JPWO2004048605A1 - 特定リポ蛋白中の脂質測定法 - Google Patents
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Abstract
Description
疫学的には、LDL中のアポ蛋白やコレステロール値は、動脈硬化性疾患の発症頻度と正相関を示し、一方、HDL中のアポ蛋白やコレステロール値は動脈硬化性疾患の発症頻度と逆相関を示す事が知られており、今日では、虚血性心疾患の予防や診断を目的としてLDL中やHDL中のアポ蛋白やコレステロールの測定が行われている。
LDLやHDL中の脂質の測定法としては、例えば超遠心分離によってLDLやHDLを、他のリポ蛋白と分離した後、それぞれの脂質測定に供する方法や、電気泳動によって分離した後に脂質染色を行って、その発色強度を測定する方法が知られている。しかしながら、これらの方法は、いずれも、操作が煩雑で多数の検体を処理できないなどの問題があり、日常的にはほとんど用いられていなかった。
リポ蛋白中の脂質測定で最も一般的なものは、HDL中のコレステロールの測定である。HDLコレステロール測定方法として、臨床検査の領域で用いられている方法には、検体に沈殿剤を加えてHDL以外のリポタンパクを凝集させ、これを遠心分離によって取り除き、分離されたHDLのみを含む上清中のコレステロールを測定する沈殿法がある。この方法は比較的多量の検体量を要し、全分析工程を完全に自動化する事はできなかった。近年、酵素的にHDLコレステロールを分別定量する方法も検討されている。例えば、胆汁酸塩及び非イオン系界面活性剤の存在下に、酵素反応を行う方法(特開昭63−126498号公報)、HDL以外のリポ蛋白をあらかじめ凝集させておき、HDL中のコレステロールのみを酵素的に反応させた後に、酵素を失活させると同時に凝集を再溶解して吸光度を測定する方法(特開平6−242110号公報)、HDL以外のリポタンパクを沈殿させる沈殿試薬とコレステロール測定試薬を組み合わせて使用し、沈殿しないHDL中のコレステロールを測定する方法(特許第2600065号公報)、抗体を使用するもの(特開平9−96637号公報)、糖化合物を使用するもの(特開平7−301636号公報)、第一反応中に、特殊な界面活性剤の存在下でコレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼをHDL以外のリポ蛋白に作用させ、これらに含まれるコレステロールを、優先的に作用させたのち、HDL以外のコレステロールに対する反応を抑制しながらHDL中のコレステロールを測定する方法(特開平9−299号公報)、特定の群から選ばれる界面活性剤とコレステロール測定用酵素試薬を使用して、HDL中のコレステロールがコレステロール測定用酵素試薬と優先的に反応する時間内に測定する方法(特開平11−56395号公報)、コレステロールオキシダーゼ及びコレステロールエステラーゼをHDL中のコレステロールに特異的に作用する界面活性剤と組み合わせる方法(特開2001−103998号公報)がある。
HDLコレステロールに次いで測定されるLDLコレステロール測定においては、臨床的な意義は大規模疫学研究を通じ広く知られていたものの、HDLコレステロール測定における沈殿法のような方法が開発されなかったことから、超遠心分離法の結果を基に考案された「推定値」を求める換算式法(Freidewald法。以下F式法と略)が利用されていた。F式法のLDLコレステロールは総コレステロールからHDLコレステロールとVLDLコレステロールを差し引いて算出され、VLDLコレステロールとして中性脂肪濃度の1/5の値が使用されている。VLDLコレステロールを中性脂肪から推定するため、中性脂肪濃度が400mg/dlを越える人や、III型高脂血症患者には使用できず、また食事により一過性に中性脂肪が増加している時には負の影響が出るなどの問題があった。これに対し、LDLコレステロールの酵素法も開発され、LDLコレステロールを含む試料からHDLコレステロールを消去したのち、残存するLDLコレステロールを測定する方法(特再平8−828734号公報)、糖化合物及び又は蛋白可溶化剤の存在下、試料中のLDLコレステロールを測定する方法(特再平8−829599号公報)がある。特定構造を有する界面活性剤を使用する方法(特開平9−313200号公報)やアミンを含む緩衝液中でLDL以外に作用する界面活性剤を使用する方法(特開平10−38888号公報)もある。
中性脂肪は、血漿中の多くがVLDL中に存在する事から先述のF式法によるLDLコレステロール推定においてVLDLコレステロール値推定に用いられている(VLDLコレステロール=TG/5)。一般に中性脂肪測定は、第一反応で遊離グリセロールを消費した後、第二反応でリポ蛋白リパーゼにより生成する遊離グリセロールをリン酸化し、更にグリセロリン酸酸化酵素を作用させ生成する過酸化水素をパーオキシダーゼ、4−アミノアンチピリン、トリンダー色素と反応させて発色させる方法が用いられる。遊離グリセロールの消費にはいわゆる無色発色法が用いられ、パーオキシダーゼとその基質の一方やカタラーゼ、及びその組み合わせが汎用される。特定リポ蛋白中の中性脂肪測定は、従来超遠心分離法や凝集剤を用いた分画法、ゲル濾過による分画法などが知れられている、また特定リポ蛋白以外のリポ蛋白の反応を阻害する界面活性剤やHLB15以上の界面活性剤を用いる方法(国際公開第00/43537号)がある。
したがって、本発明の目的は、簡便な操作で効率良く種々の自動分析装置に適用できる特定画分中の脂質測定法を提供することにある。
そこで、本発明者は、鋭意研究を行った結果、少なくとも目的脂質測定の特異性を決定する工程において特定の界面活性剤を用いることによって試料中の測定対象リポ蛋白中の脂質が特異的に測定できること、更にこれらの界面活性剤が共通の構造的特徴を有していることを見出して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、特定リポ蛋白中の脂質測定法において、少なくとも目的脂質測定の特異性を決定する工程で多環型ポリオキシアルキレン誘導体を用いることを特徴とする特定リポ蛋白中の脂質測定法を提供するものである。
