JP2020521460A - O−糖タンパク質のためのプロテアーゼ及び結合ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号1のアミノ酸配列;
(b)該配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列;又は
(c)該配列番号1の配列の断片若しくは該配列番号1のアミノ酸配列と85%同一であるアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列
を含むポリペプチドが提供される。
(a)配列番号5のアミノ酸配列;
(b)配列番号5若しくは配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列;あるいは
(c)該配列番号5若しくは配列番号20の配列の断片、又は該配列番号5若しくは配列番号20のアミノ酸配列と85%同一であるアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列
を含むポリペプチドが提供される。
(a)該サンプルを本発明のポリペプチドと接触させて、該本発明のポリペプチドとO結合型糖ペプチド及び/又はO−糖タンパク質との間で複合体(O結合型糖ペプチド/タンパク質−ポリペプチド複合体)を形成させることと;
(b)任意で、接触させたサンプルから該ポリペプチドを分離することと;
(c)分離されたポリペプチドがO−結合型の糖タンパク質又は糖ペプチドに結合しているかどうかを判定して、該サンプル中のO−結合型の糖ペプチド又は糖タンパク質の有無を判定することと
を含む方法も提供される。
配列番号1は、O−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列である。
「ポリペプチド」は、本明細書では、2つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、又は他のペプチドミメティックの化合物を指すために、その最も広い意味で使用される。従って、用語「ポリペプチド」は、短いペプチド配列を含み、より長いポリペプチド及びタンパク質も含む。用語「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」は、互換的に使用することができる。本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸」とは、D型又はL型の光学異性体の両方を含む、天然及び/又は非天然、すなわち、合成のアミノ酸、並びにアミノ酸アナログ、及びペプチドミメティックを指す。
エンドプロテーゼ活性を有するポリペプチドの機能的特徴
一実施形態では、本発明は、O−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性を有するポリペプチドに関する。言い換えれば、ポリペプチドは、任意のO−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有する。ポリペプチドは、O結合型糖タンパク質、好ましくは、任意のヒトO結合型糖タンパク質を切断する。O結合型糖タンパク質の例は、完全長抗体、Fc断片及びFc融合タンパク質、特にIgA、IgD、及びIgG3のアイソタイプのものを含む、免疫グロブリンの全て又は一部を含むか又はからなる任意のタンパク質を含む。O結合型糖タンパク質の別の例は、IgG1のFc部分に連結しているヒトTNFα受容体2のリガンド結合ドメインと多数のO−グリコシル化部位との融合タンパク質であるエタネルセプトである。O結合型糖タンパク質の他の例は、エリスロポエチン(EPO)、TNFα受容体、フェチュイン、及びプラスミノーゲンを含む。
この章は、この実施形態に係るポリペプチドの構造的特徴について記載し、これは、上の章に概説された機能的特徴に加えて適用される。
(a)配列番号1のアミノ酸配列;
(b)該配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列;又は
(c)該配列番号1の配列の断片若しくは該配列番号1のアミノ酸配列と85%同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列
を含み、
任意で、N末端における追加のメチオニン及び/又はC末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグが、リンカーによってC末端に連結され得るポリペプチドである。
また、本発明は、O−糖タンパク質を加水分解する方法であって、該タンパク質のサンプルを、O−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有する本発明のポリペプチドと接触させることを含み、任意で、加水分解生成物を検出することを更に含む方法を提供する。
エンドプロテーゼ活性が欠けているポリペプチドの機能的特徴
