JP7436981B2 - コレステロールエステラーゼ活性が向上したポリペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、ポリペプチドを改変することにより、改変前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上したポリペプチド、改変前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性を向上する方法、該ポリペプチドの製造方法、および該ポリペプチドを含む試薬組成物、該ポリペプチドを用いたコレステロールの測定方法等に関する。
リパーゼ（ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｌｉｐａｓｅ、ＥＣ ３．１．１．３）は、脂質を構成するエステル結合を加水分解する酵素群の中で、特にトリグリセリドやジグリセリドを加水分解して脂肪酸とグリセロールを遊離する反応を触媒する基質特異性をもつエステラーゼ（エステル結合を加水分解する反応を触媒する）である。
コレステロールエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．１３）は、脂質を構成するエステル結合を加水分解する酵素群の中で、特にコレステロール脂肪酸エステルを加水分解して脂肪酸とコレステロールを遊離する反応を触媒する基質特異性をもつエステラーゼである。
リパーゼやコレステロールエステラーゼのような酵素は、常温、常圧、中性ｐＨのような温和な環境で、特定の反応だけを触媒する高い基質特異性（分子認識能）をもつため工業利用に向いているが、実用化のためには製造コストを低く抑えることが課題になる場合がある。従って、製造コストを低く抑えることに成功して実用化に至っている酵素の基質特異性を改変することができれば、製造コストが低く抑えられた新たな酵素を創出することができる。
製造コストを低く抑えることに成功して実用化に至っている公知のリパーゼの例としてバークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ：以下「Ｂ．セパシア」と呼ぶことがある。シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）、「Ｐ．セパシア」と呼ばれる場合もある）由来のリパーゼがある（特許文献１、配列番号１）。Ｂ．セパシア由来リパーゼの基質特異性を、コレステロールエステラーゼに改変することができれば、製造コストを低く抑えられたコレステロールエステラーゼを新たに創出することができる。
Ｂ．セパシア由来リパーゼの立体構造は明らかになっており（非特許文献１）、リガンドと結合した構造の報告もある（非特許文献２～５）。しかし、非特許文献２～５のリガンドはステロール骨格を含むものではなく、さらにリガンドは様々な向きで結合しているので、これらの構造からコレステロールエステルがどのような向きでリパーゼ分子と結合し、どのアミノ酸がコレステロールエステラーゼ活性を向上するために重要なのかを推察することは困難であった。
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５、１７３－１８５（１９９７）
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４、３３３－３４０（１９９８）
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８、３９６４－３９７３ （２００１）
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ１２、４２７－４３７ （２００５）
Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ１１２、４８７６－４８８３ （２００８）
本発明の課題は、バークホルデリア属の細菌に由来するリパーゼのポリペプチドを改変することにより、改変前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上したポリペプチドを提供することである。また本発明の別の課題としては、バークホルデリア属の細菌に由来するリパーゼのポリペプチドを改変することにより、改変前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性を向上する方法、該ポリペプチドの製造方法、および該ポリペプチドを含む試薬組成物、該ポリペプチドを用いたコレステロールの測定方法等を提供することである。
本発明者らは、配列番号１、２、３または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位に位置するロイシンを、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンを、イソロイシン又はアラニンに置換することにより、改変前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上したポリペプチドが得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本願発明は以下の発明を包含する。
［１］配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドであって、配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸が、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸がイソロイシン又はアラニンに置換されており、置換前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上しているポリペプチド。
［２］前記アミノ酸配列が配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列であり、当該アミノ酸配列における２６６位のバリンに相当するアミノ酸が更にロイシンに置換されている、［１］に記載のポリペプチド。
［３］前記ポリペプチドが、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属又はパラバークホルデリア（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の細菌のポリペプチドに由来する、［１］又は［２］に記載のポリペプチド。
［４］前記配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドが、リパーゼ活性を有するポリペプチドである、［１］～［３］のいずれかに記載のポリペプチド。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、
配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸を、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸をイソロイシン又はアラニンに置換する工程を含む、方法。
［６］前記アミノ酸配列が配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列であり、当該アミノ酸配列の２６６位のバリンに相当するアミノ酸をロイシンに置換する工程を更に含む、［５］に記載の方法。
［７］配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドのコレステロールエステラーゼ活性を向上する方法であって、
配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸を、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸をイソロイシン又はアラニンに置換する工程を含む、方法。
［８］前記アミノ酸配列が配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列であり、当該アミノ酸配列の２６６位のバリンに相当するアミノ酸をロイシンに置換する工程を更に含む、［７］に記載の方法。
［９］［１］～［４］のいずれかに記載のポリペプチドを含む、試薬組成物。
［１０］リポタンパク質中のコレステロール又はそのエステルを測定するための、［９］に記載の試薬組成物。
［１１］前記リポタンパク質が、超高比重（密度）リポタンパク質、高比重（密度）リポタンパク質、低比重（密度）リポタンパク質、超低比重（密度）リポタンパク質、中間比重（密度）リポタンパク質、カイロミクロン、ｓｍａｌｌ－ＬＤＬ、βリポタンパク質、ｐｒｅ－リポタンパク質及びαリポタンパク質から成る群から選択される少なくとも１種のリポタンパク質である、［１０］に記載の試薬組成物。
［１２］［９］～［１１］のいずれかに記載の試薬組成物を含む、キット。
［１３］［９］～［１１］のいずれかに記載の試薬組成物又は［１２］に記載のキットを用いてコレステロール又はそのエステルを測定する方法であって、
前記組成物又はキットに含まれるポリペプチドと、コレステロール又はそのエステルを含むか、又はその疑いのある被験試料とを接触させる工程を含む、方法。
［１］配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドであって、配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸が、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸がイソロイシン又はアラニンに置換されており、置換前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上しているポリペプチド。
［２］前記アミノ酸配列が配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列であり、当該アミノ酸配列における２６６位のバリンに相当するアミノ酸が更にロイシンに置換されている、［１］に記載のポリペプチド。
