグ リセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する 酵素の種類及び由来、被検試料中のリポ蛋白に含まれるトリグリセライドの濃度、 又は 2試薬系などで測定を行う場合の第 1試薬と第 2試薬などの混合比率等によ り異なるので、 一概には言えず、 適宜その条件に適した濃度で存在 （含有） させ ればよいが、 通常は、 0 . 0 0 5〜 5 %の濃度で存在（含有） させればよく、 0 . 0 8〜2 %の濃度で存在 （含有） させることが好適であり、 特に 0 . 0 1〜1 % の濃度で存在 （含有） させることが好適である。
( 3 ) 他の反応補助物質
ポリア二オンとしては、 例えば、 リンタングステン等を挙げることができる。 ハロゲンイオンとしては、 例えば、 クロールイオン等を挙げることができる。 金属イオンとしては、 例えば、 銅イオン、 マンガンイオンなどの 2価金属ィォ ン等を挙げることができる。 レクチンとしては、 例えば、 レンズマメレクチン等を挙げることができる。 この他の反応補助物質を存在 （又は含有） させる濃度は、 その種類、 第一選択 的反応促進物質及び 又は第二選択的反応促進物質の種類及び濃度、 トリグリセ ライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素 の種類及び由来、 被検試料中のリポ蛋白に含まれるトリダリセライドの濃度、 又 は 2試薬系などで測定を行う場合の第 1試薬と第 2試薬などの混合比率等により 異なるので、 一概には言えず、 適宜その条件に適した濃度で存在 （含有） させれ ばよい。
9. その他の物質
本発明の測定方法においては、 必要に応じて、 更に、 緩衝剤；他の酵素；他の 酵素の基質；他の補酵素；アルカリ金属若しくはアルカリ土類金属などのイオン 又はこれを含む塩；キレート剤；アルブミンなどのタンパク質；アジ化ナトリウ ム、 抗生物質若しくは合成抗菌剤などの防腐剤；糖類若しくは高分子化合物など の安定化剤；活性化剤；ァスコルビン酸ォキシダ一ゼなどの被検試料中に含まれ る測定妨害物質の消去若しくは影響抑制に関わる物質；賦形剤；又は他の試薬成 分等を適宜必要に応じて存在させることができる。
本発明の測定方法の第 1段階における p H及び第 2段階における p Hは、 p H 5〜 10の範囲であることが好ましく、 pH5. 5〜9. 0の範囲であることが より好ましい。
よって、 第 1段階及び第 2段階においては、 pHが前記の pHの範囲となるよ うな緩衝剤を存在させることが好ましい。
このような緩衝剤としては、 例えば、 ME S、 B i s— T r i s、 B i s -T r i sプロパン、 ADA、 P I PE S、 ACES, MOP SO、 MOP S、 BE S、 TES、 HEPES、 D I P SO、 TAPSO、 POPSO、 HEPPSO、 EPP S、 T r i c i n e、 B i c i n e、 TAPS, CHES、 リン酸、 リン 酸塩、 ホウ酸、 ホウ酸塩、 グリシン、 グリシルグリシン、 イミダゾール、 又はト リス (ヒドロキシメチル) ァミノメタン 〔T r i s〕 等を挙げることができる。
10. 被検試料
本発明の測定方法において、 被検試料は、 超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ 蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドが存在する可能性があ り、 超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれる トリグリセライドの測定を行おうとするものであれば、どのようなものでもよい。 このようなものの例として、 ヒト又は動物の血液、 血清、 血漿等の体液；ヒト 若しくは動物の臓器又は筋肉等の抽出液； ヒト又は動物の糞便の抽出液；細胞又 は菌体の抽出液；あるいは植物の抽出液等を挙げることができる。 ' 1 1 . 測定操作
本発明の測定方法は、 前記の第 1段階及び第 2段階の操作により、 被検試料中 の超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれるト リグリセライドを選択的に測定するものであるが、 実際に測定を行う際の測定操 作は、 二段階で実施 （2ステップ法、 2試薬系） してもよく、 又は三段階以上で 実施 （多ステップ法、 多試薬系） してもよい。
測定反応の開始方法は、 基質若しくは測定反応に必須な物質を加えることによ り行う方法、 又は被検試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法でもよ い。
測定操作時の温度は、 3 0で又は 3 7 °C等の測定反応が進行し、 かつ測定反応 にかかわる酵素等の反応成分が熱により失活又は変質しない範囲内の温度を設定 すればよい。
また、 本発明の測定方法において、 生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測 ることは、 反応速度法 （レート法）、 終点法 （エンドポイント法） 等のいずれの方 法によるものでもよい。
生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測ることにおいて、 吸光度等の測定に よりこれを行う場合、 測定波長は測定する物質に応じて、 紫外部、 可視部又は赤 外部の適当な波長を使用すればよい。
なお、 吸光度等の測定は、 一波長のみの測定でもよく、 又は二波長による測定 でもよい。
本発明の測定方法において、 測定の手法は用手法、 又は自動分析装置などの装 置による方法のいずれをも用いることができる。
この装置としては、 例えば、 臨床検査用の自動分析装置等を挙げることができ る。
この臨床検査用の自動分析装置の例として、 コンティニユアスフロー式若しく はフローインジェクション式などのフロー方式の自動分析装置、 クローズドタイ プ ·パッチ式、 オープンタイプ ·バッチ式、 パック式若しくは遠心式などのディ スクリート方式の自動分析装置、 又はフィルム式、 若しくは試験片式などのドラ ィケミストリー方式の自動分析装置等を挙げることができる。
装置により測定を行う操作の一例を以下に示す。
① まず、 本発明の測定方法の第 1段階を行うことができる測定試薬 （本発明の 測定試薬の第 1試薬）、並びに本発明の測定方法の第 2段階を行うことができる測 定試薬 （本発明の測定試薬の第 2試薬） を各々、 使用する装置に適合した容器に 入れる。
② これらの試薬が入った容器の各々を、 装置の所定の位置に置く。
③ また、測定を行う被検試料も装置に適合した容器に入れ、所定の位置に置く。
④ 装置が臨床検査用の自動分析装置の場合は、 使用する試薬、 及び測定を行お うとする被検試料等についての測定条件 （測定パラメ一夕） 等を装置に入力し、 設定する。
⑤ そして、 測定を開始する。
通常は、 被検試料と試薬の第 1試薬のそれぞれをピペット （プローブ） 又はチ ユーブ等で反応セル （反応キュベット） に分注し、 混合、 接触させ、 第 1段階の 反応系を形成させて、 温度一定の条件下に保ち、 第 1段階の反応を行わせる。
⑥ 一定時間後 （第 1段階の反応の終了後）、 この反応セル （反応キュベット） 内 の被検試料と試薬の第 1試薬との反応液 （第 1段階の反応系） について、 規定波 長の吸光度値を測定する。
⑦ 次に、 この反応セル （反応キュベット） 内の反応液に、 試薬の第 2試薬をピ ペット （プローブ） 又はチューブ等で分注し、 混合、 接触させ、 第 2段階の反応 系を形成させて、 温度一定の条件下に保ち、 第 2段階の反応を行わせる。
⑧ 一定時間後 （第 2段階の反応の終了後）、 この反応セル （反応キュべット） 内 の被検試料と試薬の第 1試薬及び第 2試薬との反応液 （第 2段階の反応系） につ いて、 規定波長の吸光度値を測定する。 ⑨ 被検試料に替え精製水について、 前記⑤〜⑧の操作を行い、 試薬盲検の吸光 度値を測定する。
⑩ 前記⑧で得た吸光度値より試薬盲検の吸光度値を差し引いたものから、 前記 ⑥で得た吸光度値より試薬盲検の吸光度値を差し引いたものを減じて、 吸光度差 の値を算出する。
⑪ 前記⑩で算出した吸光度差の値と、 濃度既知のトリグリセライド試料 （標準 液） における吸光度差の値 〔検量線〕 とを比較することにより、 被検試料中の超 低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリグ リセライドの濃度を算出して得る。
II. 測定試薬
1 . 測定試薬 ·総論
本発明の被検試料中の超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重 リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの選択的測定試薬は、 以下の第 1試薬及び 第 2試薬より構成される。
第 1試薬：
低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的にリ ポプ口ティンリパーゼと反応させることができるポリォキシアルキレンのェ一テ ル化合物又はエステル化合物である第一選択的反応促進物質、 リポプロテインリ パーゼ、 グリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応 を触媒する酵素、 及び過酸化水素又は還元型補酵素を他の物質に変える反応を触 媒する酵素を含有し、 更に必要により過酸化水素又は還元型補酵素からシグナル を導き出す反応にかかわる物質を含有する試薬。
第 2試薬：