一実施形態では、本発明は、O−グリカンに結合する能力を保持しながら、エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下しているポリペプチドに関する。言い換えれば、ポリペプチドは、該グリカンが結合している糖タンパク質をそれほど加水分解しないO−グリカン特異的結合剤として説明することができる。
この章は、この実施形態に係るポリペプチドの構造的特徴について記載し、これは、上の章に概説された機能的特徴に加えて適用される。本発明のこの実施形態に係るポリペプチドは、該活性が低下するか又はなくなるように1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換によってアミノ酸配列が改変されていることを除いて、エンドプロテーゼ活性を有するポリペプチドに関連して上に記載したのと同じ構造的特徴を有し得る。典型的には、本発明のこの実施形態に係るポリペプチドは、HEbbH又はabxHEbbHbcのインタクトなメタロプロテアーゼモチーフを含まない。該モチーフは、付加、欠失、又は置換によって破壊され得るが、好ましくは、少なくとも1つのアミノ酸置換によって破壊される。好ましくは、置換は、該モチーフにおけるグルタミン酸(E)残基の別のアミノ酸による置換、及び/又は短い方のモチーフの1番目の位置に対応する位置(長い方のモチーフの4番目の位置)におけるヒスチジン(H)残基の置換、及び/又は短い方のモチーフの5番目の位置に対応する位置(長い方のモチーフの8番目の位置)におけるヒスチジン(H)残基の置換を含む。好ましくは、3つの上記置換のいずれか又は両方又は全てが非保存的である。E残基の置換は、電子移動を減少させるか又はなくすはずである。H残基のいずれかの置換は、亜鉛イオン補助因子の結合を減少させるか又はなくすはずである。従って、E残基は、好ましくは、非極性又は非荷電のアミノ酸、例えば、A、C、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、又はW等で置換されるが、最も好ましくは、アラニン(A)又はグリシン(G)で置換される。H残基は、それぞれ個々に、任意の非Hアミノ酸で置換されてもよいが、同様に非極性アミノ酸、例えばA及びGが好ましい。
(a)1番目の位置におけるHが、別のアミノ酸、好ましくはA若しくはGで置換される;及び/又は
(b)2番目の位置におけるEが、非荷電アミノ酸、任意でA、C、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、若しくはW、好ましくはでA若しくはGで置換される;及び/又は
(c)5番目の位置におけるHが、別のアミノ酸、好ましくはA若しくはGで置換されるように破壊されたバージョンの該モチーフを含み、
該モチーフにおけるbが、非荷電アミノ酸、任意でA、C、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、又はWである
と説明することができる。
(a)xが、好ましくは、Hを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはA若しくはGである;及び/又は
(b)bが、非荷電アミノ酸、任意でA、C、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、若しくはW、好ましくはA若しくはGである
モチーフxbbbxを含み;
任意で、該モチーフが、配列番号1の181〜185位に対応する位置において該ポリペプチド中に存在すると説明することができる。
(a)aが、アミノ酸V、T、又はGであり;
(b)bが、非荷電アミノ酸、任意でA、C、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、又はW、好ましくはA又はGであり;
(c)xが、モチーフの4番目の位置及び/又は8番目の位置におけるアミノ酸が、好ましくはHではなく、好ましくはA又はGであることを除いて、任意のアミノ酸であり;かつ
(d)cが、疎水性アミノ酸、任意でA、C、F、I、L、M、P、V、W、又はYである
モチーフabxxbbbxbcを含み;
任意で、該モチーフが、配列番号1の178〜187位に対応する位置において該ポリペプチド中に存在する
と説明することができる。
(a)配列番号5又は配列番号20のアミノ酸配列;
(b)該配列番号5又は配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列;
(c)該配列番号5若しくは配列番号20の配列の断片、又は該配列番号5若しくは配列番号20のアミノ酸と85%同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列
を含み、
任意で、N末端における追加のメチオニン及び/又はC末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグが、リンカーによってC末端に連結され得るポリペプチドである。