［３］前記ポリペプチドが、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属又はパラバークホルデリア（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の細菌のポリペプチドに由来する、［１］又は［２］に記載のポリペプチド。
［４］前記配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドが、リパーゼ活性を有するポリペプチドである、［１］～［３］のいずれかに記載のポリペプチド。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、
配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸を、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸をイソロイシン又はアラニンに置換する工程を含む、方法。
［６］前記アミノ酸配列が配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列であり、当該アミノ酸配列の２６６位のバリンに相当するアミノ酸をロイシンに置換する工程を更に含む、［５］に記載の方法。
［７］配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドのコレステロールエステラーゼ活性を向上する方法であって、
配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸を、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸をイソロイシン又はアラニンに置換する工程を含む、方法。
［８］前記アミノ酸配列が配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列であり、当該アミノ酸配列の２６６位のバリンに相当するアミノ酸をロイシンに置換する工程を更に含む、［７］に記載の方法。
［９］［１］～［４］のいずれかに記載のポリペプチドを含む、試薬組成物。
［１０］リポタンパク質中のコレステロール又はそのエステルを測定するための、［９］に記載の試薬組成物。
［１１］前記リポタンパク質が、超高比重（密度）リポタンパク質、高比重（密度）リポタンパク質、低比重（密度）リポタンパク質、超低比重（密度）リポタンパク質、中間比重（密度）リポタンパク質、カイロミクロン、ｓｍａｌｌ－ＬＤＬ、βリポタンパク質、ｐｒｅ－リポタンパク質及びαリポタンパク質から成る群から選択される少なくとも１種のリポタンパク質である、［１０］に記載の試薬組成物。
［１２］［９］～［１１］のいずれかに記載の試薬組成物を含む、キット。
［１３］［９］～［１１］のいずれかに記載の試薬組成物又は［１２］に記載のキットを用いてコレステロール又はそのエステルを測定する方法であって、
前記組成物又はキットに含まれるポリペプチドと、コレステロール又はそのエステルを含むか、又はその疑いのある被験試料とを接触させる工程を含む、方法。
本発明により、製造コストを低く抑えることに成功して実用化に至っているＢ．セパシア由来を含むリパーゼに代表される、配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドを改変することにより、改変前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上したポリペプチドの提供が容易となる。
以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について説明するが、本発明の範囲は以下の実施形態に限定して解釈されない。遺伝子操作技術は、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２年、１９８９年）等に記載の方法、又は、市販の各種酵素、キット類に添付された手順書等に従えば実施できるものである。
本発明の第一の実施形態において、本発明は、配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドであって、配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸が、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸が、イソロイシン又はアラニンに置換されており、置換前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上しているポリペプチドを提供する。
本発明の第一の実施形態において、ポリペプチド（鎖）の一次構造は、通常アミノ酸配列と一致する。本発明のアミノ酸配列は配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドであれば限定されないが、８５％以上の同一性を有するポリペプチドであれば好ましく、９０％以上の同一性を有するポリペプチドであればより好ましく、９５％以上の同一性を有するポリペプチドであればさらに好ましく、９８％以上の同一性を有するポリペプチドであれば特に好ましく、１００％の同一性を有するポリペプチドが最も好ましい。すなわち、本発明のアミノ酸配列は配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０～１００％の間の任意の同一性を有するポリペプチドであればよい。配列番号１～４について、配列間の同一性を以下の表１に示す。
本実施形態におけるポリペプチドは天然由来、または人為的に合成された合成ポリペプチドであっても良く、天然由来のポリペプチドに人為的に変異を加えたポリペプチドや、天然由来および／または人為的に合成されたポリペプチドのキメラポリペプチドであってもよい。
ポリペプチドが天然由来の場合、配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する限り、その由来は限定されない。しかしながら、ポリペプチドはバークホルデリア属由来、シュードモナス属由来、またはパラバークホルデリア属由来が好ましく、種および株によって限定されないが、シュードモナス属の場合は、シュードモナス・セパシア、シュードモナス・アシドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）、シュードモナス・ルテオラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｔｅｏｌａ）、またはシュードモナス・メソアシドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）が好ましい。バークホルデリア属の場合は、バークホルデリア・セパシア、バークホルデリア・スタビリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ）、バークホルデリア・アムビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ）、バークホルデリア・アンシナ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｎｔｈｉｎａ）、バークホルデリア・カタリネンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃａｔａｒｉｎｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・セパシア、バークホルデリア・コンタミナンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ）、バークホルデリア・ディフサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｄｉｆｆｕｓａ）、バークホルデリア・グラジオリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌａｄｉｏｌｉ）、バークホルデリア・グルマエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ）、バークホルデリア・ラタ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｌａｔａ）、バークホルデリア・ラテンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｌａｔｅｎｓ）、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・メタリカ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍｅｔａｌｌｉｃａ）、バークホルデリア・マルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア・オクラホメンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｏｋｌａｈｏｍｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ）、バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・シュードマルチボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア・プラクアエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｕｒａｑｕａｅ）、バークホルデリア・ピロシニア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ）、バークホルデリア・セミナリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｅｍｉｎａｌｉｓ）、バークホルデリア・シンギュラリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、バークホルデリア・スタグナリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｇｎａｌｉｓ）、バークホルデリア・テリトリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｅｒｒｉｔｏｒｉｉ）、バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、バークホルデリア・ユボネンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｕｂｏｎｅｎｓｉｓ）、またはバークホルデリア・ベトナミエンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ）が好ましい。