超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に 含まれるトリグリセライドを選択的にリポプロテインリパーゼと反応させること ができる第二選択的反応促進物質を含有し、 更に必要により過酸化水素又は還元 型補酵素からシグナルを導き出す反応にかかわる物質を含有する試薬。
なお、 本発明の測定試薬は、 前記の第 1試薬及び第 2試薬より構成されるもの であるが、 必要に応じて更に他の試薬、 及び Z又は標準物質 （校正物質） 等と組 み合わされたものであってもよい。
また、 本発明の測定試薬において、 第 1試薬の各成分は更に 2試薬以上に分け て含有させてもよい。 （この場合、第 1試薬は、 2試薬以上の複数試薬より構成さ れる。）
同様に、第 2試薬の各成分は更に 2試薬以上に分けて含有させてもよい。 （この 場合、 第 2試薬は、 2試薬以上の複数試薬より構成される。）
以上の試薬の構成により、 被検試料の測定時に、 被検試料中の高比重リポ蛋白 及び低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを消去し、 また被検試料中の力 イロミクロンに含まれるトリグリセライドを測定反応にはかかわらせないことに より、 被検試料中の超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ 蛋白に含まれるトリグリセライドのみを過酸化水素又は還元型補酵素に導いて選 択的に測定が行えるようにしたものである。
2 . 第 1試薬
本発明の測定試薬の第 1試薬は、 本発明の測定方法の第 1段階を行うものであ る。 （この第 1段階については、 前記の 「1 . 測定方法」 の 「2 . 第 1段階」 等に 詳細に記載）
3 . Bitste
本発明の測定試薬の第 2試薬は、 本発明の測定方法の第 2段階を行うものであ る。 （この第 2段階については、 前記の 「 1 . 測定方法」 の 「3 . 第 2段階」 等に 詳細に記載）
4 . 選択的反応促進物質
( 1 ) 第一選択的反応促進物質
本発明の測定試薬の第 1試薬に含有させる第一選択的反応促進物質は、 前記の 「1 . 測定方法」 の 「4 . 選択的反応促進物質」 の 「（1 ) 第一選択的反応促進物 質」 に記載した通りである。
( 2 ) 第二選択的反応促進物質
本発明の測定試薬の第 2試薬に含有させる第二選択的反応促進物質は、 前記の 「 1 . 測定方法」 の 「4 . 選択的反応促進物質」 の 「（2 ) 第二選択的反応促進物 質」 に記載した通りである。 ( 3 ) 選択的反応促進物質のポリオキシアルキレンの平均付加モル数 本発明の測定試薬の第 1試薬に含有させる第一選択的反応促進物質及び第 2試 薬に含有させる第二選択的反応促進物質における、 ポリオキシアルキレンの平均 付加モル数は、 前記の 「1 . 測定方法」 の 「4 . 選択的反応促進物質」 の 「（3 ) 選択的反応促進物質のポリオキシアルキレンの平均付加モル数」 に記載した通り である。
5 . リポプロテインリパーゼ
本発明の測定試薬の第 1試薬に含有させるリポプロティンリパーゼは、 前記の 「 1 . 測定方法」 の 「5 . 卜リグリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を 生成させる反応」 の 「（2 ) リポプロテインリパーゼにより触媒される反応」 に記 載した通りである。
なお、 リポプロテインリパーゼは、 第 1試薬に含有させるだけではなく、 第 1 試薬と第 2試薬の両方に含有させてもよい。
6 . グリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を触 媒する酵素
本発明の測定試薬の第 1試薬に含有させる、 グリセロールより過酸化水素又は 還元型補酵素を生成させる一連の反応を触媒する酵素は、 リポプロテインリパー ゼによる反応により生成したグリセロールから過酸化水素又は還元型補酵素を生 成させることができる反応を触媒する酵素であれば、 どのようなものでもよく、 一連の反応を触媒する 1種類の酵素であってもよく、 また、 一連の反応にかかわ る複数種類の酵素からなるものであってもよい。
このグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応を 触媒する酵素としては、 例えば、 グリセロールキナーゼ、 グリセ口一ルー 3—リ ン酸ォキシダーゼ、 グリセロール一 3—リン酸デヒドロゲナ一ゼ等を挙げること ができる。
なお、 グリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応 及びこの反応を触媒する酵素の詳細については、前記の「 I . 測定方法」 の「5 . トリダリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる反応」 の 「（3 ) グリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応」 に記載 した通りである。
また、 前記のグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連 の反応を触媒する酵素は、 第 1試薬に含有させるだけではなく、 第 1試薬と第 2 試薬の両方に含有させてもよい。
なお、 グリセロールキナーゼによる触媒反応には、 アデノシン三リン酸 （A T P ) 及びマグネシウムイオンが必要である。 よって、 グリセロールキナーゼを用 いる場合には、第 1試薬にアデノシン三リン酸及びマグネシウムイオンを存在（又 は含有） させる。
このアデノシン三リン酸及びマグネシウムイオンは、 前記の 「1 . 測定方法」 の 「5 . トリダリセライドより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる反応」 の「（3 )グリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の反応」 に記載した通りである。
前記のアデノシン三リン酸又はマグネシウムイオンは、 第 1試薬に含有させる だけではなく、 第 1試薬と第 2試薬の両方に含有させてもよい。
また、 グリセロール一 3—リン酸デヒドロゲナーゼを用いる場合には、 ニコチ ンアミドアデニンジヌクレオチド (酸化型) 〔N A D +〕、 又はニコチンアミドア デニンジヌクレオチドリン酸 (酸化型） 〔N A D P + (酸化型）〕 等の酸化型補酵 素が必要であるので、 第 1試薬 （又は、 第 1試薬及び第 2試薬） にこの酸化型補 酵素を含有させる。
7 . 過酸化水素又は還元型補酵素を他の物質に変える反応を触媒する酵素
本発明の測定試薬の第 1試薬に含有させる、 過酸化水素又は還元型補酵素を他 の物質に変える反応を触媒する酵素は、 生成した過酸化水素又は還元型補酵素を 他の物質に変える反応を触媒することができる酵素であれば、 どのようなもので もよく、 この反応を触媒する 1種類の酵素であってもよく、 また、 この反応にか かわる複数種類の酵素からなるものであってもよい。
過酸化水素を他の物質に変える反応を触媒する酵素としては、 例えば、 力タラ —ゼ、 ペルォキシダーゼ等を挙げることができる。
また、 還元型補酵素を他の物質に変える反応を触媒する酵素としては、 この還 元型補酵素を補酵素とし、 この還元型補酵素を酸化型補酵素とする反応を触媒す る脱水素酵素等を挙げることができ、より具体的には、例えば、乳酸脱水素酵素、 リンゴ酸脱水素酵素、 イソクェン酸脱水素酵素等を挙げることができる。
なお、 過酸化水素を他の物質に変える反応を触媒する酵素として、 力夕ラーゼ を用い、 これを第 1試薬に含有させる場合には、 アジ化ナトリウム等のカタラー ゼの活性を阻害する物質を第 2試薬に含有させることにより、 第 2段階で生成し た過酸化水素が力タラ一ゼによって消去（分解）されないようにする必要がある。 また、 過酸化水素を他の物質に変える反応を触媒する酵素として、 ペルォキシ ダーゼを用い、 これを第 1試薬に含有させる場合には、 被酸化性物質をも第 1試 薬に含有させる必要がある。
これにより、 過酸化水素と被酸化性物質は、 ペルォキシダーゼによる触媒反応 により酸化物質に変わる。
この被酸化性物質としては、 例えば、 4一ァミノアンチピリン、 フエノール若 しくはその誘導体、 又はァニリン誘導体等を挙げることができる。
なお、 4ーァミノアンチピリンとフエノール若しくはその誘導体の両方、 又は 4ーァミノアンチピリンとァニリン誘導体の両方を、 第 1試薬に含有させると、 第 1段階において、 生成した過酸化水素及びペルォキシダーゼにより発色してし まうので、 共存しないよう、 いずれか一方のみを第 1試薬に存在 （含有） させる ようにしなければならない。
過酸化水素又は還元型補酵素を他の物質に変える反応及びこの反応を触媒する 酵素の詳細については、 前記の 「 1 . 測定方法」 の 「6 . 過酸化水素又は還元型 補酵素を他の物質に変える反応」 に記載した通りである。
8 . 過酸化水素又は還元型補酵素からシグナルを導き出す反応にかかわる物質 過酸化水素又は還元型補酵素からシグナルを導き出す反応にかかわる物質は、 必要により本発明の測定試薬の第 1試薬、 第 2試薬、 又は、 第 1試薬及び第 2試 薬に含有させる。
即ち、 被検試料と第 1試薬を混合、 接触させ （第 1段階）、 次いで、 第 2試薬を 混合、 接触させ （第 2段階）、 生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測るのに、 この過酸化水素自体又は還元型補酵素自体を測る場合以外は、 過酸化水素又は還 元型補酵素からシグナルを導き出す反応にかかわる物質を、第 1試薬、第 2試薬、 又は、 第 1試薬及び第 2試薬に含有させる必要がある。