(a)1番目の位置におけるHが、別のアミノ酸、好ましくはA若しくはGで置換される;及び/又は
(b)2番目の位置におけるEが、非荷電アミノ酸、任意でA、C、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、若しくはW、好ましくはA若しくはGで置換される;及び/又は
(c)5番目の位置におけるHが、別のアミノ酸、好ましくはA若しくはGで置換されるように、上記の通り達成され、
該モチーフにおけるbは、非荷電アミノ酸、任意でA、C、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、又はWである。
(a)xが、好ましくは、Hを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはA若しくはGである;及び/又は
(b)bが、非荷電アミノ酸、任意でA、C、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、若しくはW、好ましくはA若しくはGである
モチーフxbbbxを含むと説明することができる。
また、本発明は、O−グリカンに結合させる方法であって、該O−グリカンを含むサンプルを、O−グリカンに結合することができ、かつO−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下している本発明のポリペプチドと接触させることを含む方法を提供する。方法は、任意で、O−グリカンが結合しているかどうかを判定すること、及び/又は得られた混合物からO−グリカン及び任意の結合している糖タンパク質を分離することを更に含む。
材料及び方法
LSの突然変異誘発
プライマーE206A_fwd 5’−ATGGCGCACGCGCTGGGCCACG−3’及び5’−GCCACCGTAC CATTTCGTC−3’(rev)を使用し、製造業者の指示書に従って(アニーリング温度68℃、3分間伸長)、Q5(NEB)を使用する部位特異的突然変異誘発を実施し;それによって、アッカーマンシア・ムシニフィラ由来のAmuc1119遺伝子におけるグルタミン酸をアラニンに変化させて、突然変異体Amuc1119E206A(LSE206A)を作製した。コンストラクトをDH5α大腸菌に形質転換し、単離し、シーケンシングを使用して確認した(GATC Biotech)。
アッカーマンシア・ムシニフィラATCC BAA−835由来の遺伝子Amuc1119及び突然変異体Amuc1119E206A(Amuc1119−LS;Amuc1119E206A−LSE206A)を、大腸菌における発現に対してコドン最適化し(DNA2.0)、融合タンパク質の一部としてC末端における6×Hisタグと共に発現ベクターにクローニングした。
TNFαRを2:1比でLSと混合し、37℃で15〜60分間インキュベートし、その後、4〜20%Novex勾配SDS−PAGEでタンパク質を分離した。LS活性に対するNaCl(0〜1M)、二価カチオン、EDTA、及びpHの影響を調べ、Gel Doc EZ(BioRad)を使用した濃度測定分析を通して生成された加水分解断片の差を測定した。
TNFαR(0.5μg)を、PBS中37℃で15又は60分間、様々な用量のLSと共にインキュベートし、その後、4〜20%Novex勾配SDS−PAGEでタンパク質を分離した。効率的なインキュベート条件に最適な用量及び時間を求めるために、生成された断片の強度(濃度測定)を使用した。
2:1の比(基質:酵素)で、LSを様々なN又はO結合型基質と共に37℃で一晩インキュベートした。50:1(基質:酵素)の比で、LSをEPO(0.3mg/mL)と共にインキュベートした。タンパク質を分離し、4〜20%Novex勾配SDS−PAGEゲルで分析した。
LSE206Aをカップリングバッファ(0.2M NaHCO3、0.5M NaCl pH8.3)に再懸濁させ、20mg/mLに濃縮した。製造業者の指示書に従って、カップリング用にNHS活性化セファロース4 Fast Flow(GE Healthcare)を調製した(例えば、HCl洗浄及びカップリングバッファで平衡化)。常に混合するためにゆっくり揺らしながら、4℃で一晩セファロースと共にインキュベートすることによって、LSE206Aを固定化した。0.1M Tris pH8.5を添加することによってセファロースをブロッキングし、0.1M Tris pH8.5/0.1M NaAc、0.5M NaCl pH5.0による洗浄を3回繰り返し、使用までEtOH中で保存した。
PBSで平衡化した固定化されたLSE206A(例えば、約50μgのタンパク質)50μLを含むスピンカラムを、シアリダーゼミックス(Am0707:Am1757)又はシアリダーゼとストレプトコッカス・オラリスのエンド−α−N−アセチル−ガラクトサミニダーゼ(例えば、O−グリコシダーゼ)との組み合わせのいずれかで前処理した糖タンパク質10μgと共にインキュベートした。サンプルを37℃で2時間インキュベートし、その後、カラムをPBSで洗浄し(10体積;100g、30秒間)、0.1MグリシンpH3.0で溶出した。画分をSDS−PAGで分析した。
