JP7195008B2 - グリカン分析のための酵素 - Google Patents
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Description
(a)配列番号2のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;
(b)該配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;又は
(c)該配列番号2の配列の断片若しくは該配列番号2のアミノ酸配列と85%同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;
から独立して選択される第1のシアリダーゼを含む組成物であって、
任意で、該第1のシアリダーゼが、N末端における追加のメチオニン及び/又はC末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグが、リンカーによってC末端に連結され得る組成物を提供する。
(d)配列番号5のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;
(e)該配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;又は
(f)該配列番号5の配列の断片若しくは該配列番号5のアミノ酸配列と85%同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;
から独立して選択される第2のシアリダーゼを更に含む、上に定義された組成物であって、
任意で、該第2のシアリダーゼが、N末端における追加のメチオニン及び/又はC末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグが、リンカーによってC末端に連結され得る組成物を提供する。
糖タンパク質を含有するサンプルを上に定義されたと接触させることを含み、任意で、得られた生成物を分析する方法を提供する。
配列番号1、2、及び3は、それぞれ、アッカーマンシア・ムシニフィラ(Akkermansia muciniphila)から単離されたシアリダーゼのアミノ酸配列である。配列番号1は、N末端にシグナルモチーフを含む野生型配列である。配列番号2は、シグナルモチーフが除去された野生型配列である。配列番号3は、追加のN末端メチオニン及びC末端リンカー+His6タグを含むことを除いて配列番号2と同一である。配列番号2の配列を含む任意の配列(配列番号1~3のそれぞれを含む)を本明細書ではAm0707と称する場合もある。
開示される生成物及び方法の様々な用途は、当技術分野における具体的なニーズに応じて調整できることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されたい。上記であろうと下記であろうと、本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「ポリペプチド」は、本明細書では、2つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、又は他のペプチドミメティックの化合物を指すために、その最も広い意味で使用される。従って、用語「ポリペプチド」は、短いペプチド配列を含み、より長いポリペプチド及びタンパク質も含む。用語「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」は、互換的に使用することができる。本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸」とは、D型又はL型の光学異性体の両方を含む、天然及び/又は非天然、すなわち、合成のアミノ酸、並びにアミノ酸アナログ、及びペプチドミメティックを指す。
機能的特徴
グリカン鎖を改変するために化学的及び遺伝的アプローチを使用することに加えて、幾つかの酵素(グリコシダーゼ)は、シアル酸を他のグリカンに結合させる結合に対して作用することができる。シアリダーゼ又はノイラミニダーゼと呼ばれるこれら酵素は、特定の種類のシアル酸結合に対して高度の特異性を示す。ヒト糖タンパク質内には一般的に3つの異なる結合タイプがみられるが、アルファ(2-3)結合が主要な形態であり、続いて、アルファ(2-6)及びアルファ(2-8)である。本明細書では、簡略化するために、これら結合タイプを2-3、2-6、及び2-8の結合と称する場合もある。2-3結合は、シアル酸六炭糖の位置番号2における炭素原子が、酸素原子を介して、結合するグリカンの六炭糖の3位における炭素に結合することを意味する。対応して、2-6結合又は2-8結合は、それぞれ、結合するグリカンの六炭糖の6位又は8位に結合することを意味する。