また本発明は、特定リポ蛋白に作用する多環型ポリオキシアルキレン誘導体及び目的脂質測定試薬を含有することを特徴とする特定リポ蛋白中の脂質測定試薬を提供するものである。
本発明によれば、数多くの界面活性剤の中から効率よく有用な界面活性剤を選択でき、これを用いて遠心分離などの前処理の必要がなく、簡便な操作で効率良く特定画分中の脂質を定量する事ができる。また、少ない試料で、簡便な操作により、特異的な測定が可能であるため、種々の分析方法に適用でき、臨床検査の領域においても極めて有用である。
図2は、本発明方法と従来法(コレステストLDL使用)との相関関係を示す図である。
図3は、本発明方法と従来法(コレステストN HDL使用)との相関関係を示す図である。
図4は、本発明方法と従来法(コレステストLDL使用)との相関関係を示す図である。
図5は、本発明方法によるLDL中性脂肪の測定結果を示す図である。
図6は、本発明によるHDL中性脂肪の測定結果を示す図である。
図7は、本発明の界面活性剤のHLBと相関係数の関係を示す図である。
図8は、本発明の界面活性剤のアリール基数と相関係数の関係を示す図である。
また多環性基の好ましい例としては、フェニル基上にフェニル基、ナフチル基、アルキルフェニル基、フェニルアルキル基及びスチリル基から選ばれるアリール基が1〜5個、より好ましくは1〜3個が置換した基が挙げられる。
当該界面活性剤のポリオキシアルキレン基としては、ポリオキシエチレン基、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン基、ポリオキシプロピレン基などが挙げられ、ポリオキシエチレン基が特に好ましい。ポリオキシアルキレン付加モル数は、測定対象である目的脂質、ポリオキシアルキレン基の種類によっても異なるが2〜100、更に5〜50、特に10〜50が好ましい。
多環型ポリオキシアルキレン誘導体のうち、非イオン性界面活性剤としてはポリオキシアルキレンエーテル系非イオン性界面活性剤が好ましい。また非イオン性界面活性剤の場合、そのHLBは12〜18が好ましい。また陰イオン性界面活性剤としてはスルホン酸エステル系、リン酸エステル系又はスルホサクシネート系の陰イオン性界面活性剤が好ましい。
また、目的脂質がコレステロールの場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体として、特定のリポ蛋白に作用するHLB12〜18の非イオン性界面活性剤であって、目的脂質に対する特異性が該界面活性剤のHLB値に依存せず、専らアリール基の数に支配される界面活性剤を使用するのが好ましい。
また、目的脂質がコレステロールの場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体として、特定のリポ蛋白に作用するHLB12〜18の非イオン性界面活性剤であって、アリール基を2個以上有する界面活性剤(但し、LDL中のコレステロールを測定した際に緩衝液により測定の特異性が影響されるHLB13〜15のものを除く)を使用するのが好ましい。
更に、目的脂質がHDL中のコレステロールである場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体として、HDLに優先的に作用するHLB14.1〜18、特にHLB14.3〜18の非イオン性界面活性剤を使用するのが好ましい。また、目的脂質がLDL中のコレステロールである場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体として、LDL以外に優先的に作用するHLB15.1〜18、特にHLB15.3〜18の非イオン性界面活性剤を使用するのが好ましい。また、目的脂質が特定のリポ蛋白中の中性脂肪である場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体として、LDL以外に優先的に作用するHLBが12〜18であって2個以上のアリール基を有する非イオン性界面活性剤を使用するのが好ましい。目的脂質がLDL中の中性脂肪である場合、多環型ポリオキシアルキレン誘導体がLDL以外に優先的に作用するHLBが12〜15であって2個以上のアリール基を有する非イオン性界面活性剤を使用するのが好ましい。ここで、優先的に作用するとは、特定のリポ蛋白に対して他のリポ蛋白に優先して作用することをいう。
特に好ましいポリオキシアルキレン誘導体としては、複数のフェニル基を有するポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンポリスチリルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンフェニルフェノールエーテル、ポリオキシアルキレンポリスチリルフェニルエーテル縮合物、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル縮合物、ポリオキシアルキレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンスチリル化フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンアリルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレン多環フェニルスルホサクシネートなどが挙げられる。