エタネルセプト(Enbrel(登録商標))は、臨床的に承認されている、TNFαに結合するFc融合タンパク質である。エタネルセプトは幾つかのO−グリカンを含有する。酵素の切断特異性を試験するために、エンドプロテーゼをエタネルセプトと共に37℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析を単純化するために、第2ラウンドの酵素処理を行って、シアリダーゼ及びO−グリコシダーゼを使用して残りのO−グリカンを除去した(一晩、PBS中、1:40比の全ての単一酵素)。C18逆相液体クロマトグラフィによってペプチドを分離した後、生成されたペプチドをMS/MSによって分析した。
LSは、推定メタロプロテアーゼである
配列及びドメインの類似性に基づいて、LSは、一般的なメタロプロテアーゼ配列abxHEbbHbc(a=V/T、b=非荷電、c=疎水性)に対する類似性を共有している、推定活性部位配列GMAHELGHGLを含有する幾つかのメタロプロテアーゼと相同性を共有している。ヒスチジンは、一般に基質結合及びZn2+親和性に関与するが、グルタミン酸は、ヒスチジンと共に電子移動、ひいては、加水分解効果を媒介する。酵素を更に特性評価することができるように、EをAに変更することによって基質に結合することはできるが、加水分解能が欠けているか又は低下しているLSE206A突然変異体を構築した。完全に不活性にするために、更なる改変(例えば、HからAへの変更)が必要になる場合もある。両コンストラクトは良好に発現し、そのHisタグに基づいて、アフィニティークロマトグラフィーを使用して容易に精製された(図1)。
LSの基質特異性について調べるために、プロテアーゼを多様なタンパク質と共にインキュベートした。図2に示す通り、LSをIgA及びハーセプチン(トラスツズマブ)と共にインキュベートした。LSは、IgA等のO結合型グリカンを有するタンパク質にのみ作用することができた。一見したところ末端シアル酸の存在がLSの活性を部分的に阻害するが、シアル酸が存在しないことが加水分解にとって必須ではない(図4)。
LSの酵素特性を評価するために、SDS−PAGEゲルの濃度測定分析を実施した。LSは、ほとんどの条件下で活性であるが、わずかに酸性のpH及び低NaCl濃度が好ましい(図3A〜3B)。Mg2+及びCa2+のイオンは、いずれもLSの加水分解活性に対して正の影響を与えたが、Zn2+の存在は活性を著しく低下させ、EDTAは活性を完全に消失させた(図3C〜D)。
末端シアル酸の非存在下では増大した活性を有するが、LSの活性にとってO−グリカンにおける他の糖質の重要性は完全には理解されていなかった。LSの活性は末端シアル酸の非存在下において著しく増大するが、ガラクトースを除去するとLSの活性が完全に阻害される(図4A)。更に、シアリル化タンパク質におけるLSの活性低下は、一晩インキュベートした後の完全な加水分解によって示される通り、シアル酸の存在下で結合を加水分解する能力がないことに起因するのではない(図4B)。LSの活性はO−グリカンに完全に依存しているが、その理由は、N−グリカンの除去がLSによる加水分解に影響を与えなかったためである(図4C)。
O−グリカンが活性にとって重要であることが示されたので、次に、LSの特異的切断部位について調べようとした。質量分析を使用して、LSがO−グリコシル化Ser/ThrとそのN末端アミノ酸との間のアミノ結合を、アミノ酸の種類にかかわらず(例えば、プロリンが加水分解を阻害するとは思われない)加水分解することを立証することができた(図5)。
LSのO−グリカンに結合し、グリカンに隣接する(例えば、Ser/Thrに隣接する)アミノ酸結合を特異的に加水分解する能力を備えていることから、LSのE206A突然変異体は加水分解能が欠けているが、結合能は保持していると仮定した。このようなツールは、特に、a)O結合型糖タンパク質の同定、b)除去又は研究のためのO結合型糖ペプチドのアフィニティー精製、及びc)O−グリカンのアフィニティー精製にとって有用である。
エンドプロテーゼ活性が特定のシアル酸結合に依存しているので、最大の効果を得るためには2−3及び2−6結合シアル酸の両方を除去する必要があることが本発明者らによって最近判明した。LSの活性に対する特定のシアル酸結合の個々の役割を決定するために、Enbrelを、LSと組み合わせて様々なシアリダーゼと共に30分間〜20時間インキュベートした。LSによる加水分解には、2−3結合を除去すれば十分であると思われた(図7)。
EPOをPNGaseF、シアリダーゼ(Smix、Am0707及びAm1757を含む)、及び/又はO−グリコシダーゼで処理し、LSと共にインキュベートした。
SAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGD(質量=4900.5868Da−切断点のC末端側の配列に対応、従って、N末端セリンに依然として結合しているO−グリカンを含む);及び
APPRLICDSRVLERYLLEAKEAEDITTGCAEHCSLDENITVPDTKVDFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAA(質量=13714.1199Da、切断点のN末端側の配列に対応)。
序論
実施例1に記載のLSE206A突然変異体には、LSの活性部位の部位特異的突然変異(abxHEbbHbcからabxHAbbHbcへ)が組み込まれたので、酵素クレフトの電子移動能が除去されている。以下に更に説明する通り、更なるストレス試験時に、この変化によって野生型配列に比べてO−グリコプロテアーゼ活性が低下するが、完全にはなくならないことが見出された。従って、本発明者らは、酵素クレフトに更なる置換が組み込まれた別の突然変異体を開発し、特性評価した。具体的には、補助因子亜鉛イオンの配向において重要なHis残基をAlaで置換した。得られた二重突然変異体をH205A/E206A(abxHEbbHbcからabxAAbbHbcへ)と称する。
(例えば、実施例1に示すような)標準的なプロトコールを使用する部位特異的突然変異誘発を使用して、アッカーマンシア・ムシニフィラのAmuc1119遺伝子に比べてヒスチジン及びグルタミン酸の両方をアラニンに変化させて、二重突然変異体Amuc1119H205A/E206A(LSH205A/E206A)を作製した。コンストラクトを大腸菌に形質転換し、実施例1の通り単離し、シーケンシングを使用して確認した。実施例1に記載の通り、大腸菌における発現を実施した。発現したタンパク質の配列を配列番号21として提供する。
2.2.1 二重突然変異体はLSの活性を完全に不活化する
実施例1に示す通り、2時間でO−糖タンパク質を加水分解する能力がないことに鑑みて、単一突然変異体LSE206Aは不活性であることが分かった。しかし、ストレス試験では、O−グリコプロテアーゼ活性が完全にはなくならず、より高い酵素:O−糖タンパク質比及びより長いインキュベート時間では若干の活性が観察されたので低下するだけであることが見出された。
様々なタンパク質に対する結合を評価するために、固定化されたLSH205A/E206A(50μL樹脂)(実施例1と同じプロトコールを使用して調製)をPBSで平衡化し、その後、様々なタンパク質サンプル50μgを0.5mg/mLの濃度で添加し、回転させながら室温で2時間インキュベートした。遠心分離(200g、1分間)を介して素通り画分を回収し、樹脂をPBS350μLで3回洗浄した。8M尿素50μLと共に2回逐次5分間インキュベートし、続いて、遠心分離(1000g、1分間)することによって、結合しているタンパク質を溶出した。全てのサンプルを等体積でロードした。出発/ローディング物質、素通り画分、及び溶出液をSDS−PAGEによって評価した。
より多くのO−グリコシル化タンパク質に結合するように、固定化された二重突然変異体樹脂の能力を改善する能力について調べるために、樹脂への固定化中に様々な濃度の二重突然変異体(5〜15mg/mL)を使用した。代表的なゲルを図12Aに示す。示されている%は、ポジティブコントロールに比べた結合レベルであり、ゲルの濃度測定分析によって決定した。結果を図12Bのグラフに示す。固定化中により高い濃度の二重突然変異体を使用したとき、O−糖タンパク質結合能が高くなると共に能力の用量依存的増大がみられた。15mg/mLの固定化二重突然変異体を使用して更に実験を継続した。更に、1M尿素及び1M GHClの存在下でさえも高い程度のO−糖タンパク質結合が維持されたが、後者では、結合効率が著しく低下した。
O−糖タンパク質をアフィニティー精製する二重突然変異体樹脂の能力、及びこの能力に対するサンプル濃度の影響を具体的に調べるために、様々な量及び濃度のアシアリル化エタネルセプトを樹脂に添加した。個々のカラム(二重突然変異体樹脂50μLを含有する)は、O−糖タンパク質約150μgに結合する能力、すなわち、3mg(糖タンパク質)/L(樹脂)を有していた。図13は、代表的なゲルを示す。
樹脂の結合能に対するイオン強度、バッファの体積/種類、及びpHの効果を試験するために、多様な異なる条件下で、回転させながら室温で2時間、サンプルタンパク質を二重突然変異体樹脂に結合させた。いずれの場合も、次いで、樹脂をそのそれぞれの結合バッファ(350μL)で3回洗浄し、次いで、8M尿素を添加して溶出した(50μL、5分間インキュベート;2回繰り返す)。次いで、全てのサンプルをSDS−PAGEによって分析した。