本発明者らは、共生腸内細菌アッカーマンシア・ムシニフィラから幾つかのシアリダーゼを同定し、特性評価した。本明細書ではAm0707と称されるシアリダーゼのうちの1つは、予想外なことに、2-8結合に対して高い活性を有するが、2-3及び2-6の結合も切断することができる。従って、広域スペクトルシアリダーゼであるとみなすことができる。本明細書ではAm1757と称される別のシアリダーゼは、2-3結合に対してのみ高い活性を有する。従って、狭域スペクトルシアリダーゼであるとみなすことができる。
(a)配列番号2のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;
(b)該配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;又は
(c)該配列番号2の配列の断片若しくは該配列番号2のアミノ酸配列と85%同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;
であり、第2のシアリダーゼは、
(d)配列番号5のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;
(e)該配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;又は
(f)該配列番号5の配列の断片若しくは該配列番号5のアミノ酸配列と85%同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;
であり、
任意で、該第1及び/又は該第2のシアリダーゼは、N末端における追加のメチオニン及び/又はC末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグは、リンカーによってC末端に連結され得る。
シアリダーゼ組成物は、好ましくは実質的に単離又は精製された形態の、少なくとも1つのシアリダーゼを含む。上記ポリペプチドに関する一般的な記載のように、これは、典型的には、シアリダーゼが発現した細胞からの細胞抽出物中に存在する他の成分の大部分から単離されていることを意味する。実質的に精製されたとは、シアリダーゼが、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は好ましくは少なくとも90%均質になるまで精製されたと理解される。純度レベルは、任意の好適な手段によって評価することができるが、典型的には、サンプルのSDS-PAGE分析に続いてクマシーブルー検出を含む。シアリダーゼは、該シアリダーゼの意図する目的に干渉しない担体、希釈剤、又は保存剤と混合されてもよく、それでもなお実質的に単離又は精製されたとみなされ得る。シアリダーゼ組成物は、追加の活性成分、例えば、別のシアリダーゼ又は別の酵素を含んでいてもよく、この場合、各該成分は、それぞれの意図する目的に適切な比で混合される前に、高レベルの均質性になるまで個々に精製される。本発明の好ましいシアリダーゼ組成物では、該組成物は、少なくとも90%均質になるまでそれぞれ精製され、互いに対して1:1比で存在する、第1のシアリダーゼ及び第2のシアリダーゼを含む。このような組成物は、追加の活性成分、例えば、シアリダーゼではない別の酵素を含んでいてもよい。他の酵素は、プロテアーゼ及び/又はグリコシダーゼであってよい。プロテアーゼは、好ましくは、O-糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼである。グリコシダーゼは、好ましくは、O-グリコシダーゼである。両方の種類の酵素については、以下でより詳細に論じる。
(a)配列番号2のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;
(b)該配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;又は
(c)該配列番号2の配列の断片若しくは該配列番号2のアミノ酸配列と85%同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;
から独立して選択される第1のシアリダーゼを含む組成物であって、
任意で、該第1のシアリダーゼが、N末端における追加のメチオニン及び/又はC末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグが、リンカーによってC末端に連結され得る組成物を提供する。
(d)配列番号5のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;
(e)該配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;又は