なお、 この過酸化水素又は還元型補酵素からシグナルを導き出す反応にかかわ る物質は、 生成した過酸化水素又は還元型補酵素からシグナルを導き出すことが できる反応にかかわる物質であれば、 どのようなものでもよく、 前記反応にかか わる 1種類の物質であってもよく、 また、 前記反応にかかわる複数種類の物質か らなるものであってもよい。
そして、 この過酸化水素又は還元型補酵素からシグナルを導き出す反応にかか わる物質としては、 例えば、 ペルォキシダ一ゼ、 トリンダ一反応系における色原 体 （4一ァミノアンチピリン、 フエノール若しくはその誘導体、 又はァニリン誘 導体）、 ジァホラーゼ、 1ーメトキシーフエナジンメトサルフェート、 又はテトラ ゾリゥム塩等を挙げることができる。
また、 この過酸化水素又は還元型補酵素からシグナルを導き出す反応にかかわ る物質の全てを第 1試薬、 又は第 2試薬に含有させてもよいが、 過酸化水素又は 還元型補酵素からシグナルを導き出す反応にかかわる物質を第 1試薬と第 2試薬 に分けて含有させた方が、 試薬が安定となるので好ましい。
例えば、 4ーァミノアンチピリンとフエノール若しくはその誘導体を分け、 又 は 4—ァミノアンチピリンとァニリン誘導体を分けて、 第 1試薬と第 2試薬の 各々に含有させる。
更に、 ペルォキシダーゼ及び 4—ァミノアンチピリン及びフエノール若しくは その誘導体、 又はペルォキシダーゼ及び 4—ァミノアンチピリン及びァニリン誘 導体を、 第 1試薬に含有させると、 第 1段階において、 生成した過酸化水素によ り発色してしまうので、 前記の 3物質が共存しないよう、 第 1試薬と第 2試薬に 分けて含有させるようにすることが好ましい。
なお、 過酸化水素又は還元型補酵素からシグナルを導き出す反応にかかわる物 質の詳細については、 前記の 「1 . 測定方法」 の 「7 . 過酸化水素又は還元型補 酵素の測定」 に記載した通りである。
9 . 反応補助物質
本発明の測定試薬において、 第 1試薬及び Z又は第 2試薬に反応補助物質を含 有させてもよい。 なお、 この反応補助物質の詳細については、 前記の 「 1. 測定方法」 の 「8. 反応補助物質」 に記載した通りである。
10. その他の物質
本発明の測定試薬の第 1試薬及び/7又は第 2試薬においては、 必要に応じて、 更に、 緩衝剤；他の酵素；他の酵素の基質；他の補酵素；アルカリ金属若しくは アルカリ土類金属などのイオン又はこれを含む塩；キレート剤；アルブミンなど のタンパク質；アジ化ナトリウム、 抗生物質若しくは合成抗菌剤などの防腐剤； 糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤；活性化剤；ァスコルビン酸ォキシダ ーゼなどの被検試料中に含まれる測定妨害物質の消去若しくは影響抑制に関わる 物質；賦形剤；又は他の試薬成分等を適宜必要に応じて含有させることができる。 本発明の測定試薬の第 1試薬の P H及び第 2試薬の p Hは、 各々 p H 5〜 1 0 の範囲であることが好ましく、 pH5. 5〜9. 0の範囲であることが特に好ま しい。
よって、 第 1試薬及び第 2試薬の各々においては、 pHが前記の pHの範囲と なるような緩衝剤を含有させることが好ましい。
このような緩衝剤は、 前記の 「1. 測定方法」 の 「9. その他の物質」 に例示 した通りである。
1 1. 被検試料
本発明の測定試薬の対象となる被検試料の詳細については、 前記の 「 I . 測定 方法」 の 「10. 被検試料」 に例示した通りである。
1 2. 測定操作
本発明の測定試薬により、 被検試料中の超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋 白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に測定する操作 の詳細については、 前記の 「 1. 測定方法」 の 「1 1. 測定操作」 に記載した通 りである。 本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2002 - 168738の明細書 に記載された内容を包含する。 発明を実施するための最良の形態
次に、 実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが,、 本発明はこれらに限定さ れるものではない。
〔実施例 1〕 本発明の測定方法及び測定試薬による精製リポ蛋白画分中の,卜リグ セライドの測定
各種の第一選択的反応促進物質及び第二選択的反応促進物質を各々用いた測定 方法及び測定試薬にて、精製リポ蛋白画分中のトリグリセライドの測定を行った。 1. 本発明の測定試薬の調製
(1) 第 1試薬 （試薬 A) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分
2—モルホリノエタンスルホン酸 [MES] 50 mM N— （2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 一 3 5—ジメ卜キシァニリンナ トリウム （色原体） 1. 5mM グリセロールキナーゼ 150単位 Z 1 グリセロール一 3—リン酸ォキシダ一ゼ 3 000単位 Z 1 アデノシン三リン酸ナトリゥム 0. 5mM 塩化マグネシウム ·六水和物 1 mM カタラーゼ 1 00 000単位 Z 1 リポプロテインリパーゼ 〔： LP— BP (旭化成）〕 300, 000単位/ 1 第一選択的反応促進物質 〔物質名は表 1に記載〕 0 1 % (w/v)
第一； ¾択的反応促進物質 販冗兀 ィ匕子構； la
N P— 1 0 日光ケ カルス ホ リオキンエチレンノールフェールエーアル （10) エマ Λ "ゲン 9 上 1 花王 ホ リオキンエチレンノールフェールエー τル （II)
NP- 1 1. 2 日光ケミカルズ ホ。リオキシエチレンノニルフエニルエ-テル (II.2)
N P— 1 1. 4 日フ tケ カリレス ホ リオキンエチレンノールフェールェ一アル （11.4)
N P— 1 1. 日光ケ ^刀ノレス す、 リォキンエチレンノールフェールエーアル (11. b)
Ν Ρ— 1 1. D 日允ケ カノレス Φ リオキンエチレンノールノエ一ル丄一丁ル In. b)
Ν Ρ 1 3 n ιΐ
日允ケ カルス ホ リオキンエチレンノールフェールエーアル （13) 第—選択的反応促進物質 販冗兀 化学構造
ΝΡ- 10 日光ケミカルズ ホ。リオキシエチレンノニルフエニルエ-テル (10)
ΝΡ - 1 1. 2 日光ケミカルズ ホ。リオキシ Iチレンノニルフ 1二 エ-テル (11. )
ΝΡ - 1 1. 4 日光ケミカルズ ホ。リオキシエチレンノ::ルフエ::ルエ-テル (11.4)
ΝΡ— 1 1. 6 日光ケミカルズ ホ°リオキシエチレンノ::ルフエ；:ルエ-テル (11.6)
ΝΡ - 1 3 日光ケミカルズ ホ。リオキシ Iチレンノ：:ルフ Iニル I -テル (13)
※ 括弧内の数値 〔ポリォキシェチレンの平均付加モル数
(2) 第 2試薬 （試薬 B) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分
2—モルホリノエタンスルホン酸 [MES] 5 OmM 4一ァミノアンチピリン 0. 75mM ペルォキシダーゼ 600単位/ 1 リポプロテインリパーゼ 〔LPL (旭化成）〕 500, 000単位 Z 1 アジ化ナトリウム 0 1 % (w/v) 第二選択的反応促進物質 〔物質名は表 1に記載〕 0 5 % (w/v) 2. 総卜リグリセライ ド測定試薬 （対照） の調製
(1) 第 1試薬 （試薬 C) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 ： pH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分 2—モルホリノエタンスルホン酸 [ME S] 5 OmM
N- (2—ヒドロキシ _ 3—スルホプロピル） — 3， 5—ジメトキシァニリンナ トリウム （色原体） 1. 5 mM グリセロールキナーゼ 1 5 0単位 Z 1 グリセ口一ルー 3—リン酸ォキシダーゼ 3 0 0 0単位 Z 1 アデノシン三リン酸ナトリウム 0. 5mM 塩化マグネシウム ·六水和物 1 mM カタラーゼ 1 0 0 0 0 0単位 Z 1 アデ力ノール B— 7 9 5 (旭電化工業） 0 5 % (w/v) (2) 第 2試薬 （試薬 D) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH 6. 0 (2 0°C) の試薬を調製した。
試薬成分
2—モルホリノエタンスルホン酸 [ME S] 5 OmM 4—ァミノアンチピリン 0. 7 5mM ペルォキシダーゼ 6 0 0単位 Z 1 リポプロテインリパーゼ 〔L PL (旭化成）〕 1 2 0 , 0 0 0単位/ 1 アジ化ナトリゥム 0 1 % (w/v) アデ力ノール B— 7 9 5 (旭電化工業） 0 5 % (w/v) 3. 精製リポ蛋白画分の調製
凝固阻止剤を入れた採血管で血液を採取し、これを密度勾配遠心法にて分離し、 カイロミクロン、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白及び高 比重リポ蛋白の 5種類の比重の異なるリポ蛋白の画分をそれぞれ得た。 これらの 5種類の画分を被検試料として測定に供した。
4. リポ蛋白画分中のトリダリセライドの測定
前記 3で調製した各リポ蛋白画分中のトリグリセライドの測定は、 以下に示す 手順で日立 7 1 7 0 S形自動分析装置 （日立製作所） を用いて行った。
① 反応セル （反応キュベット） に、 前記 3で調製したリポ蛋白画分の 2. 5 H 1を被検試料として分注した。 次に、 この反応セル （反応キュベット） に、 前記 1の （1) の本発明の第 1試 薬 （試薬 A) 2,00 1を分注し、 混合した。 .
