EA028490B1 - Эндогликозидаза из streptococcus pyogenes и способы с применением указанной эндогликозидазы - Google Patents

Abstract

Согласно изобретению предложена эндогликозидаза, обозначаемая EndoS49 и имеющая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. EndoS49 выделяли из штамма NZ131 Streptococcus pyogenes, она представляет собой гомолог EndoS. EndoS49 обладает специфичной эндогликозидазной активностью в отношении нативного IgG и расщепляет более широкий спектр гликанов Fc, чем EndoS. Получен ее мутант с заменой глутаминовой кислоты в положении 186 SEQ ID NO: 1; указанный мутант не обладает эндогликозидазной активностью, но способен связываться с IgG. Раскрыты способы с применением EndoS49, ее делеций и указанного мутанта особенно для оценки гликозилирования IgG или выделения IgG.

Description

Настоящее изобретение относится к новой эндогликозидазе, ее мутантам, характеризующимся отсутствием гликан-гидролизующей активности, и ее применению в способах гидролиза гликана гликопротеинов.

Предшествующий уровень техники

Эндогликозидаза δ (Εηάοδ) секретируется многими серотипами б1гср1ососси5 руодепез и обладает специфичной эндогликозидазной активностью по отношению к нативному 1дО (иммуноглобулин О) за счет гидролиза консервативных гликанов, присоединенных к остатку аспарагина 297 в тяжелых цепях 1дО, СоШп апб О1зсп, ТЬе ΕΜΒΟ 1оигпа1. 2001, 20 3046-3055. Εηάοδ представляет собой первый известный бактериальный фермент с уникальной специфичностью по отношению к нативному 1дО. В отличие от этого активности других известных эндогликозидаз требуют денатурации гликопротеинового субстрата или усиливаются ею.

Антитела, такие как 1дО, широко применяются в фундаментальных исследованиях, а также в диагностике и разработке лекарственных средств. В некоторых из этих приложений, таких как иммуногистохимия, иммунологический анализ, выявление опухолей, радиотерапия, кристаллографические исследования сайтов связывания антитела и иммунонацеливание, удобнее использовать РаЪ-фрагменты, чем целые молекулы 1дО. Некоторыми преимуществами использования РаЪ-фрагментов являются следующие: на них не будут оказывать влияние Рс-рецепторы на клетках, и они не прецититируют антигены, они демонстрируют сниженную иммуногенность и в меньшей степени подвергаются фагацитозу, радиомеченные РаЪ-фрагменты быстрее выводятся из ткани, чем целые молекулы 1дО. Для других применений желательно использовать Рс-фрагменты 1дО. В других применениях может быть желательным применять дегликозилированные варианты антител или других гликопротеинов.

Расщепление 1дО с образованием РаЪ- и Рс-фрагментов чаще всего осуществляется с использованием протеолитических ферментов, таких как пепсин или папаин. Данные ферменты часто расщепляют другие белки, поэтому реакцию расщепления обычно нужно проводить на очищенной фракции 1дО. Кроме того, пепсин и папаин, как правило, расщепляют 1дО в более чем одном месте. Это означает, что получаемые фрагменты часто не соответствуют целым РаЪ- или Рс-фрагментам, и даже если расщепление действительно дает к РаЪ- и Рс-фрагменты, они, как правило, чувствительны к дальнейшему расщеплению на меньшие фрагменты. Выделение Рс-фрагментов из РаЪ-фрагментов чаще всего проводят с использованием разделительных аффинных колонок с белком А или О, в которых используются Рссвязывающие свойства бактериальных белков А и О.

В терапевтических приложениях применяют многие разные гликопротеины. Способы анализа гликозилирования таких белков применяются в исследовании и разработке белков в качестве терапевтических средств. Обеспечение гликозилированных вариантов данных белков также может быть желательным.

Краткое описание изобретения

Авторы изобретения идентифицировали новую эндогликозидазу из серотипа М49 δΐΐΐρίο^^ιΐδ руодепез, обозначаемую в настоящей заявке Εηάοδ49. Εηάοδ49 была выделена из штамма ΝΖ131, нефритогенного и обладающего высокой способностью к трансформации штамма серотипа М49. Штамм ΝΖ131 представляет собой клинический изолят из случая острого постстрептококкового гломерулонефрита в Новой Зеландии. На уровне белка Εηάοδ49 характеризуется менее чем 40%-ной идентичностью с Εηάοδ и представляет собой белок массой 90 кДа, тогда как масса Εηάοδ составляет 108 кДа. Εηάοδ49 обладает дегликозилирующей активностью в отношении более широкого диапазона белков, чем Εηάοδ.

Этот фермент представляет собой фермент массой 90 кДа, содержащий каталитический домен гликозидгидролаз семейства 18. Εηάοδ49 гидролизует гликан на гликопротеинах человека и, в частности, на 1дО1_-4 и α-1-микроглобулине. Εηάοδ49 можно использовать для гидролиза гликанов на гликопротеинах человека, включая 1дО и α-1-микроглобулин. Таким образом, Εηάοδ49 можно использовать в анализе углеводного состава, в которых осуществляют контакт фермента с гликопротеином и разделяют продуцируемые продукты для анализа гликанов и белка. Εηάοδ49 можно также использовать для получения дегликозилированных белков. Данный фермент можно модифицировать для снижения или уничтожения эндогликозидазной активности.

Модифицированный полипептид Εηάοδ49, который не обладает эндогликозидазной активностью, может использоваться в способах выделения гликозилированного и/или функционально активного 1дО. Путем применения такого модифицированного полипептида Εηάοδ49 в комбинации с дополнительным 1дО-связывающим реагентом, который способен связывать денатурированный и/или дегликозилированный 1дО, авторы изобретения также разработали способ оценки статуса гликозилирования или функционального качества образца, содержащего 1дО.

Соответственно, согласно настоящему изобретению предложен полипептид, содержащий:

(а) аминокислотную последовательность δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1;

(б) ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 50% идентичностью с аминокислотной последовательностью δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 и обладающий эндогликозидазной активностью; или

- 1 028490 (в) фрагмент любой из указанных последовательностей, обладающий эндогликозидазной активностью.

Согласно изобретению также предложен полипептид, способный связываться с 1дС и не обладающий эндогликозидазной активностью, содержащий:

(а) аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0: 2;

(б) ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 50% идентичностью с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 1, в котором аминокислота, эквивалентная глутаминовой кислоте, замещена в положении 186; или (в) фрагмент любой из указанных последовательностей.

Согласно изобретению также предложены полинуклеотиды, экспрессионные векторы и клеткихозяева, кодирующие или экспрессирующие полипептиды согласно изобретению. Изобретение также относится к применению полипептидов согласно изобретению в способе определения или анализа статуса гликозилирования белка и, в частности, антитела, в частности антитела 1дС.

Согласно изобретению также предложен способ выделения 1дС из образца, содержащего 1дС, причем указанный способ включает:

(а) приведение в контакт указанного образца, содержащего 1дС, с модифицированным полипептидом Епбо849, который не обладает эндогликозидазной активностью в отношении 1дС;

(б) отделение указанного Епбо849 от образца, с которым его приводили в контакт, с получением выделенного 1дС.

Кроме того, предложен способ оценки статуса гликозилирования или функционального качества образца, содержащего 1дС, где способ включает взятие первой и второй частей образца, содержащего 1дС. и при этом стадии (а) и (б) согласно вышеупомянутому способу выполняют для первой части образца, и стадии (а) и (б) согласно вышесказанному выполняют для второй части образца, за тем исключением, что полипептид Епбо849 заменяют альтернативным 1дС-связывающим реагентом, который способен связывать денатурированный и/или дегликозилированный 1дС, и способ дополнительно включает:

(в) определение количества 1дС, связанного с полипептидом Епбо849, в первой части образца, и количества 1дС, связанного с альтернативным 1дС-связывающим реагентом во второй части образца; и (г) сравнение обоих количеств связанного 1дС, определенных в (в);

что обеспечивает оценку статуса гликозилирования или функционального качества образца, содержащего 1дС.

Модифицированный фермент согласно настоящему изобретению можно также применять в способах выделения РаЬ- или Рс-фрагментов 1дС. В способах согласно изобретению применяют высокоспецифичный фермент, расщепляющий 1дС, из 8.руодепе§, Ие8 (иммуноглобулин С-разрушающий фермент 8.руодепе§) и полипептид Епбо849.

В одном способе согласно изобретению образец, содержащий 1дС, приводят в контакт с Ие8 и полипептидом Епбо849, который представляет собой модифицированный полипептид Епбо849, не обладающий эндогликозидазной активностью, как описано выше.

В способах согласно изобретению обычно Ие8 расщепляет 1дС с образованием РаЬ- и Рсфрагментов, и полипептид Епбо849 связывается с Рс-фрагментами. Рс-фрагменты затем отделяют от РаЬфрагментов.

Данный способ особенно полезен для выделения РаЬ- или Рс-фрагментов из образцов, содержащих очищенный 1дС. Более конкретно он полезен для выделения РаЬ- или Рс-фрагментов из образца, содержащего 1дС, очищенный с использованием модифицированного полипептида Епбо849 согласно изобретению. Однако способ также может быть адаптирован для применения на образцах, содержащих неочищенный 1дС, таких как сыворотка, клеточный лизат или среда клеточной культуры.

Также предложены наборы для осуществления способов согласно изобретению.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1. Выравнивание Епбо849 и Епбо8 с использованием С1и51а1\У выявляет два разных белка. Епбо849 и Епбо8 выравнивали, используя С1ик1а1Ю в программе МасУесГОг. Каталитический мотив СН18 (П**П*П*Е) находится в положении 179-186 с С1и186 в качестве каталитического остатка.

Фиг. 2. Епбо849 обладает активностью по отношению к гликопротеинам.

A. 1 мкг Епбо849, его каталитического мутанта и укороченных вариантов инкубировали с 3 мкг человеческого 1дС в ФБР (фосфатно-солевой буферный раствор) в течение ночи при 37°С и анализировали на геле 8И8-РАСЕ (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и путем блоттинга с лектином ЬСА.

Б. 1 мкг Епбо849 и Епбо849 (Е186Б) инкубировали с 3 мкг человеческого 1дС подклассов 1-4 и исследовали, как описано выше.

B. 1 мкг Епбо849 и его мутантов инкубировали с 3 мкг α-1-микроглобулина и исследовали на 10% геле 8И8-РАСЕ.

Фиг. 3. Епбо849 связывается с 1дС. 4, 2 и 1 мкг Епбо849 и его мутантов иммобилизировали на РУЭР (поливинилиденфторидной) мембране и инкубировали с человеческим 1дС и позже с белком С, связанным с пероксидазой хрена (НРР).

- 2 028490

Фиг. 4. Геномный контекст ηάοδ49 и ηάοδ. Сравнение генов, окружающих и6о49 и ηάοδ в штаммах ΝΖ131 (М49) и 5005 (М1) ΟΆδ, проводили в МасУесЮг.

Фиг. 5. Филогенетический анализ Εηάοδ49 и других бактериальных эндогликозидаз.

Фиг. 6. Гель δΌδ-ΡΑΟΕ с авастином и эрбитуксом после расщепления под действием Εηάοδ или Εηάοδ49 с последующим расщеплением под действием Ιώ;δ.

Краткое описание последовательностей δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 представляет собой аминокислотную последовательность полипептида Εηάοδ49, выделенного из δ. ργο^^δ М49 серотипа ΝΖ131.

δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2 представляет собой аминокислотную последовательность модифицированного полипептида Εηάοδ49 (Ε186Ό), происходящую из последовательности δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1.

δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид Εηάοδ49.

δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 4 представляет собой аминокислотную последовательность Ιώ;δ. выделенной из δ. руο^^δ ΑΡ1.

Подробное описание изобретения

Основные свойства полипептидов.

Настоящее изобретение относится к новому полипептиду Εηάοδ49. Согласно изобретению также предложены различные способы, в которых применяются бактериальные белки Εηάοδ49 и Ι®δ. а также другие белки. В настоящей заявке термины белок, пептид и полипептид используются взаимозаменяемо. Предполагается, что для определенных полипептидов и способов согласно изобретению требуется полипептид Εηάοδ49, обладающий эндогликозидазной активностью, тогда как для других полипептидов и способов согласно изобретению требуется модифицированный полипептид Εηάοδ49, не обладающий указанной активностью.

Следующий далее раздел относится к основным свойствам всех полипептидов согласно изобретению и, в частности, к вариантам, изменениям, модификациям или дериватизации аминокислотной последовательности, которые включены в полипептиды согласно изобретению. Предполагается, что такие варианты, изменения, модификации или дериватизация, описанные здесь, подчиняются требованию того, что полипептиды сохраняют любую дополнительно требующуюся активность или характеристику, которые могут быть определены в следующих разделах данного описания.

Варианты полипептидов согласно изобретению могут быть определены по конкретным уровням аминокислотной идентичности, которые более подробно описаны в следующих разделах данного описания. Аминокислотная идентичность может быть рассчитана с использованием подходящего алгоритма. Например, алгоритмы РГЕБИР и ΒΕΑδΤ могут быть использованы для расчета гомологии или выравнивания последовательностей (как, например, установление эквивалентных или соответствующих последовательностей (как правило, с использованием установок по умолчанию), например, как описано в Αίΐδθιιι1 δ.Ρ. (1993) 1. Μο1. Ενο1. 36:290-300; А1йеЬи1, δ.Ρ. е1 а1. (1990) 1. Μο1. ΒίοΙ. 215:403-10. Программа для выполнения анализов ΒΕΑδΤ общедоступна через Национальный центр биотехнологической информации (1ιΠρ://\γ\γ\γ.ικΕί.η1ιη.ηί1ι.8ον/). Данный алгоритм, во-первых, включает установление пары последовательностей с максимальным сходством (ΗδΡ) путем установления коротких слов длиной в запрашиваемой последовательности, которые либо соответствуют, либо удовлетворяют некоторой положительной пороговой оценке Т при выравнивании со словом такой же длины в последовательности базы данных. Т называют пороговым значением оценки близости к слову (А11зсЬи1 е1 а1., выше). Эти исходные попадания близости к слову действуют в качестве затравок для инициации поисков ΗδΡ, содержащих их. Слова-попадания расширяют в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока увеличивает кумулятивная оценка выравнивания. Продления слов-попаданий в каждом направлении прекращают, когда кумулятивная оценка выравнивания уменьшается на величину X относительно своего максимального достигнутого значения; кумулятивная оценка падает до нуля или ниже в связи с накоплением одного или большего числа отрицательных остаточных выравниваний или достигается конец любой последовательности. Параметры Т и X алгоритма ΒΕΑδΤ определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе ΒΕΑδΤ по умолчанию используется длина слова (^), равная 11, матрица замен ΒΕΟδΌΜ62 (см. НемИюТ ηηά НенИюТ (1992) Ргос. Ναΐ1. Αсаά. δα. υδΑ 89: 10915-10919), число выравниваний (В), равное 50, ожидаемая величина (Е), равная 10, М=5, Ν=4 и сравнение обеих нитей.