(f)該配列番号5の配列の断片若しくは該配列番号5のアミノ酸配列と85%同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列を含むか若しくはからなるポリペプチド;
から独立して選択される第2のシアリダーゼを更に含み、
任意で、該第2のシアリダーゼが、N末端における追加のメチオニン及び/又はC末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグが、リンカーによってC末端に連結され得る組成物を提供する。第1及び第2のシアリダーゼは、好ましくは、互いに対して1:1比で存在していてよい。
また、本発明者らは、特に上記シアリダーゼ組成物と組み合わせて使用したときにO結合型グリカンを効率的に加水分解する、哺乳類の口道に存在する共生細菌ストレプトコッカス・オラリス由来のO-グリコシダーゼを同定し、特性評価した。O-グリコシダーゼは、本明細書では「O-glyk」又は「So」と称される場合もある。シグナル配列及びLPTXG細胞壁アンカーモチーフを含むO-glykの野生型配列を、配列番号7として提供する。シグナル配列を欠いているO-glykの野生型配列を、配列番号8として提供する。シグナル配列及び細胞壁アンカーモチーフのC末端部を欠いているO-glykの野生型配列を、配列番号9として提供する。N末端における追加のメチオニン及び/又はC末端におけるヒスチジン若しくは他のタグを含めるために、これら配列を任意で改変してもよい。このような追加の配列は、(例えば、大腸菌における)発現及び/又は精製に役立ち得る。ヒスチジンタグは、好ましくは、6個のヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、典型的にはアミノ酸の短い配列、例えば3~5個のアミノ酸であるリンカーによってC末端に連結される。リンカーは、典型的には、主にグリシン及びセリンの残基からなり、好ましくは、配列GSGを含んでいてよい。例えば、GSG及びGSGLEが好適なリンカーである。N末端に追加のメチオニン、そして、C末端にGSGLEリンカー及びHis6タグを有する例示的なO-glyk配列を、配列番号10として提供する。本開示における「O-glyk」又は「So」に対する任意の言及は、配列番号7、8、9、又は10のいずれをも意味し得るが、好ましくは、配列番号9のアミノ酸配列を含むか又はからなり、典型的には、2070アミノ酸以下であるポリペプチドを指す。最も好ましいのは、配列番号10のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
また、本発明者らは、上記シアリダーゼ組成物の作用が、O-グリカン特異的エンドプロテアーゼ、特に、典型的には375アミノ酸以下であり、好ましくは配列番号12のアミノ酸配列からなるポリペプチドである配列番号11のアミノ酸配列を含むO-グリカン特異的エンドプロテアーゼの活性を増強することも見出した。
本発明は、本発明の組成物中の酵素が、存在する任意の基質に対して作用するのに好適な条件下で、サンプルを該組成物と共にインキュベートする任意の方法を提供する。該方法は、任意で、得られた生成物の分析を含んでいてもよい。該分析は、SDS-PAGE、HPLC、レクチンブロッティング、ELISA、又は質量分析を含む任意の好適な手段によって、生成物を分離及び/又は検出及び/又は単離することを含んでいてよい。
材料及び方法
シアリダーゼの発現及び精製
アッカーマンシア・ムシニフィラで同定された遺伝子(Am0705、Am0707、Am1757、Am2058)を、ベクターpET21a(+)において大腸菌で良好に発現するようにコドン最適化した。ベクターをBL21(DE3)Star細胞に形質転換した。大腸菌を200rpmで37℃のLB中においてルーチン的に培養した。プラスミドの存在下で、100μg/mLアンピシリンを添加した。一晩インキュベートした後、培養物を新鮮LB(amp)で1:20希釈し、OD620が約0.7~0.8になるまで成長させ、その後、1mM IPTGを添加することによって組み換えタンパク質発現を誘導し、5時間発現を継続させた後、細胞を収集し、凍結させた。凍結細胞を解凍し、His結合バッファ(20mM NaP pH7.4、500mM NaCl、20mMイミダゾール)に溶解させ(resolved)、細胞内タンパク質を放出させるために超音波処理した。遠心分離によって細胞残屑を除去した。滅菌濾過した上清をニッケルカラムでアフィニティ精製し、PD-25カラムにおいて20mM Tris-HCl pH8.0に再緩衝した。Nanodropを使用してタンパク質の濃度を決定し、SDS-PAGEを通して純度を推定した。