そして、 この反応セル （反応キュベット） を、 37°Cで加温して、 第 1段階の 反応を行わせた。
② 前記の第 1試薬 （試薬 A) の添加後 4分 30秒目 （16ポイント目） に、 こ の反応セル （反応キュベット） 内の反応液 （被検試料と第 1試薬との反応液） の 吸光度 （主波長 600 nm、 副波長 700 nm) を試料盲検として測定した。
③ 前記の吸光度の測定後に、 この反応セル (反応キュベット） 内の反応液に、 更に、 前記 1の （2) の本発明の第 2試薬 （試薬 B) を 100 1分注し、 混合 した。
そして、 この反応セル （反応キュベット） を、 37°Cで加温して、 第 2段階の 反応を行わせた。
④ 前記の第 1試薬 （試薬 A) の添加後 9分 47秒目 （34ポイント目） に、 こ の反応セル （反応キュベット） 内の反応液 （被検試料と第 1試薬及び第 2試薬と の反応液） の吸光度 （主波長 600 nm, 副波長 700 nm) を、 この被検試料 の測定値として測定した。
⑤ 前記の被検試料に替え、 精製水について、 前記①〜④の操作を行い、 試薬盲 検の吸光度を測定した。
⑥ 前記④で得た吸光度 (測定値）より試薬盲検の吸光度を差し引いたものから、 前記②で得た吸光度 （試料盲検） より試薬盲検の吸光度を差し引いたものを減じ て、 被検試料の吸光度差を算出した。
⑦ トリダリセライドであるトリオレイン （トリオレオイルグリセロール） の水 溶液 （濃度： 25 OmgZd 1 ) を被検試料とし、 前記 2の （1) の総トリダリ セライド測定試薬の第 1試薬 （試薬 C)、 及び前記 2の （2) の総トリグリセライ ド測定試薬の第 2試薬 （試薬 D) を用いて、 前記①〜⑥の操作を行い、 このトリ ォレインの水溶液の吸光度差 〔検量線〕 を算出した。
⑧ 前記⑥で算出した被検試料の吸光度差と、 前記⑦で算出した 25 OmgZd 1のトリオレインの水溶液の吸光度差 〔検量線〕 を比較し、 被検試料 （リポ蛋白 画分） に含まれる卜リグリセライドの濃度を算出して得た。 なお、 前記の測定における、 本発明の第 1試薬 （試薬 A) に含有させた第一選 択的反応促進物質と、 本発明の第 2試薬 （試薬 B ) に含有させた第二選択的反応 促進物質との組合せは、 表 2に示した。
また、 前記の方法と同様にし、 前記 2の （1 ) の総トリグリセライド測定試薬 の第 1試薬 （試薬 C )、 及び前記 2の （2 ) の総トリグリセライド測定試薬の第 2 試薬 （試薬 D ) を用いて、 前記 3で調製した各リポ蛋白画分中のトリグリセライ ドの測定を行った。
本発明の測定試薬に含有させた第一選択的反応促進物質及び第二選択的反応促 進物質の効果を確かめるため、 本発明の測定試薬 （試薬 A及び試薬 B ) を用いた ときの各被検試料（リポ蛋白画分） に含まれるトリグリセライドの濃度（測定値） を、 総トリグリセライド測定試薬 （試薬 C及び試薬 D ) を用いたときの各被検試 料 （リポ蛋白画分） に含まれるトリグリセライドの濃度 （測定値） で除した値を 求めた。
この値を表 2に示した。
表 2
Figure imgf000042_0001
CM：カイロミクロン
VLDL：超低比重リポ蛋白
I DL ：中間比重リポ蛋白
LDL ：低比重リポ蛋白
HDL ：高比重リポ蛋白
5. まとめ
(1) 第二選択的反応促進物質を NP— 1 0とした場合
本発明の第 2試薬 （試薬 B) に含有させる第二選択的反応促進物質を NP— 1 0 (ポリォキシエチレンの平均付加モル数が 1 0のポリオキシエチレンノニルフ ェニルエーテル） とし、 本発明の第 1試薬 （試薬 A) に含有させる第一選択的反 応促進物質 (ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル) のポリオキシェチレ ンの平均付加モル数を種々変えた場合の測定結果について以下説明を行う。 ① 第一選択的反応促進物質のポリオキシエチレンの平均付加モル数が 1 0 〔N P— 1 0〕の場合には、被検試料がカイロミクロン画分、超低比重リポ蛋白画分、 中間比重リポ蛋白画分、 低比重リポ蛋白画分及び高比重リポ蛋白画分のいずれの 場合でも、 各々のリポ蛋白画分に含まれるトリグリセライドを測定できていない ことが分かる。 ② 第一選択的反応促進物質のポリオキシエチレンの平均付加モル数が 1 1 〔ェ マルゲン 91 1〕 の場合、 1 1. 2 [NP- 1 1. 2〕 の場合、 1 1. 4 〔N P - 1 1. 4〕 の場合、 1 1. 5 [NP- 1 1. 5] の場合、 及び 1 1. 6 [NP - 1 1. 6〕 の場合にはいずれも、 超低比重リポ蛋白画分及び中間比重リポ蛋白 画分に含まれるトリグリセライドを測定できており、 それに対してカイロミクロ ン画分、 低比重リポ蛋白画分、 及び高比重リポ蛋白画分に含まれるトリダリセラ イドはほとんど測定していないか又は僅かにしか測定していないことが分かる。 即ち、 ポリオキシエチレンの平均付加モル数を四捨五入した場合、 第二選択的 反応促進物質のポリオキシエチレンの平均付加モル数 （n) が 1 0であって、 第 一選択的反応促進物質のポリオキシエチレンの平均付加モル数 （m) が 1 1〜1 2のとき （mZnが 1. 1〜1. 2のとき）、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋白、 及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドに比較して、 超低比重リポ蛋白 及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に測定することがで きることが確かめられた。
③ 第一選択的反応促進物質のポリオキシエチレンの平均付加モル数が 13 CN P— 1 3〕 の場合、 超低比重リポ蛋白画分及び中間比重リポ蛋白画分に含まれる トリグリセライドを測定できているものの、 低比重リポ蛋白画分に含まれるトリ グリセライドをも測定してしまうことが分かる。
即ち、 超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含ま れるトリグリセライドだけを選択的に測定することができないことが確かめられ た。
(2) 第一選択的反応促進物質をェマルゲン 91 1とした場合
本発明の第 1試薬 （試薬 A) に含有させる第一選択的反応促進物質をエマルゲ ン 9 1 1 (ポリォキシェチレンの平均付加モル数が 1 1のポリォキシエチレンノ ニルフエニルエーテル） とし、 本発明の第 2試薬 （試薬 B) に含有させる第二選 択的反応促進物質 （ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル） のポリオキシ エチレンの平均付加モル数を種々変えた場合の測定結果について以下説明を行う。 ① 第二選択的反応促進物質のポリオキシエチレンの平均付加モル数が 10 〔N P— 1 0〕 の場合、 超低比重リポ蛋白画分及び中間比重リポ蛋白画分に含まれる トリグリセライドを測定できており、 それに対してカイロミクロン画分、 低比重 リポ蛋白画分及び高比重リポ蛋白画分に含まれる卜リグリセライドをほとんど測 定していないことが分かる。
即ち、 第一選択的反応促進物質のポリオキシエチレンの平均付加モル数 （m) が 1 1であって、 第二選択的反応促進物質のポリオキシエチレンの平均付加モル 数 （n) が 10のとき （m/nが 1. 1のとき）、 カイロミクロン、 低比重リポ蛋 白及び高比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライドに比較して、 超低比重リポ蛋 白及び中間比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に測定することが できることが、 この実験結果からも確かめられた。
② 第二選択的反応促進物質のポリオキシエチレンの平均付加モル数が 1 1. 2 [NP- 1 1. 2〕 の場合、 1 1. 4 〔NP— 1 1. 4〕 の場合、 1 1. 6 〔N P- 1 1. 6〕 の場合、 及び 1 3 〔NP— 1 3〕 の場合には、 超低比重リポ蛋白 画分及び中間比重リポ蛋白画分に含まれるトリグリセライドを測定できているも のの比率が低いことが分かる。
即ち、 ポリオキシエチレンの平均付加モル数を四捨五入した場合、 第一選択的 反応促進物質のポリオキシエチレンの平均付加モル数 （m) が 1 1であって、 第 二選択的反応促進物質のポリオキシエチレンの平均付加モル数 （n) が 1 1〜1 3のとき （mZnが 0. 85〜1. 0のとき） は、 超低比重リポ蛋白及び中間比 重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライドの選択的測定に は適さないものであることが確かめられた。