Алгоритм ΒΕΑδΤ выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями; см., например, Кат1ш аЫ Α1ΐδθιιι1 (1993) Ргос. Ν;·ιΐ1. Αсаά. δ^. υδΑ 90: 5873-5787. Одной мерой сходства, обеспечиваемой алгоритмом ΒΕΑδΤ, является наименьшая суммарная вероятность (Ρ(Ν)), которая дает показатель вероятности, с которой могло бы произойти случайное совпадение между двумя полинуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, последовательность считают сходной с другой последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении первой последовательности со второй последовательностью меньше примерно 1, предпочтительно меньше примерно 0,1, более предпочтительно меньше примерно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше примерно 0,001. В качестве альтернативы пакет программного обеспечения ШУОСО реализует программу ΒΕδΤΡΙΤ, ко- 3 028490 торая может быть использована для расчета гомологии (например, использована в режиме ее установок по умолчанию) (Эеуегеих е! а1. (1984) Хнскзс Аск1з Кезеагей 12, 387-395).

Ясно, что варианты полипептидов согласно изобретению также включают варианты с заменами. Варианты с заменами предпочтительно включают замену одной или более аминокислот тем же числом аминокислот и осуществление консервативных аминокислотных замен. Например, аминокислота может быть заменена альтернативной аминокислотой, имеющей аналогичные свойства, например другой основной аминокислотой, другой кислой аминокислотой, другой нейтральной аминокислотой, другой заряженной аминокислотой, другой гидрофильной аминокислотой, другой гидрофобной аминокислотой, другой полярной аминокислотой, другой ароматической аминокислотой или другой алифатической аминокислотой. Некоторые свойства 20 главных аминокислот, которые можно использовать для выбора подходящих заместителей, выглядят следующим образом: _

А1а	алифатическая, гидрофобная, нейтральная	Μεΐ	гидрофобная, нейтральная
Суз	полярная, гидрофобная, нейтральная	Азп	полярная, гидрофильная, нейтральная
Азр	полярная, гидрофильная, заряженная (-)	Рго	гидрофобная, нейтральная
Сг1и	полярная, гидрофильная, заряженная (-)	СНп	полярная, гидрофильная, нейтральная
Рйе	ароматическая, гидрофобная, нейтральная	Агд	полярная, гидрофильная, заряженная (+)
О1у	алифатическая, нейтральная	8ег	полярная, гидрофильная, нейтральная
ΗΪ3	ароматическая, полярная, гидрофильная, заряженная (+)	Тйг	полярная, гидрофильная, нейтральная
Не	алифатическая, гидрофобная, нейтральная	Уа1	алифатическая, гидрофобная, нейтральная
Ьуз	полярная, гидрофильная, заряженная (+)	Тгр	ароматическая, гидрофобная, нейтральная
Ьеи	алифатическая, гидрофобная, нейтральная	Туг	ароматическая, полярная, гидрофобная

Полипептиды согласно изобретению и для применения в изобретении могут находиться по существу в выделенной (изолированной) форме. Ясно, что полипептид может быть смешан с носителями или разбавителями, которые не препятствуют реализации предполагаемого назначения полипептида, и он все же будет считаться по существу изолированным. Полипептид для применения в изобретении может быть также представлен по существу в очищенной форме, и в этом случае обычно он будет содержать полипептид в препарате, в котором больше чем 50%, например больше чем 80, 90, 95 или 99 мас.% полипептида в препарате представляет собой полипептид согласно изобретению.

Аминокислотная последовательность полипептидов согласно изобретению и для применения в изобретении может быть модифицирована для включения аминокислот, не встречающихся в природе, или увеличения стабильности соединения. Если полипептиды получают синтетическими способами, такие аминокислоты можно вводить во время получения. Полипептиды можно также после получения синтетическим либо рекомбинантным путем.

Полипептиды согласно изобретению или для применения в изобретении также можно получать с использованием Ό-аминокислот. В таких случаях аминокислоты будут связаны в обратной последовательности в ориентации от С к N. Это обычная практика при получении таких полипептидов.

В технике известен целый ряд модификаций боковых цепей, и они могут быть осуществлены для боковых цепей полипептидов, при условии сохранения у полипептидов любой дополнительной требующейся активности или характеристики, которые могут быть указаны в настоящей заявке.

Также станет понятно, что полипептиды согласно изобретению и применяемые в изобретении могут быть химически модифицированы, например модифицированы посттрансляционно. Например, они могут быть гликозилированы, фосфорилированы или могут содержать модифицированные аминокислотные остатки. Они могут быть модифицированы путем добавления сигнальной последовательности для

- 4 028490 облегчения встраивания в клеточную мембрану.

Полипептиды согласно изобретению также можно дериватизировать или модифицировать для облегчения их выделения или очистки. Таким образом, в одном варианте реализации изобретения полипептид для применения в изобретении дериватизируют или модифицируют путем добавления лиганда, который способен связываться прямо и специфично со средством разделения. В качестве альтернативы полипептид дериватизируют или модифицируют путем добавления одного члена связывающейся пары, и средство разделения содержит реагент, который дериватизирован или модифицирован путем добавления другого члена связывающейся пары. Можно использовать любую подходящую связывающуюся пару. В предпочтительном варианте реализации, где полипептид для применения в изобретении дериватизируют или модифицируют путем добавления одного члена связывающейся пары, полипептид предпочтительно мечен гистидином или мечен биотином. Как правило, кодирующую последовательность аминокислоты гистидиновой или биотиновой метки встраивают на уровне гена, и белки экспрессируют текомбинантным способом в Е. сой. Гистидиновая или биотиновая метка, обычно находится на одном конце полипептида, либо на Ν-конце, либо на С-конце. Гистидиновая метка обычно состоит из шести остатков гистидина, хотя она может быть длиннее, чем шесть остатков гистидина, обычно вплоть до 7, 8, 9, 10 или 20 аминокислот или короче, например иметь в длину 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту. Кроме того, гистидиновая метка может содержать одну или большее число аминокислотных замен, предпочтительно консервативных замен, определенных выше.

Полипептиды Εηάοδ49, обладающие эндогликозидазной активностью.

Полипептид Εηάοδ49 в данном примере представляет собой предпочтительно Εηάοδ49 §.руодепе8, или вариант или фрагмент Εηάοδ49 δ. руодепек, который сохраняет эндогликозидазную активность. Вариант может представлять собой полипептид Εηάοδ49 из другого δύΌρΐο^^πδ есцц, δϋΐρΐο^^πδ /ооерШеш1сик или предпочтительно δΟΌΐΓίο^^ιικ руодегек.

Полипептид Εηάοδ49 может содержать:

(a) аминокислотную последовательность δΕΟ ГО N0: 1;

(b) ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 50% идентичностью с аминокислотной последовательностью δΕΟ ГО N0: 1 и обладающий эндогликозидазной активностью; или (c) фрагмент любой из указанных последовательностей, обладающий эндогликозидазной активностью.

В предпочтительном варианте полипептид содержит последовательность δΕΟ ГО N0: 1 или состоит из нее. δΕΟ ΙΌ N0: 1 представляет собой последовательность Εηάοδ49 из δ. руодеиек. Полипептид Εηάοδ49 согласно изобретению может дополнительно не содержать сигнальной последовательности.

Варианты полипептидов, описанные в данном разделе, представляют собой варианты полипептидов, для которых аминокислотная последовательность отличается от последовательности в δΕΟ ГО N0: 1, но которые сохраняют эндогликозидазную активность Εηάοδ49. Такие варианты могут включать аллельные варианты и делецию, модификацию или добавление единичных аминокислот или групп аминокислот в последовательности белка при условии, что пептид сохраняет эндогликозидазную активность в отношении 1дС.

Варианты последовательностей обычно отличаются по меньшей мере 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 100 или большим числом мутаций (которые могут представлять собой замены, делеции или вставки аминокислот). Например, может быть сделано от 1 до 100, от 2 до 50, от 3 до 30 или от 5 до 20 замен, делеций или вставок аминокислот при условии, что модифицированный полипептид сохраняет активность в качестве 1дС-специфичной эндогликозидазы.

Варианты аминокислотной последовательности δΕΟ ГО N0: 1 предпочтительно содержат остатки с 179 по 186 δΕΟ ΙΌ N0: 1, и, в частности, включают мотив ο**ο*ο*Ε.

Данные аминокислоты составляют каталитический домен гликозидгидролаз семейства 18. Глутаминовая кислота в положении 186 необходима для ферментативной активности. Поэтому наиболее предпочтительно вариант δΕΟ ГО N0: 1 содержит глутаминовую кислоту в положении, эквивалентном положению 186 δΕΟ ΙΌ N0: 1. Вариант δΕΟ ΙΌ N0: 1 может содержать остатки с 179 по 186 δΕΟ ΙΌ N0: 1, содержащие одну или более консервативных замен, при условии, что данный вариант содержит глутаминовую кислоту в положении, эквивалентном положению 186 δΕΟ ГО N0: 1.

Обычно полипептиды, которые демонстрируют эндогликозидазную активность Εηάοδ49, характеризующиеся более чем примерно 50, 55 или 65% идентичностью, предпочтительно по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% и особенно предпочтительно по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 99% идентичностью, с аминокислотной последовательностью δΕΟ ГО N0: 1, считают вариантами белка. Идентичность вариантов δΕΟ ГО N0: 1 может быть измерена на участке по меньшей мере из 100, по меньшей мере 250, по меньшей мере 500, по меньшей мере 750, по меньшей мере 800, по меньшей мере 810, по меньшей мере 820, по меньшей мере 930, по меньшей мере 940 или более соседних аминокислот последовательности, показанной в δΕΟ ГО N0: 1, или более предпочтительно на всей длине δΕΟ ГО N0: 1.

Фрагмент полипептида Εηάοδ49, применяемый в изобретении, обычно имеет длину по меньшей мере 400, 500, 600, 700, 750, 800 или 850 аминокислот при условии, что он сохраняет эндогликозидазную

- 5 028490 активность Εηάοδ в отношении 1§С. В предпочтительном варианте фрагмент полипептида Εηάοδ49, используемый в изобретении, охватывает остатки от 179 до 186 δΕφ ГО N0: 1.

Полипептиды для применения в настоящем изобретении могут быть выделены из любого подходящего организма, который экспрессирует полипептид Εηάοδ49 или вариант полипептида Εηάοδ49. Как правило, полипептид Εηάοδ49 выделяют из подходящих штаммов δίΓορΙοεοεειίδ. экспрессирующих Εηάοδ49, предпочтительно штаммов δ.ργο^βηβδ, и, в частности, штаммов δ.ργο^βηβδ серотипа М49.

Выделение и очистку Εηάοδ49 из экспрессирующей культуры δ.ργο^βηβδ или из культур других клеток, экспрессирующих Εηάοδ49, обычно осуществляют на основе эндогликозидазной активности. В предпочтительном варианте способ очистки включает стадию осаждения сульфатом аммония и стадию ионообменной хроматографии. Согласно одному способу культуральную среду фракционируют добавлением возрастающего количества сульфата аммония. Количества сульфата аммония могут составлять 10-80%. В предпочтительном варианте культуральную среду фракционируют 50% сульфатом аммония, и образующийся супернатант дополнительно осаждают 70% сульфатом аммония. Выпавшие в осадок полипептиды затем можно подвергать ионнобменной хроматографии, например, с помощью РРЬС (жидкостная экспресс-хроматография белков) на колонке Μοηο ф. Элюированные фракции можно исследовать на эндогликозидазную активность и можно объединять фракции с максимальной активностью. Фракции можно исследовать методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (δΌδ ΡΑΟΕ, δΌδ-ПААГ). Фракции можно хранить при -80°С.

Полипептиды для применения в изобретении могут быть также получены в виде фрагментов таких выделенных полипептидов. Дополнительно полипептиды Εηάοδ49 могут быть также получены синтетическим путем или с использованием методов генной инженерии. Например, рекомбинантный полипептид Εηάοδ49 может быть получен путем трансфицирования клеток млекопитающих в культуре экспрессионным вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, функционально связанный с подходящими контрольными последовательностями, культивирования клеток, экстрагирования и очистки полипептида Εηάοδ49, продуцируемого данными клетками.

Полипептиды Εηάοδ49 согласно изобретению, описанные в данном разделе, демонстрируют эндогликозидазную активность. В предпочтительном варианте полипептид гидролизует 1§С или Рс-фрагменты 1дС за счет гидролиза гликана, связанного с полноразмерным полипептидом тяжелой цепи 1§С. В предпочтительном варианте полипептид Εηάοδ49 согласно изобретению также обладает эндогликозидазной активностью и способен гидролизовать гликан α-1-микроглобулина.

Эндогликозидазная активность может быть определена в подходящем анализе. Например, исследуемый полипептид можно инкубировать с гликопротеином, таким как 1§С или α-1-микроглобулин, при подходящей температуре, такой как 37°С. Исходные вещества и продукты реакции затем могут быть исследованы с использованием электрофореза в δΌδ-ПААГ. Как правило, молекулярная масса тяжелой цепи 1§С уменьшается приблизительно на 3-4 кДа, если тестируемый полипептид обладает эндогликозидазной активностью в отношении 1§С. Другой анализ для определения того, обладает ли тестируемый полипептид эндогликозидазной активностью в отношении 1§С, заключается в определении гликозилированного 1§С с использованием агглютинина лектина Ьсн5 сиПнап5 (ЬСА), возможно с использованием пероксидазы хрена и субстрата пероксидазы. Как правило, углеводный сигнал снижается, если тестируемый полипептид обладает эндогликозидазной активностью в отношении 1§С. Другой анализ для определения того, обладает ли тестируемый полипептид эндогликозидазной активностью в отношении 1§С, заключается в инкубации тестируемого полипептида с очищенными Рс-фрагментами 1§С с последующим восстановлением образца 10 мМ дитиотреитолом и масс-спектроскопическим анализом (ΜΑΌΌΙТ0Р). Эндогликозидазная активность также может быть измерена для полипептидов Εηάοδ49 с использованием в анализах, упомянутых выше, α-1-микроглобулина вместо 1§С.

Эндогликозидазная активность полипептидов может быть дополнительно охарактеризована путем исследований ингибирования.