2-3’-シアリルラクトース、2-6’-シアリルラクトース、及びコロミン酸(2-8’;Sigma-Aldrich)を基質として使用して、酵素の加水分解特異性を判定した。酵素(0.05μg)を20mM Tris-HCl pH6.8中基質(25μM)と混合し、37℃で30分間インキュベートし、その後、製造業者の指示書(Sialic Acid Quantification Kit、Abcam)に従って混合物中の遊離シアル酸を定量した。
TNFαR、EPO、Enbrel、及びフェチュイン(0.5μg)を様々な濃度の試験したシアリダーゼ(1:40)又は市販のシアリダーゼ(NEB製、製造業者に従う)と共に混合し、30分間インキュベートし、その後、タンパク質を4~20%Novex勾配SDS-PAGEで分離及び/又はSNAレクチンブロットで分析した。
分離されたタンパク質を、Trans-Blot Turbo Transfer System(BioRad)を使用してPVDFメンブレンに転写した。メンブレンをレクチンバッファでブロッキングし、続いて、一次結合剤(SNA-ビオチン)及び二次結合剤(HRP-ストレプトアビジン;VectorLabs)と共にインキュベートし、その間に洗浄工程を行った。West Pico SuperSignal(ThermoFisher)キットによって化学発光させ、ChemiDoc(BioRad)で検出した。
NaCl(0~1.5M)及びイオン(2mM CaCl2、2mM ZnCl2、5mM EDTA)の影響について調べるために、シアリダーゼを、20mM Tris-HCl pH8.0中2-3’シアリルラクトース(25μM)と共にインキュベートした。最適pHについては、シアリダーゼを酢酸バッファ(4.6及び5.6)及びTris-HClバッファ(6.8、7.4、8.0、及び8.8)中でインキュベートした。全てのサンプルを室温で15分間インキュベートし、その後、製造業者の指示書に従って、混合物をシアル酸定量キット(Abcam)に1:1添加した。全ての値を、各群内の最高活性に関して相対活性として表した。
アッカーマンシア・ムシニフィラのシアリダーゼ、シアリダーゼ混合物、及び定評のあるブランドから購入したシアリダーゼ(NEB P0743S、P0720S、及びP0722S)を、製造業者の指示書に従って、シアル酸定量バッファ(1:1比)と共に、それぞれの最適なバッファ中で2-3’及び2-6’のシアリルラクトース、並びにコロミン酸と共に20分間インキュベートした。
全てのアッカーマンシア・ムシニフィラのシアリダーゼは、良好に発現し、Hisカラムで精製することができる
アッカーマンシアとアノテーションが付けられたシアリダーゼAm0705、Am0707、Am1758、及びAm2058を大腸菌で組み換え的に発現させ、Hisカラムで高純度になるまで精製した(図1)。タンパク質は良好に発現し、そのレベルは、大腸菌培養物1Lあたり70~150mgの精製された酵素の間でばらついていた。更に、シアリダーゼはTrisバッファに高度に可溶性であり、それほど沈殿することなく>3mg/mLに濃縮することができた。
様々なO及びN結合型糖タンパク質に対する精製されたシアリダーゼの初期スクリーニング中、Am0705を除く全てのシアリダーゼが強力な活性を示した(データは割愛する)。Am2058の活性は一定していなかったことから、Am0707及びAm0707/1757の混合物(ミックス、1:1)の特性評価を継続した。
幾つかのシアリダーゼは結合特異性を示し、特定のシアル酸結合(例えば、2-3、2-6、及び/又は2-8)を加水分解する限られた能力を有していた。4つのアッカーマンシア・ムシニフィラのシアリダーゼが様々な結合に作用する能力について調べるために、1種の結合しか存在しない特定の基質(2-3’-シアリルラクトース、2-6’-シアリルラクトース、及びコロミン酸)と共に該シアリダーゼをインキュベートし、遊離シアル酸を定量した(図2)。Am1757は、2-3結合に対して高い特異的活性を有していたが、Am0707は、全ての試験した結合に対してより広いが低い活性を有していた。Am0707とAm1757との組み合わせ(ミックス)からは、より優れた広域スペクトル生成物が得られた(図2)。
シアリダーゼ活性を最適化するために必要な条件について更に調べるために、イオン、pH、及びNaClに対するシアリダーゼの依存性について調べた。2つのシアリダーゼは同様に挙動し、EDTA及びZn2+に対して高い感受性を有していたが、Ca2+に依存していた。酵素は、中性~塩基性のpHにおいてより高い活性を有し、NaClの存在下でその活性の多くを失った(図3)。
特性評価されたシアリダーゼは相補的活性を有しており、Am1757は高い2-3結合加水分解活性を有し、Am0707は2-6、8結合にも作用したので、2つの酵素の比を変化させることによって、ネイティブ糖タンパク質における全てのシアル酸結合に対して2つの酵素の混合物が高い効率を示し得るかどうかについて調べた。1:40 Am0707と共に1:40 Am1757を含有する混合物は、フェチュインにおける全てのシアル酸を急速に(<15分間)加水分解した(図4)。