〔実施例 2〕 反応補助物質の効果の確認
第一選択的反応促進物質及びノ又は第二選択的反応促進物質の選択的反応促進 の働きが、 反応補助物質の存在 （含有） により高まることの効果を確かめた。 1. 本発明の測定試薬の調製
(1) 第 1試薬 （試薬 E) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分 濃度 2—モルホリノエ夕ンスルホン酸 [ME S] 5 OmM N— （2—ヒドロキシー 3 _スルホプロピル） 一 3 5—ジメトキシァニリンナ トリウム （色原体） 1. 5 mM グリセロールキナーゼ 1 50単位 Z 1 グリセロール一 3—リン酸ォキシダ一ゼ 3, 000単位/ 1 アデノシン三リン酸ナトリウム 0. 5 mM 塩化マグネシウム ·六水和物 1 mM カタラーゼ 100, 000単位/ 1 リポプロテインリパーゼ 〔LP— BP (旭化成）〕 100, 000単位/ 1 ェマルゲン 9 1 1 (花王) 0. 1 % (w/v) 反応補助物質 〔物質名及び濃度は表 3に記載〕
307066
表 3
Figure imgf000046_0001
(2) 第 2試薬 （試薬 F) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 pH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分 濃度
2—モルホリノエタンスルホン酸 [ME S] 5 OmM
4一ァミノアンチピリン 0. 75mM ペルォキシダ一ゼ 600単位 Z 1 リポプロテインリパーゼ 〔； LPL (旭化成）〕 500, 0 0 0単位/ 1 アジ化ナトリウム 0 1 % (w/v) NP— 1 0 (日光ケミカルズ） 0 5 % (w/v)
2. 総トリグリセライド測定試薬 （対照）
(1) 第 1試薬 （試薬 C)
前記実施例 1の 2の （1) の第 1試薬 （試薬 C) を用いた。
(2) 第 2試薬 （試薬 D)
前記実施例 1の 2の （2) の第 2試薬 （試薬 D) を用いた。
3. 精製リポ蛋白画分
前記実施例 1の 3のカイロミクロン、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白の 5種類のリポ蛋白の画分を、 それぞれ被検 試料として測定に用いた。
4. リポ蛋白画分中のトリダリセライドの測定
前記 3で調製した各リポ蛋白画分中のトリグリセライドの測定は、 本発明の第 1試薬 （試薬 A) に代えて前記 1の （1) の本発明の第 1試薬 （試薬 E) を用い たこと、 及び本発明の第 2試薬 （試薬 B) に代えて前記 1の （2) の本発明の第 2試薬 （試薬 F) を用いたこと以外は、 前記実施例 1の 4の①〜⑧の記載の通り に行った。
そして、 前記の各々の第 1試薬 （試薬 E) 毎に 〔各反応補助物質及び各濃度毎 に〕、 前記の測定を行った。
また、 前記の方法と同様にし、 前記 2の （1) の総卜リグリセライド測定試薬 の第 1試薬 （試薬 C)、 及び前記 2の （2) の総トリグリセライド測定試薬の第 2 試薬 （試薬 D) を用いて、 前記 3で調製した各リポ蛋白画分中のトリグリセライ ドの測定を行った。
そして、本発明の測定試薬（試薬 E及び試薬 F)を用いたときの各被検試料（リ ポ蛋白画分） に含まれるトリダリセライドの濃度 （測定値） を、 総トリダリセラ イド測定試薬 （試薬 C及び試薬 D) を用いたときの各被検試料 （リポ蛋白画分） に含まれるトリダリセライドの濃度 （測定値） で除した値を求めた。
この値を表 4に示した。 表 4
Figure imgf000048_0001
CM：カイロミクロン
VLDL ：超低比重リポ蛋白
I DL ：中間比重リポ蛋白
LDL ：低比重リポ蛋白
HDL ：高比重リポ蛋白
5. まとめ
① 反応補助物質として JS— CDを、 本発明の第 1試薬 （試薬 E) に含有させる ことにより、 低比重リポ蛋白に含まれる卜リグリセライドを測り込んでしまう度 6 合いを低減させることができることが分かる。
そして、 含有させる濃度を増加させたとき、 超低比重リポ蛋白及び中間比重リ ポ蛋白に含まれるトリグリセライドを測定できる度合いは減少するものの、 それ を上回る比率で低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの測り込みを減少さ せることができることが分かる。
これは、 反応補助物質として、 ヒドロキシプロピルーァー C D、 マルトシルー /3— C D、 水溶性 β一シクロデキストリンポリマー、 又は水溶性アーシクロデキ ストリンポリマ一を用いたときも、 同様の効果が生じることが分かる。
② 反応補助物質としてァー C Dを、 本発明の第 1試薬 （試薬 E ) に含有させる ことにより、 低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを測り込んでしまう度 合いを低減させることができることが分かる。
そして、 含有させる濃度を増加させたとき、 超低比重リポ蛋白及び中間比重リ ポ蛋白に含まれるトリグリセライドを測定できる度合いは減少するものの、 それ を上回る比率で低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドの測り込みを減少さ せることができることが分かる。
③ 反応補助物質として α— C Dスルホン酸ナトリゥムを、本発明の第 1試薬（試 薬 E ) に含有させることにより、 低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを 測り込んでしまう度合いを低減させることができることが分かる。
④ 反応補助物質としてイソエリート Pを、 本発明の第 1試薬 （試薬 E ) に含有 させることにより、 低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを測り込んでし まう度合いを低減させることができることが分かる。
そして、 含有させる濃度を増加させたとき、 低比重リポ蛋白に含まれるトリグ リセライドの測り込みを減少させることができることが分かる。
以上のことより、 反応補助物質であるシクロデキストリン又はその誘導体を存 在 （含有） させることにより、 第一選択的反応促進物質及び Z又は第二選択的反 応促進物質の選択的反応促進の働きを高められることが確かめられた。
〔実施例 3〕 リポプロテインリパーゼの性質による効果の確認
第 1試薬に含有させる （第 1段階に存在させる） リポプロテインリパーゼ、 及 び第 2試薬に含有させる （第 2段階に存在させる） リポプロテインリパーゼの性 質による測定結果への効果について確かめた。
1. 本発明の測定試薬の調製
(1) 第 1試薬 （試薬 G) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるよう ：純水に溶解し、 pH6. 0 (20 ） の試薬を調製した。
試薬成分
2—モルホリノエタンスルホン酸 [MES] 5 OmM
N— (2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル) 一 3 5ージメトキシァニリンナ トリウム （色原体） 1. 5mM グリセロールキナーゼ 1 50単位 Z 1 グリセロール一 3—リン酸ォキシダーゼ 3 000単位ノ 1 アデノシン三リン酸ナトリウム 0. 5mM 塩化マグネシウム ·六水和物 1 mM カタラーゼ 100 000単位 Z 1 ェマルゲン 9 1 1 (花王） 0 1 % (w/ v) リポプロティンリパーゼ 〔商品名及び活性値は表 5に記載〕
(2) 第 2試薬 （試薬 H) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 pH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分
2—モルホリノエタンスルホン酸 [MES] 50 mM 4—ァミノアンチピリン 0. 75mM ペルォキシダーゼ 600単位 Z 1 アジ化ナトリウム 0. 1 % (w/v) NP— 10 (日光ケミカルズ） 0. 5 % (w/v) リポプロティンリパーゼ 〔商品名及び活性値は表 5に記載〕
2. 総トリグリセライド測定試薬 （対照）
(1) 第 1試薬 （試薬 C)
前記実施例 1の 2の （1) の第 1試薬 （試薬 C) を用いた。 ( 2 ) 第 2試薬 （試薬 D )