二重突然変異体とそのO−糖タンパク質基質との間の高い親和性に基づいて、本発明者らは、イオン強度に基づかない、結合しているタンパク質を樹脂から溶出するための様々な手段について調べた。尿素は、用量依存的溶出を有し、8M尿素を使用すると100%近く溶出された(図15A)。高濃度のSDS(例えば、5〜10%)も、結合しているタンパク質の大部分を溶出した(図15B)。しかし、多くの下流の用途は洗浄剤の存在に対して感受性であるので、結合しているタンパク質/ペプチドの非酵素的放出にとっては、高レベルの尿素の使用がより実用性が高い可能性がある。
本発明者らは、二重突然変異体に結合しているタンパク質にLSを添加した結果、それが放出され得るので、尿素の添加は溶出に必須ではないと推測した。アバタセプト及びエタネルセプトはいずれも6時間でLSによって加水分解され、二重突然変異体樹脂から溶出され得たが、24時間後にはわずかにより完全に溶出された(図16A)。その後の尿素の添加によって、アフィニティーマトリクスに結合した状態のままのO−糖タンパク質が非常にわずかであることが示され、このことは、LS溶出ストラテジが非常に効率的であったことを立証する。
単純化された系だけでなく、複合培地でも、この系がO−グリコシル化されたタンパク質のための汎用アフィニティーマトリクスとして機能し得ることの概念実証として、本発明者らは、ヒト血清からO−糖タンパク質を精製する二重突然変異体の能力について調べた。ヒト血清は、主に非グリコシル化(BSA)及びN−グリコシル化(IgG)されたタンパク質からなり、全血清プロテオームのうちのほんのわずかしかO−グリコシル化されていない。
LS二重突然変異体がO−糖タンパク質に対しても特異的であることを立証するために、一連の実験を実施した。第1の実験では、O−グリコシル化ペプチド(スレオニンにコア1O−グリカンを含むグリコドロソシン(GD)=GKPRPYSPRPTSHPRPIRV(配列番号47))及び幾つかの非グリコシル化ペプチド(H2686、H4062、H8390、及びインスリン酸化ベータ鎖(IOB))のミックスをLS二重突然変異体樹脂と共にインキュベートした。(H2686=YIYGSFK(配列番号48)、H4062=KKLVFFA(配列番号49)、H8390=FLPLILGKLVKGLL(配列番号50))。
本発明者らは、他の市販されているO−糖タンパク質結合マトリクス、具体的には、レクチンピーナッツ凝集素(PNA)及びナヨクサフジ(Vicia villosa)レクチン(VVA)と比べて、O−糖タンパク質をアフィニティー精製する二重突然変異体の能力を評価した。エタネルセプト及びアシアリル化エタネルセプトをモデル基質として使用した。
配列番号1
(下線はシグナル配列)
(メタロプロテアーゼモチーフ)
(下線はシグナル配列)
(注記:下線は、予測されるO−グリカンを有するセリン;C末端アルギニンは、一般的に発現中に切断される)
(破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ)
(破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ)
(破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ)
(下線はメタロプロテアーゼモチーフ)
(下線はメタロプロテアーゼモチーフ)
(下線はメタロプロテアーゼモチーフ)
(下線はメタロプロテアーゼモチーフ)
(下線はメタロプロテアーゼモチーフ)
(下線はメタロプロテアーゼモチーフ)
(Uniprotアクセッション:Q9I5W4.1)
(下線はメタロプロテアーゼモチーフ)
(太字、下線はシグナル配列)
(Uniprotアクセッション:Q89ZX7.1)
(下線はメタロプロテアーゼモチーフ)
(太字、下線はシグナル配列)
(太字、イタリック体は成熟タンパク質において除去される他の配列)
(Uniprotアクセッション:A0A0H2YN38.1)
(下線はメタロプロテアーゼモチーフ)
(太字、下線はシグナル配列)
(太字、イタリック体は成熟タンパク質において除去される他の配列)
(下線は破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ)
(下線は破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ)
(下線は破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ)
(下線は破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ)
(下線は破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ)
(下線は破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ)
(メタロプロテアーゼモチーフ)
(メタロプロテアーゼモチーフ)
(メタロプロテアーゼモチーフ)
(破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ)
(破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ)