パラバークホルデリア属由来の場合はパラバークホルデリア・アスパラチ（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｓｐａｌａｔｈｉ）、パラバークホルデリア・ブリオフィラ（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｂｒｙｏｐｈｉｌａ）、パラバークホルデリア・カフェイニリティカ（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃａｆｆｅｉｎｉｌｙｔｉｃａ）、パラバークホルデリア・フンゴラム（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｆｕｎｇｏｒｕｍ）、パラバークホルデリア・ギンセンギテラエ（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｉｎｓｅｎｇｉｔｅｒｒａｅ）、パラバークホルデリア・インサルサ（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｉｎｓｕｌｓａ）、パラバークホルデリア・クルリエンシス（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｋｕｒｕｒｉｅｎｓｉｓ）、パラバークホルデリア・セディミニコラ（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｅｄｉｍｉｎｉｃｏｌａ）、またはパラバークホルデリア・フェナジニウム（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）が好ましい。また公知の種に分類できないバークホルデリア属菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、またはパラバークホルデリア属菌（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）でもよい。ポリペプチドは、バークホルデリア（シュードモナス）・セパシア、バークホルデリア・ユボネンシス、又はバークホルデリア・グルマエ、バークホルデリア・タイランデンシスに由来することが特に好ましい。
上記の菌はバイオリソースセンターであるＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）から購入可能である。
本実施形態において、配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドは、コレステロールエステラーゼ活性以外に任意の反応を触媒する活性を持っていてもよい。
本発明においてコレステロールエステラーゼ活性以外の活性は限定されないが、リパーゼ活性などのエステラーゼ活性であってもよい。これらの活性はＢｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３、１９７４－１９８４（２０１９）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２５９ ９－１７（１９９５）などに記載された公知の活性の測定方法で検出できれば良く、活性の強さや、リパーゼ活性およびコレステロールエステラーゼ活性など複数の活性がある場合、その比率によって限定されない。なお、配列番号１～４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドはリパーゼ活性を有する。
本発明においてコレステロールエステラーゼ活性以外の活性は限定されないが、リパーゼ活性などのエステラーゼ活性であってもよい。これらの活性はＢｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３、１９７４－１９８４（２０１９）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２５９ ９－１７（１９９５）などに記載された公知の活性の測定方法で検出できれば良く、活性の強さや、リパーゼ活性およびコレステロールエステラーゼ活性など複数の活性がある場合、その比率によって限定されない。なお、配列番号１～４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドはリパーゼ活性を有する。
本実施形態において、配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸が、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸が、イソロイシン又はアラニンに置換されている。コレステロールエステラーゼ活性を更に向上させる観点からは、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列における２６６位のバリンに相当するアミノ酸が更にロイシンに置換されていることが好ましい。
配列番号１～３と配列番号４とで置換されるロイシンの位置が異なるように、各ポリペプチドにおいては、置換されるアミノ酸の位置がポリペプチドの種類によって異なる場合がある。つまり、「２８７位」や「２８６位」のアミノ酸位は配列番号１～４のアミノ酸配列を基準とした場合のアミノ酸の位置であり、他のアミノ酸配列において相当する位置とは異なる位置にロイシンと同一又は異なるアミノ酸があったとしても、このアミノ酸をイソロイシン又はアラニンに置換することで、置換前よりもコレステロールエステラーゼ活性が向上する限り、置換後のポリペプチドは本発明の範囲内に含まれる。２６６位のバリンについても同様であり、対応するアミノ酸をロイシンに置換することで、置換前よりもコレステロールエステラーゼ活性が向上する限り、置換後のポリペプチドは本発明の範囲内に含まれる。
本明細書で使用する場合、「アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するロイシン」などの記載における「相当する」とは、対応するアミノ酸が、比較されるタンパク質（酵素）間においてその機能の発揮に同等の貢献をしていることを意味し、特に基質特異性に対する貢献が同等であることを意味する。例えば、基準のアミノ酸配列（つまり配列番号１～４とのいずれかのアミノ酸配列）に対して比較対象のアミノ酸配列を、一次構造（即ちアミノ酸配列）の部分的な相同性を考慮しつつ、最適な比較ができるように並べたときに（このときに必要に応じてギャップを導入し、アライメントを最適化してもよい）、基準のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を「相当するアミノ酸」として特定することができる。
一次構造を比較する方法にはＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１０．１５、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）などの遺伝子解析ソフトウェアを使用する方法があり、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）、ＭｕｌｔＡｌｉｎ （ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｇｅｎｏｐｏｌｅ－ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｐｒｄ．ｆｒ／ｍｕｌｔａｌｉｎ／）、Ｔ－ＣＯＦＦＥＥ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ＿ｈｏｍｅ＿ｐａｇｅ／ｔ＿ｃｏｆｆｅｅ＿ｈｏｍｅ＿ｐａｇｅ．ｈｔｍｌ）、ＭＡＦＦＴ （ｈｔｔｐ：／／ａｌｉｇｎ．ｂｍｒ．ｋｙｕｓｈｕ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｍａｆｆｔ／ｏｎｌｉｎｅ／ｓｅｒｖｅｒ／）、ＰＲＯＭＡＬＳ （ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｄａｔａ．ｓｗｍｅｄ．ｅｄｕ／ｐｒｏｍａｌｓ／）等のマルチプルアラインメントツールを提供しているサイトを利用する方法もある。
一次構造同士の比較に代えて、又はこれに加えて三次構造（立体構造）同士の比較によって「相当するアミノ酸」を特定することもできる。三次構造情報を利用することによって信頼性の高い比較結果が得られる。この場合は、複数の酵素の三次構造の原子座標を比較しながらアライメントを行っていく手法をとることが出来る。変異対象酵素の三次構造情報は例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｄｂｊ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ＿ｊ．ｈｔｍｌ）より取得することができる。