前記実施例 1の 2の （2 ) の第 2試薬 （試薬 D ) を用いた。
3 . 精製リポ蛋白画分
前記実施例 1の 3のカイロミクロン、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白の 5種類のリポ蛋白の画分を、 それぞれ被検 試料として測定に用いた。
4 . リポ蛋白画分中のトリダリセライドの測定
前記 3で調製した各リポ蛋白画分中の卜リグリセライドの測定は、 本発明の第 1試薬 （試薬 A) に代えて前記 1の （1 ) の本発明の第 1試薬 （試薬 G) を用い たこと、 及び本発明の第 2試薬 （試薬 B ) に代えて前記 1の （2 ) の本発明の第 2試薬 （試薬 H) を用いたこと以外は、 前記実施例 1の 4の①〜⑧の記載の通り に行った。
なお、 前記の測定における、 本発明の第 1試薬 （試薬 G) に含有させたリポプ 口ティンリパーゼと、 本発明の第 2試薬 （試薬 H) に含有させたリポプロテイン リパーゼとの組合せは表 5に示した通りである。
また、 前記の方法と同様にし、 前記 2の （1 ) の総トリグリセライド測定試薬 の第 1試薬 （試薬 C )、 及び前記 2の （2 ) の総トリグリセライド測定試薬の第 2 試薬 （試薬 D ) を用いて、 前記 3で調製した各リポ蛋白画分中のトリグリセライ ドの測定を行った。
そして、本発明の測定試薬（試薬 G及び試薬 H)を用いたときの各被検試料（リ ポ蛋白画分） に含まれるトリダリセライドの濃度 （測定値） を、 総トリダリセラ イド測定試薬 （試薬 C及び試薬 D ) を用いたときの各被検試料 （リポ蛋白画分） に含まれるトリダリセライドの濃度 （測定値） で除した値を求めた。
この値を表 5に示した。 表 5
Figure imgf000052_0001
◎その活性が界面活性剤の存在に依存する CM：カイロミクロン
リポプロテインリパ一ゼ VLDL ：超低比重リポ蛋白
LP-BP (旭化成） I DL ： 中間比重リポ蛋白
LPL- 3 14 (東洋紡績） LDL ：低比重リポ蛋白
HDL ：高比重リポ蛋白
◎その活性が界面活性剤の存在に依存し難い
リポプロテインリパーゼ
L PL (旭化成）
LPL- 31 1 (東洋紡績）
5. まとめ
① その活性が界面活性剤の濃度に依存するリポプロティンリパーゼである L P -BP (旭化成） を第 1試薬に含有させ （第 1段階に存在させ）、 そして、 その活 性が界面活性剤の濃度に依存し難いリポプロティンリパーゼである L P L (旭化 成） を第 2試薬に含有させた （第 2段階に存在させた） 場合、 超低比重リポ蛋白 画分及び中間比重リポ蛋白画分に含まれるトリグリセライドを測定できており、 それに対してカイ口ミクロン画分、 低比重リポ蛋白画分及び高比重リポ蛋白画分 に含まれるトリグリセライドはほとんど測定していないか又は僅かにしか測定し ていないことが分かる。 6 そして、 第 1試薬に含有させた （第 1段階に存在させた） L P— B Pの活性値 が高くなるにつれ、 低比重リポ蛋白画分に含まれるトリグリセライドの測り込み が少なくなることも分かる。
② その活性が界面活性剤の濃度に依存するリポプロティンリパ一ゼである L P L - 3 1 4 (東洋紡績） を第 1試薬に含有させ （第 1段階に存在させ）、 そして、 その活性が界面活性剤の濃度に依存し難いリポプ口ティンリパーゼである L P L (旭化成） を第 2試薬に含有させた （第 2段階に存在させた） 場合、 超低比重リ ポ蛋白画分及び中間比重リポ蛋白画分に含まれるトリグリセライドを測定できて おり、 それに対してカイロミクロン画分、 低比重リポ蛋白画分及び高比重リポ蛋 白画分に含まれるトリグリセライドはほとんど測定していないか又は僅かにしか 測定していないことが分かる。
そして、 第 1試薬に含有させた （第 1段階に存在させた） L P L— 3 1 4の活 性値が高くなるにつれ、 低比重リポ蛋白画分に含まれるトリグリセライドの測り 込みが少なくなることも分かる。
③ その活性が界面活性剤の濃度に依存するリポプロティンリパ一ゼである L P 一 B P (旭化成） を第 1試薬に含有させ （第 1段階に存在させ）、 そして、 やはり その活性が界面活性剤の濃度に依存するリポプロティンリパーゼである L P L -
3 1 4 (東洋紡績） を第 2試薬に含有させた （第 2段階に存在させた） 場合、 超 低比重リポ蛋白画分及び中間比重リポ蛋白画分に含まれるトリグリセライドを測 定できており、 そして、 カイロミクロン画分、 低比重リポ蛋白画分及び高比重リ ポ蛋白画分に含まれるトリダリセライドは僅かにしか測定していないことが分か る。
しかし、 この場合、 前記①及び②に比べて、 超低比重リポ蛋白画分及び中間比 重リポ蛋白画分に含まれるトリグリセライドを測定できる度合いが若千低いこと が分かる。
④ その活性が界面活性剤の濃度に依存し難いリポプロテインリパーゼである L P L— 3 1 1 (東洋紡績）を第 1試薬に含有させ（第 1段階に存在させ）、そして、 やはりその活性が界面活性剤の濃度に依存し難いリポプロティンリパーゼである L P L (旭化成） を第 2試薬に含有させた （第 2段階に存在させた） 場合、 超低 比重リポ蛋白画分及び中間比重リポ蛋白画分に含まれるトリグリセライドを測定 できており、 そして、 カイロミクロン画分、 低比重リポ蛋白画分及び高比重リポ 蛋白画分に含まれるトリグリセライドはほとんど測定していないか又は僅かにし か測定していないことが分かる。
しかし、 この場合、 第 1試薬に含有させた （第 1段階に存在させた） LPL— 3 1 1の活性値が高くなるにつれ、 超低比重リポ蛋白画分及び中間比重リポ蛋白 画分に含まれるトリダリセライドを測定できる度合いが低くなることが分かる。 以上のことより、 第 1試薬に含有させる （第 1段階に存在させる） リポプロテ インリパーゼは、 その活性が界面活性剤の濃度に依存するものであることが好ま しく、 そして、 第 2試薬に含有させる （第 2段階に存在させる） リポプロテイン リパーゼは、 その活性が界面活性剤の濃度に依存し難いものであることが好まし いことが確かめられた。
〔実験例〕 （リポプロテインリパーゼの性質の確認）
各種のリポプロテインリパーゼについて、 その活性が界面活性剤の濃度に依存 するものであるか、 又はその活性が界面活性剤の濃度に依存し難いものであるか 、 性質の確認を行った。
1. 測定試薬の調製
(第 1試薬の調製）
(1) 第 1試薬 （試薬 I) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分 濃度 2—モルホリノエタンスルホン酸 [ME S] 5 OmM
N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル) 一 3， 5—ジメトキシァニリンナ トリウム （色原体） 1. 5mM グリセロールキナーゼ 1 50単位 Z 1 グリセロール一 3—リン酸ォキシダーゼ 3， 000単位71 アデノシン三リン酸ナトリウム 0. 5mM 塩化マグネシウム ·六水和物 1 mM カタラーゼ 100， 000単位 1
BT- 1 2 〔ポリオキシエチレンの平均付加モル数が 1 2のポリオキシエチレン 2級アルキルエーテル〕 （日光ケミカルズ） 0. 1 % (w/v)
(2) 第 1試薬 （試薬 J) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分
2一モルホリノエタンスルホン酸 [ME S] 5 OmM
N— （2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 一 3 5—ジメトキシァニリンナ トリウム （色原体） 1. 5mM グリセロールキナーゼ 1 50単位/ 1 グリセロール一 3—リン酸ォキシダーゼ 3， 000単位/ 1 アデノシン三リン酸ナトリゥム 0. 5mM 塩化マグネシウム ·六水和物 1 mM 力夕ラーゼ 100, 000単位 Z 1
R— 1020〔ポリオキシエチレンノニルフエニルホルムアルデヒド縮合物〕 （日 光ケミカルズ） 0. 1 % (w/v)
(第 2試薬の調製）
(3) 第 2試薬 （試薬 K) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分 濃度
2—モルホリノエタンスルホン酸 [ME S] 5 OmM
4—ァミノアンチピリン 0. 75mM ペルォキシダーゼ 600単位/ 1 リポプロテインリパーゼ 〔： LP— BP (旭化成）〕 100， 000単位ノ 1
BT- 1 2 〔ポリォキシェチレンの平均付加モル数が 1 2のポリオキシエチレン 2級アルキルエーテル〕 (日光ケミカルズ) 0. 1 % (w/v)