(破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ)
(TにO−gly部位を有するグリコドロソシンペプチド)
(非O−グリコシル化ペプチド)
(非O−グリコシル化ペプチド)
(非O−グリコシル化ペプチド)
Claims (20)
- (a)配列番号1のアミノ酸配列;
(b)前記配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列;又は
(c)前記配列番号1の配列の断片若しくは前記配列番号1のアミノ酸配列と85%同一であるアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列
を含む、O−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性を有するポリペプチド。 - 前記配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列又はその断片が、モチーフHEbbH(式中、bは、非荷電アミノ酸、任意でA、C、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、又はWである)を含み、任意で、前記モチーフが、配列番号1の181位〜185位に対応する位置において前記ポリペプチド中に存在する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記モチーフが、配列HEIGH又はHELGH、好ましくはHELGHを含む、請求項2に記載のポリペプチド。
- (a)aが、アミノ酸V、T、又はGであり;
(b)bが、非荷電アミノ酸、任意でA、C、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、又はWであり;
(c)xが、任意のアミノ酸であり;
(d)cが、疎水性アミノ酸、任意でA、C、F、I、L、M、P、V、W、又はYである、モチーフabxHEbbHbcを含み、
任意で、前記モチーフが、配列GMAHELGHGL又はGVAHELGHNF、好ましくはGMAHELGHGLを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - N末端における追加のメチオニン及び/又はC末端におけるHisタグを含み、前記タグが、リンカーによって前記C末端に連結されていてよく、任意で、前記ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列を含むか又は配列番号2のアミノ酸配列からなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、溶液中で提供されるか、凍結乾燥されているか、又は固定化されており、任意で、前記ポリペプチドが、シアリダーゼ、好ましくはAm1757又はAm1757とAm0707との混合物と共に提供され、Am1757が、配列番号11からなるポリペプチドである及び/又はAm0707が、配列番号14からなるポリペプチドである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- O−糖タンパク質を加水分解する方法であって、前記タンパク質を含むサンプルを請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含み、任意で、加水分解生成物を検出又は分析することを更に含む方法。
- タンパク質のグリコシル化状態を評価する方法であって、前記タンパク質を含むサンプルを請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることと、生成された生成物を検出及び/又は分析することとを含み、任意で、切断生成物の有無を使用して前記サンプル中のO−糖タンパク質の有無を判定する、並びに/又は前記分析を実施してO−グリカン鎖の種類及び/若しくはそのO−糖タンパク質への結合位置を同定する、方法。
- 前記分析又は検出が、アフィニティークロマトグラフィー、SDS−PAGE、HPLC、又は質量分析によって実施される、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記タンパク質又はサンプルを請求項1〜6に記載のポリペプチドと接触させる前に又は同時に、前記サンプルをシアリダーゼと共にインキュベートし、好ましくは、前記シアリダーゼが、Am1757又はAm1757とAm0707との混合物である、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- Am1757が、配列番号11からなるポリペプチドである及び/又はAm0707が、配列番号14からなるポリペプチドである、請求項10に記載の方法。
- O−グリカン又はO−糖タンパク質に結合することができ、O−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下しているポリペプチドであって、