配列番号１～３のアミノ酸配列を基準とする場合、当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸、又は配列番号４のアミノ酸配列を基準とする場合、当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸は、ロイシンであることが好ましい。
配列番号１又は２のアミノ酸配列を基準とする場合、当該アミノ酸配列の２６６位のバリンに相当するアミノ酸は、バリンであることが好ましい。配列番号３のアミノ酸配列を基準とする場合、当該アミノ酸配列の２６６位のロイシンに相当するアミノ酸はロイシンであることが好ましい。配列番号４のアミノ酸配列を基準とする場合、当該アミノ酸配列の２６５位のロイシンに相当するアミノ酸はロイシンであることが好ましい。
配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列における２８７位又は配列番号４のアミノ酸配列における２８６位に相当するアミノ酸はイソロイシンに置換されていることが好ましい。
配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列における２６６位又は配列番号４のアミノ酸配列における２６５位に相当するアミノ酸は、ロイシンに置換されていることが好ましい。
本実施形態において、「置換前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上している」とは、置換前のポリペプチドが保持していなかったコレステロールエステラーゼ活性が置換により新たに付与されるか、もしくは、置換前のポリペプチドとの比較でコレステロールエステラーゼ活性が実質的に向上していることを意味する。実質的に向上しているとは、置換前のポリペプチドとの比較で活性が少なくとも実質的に向上していることを意味する。２０％以上向上していれば好ましく、５０％以上向上していればより好ましく、１００％以上向上していればさらに好ましく、２００％以上向上していれば特に好ましく、１０００％以上が最も好ましい。
本実施形態において、アミノ酸配列をコードする塩基配列は特に限定されないが、例えば配列番号１～４のアミノ酸配列をコードする塩基配列の場合、それぞれ順番に配列番号５～８が例示される。配列番号５～８の塩基配列は、コレステロールエステラーゼ活性が低下しない限り、大腸菌や放線菌等宿主のコドン使用頻度に合わせて変更され得る。また、配列番号５～８で示されるような塩基配列はジェンスクリプトジャパン株式会社等のＤＮＡ合成受託会社に依頼して合成してもよい。
本実施形態におけるポリペプチドは、置換前又は置換後にリパーゼ活性を有していてもよい。このようなリパーゼ活性を有するポリペプチドは、ポリペプチドが三次構造を形成してリパーゼ活性をＢｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３、１９７４－１９８４（２０１９）などに記載された公知の活性の測定方法で検出できればよく、活性の程度や、リパーゼ活性に加えコレステロールエステラーゼ活性など複数の活性がある場合、その比率によって限定されない。
本発明の第二の実施形態において、配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸を、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸をイソロイシン又はアラニンに置換する工程を含む、ポリペプチドの製造方法が提供される。
本実施形態におけるポリペプチドやその他の用語の定義は第一の実施形態で説明したとおりである。
本実施形態に係る方法は、アミノ酸配列が配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列である場合、当該アミノ酸配列の２６６位のバリンに相当するアミノ酸をロイシンに置換する工程を更に含むことが好ましい。
アミノ酸を異なるアミノ酸に置換する方法のひとつとして、部位特異的変異導入法（Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、ＳＤＭ）が挙げられる。すなわち、原型の遺伝子ＤＮＡが組み込まれたプラスミドの一本鎖ＤＮＡを鋳型にして、変異させようとする塩基配列を含む合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして変異型の遺伝子を合成するものである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）。また、ＫＯＤ －Ｐｌｕｓ－ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｍｕｔａ－Ｄｉｒｅｃｔ（登録商標）部位特異的変異導入キット等の市販キットを用いた方法によっても実施することができる。
本発明の第三の実施形態において、配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するポリペプチドのコレステロールエステラーゼ活性を向上する方法であって、配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸を、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸をイソロイシン又はアラニンに置換する工程を含む、方法が提供される。
本実施形態におけるポリペプチドやその他の用語の定義は第一の実施形態で説明したとおりである。
本実施形態に係る方法は、アミノ酸配列が配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列である場合、当該アミノ酸配列の２６６位のバリンに相当するアミノ酸をロイシンに置換する工程を更に含むことが好ましい。
本発明の第四の実施形態において、第一の実施形態に係るポリペプチドを含む、試薬組成物が提供される。
試薬組成物の目的は特に限定されないが、試薬組成物は、リポタンパク質中のコレステロール又はそのエステルを測定するために使用されるのが好ましい。測定は、コレステロールエステルおよび／またはコレステロールを定性、半定量、または定量するための測定であれば好ましく、定量するための測定がより好ましい。
定性、半定量、又は定量の対象として、超高比重（密度）リポ蛋白、高比重（密度）リポ蛋白、低比重（密度）リポ蛋白、超低比重（密度）リポ蛋白、中間比重（密度）リポ蛋白、カイロミクロン、ｓｍａｌｌ－ＬＤＬ、βリポ蛋白、ｐｒｅ－βリポ蛋白、及びαリポ蛋白であるリポ蛋白分画中のコレステロールが挙げられる。
試薬組成物は更に緩衝液、界面活性剤、安定化剤、キレート剤、防腐剤等の酵素の活性測定に使用される成分を含んでいてもよい。
本発明の第五の実施形態において、第四の実施形態に係る試薬組成物を含むキットが提供される。
キットは試薬組成物以外の構成要素を含んでいてもよい。例えば、そのような構成要素として、試薬組成物に含まれ得る緩衝液、界面活性剤、安定化剤、キレート剤、防腐剤、発色等の酵素の活性測定に使用される成分に加え、これらの成分を含む１又は複数の容器、アッセイ用のプレートなどが挙げられる。
本発明の第六の実施形態において、第四の実施形態に係る試薬組成物又は第五の実施形態に係るキットを用いてコレステロール又はそのエステルを測定する方法であって、前記組成物又はキットに含まれるポリペプチドと、コレステロール又はそのエステルを含むか、又はその疑いのある被験試料とを接触させる工程を含む、方法が提供される。
被験試料としては、ヒト又はその他の哺乳動物に由来する血液や尿などが挙げられるが、これらに限定されない。
被験試料とコレステロールエステラーゼ活性が向上しているポリペプチドとを接触させることで、従来よりも迅速にコレステロール又はそのエステルの検出が可能になる。
以下、本発明を実施例等に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例等に限定して解釈されない。また、以下に示した測定値等は測定の条件や使用機器の精度等によりその値は変化し得る。
１）バークホルデリア・セパシア由来リパーゼの発現ベクター作製
配列番号９～１２に記載のバークホルデリア・セパシアに由来するリパーゼ遺伝子及びその変異体遺伝子とそのシャペロン遺伝子を含むＤＮＡ配列を全合成した。当該ＤＮＡを鋳型として配列番号１３と１４に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（以下、プライマーと略記）を用いて、ポリメラーゼチェーンリアクション法（以下、ＰＣＲと略記）によるＤＮＡの増幅を行なった。なお、用いたＰＣＲ用酵素はＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）である。
配列番号９～１２に記載のバークホルデリア・セパシアに由来するリパーゼ遺伝子及びその変異体遺伝子とそのシャペロン遺伝子を含むＤＮＡ配列を全合成した。当該ＤＮＡを鋳型として配列番号１３と１４に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（以下、プライマーと略記）を用いて、ポリメラーゼチェーンリアクション法（以下、ＰＣＲと略記）によるＤＮＡの増幅を行なった。なお、用いたＰＣＲ用酵素はＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）である。
上記方法と同様に、特開２０１９－２０５４０２号公報の実施例２に記載の発現ベクターを鋳型として、配列番号１５と１６に記載のプライマーを用いてＤＮＡの増幅を行った。