シアリダーゼ混合物(GVS_Smix)の効率を単一の酵素及びブランド競合製品と比較するために、本発明の酵素をNew England Biolabs(NEB)製の3つの市販シアリダーゼと比較した。これらは、アルスロバクター・ウレアファシェンス(Arthrobacter ureafaciens)由来の広域スペクトルシアリダーゼ(NEB A、アルスロバクター・ウレアファシェンス由来の酵素α2-3,6,8,9ノイラミニダーゼA、カタログ番号P0722S;2-3、2-6、2-8、及び2-9の結合を切断)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)由来の狭域スペクトルシアリダーゼ(NEB S、肺炎連鎖球菌由来の酵素α2-3ノイラミニダーゼS、カタログ番号P0743S;2-3結合のみを切断)、及びウェルシュ菌(Clostridium perfringens)由来の汎用シアリダーゼ(NEB O、ウェルシュ菌由来の酵素α2-3,6,8ノイラミニダーゼO、カタログ番号P0720S、2-3、2-6、2-8の結合を切断)であった。製造業者によって示唆されている通り酵素を添加し、37℃で30分間基質と共にインキュベートした(図5)。
Smixは、NEB製品と同等又はそれ以上の効率で小さな半合成基質に対して作用することができたが(図5)、様々なシアル酸結合を有するネイティブタンパク質に対する活性についても調べることは避けられなかった。2-3及び2-6結合型のシアル酸を両方有しているので、モデルタンパク質としてフェチュインを選択した。SNAブロッティングを使用して、選択した濃度のSmixが、NEB A及びOと同様にフェチュインから全てのシアル酸を完全に除去できることが明らかになった(図6)。2つの2-3特異的酵素Am1757及びNEB Sは、予想通り、フェチュインを完全にアシアリル化することはできなかった。
材料及び方法
エンド-O-グリコシダーゼの発現及び精製
ストレプトコッカス・オラリスのエンド-N-アセチル-ガラクトサミニダーゼを、ベクターpET21a(+)において大腸菌で良好に発現するようにコドン最適化した。ベクターをBL21(DE3)Star細胞に形質転換した。大腸菌を200rpmで37℃のLB中においてルーチン的に培養した。プラスミドの存在下で、100μg/mLアンピシリンを添加した。一晩インキュベートした後、培養物を新鮮LB(amp)で1:20希釈し、OD620が約0.7~0.8になるまで成長させ、その後、1mM IPTGを添加することによって組み換えタンパク質発現を誘導し、5時間発現を継続させた後、細胞を収集し、凍結させた。凍結細胞を解凍し、His結合バッファ(20mM NaP pH7.4、500mM NaCl、20mMイミダゾール)に溶解させ(resolved)、細胞内タンパク質を放出させるために超音波処理した。遠心分離によって細胞残屑を除去した。滅菌濾過した上清をニッケルカラムでアフィニティ精製し、PD-25カラムにおいてPBSに再緩衝した。Nanodropを使用してタンパク質の濃度を決定し、SDS-PAGEを通して純度を推定した。タンパク質の配列を配列番号3として提供する。
O-グリカンコア領域の4-メチルウンベリフェロン(4MU)基質及びpNP基質を基質として使用して、酵素の加水分解活性を判定した。酵素(1μg)を基質(2mM)と混合し、37℃で15~120分間インキュベートし、その時間中、蛍光及び吸光度(405nm)をそれぞれ記録した。
TNFαR、EPO、Enbrel、フェチュイン、IgA、Orencia、及びプラスミノーゲン(0.5μg)を、Smix(1:40+1:40)又はAm1757(1:40)の存在の有り無しで、0~24時間O-グリコシダーゼ(1:40)と混合した。タンパク質を4~20%Novex勾配SDS-PAGEで分離した。
NaCl(0~1.5M)及びイオン(2mM CaCl2、2mM ZnCl2、5mM EDTA)依存性について調べるために、酵素をそれぞれの基質(4MU又はpNP)と共にインキュベートした。最適pHについては、酵素を酢酸バッファ(50mM pH4.6及び5.6)及びTris-HClバッファ(20mM pH6.8、7.4、8.0、及び8.8)中でインキュベートした。全てのサンプルを37℃で15分間インキュベートした。全ての値を、各群内の最高活性に関して相対活性として表した。
同定された酵素、及び定評のあるブランドから市販されている酵素(大便連鎖球菌由来のNEB O-グリコシダーゼ、カタログ番号P0733S、バンドル番号E0540Sとしても)をそれぞれの基質及び最適化されたバッファと共にインキュベートし、ネイティブ条件下で様々な糖タンパク質と共に0~24時間インキュベートした後、SDS-PAGEで分離した。