Полипептид Εηάοδ49 способен гидролизовать молекулы гликопротеинов, присутствующие в образце, взятом у субъекта. Таким образом, в случае, когда субъектом является человек, полипептид Εηάοδ49 способен гидролизовать гликаны в гликопротеинах субъекта, как, например, на тяжелых цепях человеческого 1§С или α-1-микроглобулина. Εηάοδ49 способен гидролизовать человеческий 1§С всех четырех подклассов (Ι§Οι_-4). В предпочтительных вариантах реализации полипептид Εηάοδ49 обладает способностью гидролизовать человеческий 1§С и α-1-микроглобулин.

Полипептиды Εηάοδ49, которые не обладают эндогликозидазной активностью.

Полипептид Εηάοδ49 в данном примере может быть также модифицированным Εηάοδ49 δ.ργ^βηβδ, который модифицирован таким образом, что не имеет эндоглигозидазной активности, но который обладает активностью связывания 1§С. Такой модифицированный Εηάοδ49, в частности, полезен в способах, описанных в настоящей заявке. Под активностью связывания 1§С подразумевается, что модифицированный Εηάοδ49 связывается с 1§С или его вариантом или фрагментом, в частности с его Рс-фрагментом, который в нормальных условиях гликозилирован. Под фразой в нормальных условиях гликозилирован подразумевается, что молекула 1§С или его варианта, или фрагмента представляет собой гликопротеин,

- 6 028490 содержащий по меньшей мере тяжелую цепь полипептида 1дО (или его варианта, или фрагмента), связанную по меньшей мере с одной углеводной группой, которая связана с встречающимися в природе молекулами 1§О. В частности, по меньшей мере одна углеводная группа представляет собой гликан, связанный с аспарагиновым остатком, соответствующим остатку 297 полноразмерного полипептида тяжелой цепи 1§О.

Полипептид Εηάοδ49 предпочтительно модифицируют путем сайт-направленного мутагенеза. Под активностью связывания 1§С подразумевается, что полипептиды Εηάοδ49, описанные в данном разделе, связываются по меньшей мере с одним, предпочтительно двумя, тремя или всеми четырьмя из подклассов 1дС. Ι§Οι-4.

Предпочтительно по меньшей мере один подкласс 1дС связан с высокой аффинностью и/или высокой специфичностью.

Под фразой высокая аффинность подразумевается, что константа аффинности связывания (К_с) для взаимодействия модифицированного Εηάοδ49 с подклассом 1§С выше 0,05 мкМ, предпочтительно выше 0,06, 0,07 или 0,08 мкМ. Активность связывания может быть определена, и аффинность связывания можно оценивать любыми подходящими способами. Например, путем анализа методом взаимодействия поверхностным плазмонным резонансом, анализа методом равновесного диализа или стандартными биохимическими методами в сочетании, например, с анализом Скэтчарда.

Вариант может быть получен полипептида Εηάοδ49 из другого организма, такого как другая бактерия, как описано в предыдущем разделе, за тем исключением, что вариант в данном примере не обладает эндогликозидазной активностью, но обладает активностью связывания с 1дС. Модифицированный полипептид Εηάοδ49 может содержать:

(а) аминокислотную последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 2;

(б) ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 50% идентичностью с аминокислотной последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 2, который не обладает эндогликозидазной активностью; или (в) фрагмент любой из указанных последовательностей их них, который не обладает эндогликозидазной активностью.

В предпочтительном варианте полипептид содержит последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 2 или состоит из нее. δΕΟ ΙΌ N0: 2 является производным последовательности δΕΟ ΙΌ N0: 1, но модифицирована таким образом, что не обладает эндогликозидазной активностью, путем замены глутаминовой кислоты (Е) на лейцин (Ь) в положении 186 δΕΟ ΙΌ N0: 1. Такие полипептиды обычно обладают активностью связывания Ι§0, как описано выше.

Варианты полипептидов, описанные выше в данном разделе, представляют собой варианты полипептидов, для которых аминокислотная последовательность отличается от аминокислотной последовательности в δΕΟ ΙΌ N0: 2, но которые не обладают эндогликозидазной активностью и сохраняют активность связывания Ι§0. Такие варианты могут включать аллельные варианты и делецию, модификацию или добавление единичных аминокислот или групп аминокислот в белковой последовательности, при условии, что пептид сохраняет вышеуказанные характеристики.

Варианты последовательностей, обычно отличаются по меньшей мере 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 100 или более мутациями (которые могут представлять собой замены, делеции или вставки аминокислот). Например, можно сделать от 1 до 100, от 2 до 50, от 3 до 30 или от 5 до 20 аминокислотных замен, делеций или вставок при условии, что модифицированный полипептид не обладает эндогликозидазной активностью и сохраняет активность связывания Ι§0.

Как правило, полипептиды, которые не обладают эндогликозидазной активностью и сохраняют активность связывания Ι§0, характеризующиеся более чем примерно 50, 55 или 65% идентичностью, предпочтительно по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% и особенно предпочтительно по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 99% идентичностью с аминокислотной последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 2, считаются вариантами белка. Идентичность вариантов δΕΟ ΙΌ N0: 2 может быть измерена на участке, составляющем по меньшей мере 100, по меньшей мере 250, по меньшей мере 500, по меньшей мере 750, по меньшей мере 800, по меньшей мере 820, по меньшей мере 830 или более соседних аминокислот последовательности, показанной в δΕΟ ΙΌ N0: 2, или более предпочтительно по всей длине δΕΟ ΙΌ N0: 2.

Фрагмент полипептида Εηάοδ49, применяемый в изобретении, обычно имеет длину по меньшей мере 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800 или 830 аминокислот при условии, что он не обладает эндогликозидазной активностью и сохраняет активность связывания Ι§0.

В альтернативном способе белок Εηάοδ49 с желательными характеристиками может быть получен путем изменения нуклеотида, кодирующего белок Εηάοδ49, с последующей экспрессией указанного нуклеотида в подходящей системе. Подходящие способы включают сайт-направленный мутагенез нуклеотида, кодирующего белок. Данную методику широко применяют в исследовании функций белка. Методика обычно основана на олигонуклеотиде и включает следующие стадии:

(1) клонирование ДНК, кодирующей интересующий белок в плазмидный вектор;

(2) денатурирование плазмидной ДНК с образованием одиночных нитей;

(3) приведение денатурированной ДНК в контакт с синтетическим олигонуклеотидом (или олиго- 7 028490 нуклеотидами), комплементарным последовательности-мишени, но содержащими желательную(ные) мутацию(ции) (точечная мутация, делеция или вставка), в результате чего синтетический олигонуклеотид комплементарно присоединяется к целевой области;

(4) удлинение мутированной нити с помощью ДНК-полимеразы с использованием в качестве матрицы нити плазмидной ДНК;

(5) размножение гетеродуплекса (мутированной/немутированной нити) с помощью трансформации в Е. сой.

После размножения примерно 50% продуцированных гетеродуплексов являются мутантами, а другие 50% представляют собой дикий тип (без мутации). Для повышения выхода мутантов применяют методы селекции и обогащения. Например, родительскую немутированную нить можно расщеплять рестриктазой, которая расщепляет только метилированную ДНК (ΌρηΙ). Это позволяет удалять родительскую нить из реакции перед трансформацией Е. сой, так как вновь синтезированные нити являются неметилированными, в то время как родительская нить (при очистке из правильного генотипа Е. со11) метилирована.

Альтернативные варианты сайт-направленного мутагенеза включают:

(1) методы на основе полимеразной цепной реакции (ПНР) с использованием специфичных мутагенных праймеров или ПНР пониженной точности с последующим скринингом желательных мутаций или потери/приобретения функции белка;

(2) введение плазмиды, несущей целевой ген, в штамм-мутатор Е. сой (дефектный по системам коррекции ДНК) и последующий скрининг желательных мутаций или потери/приобретения функции белка;

(3) химический синтез неполных или целых генов, содержащих желательные мутации, и последующее введение в соответствующую систему экспрессии белка.

В качестве альтернативы белок Епйо849 с желательными характеристиками может быть получен с использованием ДНК-независимых методов, которые включают химический синтез частей полипептида с желательной мутацией.

Полипептиды для применения в изобретении можно также получать в виде фрагментов таких выделенных полипептидов. Дополнительно полипептиды Епйо849 могут быть получены синтетическим путем или с использованием методов генной инженерии. Например, рекомбинантный полипептид Епйо849 может быть получен путем трансфицирования клеток млекопитающих в культуре экспрессионным вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, функционально связанный с подходящими контрольными последовательностями, культивирования клеток, экстрагирования и очистки полипептида Епйо849, продуцируемого данными клетками.

Полипептид Епйо849 способен связываться с молекулами 1§С, находящимися в образце, вызятом у субъекта. Таким образом, в случае, когда субъектом является человек, полипептид Епйо849 способен связываться с человеческим 1§С. Епйо849 способен связываться с человеческим 1§С всех четырех подклассов (Ι§0_1-4).

Полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева.

Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим вышеупомянутые полипептиды, и их применению в медицине. В частности, изобретение относится к полинуклеотидам, содержащим или состоящим из (а) кодирующей последовательности §ЕЦ ГО N0: 3 или последовательности, комплементарной ей; (б) последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностями, определенными в (а); (в) последовательности, которая является вырожденной в силу свойств гететического кода относительно последовательности, определенной в (а) или (б); (г) последовательности, имеющей по меньшей мере 60%-ную идентичность с последовательностями, определенными в (а), (б) или (в); и (д) фрагментов вышеупомянутых последовательностей.

Как правило, полинуклеотид представляет собой ДНК. Однако изобретение может включать полинуклеотиды РНК. Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут включать в себя синтетические или модифицированные нуклеотиды.

Полинуклеотид согласно изобретению может гибридизоваться с кодирующей последовательностью или комплементаной последовательностью кодирующей последовательности §ЕЦ ГО N0: 3 на уровне, значительно превышающем фоновый уровень. Фоновая гибридизация может встречаться, например, изза других ДНК, присутствующих в библиотеке ДНК. Уровень сигнала, генерируемого в результате взаимодействия между полинуклеотидом согласно изобретению и кодирующей последовательностью или последовательностью, комплементарной кодирующей последовательности §ЕЦ ГО N0: 3, обычно является по меньшей мере в 10 раз, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз более интенсивным, чем при взаимодействиях между другими полинуклеотидами и кодирующей последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3. Интенсивность взаимодействия можно измерять, например, с помощью зонда, меченного радиоактивным изотопом, например ³²Р. Селективная гибридизация обычно может быть достигнута при использовании условий среды повышенной жесткости. Однако такую гибридизацию можно проводить в любых подходящих условиях, известных в технике (см. §атЬгоок с1 а1., 1989). Например, если требуется высокая жесткость, подходящие условия включают от 0,1 до 0,2х§§С (раствор цитрата и хлорида натрия) при от 60

- 8 028490 вплоть до 65°С. Если требуется пониженная жесткость, подходящие условия включают 2х88С при 60°С.

Кодирующая последовательность ЗЕО ГО N0: 3 может быть модифицирована путем замен нуклеотидов, например, от 1, 2 или 3 до 10, 25, 50 или 100 замен.

Полинуклеотид ЗЕО ГО N0:3 в качестве альтернативы или дополнительно может быть модифицирован одной или большим числом вставок и/или делеций и/или удлинением любого из двух концов или обоих концов. Могут быть также включены дополнительные последовательности, такие как сигнальные последовательности. Модифицированный полинуклеотид обычно кодирует полипептид, который обладает эндогликозидазной активностью. В альтернативном варианте полинуклеотид кодирует область эпитопа полипептида ЕпбоЗ49. Могут быть сделаны вырожденные замены и/или могут быть сделаны замены, которые могли бы приводить к консервативной аминокислотной замене при трансляции модифицированной последовательности, например, как показано выше в таблице.

Нуклеотидная последовательность, которая способна селективно гибридизоваться с последовательностью, комплементарной кодирующей ДНК последовательности ЗЕО ГО N0: 3, обычно будет характеризоваться по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с кодирующей последовательностью ЗЕО ГО N0: 3 на участке по меньшей мере из 20, предпочтительно по меньшей мере 30, например, по меньшей мере 40, по меньшей мере 60, более предпочтительно по меньшей мере 100 смежных нуклеотидов или наиболее предпочтительно по всей длине ЗЕО ГО N0: 3. Способы расчета идентичности последовательности или сходства более подробно обсуждаются выше в связи с полипептидами согласно изобретению.

Любая комбинация упомянутых выше степеней идентичности последовательности и минимальные размеры могут быть использованы для определения полинуклеотидов согласно изобретению, причем более узкие комбинации (например, более высокая степень идентичности последовательности на более длинных участках) являются предпочтительными. Таким образом, например, полинуклеотид, который характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью последовательности в пределах 25, предпочтительно в пределах 30 нуклеотидов, составляет один аспект изобретения, как и полинуклеотид, который характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности в пределах 40 нуклеотидов.

Полинуклеотидные фрагменты, такие как полинуклеотидные фрагменты, подходящие для применения в качестве зондов или праймеров, будут предпочтительно иметь по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15 или по меньшей мере 20, например по меньшей мере 25, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 40 нуклеотидов в длину. Они обычно будут иметь вплоть до 40, 50, 60, 70, 100 или 150 нуклеотидов в длину. Зонды и фрагменты могут быть длиннее чем 150 нуклеотидов в длину, например вплоть до 200, 300, 400, 500, 600, 700 нуклеотидов в длину или даже вплоть до нескольких нуклеотидов, как, например, пяти или десяти нуклеотидов за исключением кодирующей последовательности ЗЕО ГО N0: 3.

Полипептиды согласно изобретению могут быть получены с использованием методов генной инженерии, синтетическими методами или с использованием любых методов, доступных специалистам в технике. Их можно также клонировать с использованием стандартных методик. Полипептиды, обычно представлены в выделенной и/или очищенной форме.

Обычно праймеры получают синтетическими способами, включая пошаговое изготовление желательной последовательности нуклеиновой кислоты путем добавления по одному нуклеотиду за один прием. Методики реализации этого с использованием автоматизированных методик легко доступны в технике.

Более длинные полинуклеотиды обычно будут получать с использованием методов генной инженерии, например с использованием методик клонирования на основе ПЦР (полимеразная цепная реакция). Данные методики будут включать создание пары праймеров (например, примерно из 15-30 нуклеотидов) для области гена пбоЗ49, которую желательно клонировать, приведение праймеров в контакт с ДНК, полученной из бактериальной клетки, проведение полимеразной цепной реакции в условиях, которые приводят к амплификации желательной области, выделение амплифицированного фрагмента (например, путем очистки реакционной смеси на агарозном геле) и выделение амплифицированной ДНК. Праймеры могут быть сконструированы (модифицированы) так, чтобы они содержали подходящие сайты распознавания для рестрикционых ферментов, чтобы амплифицированную ДНК можно было клонировать в подходящий вектор для клонирования.