これらポリオキシアルキレン誘導体の市販品としては、ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルとしてペグノール005(HLB14.6、東邦化学工業社製);ニューコール610(HLB13.8)、ニューコール710(HLB13.6)、ニューコール710F(HLB13.5)、ニューコール714(HLB15.0)、ニューコール714F(HLB14.4)、ニューコール740(HLB17.9)、ニューコール2600FB(HLB13.4)、ニューコール2608F(HLB13.0)、ニューコール2609(HLB13.0)(以上、日本乳化剤社製);ポリオキシアルキレンポリスチリルフェニルエーテルとしてパイオニンD−6112W(HLB13.0)、パイオニンD−6115X(HLB14.5)、パイオニンD−6115Z(HLB15.5)(以上、竹本油脂社製);ポリオキシアルキレンフェニルフェノールエーテルとしてソルポールT−15(HLB12.0)、ソルポールT−20(HLB13.3)、ソルポールT−26(HLB14.4)(以上、東邦化学工業社製);ポリオキシアルキレンポリスチリルフェニルエーテル縮合物としてパイオニンD−6320(HLB13.0)(竹本油脂社製);ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル縮合物としてパイオニンD−640(HLB14.3)(竹本油脂社製)、R−1020(HLB18.0)(日光ケミカルズ);ポリオキシアルキレンジスチレン化フェニルエーテルとしてエマルゲンA−90(HLB14.5)(花王社製);ポリオキシアルキレンスチリル化フェニルエーテルとしてサンモール2SP−180(HLB14.5)(日華化学社製);TSP−16(HLB12.7)(青木油脂社製);ポリオキシアルキレンアリルフェニルエーテルとしてはニューカルゲンFS−12(HLB13)(竹本油脂社製);ポリオキシアルキレン多環フェニルスルホサクシネートとしてエアロールT−1500(東邦化学工業社製)などがある。
これらの多環型ポリオキシアルキレン誘導体は単独でも、混合しても、他の界面活性剤と組み合わせても用いることができる。また、本発明の多環型ポリオキシアルキレン誘導体は複数の多環型ポリオキシアルキレン誘導体の混合体であってもよい。例えばベンジル基を有するフェニルエーテルでは、モノベンジル、ジベンジル、トリベンジルの形態のものが単独でもあるいは混合していてもよい。またスチリル基を有するフェニルエーテルでは、モノスチリル、ジスチリル、トリスチリルの形態のものが単独でもあるいは混合していてもよい。各形態の混合比も特に制限はないが、モノ体が1〜20%、ジ体が10〜40%、トリ体が40〜90%が好適であり、更にモノ体が2〜15%、ジ体が10〜40%、トリ体が50〜90%が好適で、これらの混合物の市販品の例としてはペグノール005(およその混合比の中心はモノ体が7%、ジ体が20%、トリ体が73%)がある。これらの各成分の使用量は化合物によってことなり、特に制限されるものではないが0.0001質量%〜10質量%(以下、単に%で示す)で、好ましくは0.001%〜5%で使用される。また本発明の多環型ポリオキシアルキレン誘導体は少なくとも目的脂質測定の特異性を決定する工程にあればよい。
本発明は特定リポ蛋白中の目的脂質を測定する方法及びその試薬であり、特定リポ蛋白にはHDL、LDL、IDL、VLDL、カイロミクロン及びこれらの分解物が含まれる。また目的脂質にはコレステロール、中性脂肪、リン脂質が含まれる。従って測定対象としてはHDL中のコレステロール、LDL中のコレステロール、VLDL中のコレステロール、IDL中のコレステロール、カイロミクロン中のコレステロール、これらの分解物中のコレステロール、HDL中の中性脂肪、LDL中の中性脂肪、VLDL中の中性脂肪、IDL中の中性脂肪、カイロミクロン中の中性脂肪、これらの分解物中の中性脂肪、HDL中のリン脂質、LDL中のリン脂質、VLDL中のリン脂質、IDL中のリン脂質、カイロミクロン中のリン脂質、これらの分解物中のリン脂質が挙げられる。これらの多くは動脈硬化性疾患との関連が深く分離定量する必要性が高い。
本発明の方法は目的脂質を測定する工程及び目的脂質測定の特異性を決定する工程を有するが、目的脂質測定の特異性を決定する工程は目的脂質を測定する工程と別個に行なわれても、同時に行なわれても良い。またこれらの工程は試薬等を段階に分けて用いることを示すものではなく、系中でこれらが進行すれば良い。目的脂質測定の特異性を決定する工程としては、特定リポ蛋白以外のリポ蛋白を前処理する工程、予め前処理された反応液中から目的リポ蛋白中の目的脂質を測定用酵素に反応させる工程等が挙げられる。また、目的脂質を測定する工程には、目的脂質測定用試薬が用いられ、当該試薬にはリポ蛋白から目的脂質を遊離させる酵素、例えばエステル分解酵素が含まれる。
検体としては、ヒトを含む動物、特に哺乳類の体液、体成分を用いることができるが、全血、血清、血漿、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、特に血清、血漿が好ましい。検体はそのままでも希釈してもよく、また分離のための装置で分離されたものでも、乾燥したものでも良い。
特定リポ蛋白以外のリポ蛋白とは、例えば目的脂質がHDL中の脂質の場合には、HDL以外のリポ蛋白、すなわち、LDL、VLDL、IDL、カイロミクロン及びこれらの分解物であり、目的リポ蛋白がLDLの場合はHDL,VLDL、IDL、カイロミクロン及びこれらの分解物である。本発明の界面活性剤は、特定リポ蛋白に高い親和性を有する場合と反対に特定リポ蛋白に対して他のリポ蛋白より低い親和性を有する場合があり、目的脂質により使い分けることができる。
本発明において、目的脂質測定用試薬に用いられるエステル分解酵素は、リポ蛋白を構成する脂質測定に用いられる酵素で、例えばコレステロールエステラーゼ、リポ蛋白リパーゼ、リン脂質リパーゼなどエステル結合分解酵素ならばいずれでも差し支えない。これらは、微生物由来、動物由来、植物由来など、いずれでも、また遺伝子操作により作られたものでも良い。また化学修飾の有無も問わない。これらは溶液状でも乾燥状態でも、不溶性担体に保持或いは結合されていても良い。