ストレプトコッカス・オラリスのエンド-α-N-アセチル-ガラクトサミニダーゼの発現/精製
発見フェーズ(discovery phase)中、いずれも高分子量の細菌タンパク質(>200kDa)であるS.オラリス及びビフィズス菌(Bifidobacterium bifidum)由来の2つの異なるエンド-α-N-アセチル-ガラクトサミニダーゼについて検討した。ビフィズス菌グリコシダーゼは高度に不安定であったか、又は発現及びアフィニティ精製後に高度の断片化部分が少なくとも生じた。S.オラリスについても特定の断片化が可視化され得たが、はるかにより少なかった(図8A)。更に、この酵素は、更に分解することが全くなく、4℃で最長1週間安定であった(図8B)。しかし、発現レベル(約5~10mg/L)はかなり低い。更なる分析によって、断片化が超音波処理に起因することが示唆された。
2つのO-グリコシダーゼの分析を続けたところ、コア1グリカンに対する著しい選択性が明らかになり、コア2及び3に対する活性ははるかに低かった(図9)。重要なことに、S.オラリス由来のグリコシダーゼは、ビフィズス菌由来の対応する遺伝子よりも著しく高い活性を示したので、主にS.オラリスのO-グリコシダーゼに重点的に取り組むことに決めた。
O-グリコシダーゼについての最適条件を決定するために、様々なpH及びイオン下で、様々な条件において酵素をpNPコア1基質と共にインキュベートした(図10)。O-グリコシダーゼは、中性~わずかに塩基性のpHで高い活性を示し、Zn2+の存在によって完全に阻害されたが、8mM以下のMgCl2の存在下で増大した活性を有していた(図10C)。
全てのO-グリカンの加水分解を媒介するのに必要な反応速度及び用量について調べるために、実施例1で特性評価したシアリダーゼ混合物(Am1757:Am0707の1:1ミックス)又はシアリダーゼ混合物のみと組み合わせて、様々な量のO-グリコシダーゼと共にネイティブTNFαRを1~12時間インキュベートした。図11に示す通り、比較的低濃度の酵素(例えば、約0.1μg、1:10)でさえも、1時間以内に基質を加水分解することができた。インキュベート時間を12時間まで延長した結果、高濃度のシアリダーゼでは、1:50の比で酵素が基質を完全に加水分解する能力が得られた。幾つかの態様では、酵素は「無か全か(nothing or all)」酵素であるので、半分加水分解された糖タンパク質はほとんど生じず、加水分解されていないか又は完全に加水分解されたタンパク質が生じることに留意するのが重要である。
O-グリコシダーゼがTNFαRに対してのみ作用するのか、幾つかのネイティブな糖タンパク質に作用することができるのかを更に調べるために、7つの異なる糖タンパク質を加水分解酵素の組み合わせと共にインキュベートした(図12)。S.オラリスのO-グリコシダーゼ及びビフィズス菌酵素(シアリダーゼと組み合わせて)は、一晩インキュベートした後にネイティブタンパク質を全て加水分解することができたが、プラスミノーゲンに対する活性は、タンパク質の分子量が高いことから評価が困難であった。しかし、末端シアル酸が活性を阻害したため、両酵素はシアリダーゼの存在に強く依存していた。
既存の市販製品に対するS.オラリスのグリコシダーゼの活性を比較するために、1時間又は16時間、様々な量のグリコシダーゼを使用してそのTNFαRを加水分解する能力を比較した。約1:5の酵素:基質比を使用すると、S.オラリスのグリコシダーゼは1時間でその基質を完全に加水分解することができた。1:1酵素:基質比でさえも、NEB O-グリコシダーゼは全てのO結合型グリカンを加水分解することができず、幾つかの容易にアクセス可能なグリカンに対してしか作用しなかった。更にインキュベート(例えば、16時間)することによって、S.オラリスのグリコシダーゼの最大効果を依然として維持しながら、1:50酵素:基質比が可能になった。しかし、NEB O-グリコシダーゼは、生成物を完全に脱グリコシル化することができず、このことは、変性がその機能にとって重要であることを示すが、S.オラリスのO-グリコシダーゼ生成物は、ネイティブタンパク質に対しても高い活性を有する(図13)。S.オラリスのO-グリコシダーゼはネイティブタンパク質に対して作用することができるだけでなく、変性したタンパク質からグリカンを加水分解することもできる(データは割愛する)。
O-グリコシダーゼ活性にとっての特定のグリカンの必要性について更に研究するために、TNFαRを様々な酵素と共にプレインキュベートして個々のグリカンを除去した後、O-グリコシダーゼを添加した。ガラクトースの存在と同様に、末端シアル酸の除去が活性にとって重要であったが、このことは、O-グリコシダーゼが単一の(末端)GalNAcsを除去できないことを示す(図14)。