Несмотря на то, что, в общем, методики, упоминаемые в настоящей заявке, хорошо известны в технике, можно включить ссылку, в частности, на ЗатЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошп§: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 1989.

Полинуклеотиды согласно изобретению имеют практическую ценность при получении полипептидов согласно изобретению, которое осуществляют ίη уйго. Полинуклеотиды согласно изобретению можно применять в качестве праймера, например праймера ПЦР, праймера для альтернативной реакции амплификации, зонда, например, меченного детектируемой меткой, с использованием общепринятых методов с использованием радиоактивных или нерадиоактивных меток, или полинуклеотиды могут быть клонированы в векторы.

- 9 028490

Полипептиды или праймеры согласно изобретению могут нести детектируемую метку. Подходящие метки включают радиоизотопы, такие как ³²Р или ³⁵8, ферментные метки или другие белковые метки, такие как биотин. Такие метки можно добавлять к полинуклеотидам или праймерам согласно изобретению и можно детектировать с использованием методик, известных рег 8е.

Полинуклеотиды или праймеры согласно изобретению или их фрагменты, меченые или немеченые, могут использоваться специалистом в технике в тестах на основе нуклеиновых кислот для детектирования или секвенирования ηάο849 в образце.

Такие тесты для детектирования обычно включают приведение образца, содержащего ДНК или РНК, в контакт с зондом, содержащим полинуклеотид или праймер согласно изобретению, в условиях гибридизации, и детектирование какого-либо дуплекса, образованного между зондом и нуклеиновой кислотой в образце. Такая детекция может быть осуществлена с использованием методик, таких как ПЦР, или путем иммобилизации зонда на твердой подложке, удаления нуклеиновой кислоты в образце, которая не гибридизуется с зондом, и затем детектирования нуклеиновой кислоты, которая гибридизовалась с зондом. В качестве альтернативы нуклеиновую кислоту образца можно иммобилизовать на твердой подложке и можно детектировать количество зонда, связанного с такой подложкой.

Зонды согласно изобретению могут быть удобно упакованы в форме тестового набора в подходящем контейнере. В таких наборах зонд может быть связан с твердой подложкой, когда форматы анализа, для которого создают набор, требуют такого связывания. Набор также может содержать подходящие реагенты для обработки образца, подлежащего тестированию, гибридизации зонда с нуклеиновой кислотой в образце, контрольные реагенты, инструкции и тому подобное.

Полинуклеотиды согласно изобретению могут быть включены в рекомбинантный реплицируемый вектор. Вектор можно использовать для репликации нуклеиновой кислоты в совместимой клеткехозяине. Поэтому полинуклеотиды согласно изобретению могут быть созданы путем введения полинуклеотида согласно изобретению в реплицируемый вектор, введения вектора в совместимую клетку-хозяин и выращивания клетки-хозяина в условиях, которые приводят к репликации вектора.

В предпочтительном варианте вектор представляет собой экспрессионный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид согласно изобретению. Такие экспрессионные векторы рутинно конструируются в области молекулярной биологии и могут, например, включать применение плазмидной ДНК и соответствующих инициаторов, промоторов, энхансеров и других элементов, которые могут быть необходимы и которые располагаются в правильной ориентации для обеспечения возможности экспрессии белка. Другие подходящие векторы будут очевидны специалистам в технике. В качестве дополнительного примера в этом отношении авторы изобретения ссылаются на 8атЬгоок е1 а1., 1989.

Полинуклеотиды согласно изобретению могут быть также встроены в векторы, описанные выше, в антисмысловой ориентации для обеспечения получения антисмысловой РНК. Антисмысловая РНК или другие антисмысловые полинуклеотиды или интерферирующие РНК, РНКи могут быть получены синтетическими способами. Такие антисмысловые полинуклеотиды или РНКи можно использовать в качестве тестовых соединений в анализах согласно изобретению или могут быть полезны в способах терапевтического лечения организма человека или животного.

В предпочтительном варианте полинуклеотид согласно изобретению или для применения в изобретении в векторе функционально связан с контрольной последовательностью, которая способна обеспечивать экспрессию кодирующей последовательности клеткой-хозяином, т.е. вектор представляет собой экспрессионный вектор. Термин функционально связан и относится к непосредственному соседству, когда описанные компоненты находятся в связи, позволяющей им функционировать предполагаемым образом. Регуляторная последовательность, такая как промотор, функционально связана с кодирующей последовательностью, расположена таким образом, чтобы в условиях, совместимых с регуляторной последовательностью, достигалась экспрессия кодирующей последовательности.

Векторы могут представлять собой, например, плазмидные, вирусные или фаговые векторы, содержащие точку начала репликации, возможно промотор для экспрессии указанного полинуклеотида и возможно регулятор промотора. Векторы могут содержать один или большее число селектируемых маркерных генов, например ген устойчивости к ампициллину в случае бактериальной плазмиды или ген устойчивости для грибного вектора.

Промоторы и другие сигналы регуляции экспрессии могут быть выбраны так, чтобы быть совместимыми с клеткой-хозяином, для которой предназначена экспрессия. Например, дрожжевые промоторы включают промоторы СЛЬ4 и ΛΌΗ 8. еегеу181ае, промотор ηιηΐΐ и абН 8. ротЬе. Промоторы млекопитающих включают металлотионеиновый промотор, который может быть индуцирован в ответ на тяжелые металлы, такие как кадмий. Могут быть использованы вирусные промоторы, такие как промотор большого Т-антигена 8У40, или промоторы аденовирусов. Все эти промоторы легко доступны.

Могут быть использованы промоторы млекопитающих, такие как промоторы β-актина. Тканеспецифичные промоторы особенно предпочтительны. Могут быть также использованы вирусные промоторы, например длинный концевой повтор вируса мышиного лейкоза Молони (ММЬУ ЬТК), промотор ЬТК вируса саркомы Рауса (В8У). промотор 8У40, промотор ΙΕ цитомегаловируса человека (СМУ),

- 10 028490 промоторы аденовирусов, НЗУ (вируса простого герпеса) (такие как промоторы ΙΕ НЗУ) или промоторы НРУ (вируса папилломы человека), в частности, находящаяся выше регуляторная область НРУ (ИКК). Вирусные промоторы легко доступны в технике.

Экспрессионные векторы могут быть трансформированы в подходящую клетку-хозяин для обеспечения экспрессии полипептида или полипептидного фрагмента согласно изобретению. Клетку-хозяин, трансформированную или трансфицированную экспрессионным вектором, как описано выше, культивируют в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии полипептида или фрагмента, и выделяют экспрессируемый полипептид или фрагмент. Выделение и очистку можно осуществлять, как описано выше. Клетки-хозяева будут выбраны таким образом, чтобы они были совместимы с вектором, и в предпочтительном случае будут бактериальными. Клетки-хозяева могут представлять собой также клетки животного, отличного от человека, или растения, трансформированного полинуклеотидом согласно изобретению.

ИеЗ.

ИеЗ представляет собой внеклеточную цистеиновую протеазу, продуцируемую патогеном человека 8. руодепек, и описан в №0 03/051914. ИеЗ первоначально был выделен из стрептококкового штамма группы А серотипа М1, а сейчас ген Иек идентифицирован во всех исследованных штаммах стрептококка группы А. ИеЗ обладает необычайно высокой степенью специфичности по отношению к субстрату, причем его единственным идентифицированным субстратом является 1дО. ИеЗ катализирует одно протеолитическое расщепление в нижней шарнирной области человеческого 1дО. Данное протеолитическое разрушение стимулирует ингибирование опсонофагоцитоза и мешает уничтожению З1гер1ососсик группы А. ИеЗ также расщепляет некоторые подклассы 1дО у разных животных и эффективно превращает 1дО в Рс- и РаЪ-фрагменты. Ген Иек клонировали и экспрессировали в Е. сой в виде слитого белка с ОЗТ (глутатион-З-трансфераза).

Полипептид ИеЗ для применения в способах согласно изобретению предпочтительно представляет собой ИеЗ З. руодепек или вариант или фрагмент ИеЗ З. руодепек, который сохраняет активность цистеиновой протеазы. Вариант может представлять собой полипептид ИеЗ из другого организма, такого как другая бактерия. Бактерия предпочтительно представляет собой З1гер1ососсик. З1гер1ососсик предпочтительно представляет собой З1гер1ососсик группы А, З1гер1ососсик группы С или З1гер1ососсик группы О. В частности, вариант может представлять собой полипептид ИеЗ из З1гер1ососсик группы С, такой как

З. един или З. /ооерИеиисик. В качестве альтернативы, вариант может представлять собой Ркеиботопак рийба. Полипептид ИеЗ может содержать:

(а) аминокислотную последовательность ЗЕО ГО N0: 4;

(б) ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 50% идентичностью с аминокислотной последовательностью ЗЕО ГО N0: 4 и обладающий активностью цистеиновой протеазы в отношении 1дО; или (в) фрагмент любого их них, обладающий активностью цистеиновых протеаз в отношении 1дО.

В предпочтительном варианте полипептид ИеЗ содержит последовательность ЗЕО ГО N0: 4 или состоит из нее. ЗЕО ГО N0: 4 представляет собой последовательность зрелой формы ИеЗ без сигнальной последовательности.

Варианты полипептидов ИеЗ представляют собой варианты полипептидов ИеЗ, аминокислотная последовательность которых отличается от аминокислотной последовательности ЗЕО ГО N0: 4, но которые демонстрируют такую же активность цистеиновых протеаз в отношении 1дО, как и ИеЗ. Как правило, полипептиды, характеризующиеся более чем 50, 55 или 65% идентичностью, предпочтительно по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% и особенно предпочтительно по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 99% идентичностью с аминокислотной последовательностью ЗЕО ГО N0: 4, считаются вариантами белка. Такие варианты могут включать аллельные варианты или делецию, модификацию или добавление единичных аминокислот или групп аминокислот в пределах последовательности белка, при условии, что полипептид сохраняет основную функциональность ИеЗ. Идентичность вариантов ЗЕО ГО N0: 4 может быть измерена на участке длиной по меньшей мере 50, по меньшей мере 75, по меньшей мере 100, по меньшей мере 150, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250, по меньшей мере 275, по меньшей мере 300 или более соседних аминокислот последовательности, показанной в ЗЕО ГО N0: 4 или более предпочтительно по все длине ЗЕО ГО N0: 4.

Варианты аминокислотной последовательности ЗЕО ГО N0: 4 предпочтительно содержат остатки Ьук-55 и/или Сук-65 и/или Ηίκ-233 и/или Акр-255 и/или Акр-257 ЗЕО ГО N0: 4. В наиболее предпочтительном случае вариант ЗЕО ГО N0: 4 содержит каждый из остатков Ьук-55, Сук-65, Н1к-233, Акр-255 и Акр-257 ЗЕО ГО N0: 4.

Варианты последовательности обычно отличаются по меньшей мере 1, 2, 5, 10, 20, 30, 50 и большим числом мутаций (которые могут представлять собой замены, делеции или вставки аминокислот). Например, может быть сделано от 1 до 50, от 2 до 30, от 3 до 20 или от 5 до 10 замен, делеций или вставок аминокислот. Модифицированный полипептид сохраняет активность в качестве цистеиновой протеазы, специфичной в отношении 1дО. В предпочтительном варианте варианты полипептида содержат остаток цистеина или остаток гистидина на расстоянии, которое обычно обнаруживают в цистеиновых протеазах. Например, в ЗЕО ГО N0: 4 данные остатки присутствуются на расстоянии, составляющем при- 11 028490 мерно 130 аминокислот, как это обычно бывает в цистеиновых протеазах.

Фрагмент полипептида Ие8, используемый в изобретении, обычно имеет длину по меньшей мере 10, например по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 40, 50 или более аминокислот, длину вплоть до 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот, при условии, что он сохраняет активность цистеиновой протеазы Ие8 в отношении 1дС. В предпочтительном варианте фрагмент полипептида Ие8, используемый в изобретении, охватывает остатки Ьуз-55, и/или Суз-65, и/или Н1з-233, и/или Лзр-255, и/или Лзр-257 8ЕЦ ГО N0:

4. Наиболее предпочтительно фрагмент охватывает каждый из остатков Ьуз-55, Суз-65, Н1з-233, Азр-255 и Азр-257 81+) ГО N0: 4.

Полипептиды Ие8 для применения согласно изобретению демонстрируют активность цистеиновых протеаз в отношении иммуноглобулина и, в частности, активность цистеиновых протеаз в отношении 1дС. В предпочтительном варианте потипептид расщепляет 1дС в шарнирной области и более конкретно в шарнирной области тяжелой цепи. Расщепление приводит к образованию Рс- и РаЬ-фрагментов 1дС. В предпочтительном варианте активность специфична в отношении 1дС. Активность цистеиновых протеаз может быть определена в подходящем анализе. Например, тестируемый полипептид можно инкубировать с 1дС при подходящей температуре, такой как 37°С. Исходные вещества и продукты реакции можно затем исследовать методом электрофореза в δΌδ-ПААГ для определения того, присутствует ли желательный продукт расщепления 1дС. Как правило, данный продукт расщепления представляет собой фрагмент массой 31 кДа. Как правило, не происходит дальнейшего разрушения 1дС после данного первого расщепления. Продукт расщепления можно подвергать Ν-концевому секвенированию, чтобы убедиться, что произошло расщепление в шарнирной области 1дС. В предпочтительном варианте Νконцевая последовательность содержит последовательность СР8УРЬРР.

Активность цистеиновых протеаз полипептидов можно дополнительно охарактеризовать путем исследования ингибирования. В предпочтительном варианте активность ингибируют производным пептида Ζ-υνθ-ΟΗΝ₂ и/или йодуксусной кислотой, оба из которых представляют собой ингибиторы протеаз. Однако активность обычно не ингибируется Е64.

Активность цистеиновых протеаз полипептидов обычно является специфичной в отношении 1дС в том смысле, что полипептиды не могут разрушать другие классы 1д, а именно 1дМ, 1дА, 1дИ и 1дЕ, при инкубировании с данными иммуноглобулинами в условиях, которые делают возможным расщепление 1дС. Полипептид Ие8 способен расщеплять человеческий 1дС. В предпочтительных вариантах реализации полипептид обладает способностью расщеплять человеческий, кроличий, мышиный или козий 1дС.