これらの酵素は必要に応じて、目的脂質測定のために他の酵素、補酵素、発色剤を組み合わせて使用することができる。他の酵素としてはコレステロール脱水素酵素、コレステロール酸化酵素、グリセロールリン酸化酵素、グリセロールリン酸酸化酵素、グリセロールリン酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、ピルビン酸リン酸化酵素、乳酸脱水素酵素、コリン酸化酵素、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、カタラーゼ、ジアホラーゼなどが用いられる。これらは、微生物由来、動物由来、植物由来など、いずれでも、また遺伝子操作により作られたものでも良い。また化学修飾の有無も問わない。これらは溶液状でも乾燥状態でも、不溶性担体に保持或いは結合されていても良い。補酵素としてはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型(NADH)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型リン酸(NADPH)、チオNAD、チオNADPなどが、発色剤としてはPODやジアホラーゼの作用で色素を形成するものならいずれでもよく、4−アミノアンチピリン、トリンダー色素類、ホルマザン色素類などが使用できる。これらの酵素は、単独で、或いは2種以上を組み合わせて用いる事ができ、またその使用量は酵素によって異なり、特に制限されるものではないが0.001単位〜1000単位/mLで、好ましくは0.1単位〜1000単位/mLで使用される。本発明における2つの工程は、それぞれ個別に実施されても、同一試薬内で実施されてもよい。
本発明における酵素を含む試薬には、測定の特異性を損なわず酵素の作用を調整する目的で他の酵素や塩、pH調整のための緩衝剤、界面活性剤類、防腐剤、アルブミンなどの蛋白質類、抗生物質、サポニン、レクチン、ポリアニオン類(リンタングステン酸の塩、デキストラン硫酸、ポリビニル硫酸、硫酸化シクロデキストリンなど)、2価金属の塩、ポリエチレングリコール類、リン脂質など特定のリポ蛋白に親和性を有する試薬、防腐剤やカタラーゼ阻害剤としてアジ化物の塩も配合できる。このうち、ポリアニオン類又は2価金属の塩は、目的脂質測定試薬の反応を制御する成分であり、特定リポ蛋白に作用する界面活性剤である多環型ポリオキシアルキレン誘導体と併用してもよい。
緩衝剤としては、グッドの緩衝剤、リン酸、トリス、フタル酸、クエン酸塩をはじめ、一般にpH5〜9の範囲で使用できる緩衝液及びこの範囲で緩衝作用を有するものなら何れも使用できる。その使用量は、特に制限されるものではないが0.005M〜2M、特に0.01〜1Mが好ましい。本発明で用いる多環型ポリオキシアルキレン誘導体は、例えばその反応性が緩衝液に依存するものではない。反応温度は、前記2つの工程が同一でも異なっても良く、本発明の試薬が溶液状態である温度、例えば10〜40℃が好ましい。
多環型ポリオキシアルキレン誘導体と併せて使用する界面活性剤は、例えば多環型ポリオキシアルキレン誘導体により、既に目的以外のリポ蛋白中脂質が前処理された後に、目的脂質を測定するために使用されるもの、測定の特異性を損なわず酵素の作用を調整して目的脂質測定試薬の反応を制御するものなどである。これらは特異性を決定する工程で用いられる前記多環型ポリオキシアルキレン誘導体のような特異性は必要ない。これらの界面活性剤としては、アリール基を持たない界面活性剤、アリール基を1個しか持たない界面活性剤を使用できる。これらは非イオン性でもイオン性でもよく、非イオン性としてはアリール基を持たないポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、フェニル基1個を持つポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類が使用できる。ポリオキシエチレンアルキルエーテル類としてはエマルゲン709(花王社製)など、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としてはトリトンX100(シグマ社製)など、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物類としてはプルロニックF−108(旭電化社製)などが用いられる。イオン性としては胆汁酸類が使用できる。これらの界面活性剤は0.0001〜5%、特に0.001〜5%となるように使用するのが好ましい。
これらの脂質測定用酵素試薬を添加した後、最終的に目的脂質を検出する方法は特に制限されず、例えばパーオキシダーゼやジアホラーゼと色原体を更に組み合わせて行う吸光度分析、補酵素や過酸化水素を直接検出する方法、金属等の酸化還元を測定する方法なども利用することができる。また本発明の試薬は、溶液状態だけでなく、乾燥状態、ゲル状態でも提供できる。各製剤は、ガラスビン、プラスチック容器ほか、様々な不溶性担体、例えばラテックス、ガラス、コロイドなど粒子・球状担体、半導体やガラスなど平板状、紙やニトロセルロースなど膜状担体、繊維状担体への塗布、含浸など様々な形態で提供できる。
本発明におけるHDL或いはLDLコレステロール測定においては、多環型ポリオキシアルキレン誘導体の存在下、例えばコレステロールオキシダーゼとコレステロールエステラーゼを反応させる。また、多環型ポリオキシアルキレン誘導体の存在下でHDL或いはLDL以外のリポ蛋白中コレステロールを前処理し、次工程で残っているHDL或いはLDLにコレステロールオキシダーゼとコレステロールエステラーゼを反応させても良い。
またHDL或いはLDL中性脂肪測定においては第一工程で遊離グリセロールを前処理し、次工程でリポ蛋白リパーゼを作用させ、一般の中性脂肪測定試薬反応させて測定する。このとき、多環型ポリオキシアルキレン誘導体は、第一工程に用いても第二工程に用いてもよい。好ましい態様としては、遊離のグリセロールが反応に関与しないように前処理する工程と特定のリポ蛋白にリポ蛋白リパーゼを作用させる工程からなる特定リポ蛋白中の中性脂肪測定系において、多環型ポリオキシアルキレン誘導体の存在下でリポ蛋白リパーゼと特定リポ蛋白の中性脂肪を反応させる特定リポ蛋白中の中性脂肪測定方法;及び遊離のグリセロールが反応に関与しないように前処理する工程と特定のリポ蛋白にリポ蛋白リパーゼを作用させる工程からなる特定リポ蛋白中の中性脂肪測定系において、HLB12〜15の多環型ポリオキシアルキレン誘導体の存在下で遊離のグリセロールと特定リポ蛋白以外の中性脂肪を前処理する特定リポ蛋白中の中性脂肪測定方法が挙げられる。なお、遊離グリセロールを前処理する工程は、検体中の遊離グリセロールを別途測定する場合や検体中のグリセロールが特定リポ蛋白中の中性脂肪に比べて無視できる場合、遊離グリセロールを前処理する工程或はその試薬類を省略しても差し支えない。