ＰＣＲ反応によって増幅されたこれらのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルから切り出してＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてそれぞれ精製した。この精製済みのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換後、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン硫酸塩を含むＬＢ（１％ Ｂａｃｔｏ（商標）Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％ Ｂａｃｔｏ（商標）Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％塩化ナトリウム）寒天培地に塗布した。３７℃で２４時間培養後、得られたコロニーを２５μｇ／ｍＬのカナマイシン硫酸塩を含むＬＢ培地に植え継ぎ、３７℃で１２時間培養後、培養液からＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＭｉｎｉＰｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドを抽出した。なお、この発現用ベクターは、リパーゼの分泌シグナルペプチド配列の切断箇所の３‘側にポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）配列が挿入されており、分泌シグナルペプチドが切断された成熟型リパーゼのＮ末端にＨｉｓタグが付加されるように設計した。
２）バークホルデリア・スタビリスを宿主としたバークホルデリア・セパシア由来リパーゼの発現
宿主としてのバークホルデリア・スタビリス（ＦＥＲＭ Ｐ－２１０１４株）に上記１）で作製したリパーゼの発現ベクターを導入するため、バークホルデリア・スタビリスの菌株をＬＢ培地１００ｍＬにて対数増殖期に至るまで３０℃で振とう培養した後、遠心分離にて菌体を回収した。回収した菌体に１００ｍＬの氷冷滅菌水を加え、懸濁後再び遠心分離し菌体を回収した。この操作をもう一度繰り返した後、回収した菌体に５ｍＬ冷却１０％グリセリン溶液を加え、よく懸濁し、遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体に１ｍＬの氷冷１０％グリセリン溶液を加え、懸濁し、４０μＬずつ分注し、液体窒素で瞬間冷凍し－８０℃にて保存した。冷凍保存した菌体を氷上にて融解し、上記１）にて作製した４種類の発現ベクターをそれぞれ約１００ｎｇ加え、混合した。この混合液を０．２ｃｍ幅エレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）に移し、遺伝子導入装置ジーンパルサーＩＩを用いて電場強度２．４ｋＶ／ｃｍ、キャパシタンス２５μＦ、外部抵抗２００Ωにてそれぞれ電気パルスを与えた。電気パルス処理した菌体とＤＮＡの混合液を１ｍＬのＬＢ培地に混合し、３０℃にて１時間培養した後、２００μＬの菌液を２００μｇ／ｍＬのカナマイシン硫酸塩を含むＬＢ培地に塗布し、３０℃にて２日間培養し、各発現ベクターの形質転換体を得た。
宿主としてのバークホルデリア・スタビリス（ＦＥＲＭ Ｐ－２１０１４株）に上記１）で作製したリパーゼの発現ベクターを導入するため、バークホルデリア・スタビリスの菌株をＬＢ培地１００ｍＬにて対数増殖期に至るまで３０℃で振とう培養した後、遠心分離にて菌体を回収した。回収した菌体に１００ｍＬの氷冷滅菌水を加え、懸濁後再び遠心分離し菌体を回収した。この操作をもう一度繰り返した後、回収した菌体に５ｍＬ冷却１０％グリセリン溶液を加え、よく懸濁し、遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体に１ｍＬの氷冷１０％グリセリン溶液を加え、懸濁し、４０μＬずつ分注し、液体窒素で瞬間冷凍し－８０℃にて保存した。冷凍保存した菌体を氷上にて融解し、上記１）にて作製した４種類の発現ベクターをそれぞれ約１００ｎｇ加え、混合した。この混合液を０．２ｃｍ幅エレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）に移し、遺伝子導入装置ジーンパルサーＩＩを用いて電場強度２．４ｋＶ／ｃｍ、キャパシタンス２５μＦ、外部抵抗２００Ωにてそれぞれ電気パルスを与えた。電気パルス処理した菌体とＤＮＡの混合液を１ｍＬのＬＢ培地に混合し、３０℃にて１時間培養した後、２００μＬの菌液を２００μｇ／ｍＬのカナマイシン硫酸塩を含むＬＢ培地に塗布し、３０℃にて２日間培養し、各発現ベクターの形質転換体を得た。
発現ベクターを導入したバークホルデリア・スタビリスを５ｍＬの３％酵母エキス、３％ソルビトール培地（１００μｇ／ｍＬカナマイシン硫酸塩を含む）に植菌し、２８℃にて７２時間培養した。培養液を遠心分離した上清を粗酵素液として用いた。
３）組換え型バークホルデリア・セパシアリパーゼの精製
Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社）担体にＮｉ2+を固定化した後、担体約５０μＬをマイクロ遠心チューブに加え、溶液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．０）、０．３Ｍ ＮａＣｌ）で平衡化した。５０００×ｇで３０秒間遠心し、上清を除去した。上記２）で調製した粗酵素液１ｍＬを加え、１０分間ゆっくりと混合した。５０００×ｇで３０秒間遠心後、上清を除去した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体を１ｍＬの洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で３回洗浄した。洗浄は、洗浄バッファーを加えＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体を１０秒間ゆっくりと混合し、その後５０００×ｇで３０秒間遠心し、上清を除去した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体に０．１ｍＬの溶出バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．４Ｍイミダゾール）を加え、１分間ゆっくりと混合し、その後５０００×ｇで３０秒間遠心し、上清を回収し組換え型リパーゼの溶液を得た。得られた組換え型リパーゼの溶液のタンパク質濃度の定量は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてその推奨プロトコールに従って測定した。得られた組換え型リパーゼの溶液を一部取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。バークホルデリア・セパシアリパーゼの分子量は３３．１ｋＤａであり、予想される大きさに組換え型リパーゼのバンドが観察された（図１）。
Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社）担体にＮｉ2+を固定化した後、担体約５０μＬをマイクロ遠心チューブに加え、溶液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．０）、０．３Ｍ ＮａＣｌ）で平衡化した。５０００×ｇで３０秒間遠心し、上清を除去した。上記２）で調製した粗酵素液１ｍＬを加え、１０分間ゆっくりと混合した。５０００×ｇで３０秒間遠心後、上清を除去した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体を１ｍＬの洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で３回洗浄した。洗浄は、洗浄バッファーを加えＳｅｐｈａｒｏｓｅ担体を１０秒間ゆっくりと混合し、その後５０００×ｇで３０秒間遠心し、上清を除去した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体に０．１ｍＬの溶出バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．４Ｍイミダゾール）を加え、１分間ゆっくりと混合し、その後５０００×ｇで３０秒間遠心し、上清を回収し組換え型リパーゼの溶液を得た。得られた組換え型リパーゼの溶液のタンパク質濃度の定量は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてその推奨プロトコールに従って測定した。得られた組換え型リパーゼの溶液を一部取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。バークホルデリア・セパシアリパーゼの分子量は３３．１ｋＤａであり、予想される大きさに組換え型リパーゼのバンドが観察された（図１）。
実施例１ 組換え型バークホルデリア・セパシアリパーゼのコレステロールエステラーゼ活性の測定
上記１）～３）で得た組換え型リパーゼ溶液のコレステロールエステラーゼ活性の評価は、以下の酵素活性測定法を用いて実施した。
上記１）～３）で得た組換え型リパーゼ溶液のコレステロールエステラーゼ活性の評価は、以下の酵素活性測定法を用いて実施した。
＜酵素活性測定法＞
下記の試薬を下記の通りの濃度で含有する反応試薬を調製した。
［反応試薬］
４０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
０．０２％ ＴＯＤＢ（同仁化学研究所）
１０Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
０．３％ トリトンＸ－１００
２．５Ｕ／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ
１０％ 仔牛血清液
０．０３５％ ４－アミノアンチピリン
下記の試薬を下記の通りの濃度で含有する反応試薬を調製した。
［反応試薬］
４０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
０．０２％ ＴＯＤＢ（同仁化学研究所）
１０Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
０．３％ トリトンＸ－１００
２．５Ｕ／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ
１０％ 仔牛血清液
０．０３５％ ４－アミノアンチピリン