O-glyk+Smixの複合組成物の最終濃度を決定したら(1:40)、競合するブランド製品(NEB)との比較を繰り返した。NEB製品を使用するとTNFαRにおいて若干の加水分解を検出することはできるが、加水分解が完全ではなく、12時間後でさえも完全ではないことは明らかである。これとは対照的に、O-glyk+Smixの複合組成物では、4時間以内に糖タンパク質が完全に加水分解され、これは、レクチンブロットによって裏付けられた(図15)。
O-グリコシダーゼ活性についての2-3又は2-6結合型シアル酸の相互作用を評価するために、2-3特異的又は広域スペクトルのシアリダーゼ(例えば、それぞれAm1757及びSmix)の両方と共にO-グリコシダーゼをインキュベートした。予備データは、Am1757及びAm0707が糖タンパク質から等量のシアル酸を放出できることを示唆しているが、Am1757(又はSmix)で糖タンパク質を処理した結果、基質(TNFαR)がより速く加水分解された。しかし、完全に加水分解するためには、広域スペクトルシアリダーゼで糖タンパク質を処理すること、また、2-6(又は2-8)シアル酸を除去することが重要であった(図17)。
O-glyk+Smixの複合組成物における個々の成分の影響を判定するために、O-glyk及びNEBを4つの異なるシアリダーゼ製品(GVS_Smix、NEB A、NEB S、及びNEB O)と共にインキュベートした。O-glyk+Smixの複合組成物は、Enbrelから全てのO-グリカンを効率的に加水分解した(図18)が、シアリダーゼをNEB製品のいずれかに変更した結果、O-glykの活性が著しく低下し、NEBシアリダーゼAが最も強力であった。しかし、NEB O-グリコシダーゼバンドル(NEBシアリダーゼOとNEB O-グリコシダーゼ)は、EnbrelもTNFαRも加水分解することができなかった(図15、16)が、NEBシアリダーゼOの代わりにGVS_Smixを使用することによって、糖タンパク質の完全な加水分解が観察され、このことは、O-glyk+Smixの複合組成物の効率が、糖タンパク質における2-3及び2-6の結合を全て加水分解するシアリダーゼの能力に少なくとも部分的に依存することを示唆している。
配列番号12からなるポリペプチドのエンドプロテーゼ活性は特定のシアル酸結合に少なくとも部分的に依存しているので、最大効果を得るためには2-3及び2-6結合型のシアル酸を両方除去する必要があることが、本発明者らによって最近判明した。エンドプロテアーゼ活性に対する特定のシアル酸結合の個々の役割を決定するために、エンドプロテアーゼと組み合わせて様々なシアリダーゼと共にエタネルセプトを30分間~20時間インキュベートした。エンドプロテアーゼ活性を増強するには、2-3結合を除去すれば十分であると思われた(図19)。使用したシアリダーゼは、(1)Am0707=配列番号3のポリペプチド;(2)Am1757=配列番号6のポリペプチド;ミックス=(1)と(2)との1:1の組み合わせ。
配列番号1-シアリダーゼ、Am0707-野生型(下線はシグナル配列)
MTWLLCGRGKWNKVKRMMNSVFKCLMSAVCAVALPAFGQEEKTGFPTDRAVTVFSAGEGNPYASIRIPALLSIGKGQLLAFAEGRYKNTDQGENDIIMSVSKNGGKTWSRPRAIAKAHGATFNNPCPVYDAKTRTVTVVFQRYPAGVKERQPNIPDGWDDEKCIRNFMIQSRNGGSSWTKPQEITKTTKRPSGVDIMASGPNAGTQLKSGAHKGRLVIPMNEGPFGKWVISCIYSDDGGKSWKLGQPTANMKGMVNETSIAETDNGGVVMVARHWGAGNCRRIAWSQDGGETWGQVEDAPELFCDSTQNSLMTYSLSDQPAYGGKSRILFSGPSAGRRIKGQVAMSYDNGKTWPVKKLLGEGGFAYSSLAMVEPGIVGVLYEENQEHIKKLKFVPITMEWLTDGEDTGLAPGKKAPVLK
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Claims (20)
- 第1及び第2のシアリダーゼを含む組成物であって、
第1のシアリダーゼが、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり;及び
第2のシアリダーゼが、配列番号5のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり;並びに