これらの基本的な工程は、血清中HDLコレステロール、LDLコレステロール、中性脂肪などの測定法として既に一般化しているものである。
なお、実施例においては多環型ポリオキシアルキレン誘導体を本発明の界面活性剤ということがある。
実施例1(HDLコレステロールの測定)
本発明方法により、HDLコレステロールを日立7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のHDLコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清15例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清2.4μLに、0.01% 4−アミノアンチピリン、100mM PIPES緩衝液(pH6.5)を含む試薬240μLを加え、37℃で5分加温後、本発明の界面活性剤 1%、1単位/mL コレステロールオキシダーゼ(オリエンタル酵母)、1単位/mL コレステロールエステラーゼ(旭化成)、1単位/mL パーオキシダーゼ、0.04% N,N−ジスルホブチルメタトルイジン、100mM PIPES緩衝液(pH6.5)を含む試薬80μLを加え、37℃で副波長700nm/主波長600nmにおける吸光度変化量を測定した。市販のHDLコレステロール測定試薬としては、コレステストN HDL(第一化学薬品社製)を使用して添付の使用法に従って測定し、本発明の方法との相関係数を求めた。この結果を表1に示す。表1に示したように本発明の方法と従来法である自動分析法の間には良好な相関性が認められた。対照として本発明の界面活性剤に代えフェニル基を1個有する界面活性剤(トリトンX100)を用いて同様に測定した。
実施例2(HDLコレステロールの測定)
本発明方法により、HDLコレステロールを日立7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のHDLコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清15例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清2.4μLに、0.01% 4−アミノアンチピリン、45μM ジギトニン(東京化成)、100mM PIPES緩衝液(pH6.5)を含む試薬240μLを加え、37℃で5分加温後、本発明の界面活性剤1%、1単位/mL コレステロールオキシダーゼ(オリエンタル酵母)、1単位/mL コレステロールエステラーゼ(旭化成)、1単位/mL パーオキシダーゼ、0.04重量% N,N−ジスルホブチルメタトルイジン、100mM PIPES緩衝液(pH6.5)を含む試薬80μLを加え37℃で副波長700nm/主波長600nmにおける吸光度変化量を測定した。市販のHDLコレステロール測定試薬としては、コレステストN HDL(第一化学薬品社製)を使用して添付の使用法に従って測定し、本発明の方法との相関係数を求めた。この結果を表1に示す。表2に示したように本発明の方法と従来法である自動分析法の間には良好な相関性が認められた。対照として本発明の界面活性剤に変えフェニル基を1個有する界面活性剤(トリトンX100)を用いて同様に測定した。
実施例3(HDLコレステロールの測定)
本発明方法により、HDLコレステロールを日立7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のHDLコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清15例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清2.4μLに、0.01% 4−アミノアンチピリン、0.04% リンタングステン酸Na(キシダ)、0.2% 塩化マグネシウム、100mM PIPES緩衝液(pH6.5)を含む試薬240μLを加え、37℃で5分加温後、本発明の界面活性剤1%、1単位/mL コレステロールオキシダーゼ(オリエンタル酵母)、1単位/mL コレステロールエステラーゼ(旭化成)、1単位/mL パーオキシダーゼ、0.04重量% N,N−ジスルホブチルメタトルイジン、100mM PIPES緩衝液(pH6.5)を含む試薬80μLを加え、37℃で副波長700nm/主波長600nmにおける吸光度変化量を測定した。市販のHDLコレステロール測定試薬としては、コレステストN HDL(第一化学薬品社製)を使用して、添付の使用法に従って測定し本発明の方法との相関係数を求めた。この結果を表3に示す。表3に示したように本発明の方法と従来法である自動分析法の間には良好な相関性が認められた。対照として本発明の界面活性剤に代えフェニル基を1個有する界面活性剤(トリトンX100)を用いて同様に測定した。
実施例4(LDLコレステロールの測定)
本発明方法により、LDLコレステロールを日立7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のLDLコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清15例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清2.4μLに、1単位/mL コレステロールオキシダーゼ(東洋紡)、1単位/mL コレステロールエステラーゼ(旭化成)、1単位/mL パーオキシダーゼ、0.02% N,N−ジスルホブチルメタトルイジン、100mM PIPES緩衝液(pH6.5)、本発明の界面活性剤1%からなる第一試薬240μLを加え、37℃で10分加温後に、0.02% 4−アミノアンチピリン、100mM PIPES緩衝液(pH6.5)、1% エマルゲン709を含む試薬80μLを加え37℃で副波長660nm/主波長546nmにおける吸光度変化量を測定した。市販のLDLコレステロール測定試薬としては、コレステストLDL(第一化学薬品社製)を使用して添付の使用法に従って測定した。この結果を表4に示す。表4に示したように本発明の方法と従来法である自動分析法との間には良好な相関性が認められた。対照として本発明の界面活性剤に代えフェニル基を1個有する界面活性剤(トリトンX100)を用いて同様に測定した。