Полипептиды Ие8 для применения в настоящем изобретении можно выделять из любого подходящего организма, который экспрессирует полипептид Ие8. Обычно полипептид Ие8 выделяют из подходящих штаммов 8. руодепез, экспрессирующих Ие8. Подходящие организмы и штаммы можно идентифицировать с использованием ряда методик. Например, штаммы 8. руодепез можно вначале тестировать на присутствие гена Иез. Присутствие гена ГОез можно затем подтверждать путем ПЦР с использованием праймеров или путем гибридизации зондов с геномной ДНК штамма 8. руодепез.

Штаммы 8. руодепез, экспрессирующие активный Ие8, можно идентифицировать путем анализа активности цистеиновых протеаз в отношении 1дС в супернатанте культуры. В предпочтительном варианте для ингибирования активности цистеиновой протеазы в отношении 8реВ к супернатанту добавляют ингибитор Е64. По меньшей мере пять штаммов экспрессируют активный Ие8: штаммы АР1, АР12, АР55, КТЬ3 и 8Р370. В предпочтительном варианте экспрессирующий штамм выбирают из АР1, АР12 и АР55.

Выделение и очистка Ие8 из экспрессирующей культуры 8.руодепез или из культур других клеток, экспрессирующих Ие8, обычно основаны на активности цистеиновой протеазы в отношении 1дС. В предпочтительном варианте способ очистки включает стадию осаждения сульфатом аммония и стадию ионообменной хроматографии. Согласно одному способу культуральную среду фракционируют добавлением возрастающего количества сульфата аммония. Количества сульфата аммония могут составлять 10-80%. В предпочтительном варианте культуральную среду фракционируют 50% сульфатом аммония и образующийся супернатант дополнительно осаждают 70% сульфатом аммония. Выпавшие в осадок полипептиды затем можно подвергать ионообменной хроматографии, например РРЬС на колонке Мопо О. Элюированные фракции можно иммледовать на активность цистеиновой протеазы в отношении 1дС и можно объединять фракции с максимальной активностью. Фракции можно исследовать методом электрофореза в 808-ПАЛГ. Например, Ν-концевую последовательность можно получать из полосы белка при 8Ό8 РАСЕ. Фракции можно хранить при -20°С.

Способы, в которых используется эндогликозидазная активность Епбо849.

Как описано в настоящей заявке, Епбо849 обладает эндогликозидазной активностью и способна гидролизовать гликан гликопротеинов, включая 1дС и α-1-микроглобулин. Согласно настоящему изобретению также предложены способы дегликозилирования гликопротеинов и, в частности, гидролиза гликана из гликопротеинов и, в частности, из 1дС и α-1-микроглобулина. Обычно такой способ включает инкубирование образца, содержащего гликопротеин, с Епбо849 с гликопротеином в условиях, которые делают возможной эндогликозидазную активность. Подходящие условия включают применение Епбо849

- 12 028490 в концентрации по меньшей мере, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 мкг/мл, предпочтительно по меньшей мере 10 мкг/мл. Подходящие условия также включают инкубирование образца с Εηάοδ49 в течение по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 120 мин, предпочтительно по меньшей мере 60 мин. Инкубирование предпочтительно осуществляют при комнатной температуре, более предпочтительно при приблизительно 20, 25, 30, 35, 40 или 45°С и наиболее предпочтительно при приблизительно 37°С.

Данные способы можно использовать для получения дегликозилированных гликопротеинов, которые сами по себе могут быть полезны в исследовании или терапии. Данные способы можно также использовать для характеристики гликанов на гликопротеинах, например в гликокартировании или гликопрофилировании. Такое гликокартирование и такое гликопрофилирование могут быть особенно полезными для молекул антител, таких как молекулы 1дО, например, в анализе молекул моноклональных 1дО. Как правило, способы включают инкубирование белка с Εηάοδ49 для гидролиза гликанов белка. Затем гликаны и белок или полипептид разделяют, например, с использованием любой подходящей методики, такой как ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) или гель-хроматография. Разделенные группировки можно затем анализировать с использованием любого подходящего аналитического способа, такого как масс-спектрометрия, ВЭЖХ, гель-хроматография, гель-электрофорез, спектрометрия, капиллярный электрофорез и другие стандартные лабораторные методики для анализа гликанов и/или белков.

Согласно дополнительным способам согласно настоящему изобретению способы также могут включать использование дополнительных ферментов, таких как ^δ, так что гликаны на Рс-фрагменте антитела можно исследовать более подробно, используя способы и методики, описанные в настоящей заявке.

Один пример заключается в анализе фукозилирования иммуноглобулина. Степень фукозилирования на гликанах Рс на молекуле 1дО является важной для терапевтического потенциала кандидата в лекарственные средства на основе 1дО. Нефукозилированные молекулы 1дО повышают эффект ЛЭСС (ηη) (антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность) терапевтической молекулы 1дО. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен способ анализа количества фукозы в Рс-гликанах 1дО с использованием Εηάοδ49.

Как правило, такой способ включает инкубирование гликопротеина, в данном случае иммуноглобулина, с Εηάοδ49 в условиях, которые делают возможной эндогликозидазную активность Εηάοδ49. Подходящие условия включают применение Εηάοδ49 в концентрации по меньшей мере 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 мкг/мл, предпочтительно по меньшей мере 10 мкг/мл. Подходящие условия также включают инкубирование образца с Εηάοδ49 в течение по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 мин или 120 мин, предпочтительно по меньшей мере 60 мин. Инкубирование предпочтительно происходит при комнатной температуре, более предпочтительно при приблизительно 20, 25, 30, 35, 40 или 45°С и наиболее предпочтительно при приблизительно 37°С. ^δ можно добавлять после реакции с Εηάοδ49 или в той же реакционной смеси, для индукции протеолиза, с разделением молекулы иммуноглобулина на Р(аЪ')₂ и Рс. Два фрагмента разделяют с использованием метода разделения перед введением в масс-спектрометр. После расщепления гликана О1сNΑс и коровый остаток Рис остаются присоединенными к Азп в консенснусном сайте гликозилирования Рс/2. Так как нефукозилированный иммуноглобулин не подвергается коровому фукозилированию, после расщепления Рс/2 будет содержать только ΟΙοΝΑο. Характерное различие в массе (-146 Да), происходящее от отсутствия фукозы хорошо видна в масс-спектре после деконволюции. Соответственно, применение Εηάοδ49 облегчает прямую оценку степени корового дефукозилирования 1дО.

Способ определения присутствия или отсутствия 1дО в образце или выделения 1дО из образца, содержащего 1дО.

Выделение и/или детектирование 1дО, обычно проводят в технике с использованием таких агентов, как белок О или белок А. Данные бактериальные белки хорошо взаимодействуют с 1дО. Однако белок А не связывается со всеми четырьмя подклассами 1дО (1дО_3-4), и как белок А, так и белок О не способны распознавать негликозилированные и/или денатурированные, неактивные 1дО и гликозилированные и/или нативные, функционально активные 1дО. Авторы настоящего изобретения установили, что полипептиды Εηάοδ49, которые не обладают эндогликозидазной активностью в отношении 1дО, напротив, обычно связываются со всеми четырьмя подклассами 1дО с высокой аффинностью и селективны по отношению к нормально гликозилированному 1дО, т.е. 1дО в своей нативной, функционально активной форме.

Соответственно, согласно настоящему изобретению предложен улучшенный способ определения присутствия или отсутствия 1дО в образце, который включает приведение указанного образца в контакт с полипептидом Εηάοδ49, который не обладает эндогликозидазной активностью в отношении 1дО, отделение указанного Εηάοδ49 от образца, с которым он приводился в контакт, и, посредством этого, определение наличия или отсутствия 1дО и, возможно, в том случае, когда 1дО присутствует, получение выделенного 1дО. В связи с этим, согласно изобретению также предложен способ выделения 1дО из образца, содержащего 1дО, который включает приведение указанного образца в контакт с полипептидом Εηάοδ49, который не обладает эндогликозидазной активностью в отношении 1дО, отделение указанного Εηάοδ49

- 13 028490 от образца, с которым он приводился в контакт, что обеспечивает получение выделенного 1дС.

Указанные образцы приводят в контакт с полипептидом Епбо849 в условиях, обеспечивающих возможность взаимодействия между полипептидом и образцом и проявления активности связывания 1дС, т.е. для обеспечения образования комплекса 1дС-полипептид Епбо849. Подходящие условия включают применение Епбо849 в концентрации по меньшей мере 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15 или 20 мкг/мл, предпочтительно по меньшей мере 10 мкг/мл. Подходящие условия также включают инкубирование образца с Епбо849 в течение по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 120 мин, предпочтительно по меньшей мере 60 мин. Инкубирование предпочтительно происходит при комнатной температуре, более предпочтительно при приблизительно 20, 25, 30, 35, 40 или 45°С и наиболее предпочтительно при приблизительно 37°С.

Отдельным преимуществом Епбо849 в данных способах является то, что Епбо849 специфично связывается с нормально гликозилированным 1дС. Активность связывания других агентов с 1дС, связывающих 1дС, обычно требует денатурации гликопротеина 1дС или усиливается ею. Денатурация гликопротеина 1дС обычно достигается обработкой образца, содержащего 1дС, кислотой. Такая обработка может повреждать или денатурировать некоторые антитела (антитела, чувствительные к кислоте). Так как способ согласно изобретению не требует такой обработки, этот способ особенно подходит для выделения из образца 1дС, чувствительного к кислоте, в его нативной форме.

Епбо849 может быть отделен от образца, с которым он приводился в контакт, любым подходящим способом. Предпочтительный способ удаления Епбо849 из образца включает использование Епбо849, которая дериватизирована или модифицирована, как описано выше.

Предпочтительная модификация включает добавление гистидиновой метки. Присутствие гистидиновой метки подразумевает, что полипептид с высокой аффинностью связывается с реагентом или средствами разделения, содержащими на своей поверхности хелатирующие группы, которые несут ион никеля, меди или цинка. Гистидиновая метка сильно связывается с данными ионами металлов. Поэтому такой реагент можно использовать для отделения Епбо849 от образца.

Другая предпочтительная модификация включает добавление биотиновой метки. Присутствие биотиновой метки подразумевает, что полипептид с высокой аффинностью связывается с реагентом или средствами разделения, содержащими стрептавидин. Биотиновая метка сильно связывается со стрептавидином. Поэтому такой реагент можно использовать для отделения Епбо849 от образца.

Предпочтительные реагенты или средства разделения представляют собой группы магнитных частиц, способных связываться с полипептидом Епбо849. Например, когда полипептид Епбо849 дериватизируют гистидиновой меткой, магнитные частицы на своей поверхности содержат хелатирующие группы, которые несут ион никеля, меди или цинка. В качестве альтернативы, когда полипептид Епбо849 дериватизируют биотиновой меткой, магнитные частицы на своей поверхности содержат стрептавидин.

Соответственно, предпочтительный способ удаления Епбо849 из образца включает использование группы магнитных частиц, как описано выше, и осуществление разделения в магнитном поле на образце. Магнитные частицы предпочтительно представляют собой магнитные наночастицы, и разделение в магнитном поле предпочтительно представляет собой разделение в высокоградиентном магнитном поле.

Понятно, что можно использовать любые подходящие способы разделения. Например, альтернативные способы, описанные в предыдущем разделе.

Епбо849 образца, с которым он приводился в контакт, можно исследовать на присутствие или отсутствие связанного 1дС любыми подходящими способами.

Например, можно исследовать молекулярную массу Епбо849. Епбо849, связанная с 1дС, будет иметь более высокую молекулярную массу, чем Епбо849, не связанная с 1дС. Соответственно, подходящие способы включают любой способ, позволяющий различать по массе виды белков, например электрофорез в 8П8-ПААГ и вестерн-блоттинг, масс-спектрометрию и т.д. В качестве альтернативы вышеупомянутый вестерн-блот можно непосредственно исследовать на присутствовать 1дС с использованием антител, специфичных к 1дС, или антител, специфичных к определенному подклассу 1дС. Детектирование белков в блоттинге, таким образом, представляет собой широкоиспользуемую в технике методику.

Другие подходящие способы детектирования присутствия или отсутствия 1дС, связанного с Епбо849, включают инкубирование Епбо849 с антителами к 1дС или белками, связывающими 1дС, со связанными ферментами (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза) с последующим добавлением флуорогенного/хромогенного субстрата. В данном примере развитие цветового сигнала указывает на наличие 1дС, при этом количество 1дС пропорционально величине сигнала. Детектирование белков данным способом представляет собой широкоиспользуемую методику в технике.

Дополнительные подходящие способы детектирования присутствия или отсутствия 1дС, связанного с Епбо849, включают вначале отделение связанного 1дС от Епбо849, что позволяет его исследовать/детектировать независимо от Епбо849 любым из вышеупомянутых способов или любым подходящим способом. 1дС можно отделять от Епбо849 любыми подходящими способами. Подходящие способы включают элюирование 1дС из Епбо849 путем приведения Епбо849 из образца, с которым его приводили в контакт, в контакт с подходящим элюирующим буфером. Выбор элюирующего буфера обычно будет зависеть от того, известно ли или имеется ли подозрение, или нет о том, что связывание 1дС с Епбо849

- 14 028490 чувствительно к кислоте, т.е. посредством контакта с кислотами происходит денатурация/инактивация.

Когда антитело нечувствительно к кислоте, обычно можно использовать протокол элюирования с использованием элюирующего буфера с низким рН. Протоколы элюирования данного типа хорошо известны в технике. Такие элюирующие буферы имеют рН, обычно ниже примерно 3, наиболее предпочтительно ниже примерно 2. Предпочтительные примеры включают 0,1М глицин при рН 2. В дополнение к этому или возможно такие элюирующие буферы могут обычно содержать по меньшей мере один из следующих компонентов:

натрий или соли натрия предпочтительно в концентрации примерно от 0,5 до примерно 1М; моно-, ди- или полисахариды со структурами, сходными с гликаном, ассоциированным с Ακη-297 на нативном !дС;

или любую их комбинацию.