前記組成物が、配列番号9のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号9のアミノ酸配列からなるO-グリコシダーゼを更に含む、組成物。 - 前記第1及び/又は第2のシアリダーゼが、N末端における追加のメチオニン及び/又はC末端におけるヒスチジンタグを含み、前記タグが、リンカーによってC末端に連結され得る、請求項1に記載の組成物。
- 糖タンパク質におけるシアル酸結合の90%超を加水分解することができる、請求項1又は請求項2に記載の組成物。
- 糖タンパク質がネイティブな非変性状態の糖タンパク質である、請求項3に記載の組成物。
- 配列番号3のアミノ酸配列からなるシアリダーゼ及び配列番号6のアミノ酸配列からなるシアリダーゼを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の組成物。
- 配列番号3のアミノ酸配列からなるシアリダーゼ及び配列番号6のアミノ酸配列からなるシアリダーゼが1:1比である、請求項5に記載の組成物。
- 前記第1のシアリダーゼ及び/又は前記第2のシアリダーゼが、高度に精製又は単離された形態で存在する、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物中の2つ以下のポリペプチドが、アッカーマンシア・ムシニフィラから得られたシアリダーゼである、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。
- O-糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼを更に含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記O-グリコシダーゼ及び/又はO-糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼが高度に精製又は単離された形態で存在する、請求項1~9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記O-グリコシダーゼが、配列番号10のアミノ酸配列からなる、請求項1~10のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記O-糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼが、配列番号11のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号11のアミノ酸配列からなるO-糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼである、請求項9~11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記O-糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼが、配列番号12のアミノ酸配列からなる、請求項12に記載の組成物。
- 糖タンパク質を改変する方法であって、前記糖タンパク質を含有するサンプルを請求項1~13のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
- 得られた生成物を分析する、請求項14に記載の方法。
- 前記得られた生成物が、分析され、前記分析が、前記生成物を分離及び/又は検出及び/又は単離することを含む、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記分析が、SDS-PAGE、HPLC、レクチンブロッティング、ELISA、又は質量分析の手段により行われる、請求項16に記載の方法。
- 前記組成物が、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物であり、前記方法が、前記糖タンパク質を前記組成物と接触させるのと同時に、その前に、又はその後に、前記サンプルをO-糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼと接触させることを含む、請求項14~17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、更にO-糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼを含む、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記O-糖タンパク質特異的エンドプロテアーゼが、請求項12又は13に定義されたエンドプロテアーゼである、請求項19に記載の方法。
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