実施例5(HDLコレステロールとLDLコレステロールの測定)
本発明方法により、HDLコレステロールを日立7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のHDLコレステロール測定試薬の測定値と比較した。試料として血清50例を用いた。本発明の試薬は、血清2.4μLに、1単位/mL コレステロールオキシダーゼ(東洋紡)、1単位/mL パーオキシダーゼ、0.02% N,N−ジスルホブチルメタトルイジン、0.2mM フルフェナム酸(シグマ)、50mM NaCl、50mM Bis−Tris緩衝液(pH6)を含む試薬240μLを加え、37℃で5分加温後、1単位/mL コレステロールエステラーゼ(旭化成)、1% ペグノール005、0.02% 4−アミノアンチピリン、50mM Bis−Tris緩衝液(pH6)を含む試薬80μLを加え37℃で副波長700nm/主波長600nmにおける吸光度変化量を測定した。市販のHDLコレステロール測定試薬としては、コレステストN HDL(第一化学薬品社製)を使用して添付の使用法に従って測定した。この結果を図1に示す。図1に示したように本発明の方法は、相関係数r=0.999と従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。
次に、本発明方法により、LDLコレステロールを日立7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のLDLコレステロール測定試薬の測定値と比較した。試料として血清50例を用いた。本発明の試薬は、血清2.4μLに、1単位/mL コレステロールオキシダーゼ(旭化成)、1単位/mL コレステロールエステラーゼ(旭化成)、1% ペグノール005(東邦化学工業)、1単位/mL パーオキシダーゼ、0.01% 4−アミノアンチピリン、200mM NaCl、50mM MES緩衝液(pH6.5)からなる第一試薬240μLを加え、37℃で5分加温後に、0.04% N,N−ジスルホブチルメタトルイジン、1% エマルゲン709、50mM MES緩衝液(pH6.5)を含む試薬80μLを加え37℃で副波長660nm/主波長546nmにおける吸光度変化量を測定した。市販のLDLコレステロール測定試薬としては、コレステストLDL(第一化学薬品社製)を使用して、添付の使用法に従って測定した。この結果を図2に示す。図2に示したように本発明の方法は相関係数R=0.999と従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。
以上の結果は、本発明の界面活性剤が複数の特定リポ蛋白中の脂質測定に使用できる性質を有していることを示している。
実施例6(HDLコレステロールとLDLコレステロールの測定)
本発明方法により、HDLコレステロールを日立7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のHDLコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清20例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清2.4μLに、0.01% 4−アミノアンチピリン、100mM PIPES緩衝液(pH6.5)を含む試薬240μLを加え、37℃で5分加温後、1単位/mL コレステロールオキシダーゼ(オリエンタル酵母)、1単位/mL コレステロールエステラーゼ(旭化成)、1% エマルゲンA90、1単位/mL パーオキシダーゼ、0.04% N,N−ジスルホブチルメタトルイジン、100mM PIPES緩衝液(pH6.5)を含む試薬80μLを加え、37℃で副波長700nm/主波長600nmにおける吸光度変化量を測定した。市販のHDLコレステロール測定試薬としては、コレステストN HDL(第一化学薬品社製)を使用して、添付の使用法に従って測定した。この結果を図3に示す。図3に示したように本発明の方法は本発明の方法は相関係数r=0.952と従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。
次に、本発明方法により、LDLコレステロールを日立7170形自動分析装置にて測定し、その測定値を市販のLDLコレステロール測定試薬の測定値と比較した。ヒト血清20例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清2.4μLに、1単位/mL コレステロールオキシダーゼ(東洋紡)、1単位/mL コレステロールエステラーゼ(旭化成)、1単位/mL パーオキシダーゼ、0.02% N,N−ジスルホブチルメタトルイジン、100mM PIPES緩衝液(pH6.5)、1% エマルゲンA90からなる第一試薬240μLを加え、37℃で10分加温後に、0.02% 4−アミノアンチピリン、100mM PIPES緩衝液(pH6.5)、1% エマルゲン709を含む試薬80μLを加え、37℃で副波長660nm/主波長546nmにおける吸光度変化量を測定した。市販のLDLコレステロール測定試薬としては、コレステストLDL(第一化学薬品社製)を使用して添付の使用法に従って測定した。この結果を図4に示す。図4に示したように本発明の方法は本発明の方法は相関係数r=0.987と従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。