Однако, как указано выше, способы согласно изобретению особенно подходят для детектирования/выделения антител, чувствительных к кислоте. Когда известно или есть подозрение, что ШС· связанный с Εηάοδ49, является чувствительным к кислоте, предпочтительным, соответственно, является использование элюирующих буферов и протоколов, которые не требуют низкого рН. Такие протоколы также известны в технике и основаны на принципе получения буфера, содержащего молекулу, которая конкурирует со связанным ШС за связывание с Εηάοδ49, что обеспечивает высвобождение связанного ШС. Таким образом, подходящие конкурирующие элюирующие буферы обычно содержат один или более моно-, ди- или полисахаридов со структурой, сходной с гликаном, связанным с Ακη-297 на нативном ШС. Особенно предпочтительные элюирующие буферы содержат сахарозу в концентрации от примерно 0,25 до примерно 0,5М, предпочтительно с рН от примерно 5,3 до примерно 8,3. Примеры конкретных предпочтительных элюирующих буферов включают, например, следующие: сахароза 0,25 М, в ФБР рН 7,4; сахароза 0,5 М, в ФБР рН 7,4; сахароза 0,25 М, в ФБР рН 5,3; сахароза 0,25 М, в ФБР 8,5 и сахароза 0,25 М, мальтоза 0,25 М, в ФБР рН 7,4.

Дополнительно или необязательно такие конкурирующие элюирующие буферы могут обычно содержать натрий или соли калия предпочтительно в концентрации от примерно 0,5 до примерно 1 М.

Способы отделения связанного ШС от Εηάοδ49, описанные выше, можно также использовать для получения выделенного ШС.

Способ оценки статуса гликозилирования и/или функционального качества образца, содержащего ШС.

Полипептиды Εηάοδ49 согласно изобретению в немодифицированной форме обладают способностью гидролизовать гликан ШС. Также, как описано выше, полипептиды Εηάοδ49 согласно изобретению, не обладающие эндогликозидазной активностью в отношении ШС и обладающие активностью связывания ШС, специфичны в отношении гликозилированного и/или нативного, функционально активного ШС. Таким образом, полипептиды Εηάοδ49 можно использовать для анализа статуса гликозилирования гликопротеина и, в частности, антитела ШС.

Согласно одному аспекту изобретения антитело ШС инкубируют с полипептидом Εηάοδ49 согласно изобретению, который обладает эндогликозидазной активностью. Полученные продукты можно анализировать любыми подходящими методиками, включая ВЭЖХ, масс-спектрометрию, гельхроматографию, гель-электрофорез, спектрофотометр, капиллярный электрофорез. Такие способы анализа можно проводить на любой стадии получения белка, например во время скрининга кандидатов лекарственных средств, во время разработки способов получения биологических лекарственных средств, а также контроля качества в анализах высвобождения и во время получения.

Полипептиды Εηάοδ49, которые модифицировали для удаления или снижения эндогликозидазной активности или которые сохраняют способность к связыванию с ШС в своей нативной форме, могут быть также полезны при гликокартировании и, в частности, анализе гликопротеина, и, в частности, структуры ШС.

Например, использование указанных полипептидов Εηάοδ49 возможно в комбинации с альтернативным ШС-связывающим реагентом, согласно настоящему изобретению, обеспечивает способ оценки статуса гликозилирования или функционального качества образца, содержащего ШС, который включает отбор первой и второй частей образца из образца, содержащего ШС, приведение первой части образца в контакт с плипептидом Εηάοδ49, как описано в предыдущем разделе, и второй части образца - с альтернативным ШС-связывающим реагентом, который способен связываться с негликозилированным и/или денатурированным, неактивным ШС, с последующим определением количества ШС, связанного полипептидом Εηάοδ49, в первой части образца, и количества ШС, связанного с альтернативным ШСсвязывающим реагентом, во второй части образца. Наконец, путем сравнения обоих количеств связанного ШС, определенных в первой и второй частях образца, можно оценить статус гликозилирования или функциональное качество образца, содержащего ШС.

Альтернативный ШС-связывающий реагент представляет собой обычно белок А или белок С, которые связываются со всеми формами (нативными или денатурироавнными) ШС. Таким образом, в данном примере количество ШС, связанного с указанным реагентом, представляет общее содержание ШС, присутствующего во второй части образца. Полипептид Εηάοδ49 связывается только с гликозилированным

- 15 028490 и/или нативным, функционально активным Ι§Ο, и поэтому количество ΙβΟ, связанного с Εηάοδ49, представляет только гликозилированный и/или нативный, функционально активный Ι§Ο, присутствующий в первой части образца. Путем сравнения концентрации общего ΙβΟ из второй части образца с концентрацией нативного ΙβΟ в первом образце специалист подумает, что получается отношение, которое отражает долю ΙβΟ в исходном образце, который присутствует в своей гликозилированной и/или нативной, функционально активной форме.

В другом варианте реализации альтернативный I§Ο-связывающий реагент мог бы являться специфичным в отношении негликозилированного и/или денатурированного ΙβΟ. Такой реагент может, например, представлять собой антитело. Соответственно, в данном варианте реализации доля Ι§Ο в исходном образце, который присутствует в своей гликозилированной и/или нативной, функционально активной форме, можно оценивать с использованием формулы:

Количество ΙβΟ в первой части образца/(Количество ΙβΟ в первой части образца +

Количество ΙβΟ во второй части образца).

Образцы в вышеупомянутых способах приводят в контакт с полипептидом Εηάοδ49 или альтернативным I§Ο-связывающим реагентом в условиях, обеспечивающих возможность взаимодействия между полипептидом или реагентом и образцом и проявления активности связывания Ι§Ο. Подходящие условия, например, эквивалентны условиям, установленным в предыдущем разделе.

Способ выделения РаЬ- или Рс-фрагментов ΙβΟ из образца, содержащего ΙβΟ.

Способы согласно настоящему изобретению можно использовать для выделения РаЬ-фрагментов из образцов, содержащих Ι§Ο. В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ выделения РаЬ-фрагментов Ι§Ο из образца, содержащего ΙβΟ, который включает:

(а) приведение указанного образца, содержащего ΙβΟ, в контакт с Ι®δ и полипептидом Εηάοδ49;

(б) отделение указанного Ι®δ и указанного полипептида Εηάοδ49 от образца, с которым они приводились в контакт;

что обеспечивает выделение РаЬ-фрагментов.

Предпочтительные способы отделения Ι®δ и полипептида Εηάοδ49 от образца включают использование Ι®δ и/или полипептида Εηάοδ49, который дериватизирован или модифицирован, как описано выше. Для каждого из Ι®δ и полипептидов Εηάοδ49 можно использовать одинаковые или различные модификации.

Предпочтительная модификация включает добавление гистидиновой метки. Присутствие гистидиновой метки означает, что полипептид с высокой аффинностью связывается с реагентом или средствами разделения, содержащими на своей поверхности хелатирующие группы, которые несут ион никеля, меди или цинка. Гистидиновая метка сильно связывается с данными ионами металлов. Поэтому такой реагент можно использовать для отделения Ι®δ и/или полипептида Εηάοδ49 от образца.

Другая предпочтительная модификация включает добавление биотиновой метки. Присутствие биотиновой метки означает, что полипептид с высокой аффинностью связывается с реагентом или средствами разделения, содержащими стрептавидин. Биотиновая метка сильно связывается со стрептавидином. Поэтому такой реагент можно использовать для отделения Ι®δ и/или полипептида Εηάοδ49 от образца.

Предпочтительные реагенты или средства разделения представляют собой группы магнитных частиц, способных связываться с полипептидом Εηάοδ49. Например, когда Ι®δ и/или полипептид Εηάοδ49 дериватизирован гистидиновой меткой, магнитные частицы на своей поверхности содержат хелатирующие группы, которые несут ион никеля, меди или цинка. В альтернативном случае, когда Ι®δ и/или полипептид Εηάοδ49 дериватизирован биотиновой меткой, магнитные частицы на своей поверхности содержат стрептавидин.

Соответственно, предпочтительный способ выделения Εηάοδ49 из образца включает использование группы магнитных частиц, как описано выше, и осуществление разделения в магнитном поле на образце. Магнитные частицы предпочтительно представляют собой магнитные наночастицы, и разделение в магнитном поле предпочтительно представляет собой разделение в высокоградиентном магнитном поле.

Таким образом, стадия (а) вышеупомянутого способа предпочтительно дополнительно включает приведение образца в контакт с совокупностью магнитных наночастиц, способных связываться с Ι®δ и полипептидом Εηάοδ49, и при этом стадия (б) включает осуществление разделения в магнитном поле на образце.

Полипептид Εηάοδ49 предпочтительно представляет собой модифицированный полипептид Εηάοδ49, не обладающий эндогликозидазной активностью.

В вышеупомянутом варианте реализации изобретения образец, содержащий Ι§Ο, обычно содержит очищенный или выделенный Ι§Ο. Под очищенным или выделенным Ι§Ο подразумевается фракция Ι§Ο с чистотой обычного товарного качества. ΙβΟ обычно выделяют из образца, такого как сыворотка или, в случае рекомбинантного ΙβΟ, из лизата клеток. Выделение можно проводить любым подходящим способом, предпочтительно способом, описанным выше для выделения Ι§Ο с использованием модифицированного полипептида Εηάοδ49, не обладающего эндогликозидазной активностью. Таким образом, один вариант реализации изобретения охватывает способ, представленный выше, включающий перед стадией (а):

(ί) приведение указанного образца, содержащего ΙβΟ, в контакт с полипептидом Εηάοδ49, который

- 16 028490 не обладает энлогликозидазной активностью в отношении Ι§0, что обеспечивает образование комплекса ΙβΟ-полипептид Εηάοδ49;

(ίί) отделение указанного комплекса ΙβΟ-полипептид Εηάοδ49 от образца, который приводился контакт;

(ΐΐϊ) элюирование ΙμΟ из комплекса ΙβΟ-полипептид Εηάοδ49, что обеспечивает получение образца, содержащего ΙμΟ;

и при этом стадии (а) и (б) осуществляют с образцом, содержащим Ι§0, полученным на стадии (ίίί). Отделение комплекса ΙβΟ-полипептид Εηάοδ49 от образца предпочтительно осуществляют способом, представленным выше в разделе, связанном со способами определения присутствия или отсутствия Ι§0 в образце, или выделения Ι§0 из образца, содержащего ΙμΟ.

В альтернативном варианте реализации изобретения способы адаптированы для выделения РаЬфрагментов из образцов, содержащих Ι§0, без необходимости в очистке ΙμΟ перед осуществлением способа. Данные способы можно осуществлять на образце, содержащем неочищенный Ι§0, например на цельной сыворотке, клеточном лизате или среде клеточной культуры. В данном варианте реализации изобретения способ включает:

(а) приведение указанного образца, содержащего ΙμΟ, в контакт с полипептидом Εηάοδ49, что обеспечивает образование комплекса ΙβΟ-полипептид Εηάοδ49;

(б) отделение указанного комплекса ΙβΟ-полипептид Εηάοδ49 от образца, который приводился в контакт;

(в) добавление Ιάοδ к комплексам ΙβΟ-полипептид Εηάοδ49, полученным на стадии (б); и (г) отделение указанного Ιάοδ и указанного полипептида Εηάοδ49 от смеси, полученной на стадии (в); что обеспечивает выделение РаЬ-фрагментов.

Способы отделения Ιάοδ и/или полипептида Εηάοδ49 от образцов/смесей, упомянутых выше, предпочтительно включают использование Ιάοδ и/или полипептида Εηάοδ49, который дериватизирован или модифицирован, как описано выше. На каждом из Ιάοδ и полипептида Εηάοδ49 можно использовать одинаковые или различные модификации. Предпочтительные реагенты или средства разделения представляют собой совокупности магнитных частиц, способных связываться с Ιάοδ и/или полипептидом Εηάοδ49. Например, когда Ιάοδ и/или полипептид Εηάοδ49 дериватизирован гистидиновой меткой, магнитные частицы на своей поверхности содержат хелатирующие группы, которые несут ион никеля, меди или цинка. В альтернативном варианте, когда Ιάοδ и/или полипептид Εηάοδ49 дериватизирован биотиновой меткой, магнитные частицы на своей поверхности содержат стрептавидин.

Таким образом, стадия (а) вышеупомянутого способа предпочтительно дополнительно включает приведение образца в контакт с совокупностью магнитных наночастиц, способных связываться с полипептидом Εηάοδ49, стадия (в) дополнительно включает приведение комплексов ΙβΟ-полипептид Εηάοδ49, полученных на стадии (б), в контакт с совокупностью магнитных наночастиц, способных связываться с Ιάοδ и полипептидом Εηάοδ49, и при этом стадии (б) и (г) включают осуществление разделения в магнитном поле на образце стадии (а) и смеси, полученной на стадии (в) соответственно.

Станет понятно, что можно использовать любые подходящие способы разделения. Например, альтернативные способы, описанные в разделе, относящемся к способам выделения группы клеток, которые по существу не содержат молекул ΙμΟ, связанных с РсуК, можно адаптировать для отделения Ιάοδ и/или полипептида Εηάοδ49.

Полипептид Εηάοδ49 в вышеупомянутом варианте реализации предпочтительно представляет собой модифицированный полипептид Εηάοδ49, не обладающий эндогликозидазной активностью.

Упомянутые выше способы согласно изобретению можно также использовать для выделения Рсфрагментов из образцов, содержащих Ι§0. В одном таком варианте реализации изобретения способ включает:

(а) приведение указанного образца, содержащего ΙμΟ, в контакт с Ιάοδ;

(б) отделение Ιάοδ от смеси, полученной на стадии (а), что обеспечивает выделение РаЬ- и Рсфрагментов;

(в) приведение указанных РаЬ- и Рс-фрагментов в контакт с полипептидом Εηάοδ49 для обеспечения посредством этого образования комплекса Рс-фрагмент-полипептид Εηάοδ49;

(г) отделение комплексов Рс-фрагмент-полипептид Εηάοδ49 из смеси, полученной на стадии (в); и (д) выделение Рс-фрагментов из комплексов Рс-фрагмент-полипептид Εηάοδ49, полученных на стадии (г).

Станет понятно, что можно использовать любые подходящие способы разделения, описанные выше, однако, способы отделения Ιάοδ и/или полипептида Εηάοδ49 от вышеупомянутых образцов/смесей предпочтительно включают использование Ιάοδ и/или полипептида Εηάοδ49, который дериватизирован или модифицирован, как описано выше.

В предпочтительном варианте стадия (а) вышеупомянутого способа дополнительно включает приведение образца в контакт с совокупностью магнитных наночастиц, способных связываться с Ιάοδ, стадия (в) дополнительно включает приведение РаЬ- и Рс-фрагментов, полученных на стадии (б), в контакт с совокупностью магнитных наночастиц, способных связываться с полипептидом Εηάοδ49, и при этом

- 17 028490 стадии (б) и (г) включают осуществление разделения в магнитном поле на образце стадии (а) и смеси, полученной на стадии (в) соответственно. Полипептид Еп<оЗ49 предпочтительно представляет собой модифицированный полипептид Еп<оЗ49, не обладающий эндогликозидазной активностью.