(a)配列番号5若しくは配列番号20のアミノ酸配列;
(b)前記配列番号5若しくは配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列;あるいは
(c)前記配列番号5若しくは配列番号20の配列の断片、又は前記配列番号5若しくは配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列
を含むポリペプチド。 - 前記配列番号5若しくは配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列又はその断片が、メタロプロテアーゼモチーフHEbbHを含まず、好ましくは、
(a)1番目の位置におけるHが、別のアミノ酸、好ましくはA若しくはGで置換される;及び/又は
(b)2番目の位置におけるEが、非荷電アミノ酸、任意でA、C、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、若しくはW、好ましくはでA若しくはGで置換される;及び/又は
(c)5番目の位置におけるHが、別のアミノ酸、好ましくはA若しくはGで置換されるように破壊されたバージョンの前記モチーフを含み、
前記モチーフにおけるbが、非荷電アミノ酸、任意でA、C、F、G、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、又はWである、請求項12に記載のポリペプチド。 - N末端における追加のメチオニン及び/又はC末端におけるHisタグを含み、前記タグが、リンカーによって前記C末端に連結されていてよく、任意で、前記ポリペプチドが、配列番号6又は21のアミノ酸配列を含むか又は配列番号6又は21のアミノ酸配列からなる、請求項12又は13に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、溶液中で提供されるか、凍結乾燥されているか、又は固定化されており、任意で、前記ポリペプチドが、シアリダーゼ、好ましくはAm1757又はAm1757とAm0707との混合物と共に提供される、請求項12〜14のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- O−グリカン、O−糖ペプチド、及び/又はO−糖タンパク質に結合させる方法であって、前記O−グリカン、O−糖ペプチド、及び/又はO−糖タンパク質を含むサンプルを請求項12〜15のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることと、任意で、O−グリカン、O−糖ペプチド、及び/若しくはO−糖タンパク質が結合しているかどうかを判定すること、並びに/又は得られた混合物から前記O−グリカン及び任意の結合している糖タンパク質、前記O−糖ペプチド、若しくは前記O−糖タンパク質を分離することとを含み、任意で、O−グリカン若しくは結合している糖タンパク質、O−糖ペプチド、又はO−糖タンパク質を前記サンプルから単離することを目的とする方法。
- タンパク質のグリコシル化状態を評価する方法であって、前記タンパク質を含むサンプルを請求項12〜15のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることと、前記タンパク質が前記ポリペプチドに結合しているかどうかを判定することとを含む、方法。
- サンプル中のO−糖ペプチド及び/又はO−糖タンパク質を検出する方法であって、
(a)前記サンプルを請求項12〜15のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させて、O−糖ペプチド及び/又はO−糖タンパク質と前記ポリペプチドとの間で複合体を形成させることと;
(b)任意で、接触させたサンプルから前記ポリペプチドを分離することと;
(c)分離されたポリペプチドがO−結合型の糖タンパク質又は糖ペプチドに結合しているかどうかを判定して、前記サンプル中のO−結合型の糖ペプチド又は糖タンパク質の有無を判定することと
を含む、方法。 - 前記判定及び/又は分離が、アフィニティークロマトグラフィー、SDS−PAGE、HPLC、レクチンブロッティング、ELISA、又は質量分析によって実施される、請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 結合している物質を、請求項12〜15のいずれか一項に記載のポリペプチドから、
(a)高モル濃度の尿素;
(b)高濃度の洗浄剤;又は
(c)請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド
を含むバッファで溶出する工程を更に含む、請求項16〜19のいずれか一項に記載の方法。
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