以上の結果は、本発明の界面活性剤が複数の特定脂質中の脂質測定に使用できる性質を有していることを示している。
実施例7(LDLコレステロールの測定)
各種緩衝液を用いて本発明方法のLDLコレステロール試薬を調製し、その測定値を比較した。測定は日立7170形自動分析装置を用い、ヒト血清15例を試料として用いた。本発明の試薬は、血清2.4μLに、1単位/mL コレステロールオキシダーゼ(東洋紡)、1単位/mL コレステロールエステラーゼ(旭化成)、1単位/mL パーオキシダーゼ、0.02% N,N−ジスルホブチルメタトルイジン、1% ペグノール005を含む100mM 各種緩衝液からなる第一試薬240μLを加え、37℃で5分加温後に、0.02% 4−アミノアンチピリン、1% エマルゲン709、100mM 各種緩衝液を含む試薬80μLを加え、37℃で副波長660nm/主波長546nmにおける吸光度変化量を測定した。市販のLDLコレステロール測定試薬としては、コレステストLDL(第一化学薬品社製)を使用して添付の使用法に従って測定した。この結果を表5に示す。表5に示したように本発明の方法は緩衝液の種類によらず従来法である自動分析法と良好な相関関係が認められた。
実施例8(LDL中性脂肪の測定)
血清を試料として超遠心分離法で各リポ蛋白画分に分離して、各分画中の総コレステロールを測定し図5にプロットした。また本発明方法により、同一の試料の中性脂肪を測定し図5にプロットした。測定は日立7150形自動分析装置を用いて行い、総コレステロール測定にはピュアオートS T−CHO(第一化学薬品製)を用いた。本発明のLDL中性脂肪測定試薬は、血清3μLに0.5単位/mL グリセロールキナーゼ(旭化成)、3単位/mL グリセロ3リン酸オキシダーゼ(東洋紡)、1.5単位/mL パーオキシダーゼ(東洋紡)、1単位/mL LPL(東洋紡)、1% ペグノール005(東邦化学工業)、3mM 塩化マグネシウム、0.5mM 塩化カルシウム、2.5mM ATP、0.02% エチルスルホブチルメタトルイジン、50mM MES緩衝液(pH6.3)からなる第一試薬300μLを加え、37℃で5分加温後に、0.01% 4−アミノアンチピリン、1% エマルゲン709、50mM MES緩衝液(pH6.3)を含む試薬100μLを加え、37℃で副波長700nm/主波長546nmにおける吸光度変化量を測定した。図5に示したように本発明の方法はLDL中のTGを特異的に測定している。
実施例9(HDL中性脂肪の測定)
血清を試料として超遠心分離法で各リポ蛋白画分に分離して、各分画中の総中性脂肪を測定し図6にプロットした。また本発明方法により、同一の試料の中性脂肪を測定し図6にプロットした。測定は日立7170形自動分析装置を用いて行い、総中性測定にはピュアオートS TG−N(第一化学薬品製)を用いた。本発明のHDL中性脂肪測定試薬は、血清2.8μLに3単位/mL グリセロールキナーゼ(旭化成)、3単位/mL グリセロ3リン酸オキシダーゼ(東洋紡)、500単位/mL カタラーゼ、3mM 塩化マグネシウム、3mM ATP、2mM エチルスルホブチルメタトルイジン、100mM PIPES緩衝液(pH7)からなる第一試薬210μLを加え、37℃で5分加温後に、500単位/mL リパーゼ(旭化成)、1単位/mL モノグリセリドリパーゼ(旭化成)、10単位/mL パーオキシダーゼ(東洋紡)、1.5% ペグノール005(東邦化学工業)、0.04% 4−アミノアンチピリン、1mM 塩化カルシウム、100mMPIPES緩衝液(pH7)を含む試薬70μLを加え、37℃で副波長700nm/主波長546nmにおける吸光度変化量を測定した。図6に示したように本発明の方法はHDL中のTGを特異的に測定している。
実施例10(界面活性剤のHLBと相関係数の関係)
本発明の界面活性剤については、HLB値は特に重要な意味を持たないが、好ましくは12以上としている。図7は本発明の実施例1から実施例4に示した相関係数と本発明の界面活性剤のHLBの関係を示したものである。図7は本発明の界面活性剤のHLB値と相関係数の関係に一定の傾向を認めないことを示している。
実施例11(界面活性剤のアリール基数と相関係数の関係)
本発明の界面活性剤は、2個以上のアリール基を有することを特徴の1つとしている(表5)。図8は本発明の実施例1から実施例4に示した相関係数と本発明の界面活性剤のアリール基数の関係を示したものである。なお本発明の界面活性剤のうち縮合物系のものは除外している。図8は界面活性剤のアリール基数が2個以上の場合、1個の対照法より良好な相関係数が得られることを示している。なお本発明においてアリール基を数える際は、共通の構造的特徴であるベンゼン環を有するものの代表としてフェニル基の数として表している。
Claims (24)
- 特定リポ蛋白中の脂質測定法において、少なくとも目的脂質測定の特異性を決定する工程で、多環型ポリオキシアルキレン誘導体を用いることを特徴とする特定リポ蛋白中の脂質測定法。
- 特定のリポ蛋白が、HDL、LDL、IDL、VLDL、カイロミクロン又はそれらの分解物であって、目的脂質がコレステロール、中性脂肪又はリン脂質である請求項1記載の測定法。
- 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、2個以上のアリール基を有する非イオン性又は陰イオン性の界面活性剤である請求項1又は2記載の測定法。
- 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、フェニル基上にフェニル基、ナフチル基、アルキルフェニル基、フェニルアルキル基及びスチリル基から選ばれる1〜5個が置換した多環性基を有するポリオキシアルキレンエーテル系非イオン性界面活性剤である請求項1〜3のいずれか1項記載の測定法。
- 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、特定のリポ蛋白に作用するHLB12〜18の非イオン性界面活性剤であって、目的脂質に対する特異性が該界面活性剤のHLB値に依存せず、専らアリール基の数に支配される界面活性剤である請求項1〜4のいずれか1項記載の測定法。