В альтернативном варианте реализации Рс-фрагменты можно выделять из образца, содержащего 1дО, методом, включающим:

(а) приведение указанного образца, содержащего 1дО, в контакт с ИеЗ и полипептидом Еп<оЗ49;

(б) отделение полипептида Еп<оЗ49 от смеси, полученной на стадии (а); что обеспечивает выделение Рс-фрагментов.

Станет понятно, что можно использовать любые подходящие способы разделения, описанные выше. Однако в предпочтительном случае стадия (а) вышеупомянутого способа дополнительно включает приведение образца в контакт с совокупностью магнитных наночастиц, способных связываться с полипептидом Еп<оЗ49, но не с ИеЗ, и при этом стадия (б) включает осуществление разделения в магнитном поле на смеси, полученной на стадии (а). В предпочтительном варианте ИеЗ и/или полипептид Еп<оЗ49 дериватизированы или модифицированы, как описано выше, при условии, что к каждому применяют отличную модификацию. Например, когда ИеЗ модифицируют добавлением гистидиновой метки, так что она связывается с группой магнитных частиц, содержащих на своей поверхности хелатирующие группы, которые несут ион никеля, меди или цинка, полипептид Еп<оЗ49 можно модифицировать добавлением биотиновой метки так, чтобы она связывалась с группой магнитных частиц, содержащих на своей поверхности стрептавидин. Полипептид Еп<оЗ49 предпочтительно представляет собой модифицированный полипептид Еп<оЗ49, не обладающий эндогликозидазной активностью.

Как и в случае способов выделения РаЬ-фрагментов, следует понимать, что в способах отделения Рс-фрагментов образец, содержащий 1§О, обычно содержит очищенный или выделенный 1§О. Предпочтительный способ выделения 1§О описан на стадиях (т)-(ттт), охарактеризованных выше.

Наборы.

Согласно настоящему изобретению предложено следующее: набор для выделения 1§О из образца, содержащего 1дО, содержащий:

(а) полипептид Еп<оЗ49 согласно изобретению, который не обладает эндогликозидазной активностью; и возможно (б) средства для отделения указанного полипептида Еп<оЗ49 от образца.

Набор для определения присутствия или отсутствия 1§О в образце, содержащий:

(а) полипептид Еп<оЗ49 согласно изобретению, который не обладает эндогликозидазной активностью; и возможно (б) средства для отделения указанного полипептида Еп<оЗ49 от образца.

Набор для оценки статуса гликозилирования и/или функционального качества образца, содержащего 1дО, содержащий:

(а) полипептид Еп<оЗ49 согласно изобретению, который не обладает эндогликозидазной активностью; и возможно (б) альтернативный 1дО-связывающий реагент, который способен связываться с денатурированным и/или дегликозилированным 1§О;

(в) средства для отделения указанного полипептида Еп<оЗ49 от образца и (г) средства для отделения указанного альтернативного 1дО-связывающего реагента от образца.

Альтернативный 1дО-связывающий реагент содержит белок О и/или белок А и/или белок А/О.

Согласно настоящему изобретению также предложено следующее:

набор для выделения РаЬ-и Рс-фрагментов 1§О, содержащий:

(а) ИеЗ;

(б) полипептид Еп<оЗ49;

(в) средства для отделения указанного ИеЗ и указанного полипептида Еп<оЗ49 от образца.

В предпочтительном варианте реализации набор дополнительно содержит полипептид Еп<оЗ49 согласно изобретению, который не обладает эндогликозидазной активностью, и средства для отделения указанного полипептида Еп<оЗ49 от образца. Полипептид Еп<оЗ49 предпочтительно представляет собой полипептид Еп<оЗ49 согласно изобретению, который не обладает эндогликозидазной активностью.

Предпочтительные варианты реализации вышеупомянутых наборов дополнительно содержат инструкции для использования набора в способе согласно изобретению.

Дополнительные предпочтительные варианты реализации включают варианты реализации, в которых средства для отделения полипептида Еп<оЗ49, альтернативного 1дО-связывающего реагента, полипептида ИеЗ или полипептида Еп<оЗ49 от образца представляют собой группы магнитных наночастиц, где каждая группа способна связываться с по меньшей мере одним из указанных полипептидов/реагентов/белков. В данном варианте реализации набор, обычно дополнительно содержит инструкции по выполнению разделения в магнитном поле на образце.

В предпочтительных вариантах реализации вышеупомянутых способов и наборов используемые полипептиды/белки/реагенты дериватизированы с помощью аффинной метки, предпочтительно гистидиновой метки, для содействия в отделении указанных полипептидов.

- 18 028490

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

Пример 1.

Материалы и методы.

Штаммы и рост бактерий.

Геном штамма N2131 серотипа М49 ОЛ§ секвенирован, поэтому в данной работе этот штамм выбрали в качестве эталонного штамма (Мс8йап е! а1., 2008) (Сйаи88ее е! а1., 1999). Штамм N2131 ОЛ§ размножали на кровяном агаре, и штаммы Тор10 (1пуйгодеп) и ВЬ21 рЬу8§ (1пуйгодеп) ЕзсНепсЫа сой размножали на агаризованном лизогенном бульоне (ЬВ). Для отбора клеток Тор10 Е. сой использовали карбенициллин в концентрации 100 мкг/мл и в случае ВЬ21 рЬу8§ Е. сой использовали карбенициллин в концентрации 100 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 34 мкг/мл. Ночные культуры Е. сой получали в ЬВ при 37°С при аэрации. Получение геномной ДНК штамма N2131 ОЛ§ осуществляли с использованием набора Ригедепе ЭНЛ Рипйсайоп (Ц1адеп). Трансформацию проводили с использованием теплового шока при 42°С в течение 30 с. Получение плазмиды из Е. сой осуществляли с использованием набора Р1а8пий Мйиргер I (Е./.КЛ.). Все праймеры, использованные в данной работе, перечислены в табл. 2.

Рекомбинантная экспрессия Епйо849.

Рекомбинантную экспрессию Епйо849 в Е. сой определяли путем ПНР-амплификации гена пйо849 из штамма N2131 5>1гер1ососси8 группы А, серотипа М49 с праймерами пйо849-Р-ВатН1, СТОТААООАТССАООАОААОАСТО, и пйо849-К-Хйо1, САААССТССАСТСТТТСТААТССТАССАСТТ. Фрагмент гена пйо849 расщепляли рестрикционными ферментами ВатН1 и Хйо1 и лигировали в экспрессионный вектор рОЕХ-5Х-3 (Атег8йат Вю8с1епсе8) с использованием лигазы ДНК Т4 (Регтейа8), получая плазмиду рСЕХ-пйо849. Экспрессионный вектор трансформировали в химически компетентные клетки Е. сой Тор10, рекомбинантные клетки растили на чашках Петри с карбенициллином в концентрации 100 мкг/мл и проводили скрининг методом ПЦР с использованием праймеров пйо849-Р-ВатН1 и пйо849-КХйо1. Положительные клоны выделяли, плазмиду рСЕХ-пйо849 очищали и трансформировали в экспрессирующий штамм ВЬ21 рЬу8§ Е. сой, как описано выше.

Один рекомбинантный клон растили в течение ночи при 37°С с антибиотиками и разбавляли в отношении 1:20 в среде ЬВ с антибиотиками и растили в течение 3 ч. Экспрессию белка Епйо849 индуцировали 0,1 мМ 1РТО (изопропилтиогалактозид) в течение 3 ч. Клетки собирали и лизировали реагентом ВидВи81ег РгоШп Ехйасйоп Щоуадеп). Рекомбинантный С8Т-Епйо849 очищали на колонке с глутатионсефарозой 4В (ОЕ Неаййсаге) и элюировали восстановленным глутатионом.

Мутагенез Епйо849.

Сайт-направленный мутагенез с заменой глутаминовой кислоты 186(О1и-186) на лейцин (Е186Ь) проводили с использованием набора ЦшскСйапде II 8йе-01гес1ей Ми1адепе818 (§1га1адепе) в соответствии с инструкциями производителя. Используемый праймер для мутагенеза представлял собой СТАОАТАТТОАТАТТСТТСАСОААТТТАСОААС в комбинации с последовательностью, антисмысловой в отношении вышеупомянутой последовательности, и плазмидой рСЕХ-пйо849 (мутация подчеркнута). Таким образом получили плазмиды рСЕХ-пйо849(Е186Ь), и после секвенирования рекомбинантную Епйо849(Е186Ь) экспрессировали и очищали, как описано для Епйо849. Укороченные варианты Епйо849 конструировали путем амплификации частей гена пйо849 из СА§ N2131 с праймерами пйо849(1гипс1-5), содержащими сайты рестрикции ВатН1 и Хйо1 (табл. 2). Фрагменты расщепляли и лигировали в вектор рОЕХ, как указано выше, трансформировали в Тор10 18. сой и затем в ВЬ21 рЬу8§ и выращивали с антибиотиками. Белки продуцировали, как описано выше, и очищали белки Еп8о849(!гипс1) массой 80 кДа, Епйо849(!гипс2) массой 70 кДа, Епйо849(!гипс3) массой 60 кДа, Епйо849(!гипс4) массой 50 кДа, Епйо849(!гипс5) массой 42 кДа.

Анализ гидролиза гликана гликопротеина.

мкг рекомбинантной Епйо849 и ее мутантов инкубировали с 3 мкг каждого гликопротеина в 20 мкл ФБР в течение ночи при 37°С. Гидролиз гликана исследовали на 10%-ном геле δΌδ-ПААГ и затем исследовали путем блоттинга с ЬСА лектином, как описано ранее (СоШп апй 018еп, 2001а).

Анализ методом слот-блоттинг.

Епйо849 и ее мутанты иммобилизировали на мембране из РУОР (поливинилиденфторида), активированной метанолом, в количестве 4, 2, 1 мкг в ФБР на слот с использованием оборудования для слотблоттинга Мййроге. Мембрану блокировали 5%-м обезжиренным молоком (ЭНсо) в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывку проводили последовательнос три раза в течение 10 мин в ФБРТ (фосфатно-солевой буферный раствор с добавлением Тиееп-20). Мембрану инкубировали с 10 мкг человеческого 1дО (81дта) в 0,5%-м обезжиренном молоке в течение 1 ч при 37°С и затем промывали. К мембране добавляли 5 мкг пероксидазы хрена, конъюгированной с белком О (1пуйгодеп), и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После промывки мембрану проявляли с помощью хемилюминесцентного субстрата 8ирег81дпа1 \Уе81 Рюо (Тйегто Баепййс).

Биоинформационный анализ.

Гены пйо849 и пйо8 транслировали в Епйо849 и Епйо8 и сравнивали с использованием алгоритма С1и81а1\У в программе МасУес!ог (МасУес!ог 1пс.). Филогенетическое дерево конструировали с помощью МасУес!ог с использованием последовательностей белков из РиЬМей NСВI со следующими номерами

- 19 028490 доступа: Εη6οδ (АР296340), ΕηάοΕ (ААК20477), ΕηάοΗ (ΝΡ_631673), ЕпбоС (ЛПС53484), Εη6οΡ2 (Ρ36912), Εη6οΡ3 (Ρ36913) (ΌΌΙΙίη амб Ο1δέη 2001Ь) (ΌΌ11ίη амб ИвсЬеШ, 2004) (ТагеШпто амб Р1иттег, 1974) (ТагеШпто е! а1., 1993).

ПЦР-скрининг на η6οδ49.

Праймеры, амплифицирующие ген η6οδ49 из ОА8, конструировали и обозначали η6οδ49-Ρ (ЛЛЛЛСОСООЛССЛСТЛТЛТОС) и η6οδ49-Κ (ЛЛЛСОТТОТССОЛООЛТТТО). Штаммы 42 ΟΆδ размножали на кровяном агаре и растили в течение ночи при 37°С с 5% СО₂. Отбирали единичные колонии и лизировали в 20 мкл стерильной Н₂О при 99°С в течение 10 мин. Данные лизаты использовали в качестве матрицы для реакции ПЦР в жестких условиях для детектирования η6οδ49 в ΟΆδ штаммах 42. В качестве положительного контроля конструировали праймеры для амплификации гена гесА, гесА-Р (АОСССТТОАТОАТОСТТТО) и гесА-К (ААСААТТСТОООТОАТСОО). В качестве положительных контролен в обеих ПЦР реакциях в качестве матрицы использовали геномную ДНК из ОА8 штамма ΝΖ131 (М49) и АР1(М1).

Результаты.

Анализ С1и51а1\У обнаруживает два разных фермента: Εη6οδ49 и Εη6οδ.

Гены η6οδ49 и η6οδ транслировали ίη 5^1^сο в белки и сравнивали с использованием алгоритма С1и81а1\У. На уровне гена идентичность составляет 50 и 37% на уровне белка. Анализ С1и51а1\У обнаружил (почти) идентичную сигнальную последовательность белка и консервативный каталитический домен гликозидгидролаз семейства 18 (ООРЭШШХфиг. 1). Экспериментальный анализ Εη6οδ показал, что триптофаны являются существенными для гидролизующей активности в отношении гликана (АШют е! а1., 2008). Данные триптофаны также консервативны в Εη6οδ49.

Рекомбинантные Εη6οδ49 демонстрируют гидролизующую активность в отношении гликана на человеческих гликопротеинах.

Εη6οδ49 массой 90 кДа успешно рекомбинантно экспрессировали в ВЬ21 Ε. тоП и очищали от растворимой фракции с использованием О8Т-метки. Конструировали Εη6οδ49(Ε186Ρ), каталитический мутант с заменой глутаминовой кислотой мотива ΟΗ18 (Е186) на лейцин (Ь), и очищали таким же образом. Для картирования активности белка конструировали варианты ферментов, укороченные с 5-карбоксиконца, и обозначали Εη6οδ49(1πιικ1) массой 80 кДа, Εη6οδ49(1π.πκ:2) массой 70 кДа, Εη6οδ49(1πιικ3) массой 60 кДа, Εη6οδ49(1πιικ4) массой 50 кДа и Εη6οδ49(1ππκ:5) массой 42 кДа. Данную коллекцию ферментов использовали для анализа гидролизующей активности Εη6οδ49 в отношении гликана на человеческих гликопротеинах. Вначале ферменты инкубировали с человеческим Ι§Ο в течение ночи и исследовали на геле δΌδ-ПААГ и путем блоттинга с лектином ЬСА, детектируя маннозные структуры в гликане 1дО. В геле обнаружили сдвиг тяжелой цепи Ι§Ο, обработанного Εη6οδ49, соответствующий массе 4 кДа, и блоттинг с лектином ЬСА подтвердил, что данный сдвиг обусловлен отсутствием Ν-связанного гликана (фиг. 2А). Εη6οδ49(Ε186Ρ) не показывал сдвига и изменения в составе гликана, что указывает на то, что Е186 играет решающую роль в каталитической активности Εη6οδ49. В отношении укороченных ферментов, Εη6οδ49(Ιππκ:1-4) демонстрировал активность на гликане 1дО, а Εη6οδ49(ΐΐΗΜ5), самый маленький из ферментов (42 кДа), не демонстрировал гидролизующей активности в отношении гликана (фиг. 2А).

Дополнительный анализ дегликозилирования Ι§Ο под действием Εη6οδ49 проводили путем инкубирования Ι§Ο1-4 с Εη6οδ49 и Εη6οδ49(Ε186Ρ) в течение ночи. Подклассы Ι§Ο исследовали, как указано выше, и показали, что Εη6οδ49 обладает активностью в отношении всех четырех подклассов Ι§Ο, и в соответствии с предшествующими результатами, каталитический мутант не показывал активности (фиг. 2Б). Инкубирование коллекции ферментов с α-1-микроглобулином, тяжелым гликозилированным белком сыворотки человека, и анализ на δΌδ-ПААГ показали гидролитическую активность Εη6οδ49 в отношении гликана на данном гликопротеине (фиг. 2В). Для дальнейшего выявления специфичности Εη6οδ49 модельный субстрат, состоящий из ^ацетил-З-Э-глюкозамида, связанного с флуоресцентным 4метилумбеллиферилом, инкубировали с Εη6οδ49 в течение 1, 2, 3, 4 и 16 ч и измеряли фрюоресценцию. Флуоресценция будет увеличиваться при отщеплении сахара, но такого увеличения интенсивности не наблюдали (данные не показаны), свидетельствуя о том, что Εη6οδ49 обладает активностью только на гликопротеиновых субстратах.

Связывание Εη6οδ49 с ΙχΟ.

Обнаружение того, что Εη6οδ49 обладает гидролизующей активностью в отношении гликана на Ι§Ο дало авторам изобретения основания полагать, что фермент связывается с ΙχΟ. Это оценивали с помощью анализа слот-блоттингом, в котором Εη6οδ49 и его каталитический мутант, и укороченные варианты иммобилизировали на мембране из РУИР и инкубировали с ΙχΟ, связывание детектировали с использованием белка Ο, связанного с пероксидазой хрена (НКР). Слот-блоттинг показывает повышенное связывание каталитического мутанта Εη6οδ49(Ε186Ρ) с ΙχΟ (фиг. 3).

Ген η6οδ49 присутствует у серотипа М49 ОА8.

Для выявления того, присутствует ли η6οδ49 в любых других серотипах, отличных от М49, использовали ПЦР в жестких условиях для анализа присутствия гена η6οδ49 в наборе ОА8 штаммов. Праймеры

- 20 028490 ηάοδ49-Ρ и ηάοδ49-Κ в ПЦР использовали на лизатах из ΘΑδ колоний вместе с положительным контролем с амплификацией гена гесА, присутствующего во всех ΘΑδ штаммах. Ген ηάοδ49 амплифицировали во всех отобранных ΘΑδ серотипах М49 и также в серотипе М60, тогда как ни один другой серотип не давал ПЦР-продукта (табл. 1).

В секвенированных геномах штаммов ΝΖ131 (М49) и ΜΘΑδ5005 (Μ1) ΘΑδ сравнивали гены, окружающие ηάοδ49 и ηάοδ, обнаруживая, что гены расположены в одинаковом геномном контексте и что окружающие гены являются высоко консервативными (фиг. 4). Всю длину Εηάοδ49 сравнивали с набором ранее описанных эндогликозидаз, Εηάοδ, Επύο^ ΕπάοΗ, ΕπάοΕ, ΕηάοΡ2, ΕηάοΡ3, и реконструировали филогенетическое дерево (фиг. 5). Это выявило то, что Εηάοδ и ΕπάοС являются более родственными, чем Εηάοδ и Εηάοδ49, и что эндогликозидазы из δΐ^ρΐο^^πδ являются близкородственными по сравнению с ферментами из других бактерий.

Таблица 1

Наличие ηάοδ49 в наборе ΘΑδ серотипов

Штамм	Серотип	ηάο849	гесА
5448	ΜΙ	-	+
8Р370	ΜΙ	-	+
ΑΟΝ1	ΜΙ	-	+
ΑΡΝ2	М2	-	+
ΑΝΟ3	М3	-	+
20224	М3	-	+
ΑΡΝ4	Μ4	-	+
ΑΟΝ5	Μ5	-	+
Мап£гес1о	Μ5	-	+
ΑΟΝ6	Μ6	-	+
АР6	Μ6	-	+
ΑΡΝ9	Μ9	-	+
ΑΟΝΙΙ	МП	-	+
ΑΟΝ12	Μ12	-	+
ΑΟΝ18	Μ18	-	+
ΑΟΝ19	Μ19	-	+
ΑΡΝ22	Μ22	-	+
ΑΡΝ24	Μ24	-	+
ΑΡΝ28	Μ28	-	+
ΝΖ131	Μ49	+	+
3487-05	Μ49	+	+
А\¥1	Μ49	+	+
А\У2	Μ49	+	+
А\УЗ	Μ49	+	+
А\У4	Μ49	+	+
А\У6	Μ49	+	+
А\У7	Μ49	+	+
А\У8	Μ49	+	+
А\У9	Μ49	+	+
А\¥10	Μ49	+	+
А\¥11	Μ49	+	+
Α\Υ12	Μ49	+	+
Α\Υ13	Μ49	+	+
ΑΡΝ49	Μ49	+	+
ΑΡ49	Μ49	+	+
С8101	Μ49	+	+
ΑΡ53	Μ53	-	+
АЬАВ49	Μ53	-	+
ΑΟΝ55	Μ55	-	+
ΑΟΝ57	Μ57	-	+
ΑΡΝ60	Μ60	+	+
ΑΡ74	Μ74	-	+

- 21 028490

Таблица 2

Праймеры, использованные в данной работе

Название праймера	Последовательность (5’-3’)
пбо849-Р-ВатН1	СТОТААООАТССАООАОААОАСТО
ηάοδ49-Κ-ΧΗοΙ	ОАААССТСОАОТСТТТОТААТСОТАООАСТТ
ηάο349(Ε186Ε)-Ρ	СТАОАТАТТОАТАТТСТТСАСОААТТТАСОААС
ηάο849(Ε186Ε)-Κ	ОТТСОТАААТТСОТОААОААТАТСААТАТСТАО
пс!о349(ΐαιηο 1 )-К-ХНо I	АТТТСТСОАОСТОААОАСОТССТТТАОССАСО
ηάο849(ΐηιηο2)-Κ-Χ1ιοΙ	ТАААСТСОАОССССАТСАОАААСАТСТАСТААО
ηάο849(1шпсЗ )-К-ХНо1	АТТТТСТСОАООСАТТАТСААСАТСАТААТОАСС
ηάο849(ΐηιηο4)-Κ-ΧΗοΙ	ТАААСТСОАОССАОТСАТОССТАССАТААСААОСТСАОС
ηάο349(ΐηιηο5)-Κ-ΧΗοΙ	АТТТСТСОАОСТОТССААСТТОТТОААТО
ηάο349-Ρ	ААААСОСООАССАСТАТАТОС
ηάο849-Κ	АААСОТТОТССОАООАТТТО
гесА-Р	АОСССТТОАТОАТОСТТТО
гесА-К	ААСААТТСТОООТОАТСОО

Последовательность белка Епбо849

Референсные последовательности ΝΟΒΙ

Геном ΝΖ131 :ΝΟ_011375.1

Последовательность гена пбо849: ΝΟ_011375.1

Последовательность белка Епбо849: ΥΡ002286383.1

Последовательность белка Епбо849

ΜΟΚΗΤΤνΚΚΤΤΟΤνΤΑΑΤΤΜΟΑΑΤΑΤΗΗΟδΤΝΤνΚΑΕΕΚΤνρΤΟ

ΚΤ0Ρρν0ΑΚΤνρΕΙΚΕ0ΚΚ0ΡΤΥΑ0ΥΓΚΤ\νΗ0ΚΑδΤ0Ι00Κ(5ΡΗΡΕΝΤΜΑΕνΡΚΕν0Ι

ΕΡνΡΗΟΗΤΑδΟδΡΡλνδΕΕΚϋδΥνΗΚΕΗρρθΤΑΕνρΤΙΟνΝΕΕΝΟΚΤΟΕδΚΕίΥΡΟΤΡΕΟ

ΝΚΑΕΑΑΑίνΚΑΡνΤϋΚσνΏΟΕΟΙΏΙΕΗΕΡΤΝΚΙΙΤΡΕΕΟΑΚΑΕΝνΡΚΕΙΑρΕίσΚΝΟδΟ

ΚδΚΙ.[.ΙΜ[)ΓΙΊ.δ\Ε\\ΡΙ ΗΚ(ιΙ,\ΕΙ)Ι.[)Υυ.ΚΟ Υ Υ(ιδΟ(ι(ιΗ,ΛΕ\Ι)ΙΊ\δΙ)\ν\ΟΥ()\ ΥΙΙ)

ΑδρΡΜΙΟΡδΡΡΕΕδΑδΚσΝΕλνΡθνΝΕΥΕ>ΡΝΝΡΕΚΟΚΕ>ΕΟΤΚΑΚΚΥΑΕλΥ<2ΡδΤθθΕΚΑ

ΟΙΡδΥΑΙΟΚΟσνΑΗνΡδΤΥΚΝΚΤδΤΝΕρΚΗΕνΟΝΙδΗΤΌΥΤνδΚΚΕΚΤΕΜΤΕΟΚΚΥΟν

Ι0ρΚΕ>ΙΡ0ΡΑΕΚΕρΐΐρρν0<2ΥΚσ0ΕΕΚΥΝΚΤΕνΕΤ00ΚΐρΝΕΚ0ΕΕΚΕδΚΕρΚΕΕΕΚ

ΡΕδΝνΚΕΙΤΡΕΕΕΡΕδΜΚΚΟΑΕΕνΜνθΜΤθΕΕΚΕΝΕδθΕΝΚΟΤΕΟθΙΟνΝδΙΤΗΕΤδΡ

ΟΙδΗΝδΕΟΕδΕΚδΕϋΚΚΕΕΜΤΕΜΕρνδΝΗρΚΙΤνΚΝΤΑΡΕΝρΚΡΚΟΥΥΡρΤΥϋΤΚΕΟΗ

ΥΟνΒΝΑΕΗΟΙΕΤΟΡνΡστνΤΚΚΝΤΡΙΟΟΕΕΑΡΑΙΥΚΕΟΑνΏΟΚρΥνδΚΟΥΤΥΕΑΡΚΚΟ

ΥΚΟΥΚνΗΕΤΑδΝΕΟΕΤνΤδΚνΤΑΤΤΟΕΤΥΕνονδϋθΕΚννΗΗΜΚΕΝΙΟδΟΑΙΜΜΕΝΕΑ

ΚΟΑΚνίσΤδΟΟΡΕρΑΚΚΙΡΟΟΕΚδΟΚΡΡΤλνσρΤΝλνίΑΡϋΕΟΕΙΝΕΑΚΕλνΚΕΡΝΑΕΤΝΤ

ΕΙΚΤϋδδΕΝνΑΚΟΚΕρίΕΚΟΤΤΙΟΕΕΚΜΟΙΚΝΚΚΕΥΕδΝΏΕΝλνΤΟνΑρΜΟΟΑΚΑΙΡΝδ

ΚΕδΝνΕδΚΥλνΒΕ<3νθΟΟΑδδΥΥΡρΥΤΕΕρΐΕΟ(2ΚΕδΝΓ>νΑΝΤΕΚΟ

Пример 2.

Молекулы моноклональных 1д могут демонстрировать незначительные различия в гликанах Рс, и вследствие этого гликаны Рс могут существовать в виде неоднородного пула гликанов Рс. Подавляющее большинство гликанов идентичны, но незначительная часть может демонстрировать различную структуру и состав углеводов. Разнообразие связано как с источником Рс-фрагмента, который может быть человеческим, гиманизированным или из другого вида, так и с выбором клеточной линии-продуцента и условий культивирования клеток. В данном примере два хорошо известных лекарственных средства на основе 1§О, авастин и эрбитукс, дегликозилировали как Епбо849, так и Епбо849. Образцы инкубировали с Епбо849 или Епбо849, как представлено ниже в таблице.

Дорожка	Образец	Эрбитукс 100 мкг	Авастин 100 мкг	ЕпбоЗ 0,1 мг/мл (мкл)	Епбо349 0,1 мг/мл (мкл)	МеЗ 1 мкг
1	стандарт ММ (молекулярная масса)
2		-	+	5	-	+
3		-	+	50	-	+
4		-	+	-	5	+
5		-	+	-	50	+
6		-	+	-	-	+
7		+	-	5	-	+
8		+	-	50	-	+
9		+	-	-	5	+
10		+	-	-	50	+
11		+	-	-	-	+
12	стандарт ММ	-	-	-	-	-

- 22 028490

Результаты представлены на фиг. 6. Обнаружили, что ЕпбоЗ49 обладает способностью расщеплять большее более широкий спектр Рс по сравнению с ЕпбоЗ. Даже если инкубацию оставляли на всю ночь для сведения к минимуму эффекта потенциальных различий в ферментативной активности, фермент ЕпбоЗ не мог полностью дегликозилировать гликаны Рс эрбитукса. Однако ЕпбоЗ49 демонстрирует профиль полного дегликозилирования и, следовательно, является более благоприятным ферментом в отношении профилирования гликанов иммуноглобулинов.

Claims (5)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ дегликозилирования иммуноглобулина, включающий инкубирование иммуноглобулина с полипептидом, содержащим:

   (а) аминокислотную последовательность ЗЕр II) N0: 1 или (б) ее вариант, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью ЗЕр II) N0: 1 и обладающий эндогликозидазной активностью.
2. 2. Способ по п.1, дополнительно включающий оценку профиля гликозилирования указанного иммуноглобулина путем анализа продуктов, полученных в результате указанного инкубирования.
3. 3. Способ по п.2, дополнительно включающий:

   (а) приведение иммуноглобулина в контакт с указанным полипептидом для гидролиза гликана иммуноглобулина;

   (б) отделение гликана от дегликозилированного белка;

   (в) анализ гликана и/или дегликозилированного белка, полученных таким образом.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором иммуноглобулин представляет собой антитело 1дО.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, в котором иммуноглобулин представляет собой моноклональное антитело 1дО.