(4) 第 2試薬 （試薬 ） の調製 下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH6. 0 (20^) の試薬を調製した。
試薬成分 濃度
2—モルホリノエタンスルホン酸 [ME S] 5 OmM 4—ァミノアンチピリン 0. 75mM ペルォキシダーゼ 600単位ノ 1 リポプロテインリパーゼ〔L PL— 314 (東洋紡績）〕 1 00単位71
BT- 12 〔ポリオキシエチレンの平均付加モル数が 1 2のポリオキシエチレン 2級アルキルエーテル〕 (日光ケミカルズ) 0. 1 % (w/v) (5) 第 2試薬 （試薬 M) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分 濃度
2 _モルホリノエ夕ンスルホン酸 [MES] 5 OmM 4—ァミノアンチピリン 0. 75mM ペルォキシダーゼ 600単位 / 1 リポプロテインリパーゼ 〔LPL (旭化成）〕 100， 000単位 1
BT- 12 〔ポリオキシエチレンの平均付加モル数が 1 2のポリオキシエチレン 2級アルキルエーテル〕 (日光ケミカルズ) 0. 1 % (w/v) (6) 第 2試薬 （試薬 N) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 ΡΗ6· 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分 濃度
2—モルホリノエ夕ンスルホン酸 [ME S] 5 OmM 4—ァミノアンチピリン 0. 75 mM ペルォキシダーゼ 600単位/ 1 リポプロテインリパーゼ〔LPL— 31 1 (東洋紡績）〕 100単位/ 1
BT— 12 〔ポリオキシエチレンの平均付加モル数が 1 2のポリオキシエチレン 2級アルキルエーテル〕 (日光ケミカルズ) 0. 1 % (w/v) (7) 第 2試薬 （試薬 O) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH 6. 0 (2 0 ) の試薬を調製した。
試薬成分 濃度 2—モルホリノエ夕ンスルホン酸 [ME S] 5 OmM
4一アミノアンチピリン 0. 7 5mM ペルォキシダーゼ 6 0 0単位 Z 1 リポプロテインリパーゼ 〔L P— B P (旭化成）〕 1 0 0 , 0 0 0単位ノ 1 - 1 0 2 0〔ポリオキシエチレンノニルフエニルホルムアルデヒド縮合物〕 （日 光ケミカルズ） 0. 1 % (w/v)
(8) 第 2試薬 （試薬 P) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH6. 0 (2 0°C) の試薬を調製した。
試薬成分 濃度 2—モルホリノエ夕ンスルホン酸 [ME S] 5 OmM
4—ァミノアンチピリン 0. 7 5mM ペルォキシダーゼ 6 0 0単位ノ 1 リポプロテインリパーゼ〔L P L_ 3 1 4 (東洋紡績）〕 1 0 0単位71
R- 1 0 2 0〔ポリオキシエチレンノニルフエニルホルムアルデヒド縮合物〕 （日 光ケミカルズ） 0. 1 % (w/v)
(9) 第 2試薬 （試薬 Q) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH 6. 0 (2 Q° ) の試薬を調製した。
試薬成分 濃度 2—モルホリノエタンスルホン酸 [ME S] 5 OmM
4—ァミノアンチピリン 0. 7 5mM ペルォキシダーゼ 6 0 0単位/ 1 リポプロテインリパーゼ 〔： L P L (旭化成）〕 1 0 0 , 0 0 0単位ノ 1
R— 1 0 2 0〔ポリオキシエチレンノエルフエニルホルムアルデヒド縮合物〕 （日 光ケミカルズ） 0. 1 % (wZv)
(10) 第 2試薬 （試薬 R) の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、 PH6. 0 (20°C) の試薬を調製した。
試薬成分 濃度
2—モルホリノエタンスルホン酸 [ME S] 5 OmM
4—ァミノアンチピリン 0. 75mM ペルォキシダーゼ 600単位ノ 1 リポプロテインリパーゼ〔LPL— 3 1 1 (東洋紡績）〕 1 00単位71 R— 1020〔ポリオキシエチレンノニルフエニルホルムアルデヒド縮合物〕 （日 光ケミカルズ) 0. 1 % (w/v)
2. 精製リポ蛋白画分の調製
凝固阻止剤を入れた採血管で血液を採取し、 これを密度勾配遠心法にて分離し 、 超低比重リポ蛋白の画分を得た。 この画分を被検試料として測定に供した。 3. リポプロテインリパ一ゼの性質の確認
前記 1で調製した各試薬により前記 2で調製した超低比重リポ蛋白画分中のト リグリセライドの測定を行うことによって、 各リポプロテインリパーゼの性質の 確認を行った。
なお、 この測定は、 表 6に記載した試薬の組合せにおいて、 前記実施例 1の 4 の 「リポ蛋白画分中のトリダリセライドの測定」 に記載の方法と同様にして、 日 立 7 170 S形自動分析装置 （日立製作所） を用いて行った。
各リポプロテインリパーゼの性質を確かめるため、 前記各測定により得られた 測定値 〔被検試料 （超低比重リポ蛋白画分） に含まれるトリダリセライドの濃度 〕 （測定値） を、 表 6に示したように他の測定値で除した値を求めた。
この値を表 6に示した。 表 6
試薬の組合せ I定値を他の測定値で除した値
Figure imgf000059_0002
Figure imgf000059_0001
4. まとめ
( 1 ) 界面活性剤が B T - 12の場合
① LP— BPを第 2試薬に含有させたときの測定値を、 LPLを第 2試薬に含 有させたときの測定値で除した場合
この除した値は 0. 15である。
このことより、 同じ界面活性剤濃度において、 LP— BPに比べて LP Lの方 がより酵素活性が高いことが分かる。
即ち、 L P— B Pはその活性が界面活性剤の濃度に依存するリポプロティンリ パーゼであり、 L P Lはその活性が界面活性剤の濃度に依存し難いリポプロティ ンリパーゼであることが確かめられた。
② LPL— 3 14を第 2試薬に含有させたときの測定値を、 ？ ー 3 1 1を 第 2試薬に含有させたときの測定値で除した場合
この除した値は 0. 44である。
このことより、 同じ界面活性剤濃度において、 L PL— 3 14に比べて L PL - 31 1の方がより酵素活性が高いことが分かる。
即ち、 L P L— 314はその活性が界面活性剤の濃度に依存するリポプロティ ンリパーゼであり、 LPL— 3 1 1はその活性が界面活性剤の濃度に依存し難い リポプロティンリパーゼであることが確かめられた。
( 2 ) 界面活性剤が R— 1020の場合 ① LP— BPを第 2試薬に含有させたときの測定値を、 LPLを第 2試薬に含 有させたときの測定値で除した場合
この除した値は 0. 46である。
このことより、 同じ界面活性剤濃度において、 LP— BPに比べて LP Lの方 がより酵素活性が高いことが分かる。
即ち、 L P— B Pはその活性が界面活性剤の濃度に依存するリポプロティンリ パーゼであり、 L P Lはその活性が界面活性剤の濃度に依存し難いリポプロティ ンリパーゼであることが確かめられた。
② L PL— 314を第 2試薬に含有させたときの測定値を、 卩し一 3 1 1を 第 2試薬に含有させたときの測定値で除した場合
この除した値は 0. 29である。
このことより、 同じ界面活性剤濃度において、 LPL— 3 14に比べて LPL - 3 1 1の方がより酵素活性が高いことが分かる。
即ち、 L P L— 314はその活性が界面活性剤の濃度に依存するリポプロティ ンリパーゼであり、 LPL— 3 1 1はその活性が界面活性剤の濃度に依存し難い リポプロテインリパーゼであることが確かめられた。 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として 本明細書中にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明の、 被検試料中の超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比 重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に測定する方法及び試薬は、 超 遠心分離機による分離操作等の繁雑な操作を必要とせず、 汎用されている自動分 析装置への適用が可能であって、 より簡便かつ正確に測定を行うことができるも のである。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の第 1段階： .