- 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、特定のリポ蛋白に作用するHLB12〜18の非イオン性界面活性剤であって、アリール基を2個以上有する界面活性剤(但し、LDL中のコレステロールを測定した際に緩衝液により測定の特異性が影響されるHLB13〜15のものを除く)である請求項1〜4のいずれか1項記載の測定法。
- 目的脂質がHDL中のコレステロールであり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体がHDLに優先的に作用するHLB14.1〜18の非イオン性界面活性剤である請求項1〜6のいずれか1項記載の測定法。
- 目的脂質がLDL中のコレステロールであり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体がLDL以外に優先的に作用するHLB15.1〜18の非イオン性界面活性剤である請求項1〜6のいずれか1項記載の測定法。
- 目的脂質が特定のリポ蛋白中の中性脂肪であり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体がLDL以外に優先的に作用する、HLB12〜18であって、2個以上のアリール基を有する非イオン性界面活性剤である請求項1〜6のいずれか1項記載の測定法。
- 目的脂質がLDL中の中性脂肪であり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体がLDL以外に優先的に作用する、HLB12〜15であって、2個以上のアリール基を有する非イオン性界面活性剤である請求項1〜6のいずれか1項記載の測定法。
- 測定系が、目的脂質測定の特異性を決定する工程と目的脂質を測定する工程を有するものである請求項1〜10のいずれか1項記載の測定法。
- 目的脂質を測定する工程が、特定リポ蛋白に作用する界面活性剤と目的脂質測定試薬の反応を制御する成分の存在下に行なわれるものである請求項11記載の測定法。
- 遊離のグリセロールが反応に関与しないように前処理する工程と特定のリポ蛋白にリポ蛋白リパーゼを作用させる工程からなる特定リポ蛋白中の中性脂肪測定系において、HLB12〜18の多環型ポリオキシアルキレン誘導体の存在下でリポ蛋白リパーゼと特定リポ蛋白の中性脂肪を反応させることを特徴とする特定リポ蛋白中の中性脂肪測定方法。
- 遊離のグリセロールが反応に関与しないように前処理する工程と特定のリポ蛋白にリポ蛋白リパーゼを作用させる工程からなる特定リポ蛋白中の中性脂肪測定系において、HLB12〜15の多環型ポリオキシアルキレン誘導体の存在下で遊離のグリセロールと特定リポ蛋白以外の中性脂肪を前処理することを特徴とする特定リポ蛋白中の中性脂肪測定方法。
- 特定リポ蛋白に作用する多環型ポリオキシアルキレン誘導体及び目的脂質測定試薬を含有することを特徴とする特定リポ蛋白中の脂質測定試薬。
- 特定のリポ蛋白が、HDL、LDL、IDL、VLDL、カイロミクロン又はそれらの分解物であって、目的脂質がコレステロール、中性脂肪又はリン脂質である請求項15記載の測定試薬。
- 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、2個以上のアリール基を有する非イオン性又は陰イオン性の界面活性剤である請求項15又は16記載の測定試薬。
- 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、フェニル基上にフェニル基、ナフチル基、アルキルフェニル基、フェニルアルキル基及びスチリル基から選ばれる1〜5個が置換した多環性基を有するポリオキシアルキレンエーテル系非イオン性界面活性剤である請求項15〜17のいずれか1項記載の測定試薬。
- 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、特定のリポ蛋白に作用するHLB12〜18の非イオン性界面活性剤であって、目的脂質に対する特異性が該界面活性剤のHLB値に依存せず、専らアリール基の数に支配される界面活性剤である請求項15〜18のいずれか1項記載の測定試薬。
- 多環型ポリオキシアルキレン誘導体が、特定のリポ蛋白に作用するHLB12〜18の非イオン性界面活性剤であって、アリール基を2個以上有する界面活性剤(但し、LDL中のコレステロールを測定した際に緩衝液により測定の特異性が影響されるHLB13〜15のものを除く)である請求項15〜18のいずれか1項記載の測定試薬。
- 目的脂質がHDL中のコレステロールであり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体がHDLに特異的に作用するHLB14.1〜18の非イオン性界面活性剤である請求項15〜20のいずれか1項記載の測定試薬。
- 目的脂質がLDL中のコレステロールであり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体がLDL以外に優先的に作用するHLB15.1〜18の非イオン性界面活性剤である請求項15〜20のいずれか1項記載の測定試薬。
- 目的脂質が特定のリポ蛋白中の中性脂肪であり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体がLDL以外に優先的に作用する、HLB12〜18であって、2個以上のアリール基を有する多環型ポリオキシアルキレン誘導体である請求項15〜20のいずれか1項記載の測定試薬。
- 目的脂質がLDL中の中性脂肪であり、多環型ポリオキシアルキレン誘導体がLDL以外に優先的に作用する、HLB12〜15であって、2個以上のアリール基を有する多環型ポリオキシアルキレン誘導体である請求項15〜20のいずれか1項記載の測定試薬。
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