反応試薬を３７℃で１０分間予備加温し、日立７０８０自動分析装置（（株）日立製作所製）を用いて、１５０μＬの反応試薬に３μＬの組換え型リパーゼ溶液を添加し、３７℃で反応させた。添加後７６．６９秒から１１９．５３秒の主波長５４６ｎｍ、副波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、単位時間当たりの吸光度変化量（ΔＡ／ｍｉｎ）を得た。下記の式から得られる値をコレステロールエステラーゼ活性と定義し、コレステロールエステラーゼ活性を算出した。
（式）
コレステロールエステラーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）＝ΔＡ／ｍｉｎ÷１８ｘ（１５０＋３）÷３÷１０００
｛式中、ΔＡ／ｍｉｎは上記反応試薬を添加した７６．６９秒から１１９．５３秒の主波長５４６ｎｍ、副波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、得られた単位時間当たりの吸光度変化量を示す。１８はＴＯＤＢと４－アミノアンチピリンの酸化縮合反応物の５５０ｎｍにおけるミリモル分子吸光係数、１５０＋３は反応総体積（反応試薬の体積＋組換え型リパーゼ溶液の体積）、３は上記組換え型リパーゼ溶液の体積をそれぞれ意味する。｝
（式）
コレステロールエステラーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）＝ΔＡ／ｍｉｎ÷１８ｘ（１５０＋３）÷３÷１０００
｛式中、ΔＡ／ｍｉｎは上記反応試薬を添加した７６．６９秒から１１９．５３秒の主波長５４６ｎｍ、副波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、得られた単位時間当たりの吸光度変化量を示す。１８はＴＯＤＢと４－アミノアンチピリンの酸化縮合反応物の５５０ｎｍにおけるミリモル分子吸光係数、１５０＋３は反応総体積（反応試薬の体積＋組換え型リパーゼ溶液の体積）、３は上記組換え型リパーゼ溶液の体積をそれぞれ意味する。｝
組換え型リパーゼの溶液について、得られた活性値と上記３）のタンパク質濃度から、タンパク質１ｍｇあたりの比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。その結果を表２に示す。
表２に示されるとおり、野生型のバークホルデリア・セパシアリパーゼはコレステロールエステラーゼ活性をほとんど有しないのに対して、２６６Ｌ（２６６位のアミノ酸をロイシンに置換したことを示す。以下同様）変異体あるいは２８７Ｉ変異体はコレステロールエステラーゼ活性が向上し、２６６Ｌ２８７Ｉ二重変異体はコレステロールエステラーゼ活性が著しく向上した。この結果より、バークホルデリア・セパシア由来リパーゼの２６６位および２８７位のアミノ酸をそれぞれロイシン、イソロイシンに置換されたポリペプチドは改変前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上することが示された。
実施例２ バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼおよびその変異体のコレステロールエステラーゼ活性の測定
配列番号１７～２２に記載のバークホルデリア・ユボネンシスに由来するリパーゼ遺伝子及びその変異体遺伝子とそのシャペロン遺伝子を含むＤＮＡ配列を全合成した。当該ＤＮＡを鋳型に用いて配列番号２３と２４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行ない、上記１）に記載の方法に準じて、発現ベクターを作製した。
配列番号１７～２２に記載のバークホルデリア・ユボネンシスに由来するリパーゼ遺伝子及びその変異体遺伝子とそのシャペロン遺伝子を含むＤＮＡ配列を全合成した。当該ＤＮＡを鋳型に用いて配列番号２３と２４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行ない、上記１）に記載の方法に準じて、発現ベクターを作製した。
上記２）に記載の方法に準じてバークホルデリア・スタビリスを宿主としてバークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼを発現させた。
上記３）に記載の方法に準じて組換え型バークホルデリア・ユボネンシスリパーゼを精製し、タンパク質濃度を測定した。得られた組換え型リパーゼの溶液を一部取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。バークホルデリア・ユボネンシスリパーゼの分子量は３３．１ｋＤａであり、予想される大きさに組換え型リパーゼのバンドが観察された（図２）。 実施例１に記載の方法に準じてコレステロールエステラーゼ活性を測定し、比活性を算出した。その結果を表３に示す。
表３に示されるとおり、野生型のバークホルデリア・ユボネンシスリパーゼはコレステロールエステラーゼ活性をほとんど有しないのに対して、２６６Ｌ変異体あるいは２８７Ｉ変異体はコレステロールエステラーゼ活性が向上し、２６６Ｌ２８７Ｉ二重変異体はコレステロールエステラーゼ活性が著しく向上した。この結果より、バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの２６６位および２８７位のアミノ酸をそれぞれロイシン、イソロイシンに置換されたポリペプチドは改変前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上することが示された。
実施例３ バークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼおよびその変異体のコレステロールエステラーゼ活性の測定
配列番号２５～２７に記載のバークホルデリア・タイランデンシスに由来するリパーゼ遺伝子及びその変異体遺伝子とそのシャペロン遺伝子を含むＤＮＡ配列を全合成した。当該ＤＮＡを鋳型に用いて配列番号２８と２９に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行ない、上記１）に記載の方法に準じて、発現ベクターを作製した。
配列番号２５～２７に記載のバークホルデリア・タイランデンシスに由来するリパーゼ遺伝子及びその変異体遺伝子とそのシャペロン遺伝子を含むＤＮＡ配列を全合成した。当該ＤＮＡを鋳型に用いて配列番号２８と２９に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行ない、上記１）に記載の方法に準じて、発現ベクターを作製した。
上記２）に記載の方法に準じてバークホルデリア・スタビリスを宿主としてバークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼを発現させた。
上記３）に記載の方法に準じて組換え型バークホルデリア・タイランデンシスリパーゼを精製し、タンパク質濃度を測定した。得られた組換え型リパーゼの溶液を一部取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。バークホルデリア・タイランデンシスリパーゼの分子量は３３．３ｋＤａであり、予想される大きさに組換え型リパーゼのバンドが観察された（図３）。実施例１に記載の方法に準じてコレステロールエステラーゼ活性を測定し、比活性を算出した。
その結果を表４に示す。
その結果を表４に示す。
表４に示されるとおり、野生型のバークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼに対して２８７Ｉ変異体はコレステロールエステラーゼ活性が向上した。この結果より、バークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼの２８７位のアミノ酸をイソロイシンに置換されたポリペプチドは改変前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上することが示された。
実施例４ バークホルデリア・グルマエ由来リパーゼおよびその変異体のコレステロールエステラーゼ活性の測定
配列番号３０～３２に記載のバークホルデリア・グルマエに由来するリパーゼ遺伝子及びその変異体遺伝子とそのシャペロン遺伝子を含むＤＮＡ配列を全合成した。当該ＤＮＡを鋳型に用いて配列番号３３と３４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行ない、上記１）に記載の方法に準じて、発現ベクターを作製した。
配列番号３０～３２に記載のバークホルデリア・グルマエに由来するリパーゼ遺伝子及びその変異体遺伝子とそのシャペロン遺伝子を含むＤＮＡ配列を全合成した。当該ＤＮＡを鋳型に用いて配列番号３３と３４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行ない、上記１）に記載の方法に準じて、発現ベクターを作製した。
上記２）に記載の方法に準じてバークホルデリア・スタビリスを宿主としてバークホルデリア・グルマエ由来リパーゼを発現させた。
上記３）に記載の方法に準じて組換え型バークホルデリア・グルマエリパーゼを精製し、タンパク質濃度を測定した。得られた組換え型リパーゼの溶液を一部取り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。バークホルデリア・グルマエリパーゼの分子量は３３．１ｋＤａであり、予想される大きさに組換え型リパーゼのバンドが観察された（図４）。実施例１に記載の方法に準じてコレステロールエステラーゼ活性を測定し、比活性を算出した。その結果を表５に示す。
表５に示されるとおり、野生型のバークホルデリア・グルマエ由来リパーゼに対して２８６Ｉ変異体はコレステロールエステラーゼ活性が向上した。この結果より、バークホルデリア・グルマエ由来リパーゼの２８６位のアミノ酸をイソロイシンに置換されたポリペプチドは改変前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上することが示された。
本発明によれば、従来のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上している新規ポリペプチドの提供が可能になる。