① 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に リポプロテインリパーゼと反応させることができるポリォキシアルキレンのエー テル化合物又はエステル化合物である第一選択的反応促進物質の存在下、 被検試 料にリポプロテインリパーゼ、 及びグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵 素を生成させる一連の反応を触媒する酵素を接触させ反応させて、 低比重リポ蛋 白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補 酵素を生成させる ；
② 前記①の反応により生成した過酸化水素又は還元型補酵素を、 過酸化水素又 は還元型補酵素を他の物質に変える反応を触媒する酵素と反応させる ；
③ 前記①及び②の反応により、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれる トリグリセライドを消去する ；
並びに、 以下の第 2段階：
① 前記第 1段階の後、 超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白 及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的にリポプロテインリパ ーゼと反応させることができる第二選択的反応促進物質の存在下、 リポプロティ ンリパ一ゼ、 及びグリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一 連の反応を触媒する酵素を反応させて、超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドより過酸化水素又は還元型補 酵素を生成させる ；
② 前記①の反応により生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測る ；
により、 被検試料中の超低比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リ ポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的に測定する方法。
2 . 第二選択的反応促進物質がポリオキシアルキレンのエーテル化合物又はエス テル化合物である請求の範囲第 1項記載の方法。
3 . 第一選択的反応促進物質として用いるポリオキシアルキレンのエーテル化合 物又はエステル化合物のポリオキシアルキレンの平均付加モル数 と、 第二選択 的反応促進物質として用いるポリオキシアルキレンのエーテル化合物又はエステ ル化合物のポリォキシアルキレンの平均付加モル数 nとの比 m/ nが 1 . 1〜 1 .
2の範囲にある請求の範囲第 2項記載の方法。
4 . mが 7 . 7〜1 8の範囲にあり、 nが 7〜 1 5の範囲にある請求の範囲第 3 項記載の方法。
5 . mが 1 1〜1 2の範囲にあり、 nが 1 0である請求の範囲第 3項記載の方法。
6 . 第一選択的反応促進物質として用いるポリオキシアルキレンのエーテル化合 物又はエステル化合物が、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキルエーテル、 ポリ ォキシアルキレンの分岐鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレンの直鎖アル キルフエニルエーテル、 ポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルフエ二ルェ一テ ル、 ポリオキシアルキレンの直鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレンの分岐 鎖脂肪酸エステル、ポリォキシアルキレンの直鎖アルキル置換安息香酸エステル、 及びポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキル置換安息香酸エステルからなる群よ り選ばれる少なくとも 1種である請求の範囲第 1項記載の方法。
7 .第二選択的反応促進物質が、ポリォキシアルキレンの直鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレンの直鎖 アルキルフエ二ルェ一テル、 ポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルフエニルェ 一テル、 ポリオキシアルキレンの直鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレンの 分岐鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキル置換安息香酸エス テル、 及びポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキル置換安息香酸エステルからな る群より選ばれる少なくとも 1種のポリオキシアルキレンのエーテル化合物又は エステル化合物である請求の範囲第 1項記載の方法。
8 . ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンである請求の範囲第 1項記載の 方法。
9 . 第一選択的反応促進物質が、 ポリオキシエチレンの平均付加モル数 mが 1 1 〜1 2の範囲にあるポリオキシエチレンノニルフエニルエーテルであり、 第二選 択的反応促進物質が、 ポリオキシエチレンの平均付加モル数 nが 1 0のポリオキ シエチレンノニルフエニルエーテルである請求の範囲第 1項記載の方法。
1 0 . 第 1段階及び Z又は第 2段階において、 反応補助物質を存在させる請求の 範囲第 1項記載の方法。
1 1 . 反応補助物質が、 多糖類若しくはその誘導体、 ポリア二オン、 ハロゲンィ オン、 金属イオン又はレクチンである請求の範囲第 1 0項記載の方法。
1 2 . 第 1段階に存在させるリポプロテインリパーゼが、 その活性が界面活性剤 の濃度に依存するものであり、第 2段階に存在させるリポプロテインリパーゼが、 その活性が界面活性剤の濃度に依存し難いものである請求の範囲第 1項記載の方 法。
1 3 . 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含まれるトリグリセライドを選択的 にリポプロテインリパーゼと反応させることができるポリォキシアルキレンのェ 一テル化合物又はエステル化合物である第一選択的反応促進物質、 リポプロティ ンリパーゼ、 グリセロールより過酸化水素又は還元型補酵素を生成させる一連の 反応を触媒する酵素、 及び過酸化水素又は還元型補酵素を他の物質に変える反応 を触媒する酵素を含有する第 1試薬と、
超低比重リポ蛋白、 中間比重リポ蛋白、 低比重リポ蛋白及び高比重リポ蛋白に含 まれるトリグリセライドを選択的にリポプロテインリパーゼと反応させることが できる第二選択的反応促進物質を含有する第 2試薬とを含む、 被検試料中の超低 比重リポ蛋白及び中間比重リポ蛋白、 又は超低比重リポ蛋白に含まれるトリダリ セライドの選択的測定試薬。
1 4 . 第 1試薬及び 又は第 2試薬が、 更に過酸化水素又は還元型補酵素からシ グナルを導き出す反応にかかわる物質を含有する請求の範囲第 1 3項記載の試薬。
1 5 . 第二選択的反応促進物質がポリオキシアルキレンのエーテル化合物又はェ ステル化合物である請求の範囲第 1 3項記載の試薬。
1 6 . 第一選択的反応促進物質として用いるポリオキシアルキレンのエーテル化 合物又はエステル化合物のポリオキシアルキレンの平均付加モル数 mと、 第二選 択的反応促進物質として用いるポリォキシアルキレンのェ一テル化合物又はエス テル化合物のポリォキシアルキレンの平均付加モル数 nとの比 m/ nが 1 . 1〜 1 . 2の範囲にある請求の範囲第 1 5項記載の試薬。
1 7 . mが 7 . 7〜 1 8の範囲にあり、 nが？〜 1 5の範囲にある請求の範囲第 1 6項記載の試薬。
1 8 . mが 1 1〜 1 2の範囲にあり、 nが 1 0である請求の範囲第 1 6項記載の 。
1 9 . 第一選択的反応促進物質として用いるポリオキシアルキレンのエーテル化 合物又はエステル化合物が、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキルエーテル、 ポ リオキシアルキレンの分岐鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレンの直鎖ァ ルキルフエニルエーテル、 ポリォキシアルキレンの分岐鎖アルキルフエニルエー テル、 ポリオキシアルキレンの直鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレンの分 岐鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキル置換安息香酸エステ ル、 及びポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキル置換安息香酸エステルからなる 群より選ばれる少なくとも 1種である請求の範囲第 1 3項記載の試薬。
2 0 . 第二選択的反応促進物質が、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキルエーテ ル、 ポリォキシアルキレンの分岐鎖アルキルエーテル、 ポリオキシアルキレンの 直鎖アルキルフエニルエーテル、 ポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキルフエ二 ルエーテル、 ボリォキシアルキレンの直鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレ ンの分岐鎖脂肪酸エステル、 ポリオキシアルキレンの直鎖アルキル置換安息香酸 エステル、 及びポリオキシアルキレンの分岐鎖アルキル置換安息香酸エステルか らなる群より選ばれる少なくとも 1種のポリオキシアルキレンのエーテル化合物 又はエステル化合物である請求の範囲第 1 3項記載の試薬。
2 1 . ポリオキシアルキレンがポリオキシエチレンである請求の範囲第 1 3項記 載の試薬。
2 2 . 第一選択的反応促進物質が、 ポリオキシエチレンの平均付加モル数 mが 1 1〜1 2の範囲のポリオキシエチレンノニルフエニルエーテルであり、 第二選択 的反応促進物質が、 ポリオキシエチレンの平均付加モル数 nが 1 0のポリオキシ エチレンノニルフエ二ルェ一テルである請求の範囲第 1 3項記載の試薬。
2 3 . 第 1試薬及び 7又は第 2試薬が、 更に反応補助物質を含有する請求の範囲 第 1 3項記載の試薬。
2 4 . 反応補助物質が、 多糖類若しくはその誘導体、 ポリア二オン、 ハロゲンィ オン、 金属イオン又はレクチンである請求の範囲第 2 3項記載の試薬。
2 5 . 第 1試薬に含有されるリポプロテインリパーゼが、 その活性が界面活性剤 の濃度に依存するものであり、第 2試薬に含有されるリポプロティンリパーゼが、 その活性が界面活性剤の濃度に依存し難いものである請求の範囲第 1 S項記載の
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