配列番号１：バークホルデリア（シュードモナス）・セパシア由来リパーゼのアミノ酸配列
配列番号２：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼのアミノ酸配列
配列番号３：バークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼのアミノ酸配列
配列番号４：バークホルデリア・グルマエ由来リパーゼのアミノ酸配列
配列番号５：バークホルデリア（シュードモナス）・セパシア由来リパーゼの塩基配列
配列番号６：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの塩基配列
配列番号７：バークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼの塩基配列
配列番号８：バークホルデリア・グルマエ由来リパーゼの塩基配列
配列番号９：バークホルデリア（シュードモナス）・セパシア由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（野生型）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１０：バークホルデリア（シュードモナス）・セパシア由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２６６Ｌ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１１：バークホルデリア（シュードモナス）・セパシア由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８７Ｉ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１２：バークホルデリア（シュードモナス）・セパシア由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２６６Ｌ、２８７Ｉ二重変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１３：配列番号９～１２の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号１４：配列番号９～１２の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号１５：発現ベクターを増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号１６：発現ベクターを増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号１７：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（野生型）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１８：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２６６Ｌ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１９：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８７Ｉ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２０：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２６６Ｌ、２８７Ｉ二重変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２１：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２６６Ｉ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２２：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８７Ａ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２３：配列番号１７～２２の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号２４：配列番号１７～２２の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号２５：バークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（野生型）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２６：バークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８７Ｉ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２７：バークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８７Ａ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２８：配列番号２５～２７の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号２９：配列番号２５～２７の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号３０：バークホルデリア・グルマエ由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（野生型）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号３１：バークホルデリア・グルマエ由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８６Ｉ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号３２：バークホルデリア・グルマエ由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８６Ａ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号３３：配列番号３０～３２の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号３４：配列番号３０～３２の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号２：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼのアミノ酸配列
配列番号３：バークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼのアミノ酸配列
配列番号４：バークホルデリア・グルマエ由来リパーゼのアミノ酸配列
配列番号５：バークホルデリア（シュードモナス）・セパシア由来リパーゼの塩基配列
配列番号６：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの塩基配列
配列番号７：バークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼの塩基配列
配列番号８：バークホルデリア・グルマエ由来リパーゼの塩基配列
配列番号９：バークホルデリア（シュードモナス）・セパシア由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（野生型）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１０：バークホルデリア（シュードモナス）・セパシア由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２６６Ｌ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１１：バークホルデリア（シュードモナス）・セパシア由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８７Ｉ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１２：バークホルデリア（シュードモナス）・セパシア由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２６６Ｌ、２８７Ｉ二重変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１３：配列番号９～１２の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号１４：配列番号９～１２の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号１５：発現ベクターを増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号１６：発現ベクターを増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号１７：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（野生型）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１８：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２６６Ｌ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１９：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８７Ｉ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２０：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２６６Ｌ、２８７Ｉ二重変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２１：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２６６Ｉ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２２：バークホルデリア・ユボネンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８７Ａ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２３：配列番号１７～２２の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号２４：配列番号１７～２２の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号２５：バークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（野生型）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２６：バークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８７Ｉ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２７：バークホルデリア・タイランデンシス由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８７Ａ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号２８：配列番号２５～２７の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号２９：配列番号２５～２７の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号３０：バークホルデリア・グルマエ由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（野生型）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号３１：バークホルデリア・グルマエ由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８６Ｉ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号３２：バークホルデリア・グルマエ由来リパーゼの分泌シグナルペプチドとＨｉｓタグとマチュアなリパーゼ（２８６Ａ変異）とシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号３３：配列番号３０～３２の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
配列番号３４：配列番号３０～３２の核酸を増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー
Claims (14)
- 配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するポリペプチドのコレステロールエステラーゼ活性を向上する方法であって、
配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸を、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸をイソロイシンに置換する工程を含む、方法。 - 前記アミノ酸配列が配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列であり、当該アミノ酸配列の２６６位のバリンに相当するアミノ酸をロイシンに置換する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
- 配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と９７％以上の同一性を有するポリペプチドであって、配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸が、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸がイソロイシンに置換されており、置換前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上しているポリペプチドを含む、リポタンパク質中のコレステロール又はそのエステルを測定するための試薬組成物。
- 前記アミノ酸配列が配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列であり、当該アミノ酸配列における２６６位のバリンに相当するアミノ酸が更にロイシンに置換されている、請求項３に記載の試薬組成物。
- 前記ポリペプチドが、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属又はパラバークホルデリア（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の細菌のポリペプチドに由来する、請求項３又は４に記載の試薬組成物。
- 前記配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するポリペプチドが、リパーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項３～５のいずれか一項に記載の試薬組成物。
- 前記リポタンパク質が、超高比重リポタンパク質、高比重リポタンパク質、低比重リポタンパク質、超低比重リポタンパク質、中間比重リポタンパク質、カイロミクロン、ｓｍａｌｌ－ＬＤＬ、βリポタンパク質、ｐｒｅ－リポタンパク質及びαリポタンパク質から成る群から選択される少なくとも１種のリポタンパク質である、請求項３～６のいずれか一項に記載の試薬組成物。
- 請求項３～７のいずれか一項に記載の試薬組成物を含む、キット。
- 請求項３～７のいずれか一項に記載の試薬組成物又は請求項８に記載のキットを用いてコレステロール又はそのエステルを測定する方法であって、
前記組成物又はキットに含まれるポリペプチドと、コレステロール又はそのエステルを含むか、又はその疑いのある被験試料とを接触させる工程を含む、方法。 - 配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と９７％以上の同一性を有するポリペプチドのコレステロールエステラーゼとしての使用であって、前記ポリペプチドが、配列番号１～３の場合には当該アミノ酸配列の２８７位のロイシンに相当するアミノ酸が、又は配列番号４の場合には当該アミノ酸配列の２８６位のロイシンに相当するアミノ酸がイソロイシンに置換されており、置換前のポリペプチドと比較してコレステロールエステラーゼ活性が向上している、使用。
- 前記アミノ酸配列が配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列であり、当該アミノ酸配列における２６６位のバリンに相当するアミノ酸が更にロイシンに置換されている、請求項１０に記載の使用。
- 前記ポリペプチドが、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属又はパラバークホルデリア（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の細菌のポリペプチドに由来する、請求項１０又は１１に記載の使用。
- 前記配列番号１～４のいずれかで示されるアミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するポリペプチドが、リパーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の使用。
- リポタンパク質中のコレステロール又はそのエステルを測定するための試薬組成物の製造における、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の使用。
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| Takeda, Y. et al.，"Purification, characterization, and molecular cloning of organic-solvent-tolerant cholesterol esterase from cyclohexane-tolerant Burkholderia cepacia strain ST-200"，Extremophiles，2006年，Vol. 10，pp. 269-277 |
| Tomic, S. et al.，"Stereoselectivity of Burkholderia cepacia lipase towards secondary alcohols: molecular modelling and 3D QSAR approach"，Tetrahedron: Asymmetry，2004年，Vol. 15，pp. 1163-1172 |
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