KR102001427B1

KR102001427B1 - 스트렙토코쿠스 피오게네스 유래의 엔도글리코시다아제 및 그의 이용방법

Info

Publication number: KR102001427B1
Application number: KR1020147009205A
Authority: KR
Inventors: 마티아스 콜린; 마리아 알혼; 죠나단 쉐그렌
Original assignee: 게노비스 에이비
Priority date: 2011-09-13
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2019-07-18
Also published as: GB201406321D0; SG11201400505YA; ZA201401840B; GB201115841D0; EA201490447A1; CN103946377A; EA028490B1; CA2848230A1; WO2013037824A1; AU2012307461A1; DK2756077T3; US20140302519A1; EA028490B8; MX2014002906A; IL231410A0; PT2756077T; JP2014531205A; AU2012307461B2; BR112014005816A2; US9493752B2

Abstract

본 발명은 EndoS49로 언급되고 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 엔도글리코시다아제를 제공한다. EndoS49는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) NZ131 균주로부터 분리되었고, EndoS와 상동체이다. EndoS49는 자연적인 IgG에 특징적으로 엔도글리코시다아제 활성을 가지며 EndoS 보다 더 다양한 Fc 글리칸으로 쪼갠다. 서열번호 1의 186번째 위치의 글루탐산이 치환된 이의 변이체를 생산하였으며, 상기 변이체는 엔도글리코실라아제 활성은 결여되었으나 IgG 결합은 가능하다. EndoS49를 사용하는 방법, 이의 결실 및 상기 변이체, 특히 IgG의 글리코실화 평가 또는 IgG를 분리하는 방법이 기재되어 있다.

Description

스트렙토코쿠스 피오게네스 유래의 엔도글리코시다아제 및 그의 이용방법{ENDOGLYCOSIDASE FROM STREPTOCOCCUS PYOGENES AND METHODS USING IT}

본 발명은 신규한 엔도글리코시다아제, 글리칸 가수분해활성이 결핍된 그의 변이체 및 당단백질의 글리칸을 가수분해하는 방법에 관한 것이다.

엔도글리코시다아제 S(EndoS)는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 여러 혈청형에서 분비되며 IgG 중사슬 상의 아스파라긴 297 잔기에 붙은 보존 글리칸을 가수분해함으로써 자연 IgG에 특이적인 엔도글리코시다아제 활성을 가진다(Collin 및 Olsen, The EMBO Journal, 2001, 20 3046-3055). EndoS는 자연적 IgG에 특이성을 가진 박테리아 효소로 처음 알려졌으나, 다른 엔도글리코시다아제 활성은 당단백질 기질의 변성에 의해 강화된다.

IgG와 같은 항체는 진단의학 및 신약개발과 기초연구에서 많이 사용된다. 면역조직화학, 면역분석, 종양검출, 방사선요법, 항체결합위치의 결정 및 면역표적 등에 적용할 때 IgG 분자 전체를 이용하는 것보다 Fab 단편을 이용하는 것이 더 편리하다. Fab 단편을 이용하는 장점으로는 세포 상의 Fc 수용체 또는 항원침전물에 영향을 받지 않고 면역원성이 감소되며 식균 작용이 일어날 가능성이 적고 방사선 표지된 Fab 단편은 전체 IgG 분자보다 더 빠르게 조직에서 제거된다. 다른 적용 분야에서는 IgG의 Fc 단편을 이용하는 것이 바람직하다. 나아가 항체 또는 다른 당단백질의 탈당화된 형태를 이용하는 것이 바람직할 수 있다.

IgG를 Fab 및 Fc 단편으로 절단하는 것은 펩신이나 파파인 같은 단백질분해 효소를 이용하여 가장 흔히 수행된다. 이 효소들은 종종 다른 단백질을 절단하기 때문에 절단반응은 일반적으로 정제된 IgG 분획에서 수행되어야 한다. 그리고 펩신 및 파파인은 일반적으로 IgG를 여러 부분에서 절단한다. 이는 수득한 단편들이 전체 Fab 또는 전체 Fc 단편에 상응하지 않음을 의미하고 만약 절단결과 Fab 및 Fc 단편이 나온다고 할지라도 일반적으로 더 절단되어 더 작은 단편들이 생길 수 있다. Fab 단편으로부터 Fc 단편의 분리는 박테리아 단백질 A 및 G의 Fc 결합특성을 이용하는 단백질 A 또는 G 친화성 분리 컬럼을 이용하는 것이 가장 흔히 수행된다.

매우 다양한 당단백질들은 치료방법에 이용된다. 상기 단백질들의 글리코실화를 분석하는 방법은 치료제로서의 단백질 연구 및 개발에 사용된다. 이 단백질들의 탈당화 형태를 제공하는 것도 바람직할 수 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 EndoS49로 언급되고 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 엔도글리코시다아제를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 스트렙토코쿠스 피오게네스(Steptococcus pyogenes)의 M49 혈청형으로부터 신규한 엔도글리코시다아제를 동정하여 EndoS49라고 하였다. EndoS49는 사구체신염을 유발할 수 있고 형질전환할 수 있는 가능성이 높은 NZ131 균주의 M49 혈청형으로부터 분리되었다. NZ131 균주는 뉴질랜드에서 급성사구체신염 환자로부터 임상분리된 것이다. 단백질 수준에서 EndoS49는 EndoS와 40% 미만의 상동성을 가지고, 108 kDa의 EndoS와 비교하면 90 kDa의 단백질이다. EndoS49는 EndoS보다 넓은 단백질 범위에서 탈당화 활성을 가진다.

상기 효소는 글리코시드 가수분해효소 패밀리 18의 촉매 도메인을 가지는 90 kDa의 효소이다. EndoS49는 인간 당단백질, 특히 IgG1-4 및 알파-1-마이크로글로불린(α-1-microglobulin) 상의 글리칸을 가수분해한다. EndoS49는 IgG 및 알파-1-마이크로글로불린을 포함하는 인간 당단백질 상의 글리칸 가수분해에 사용될 수 있다. 따라서 EndoS49는 그 효소가 당단백질과 접촉하는 글리코프로파일링 분석에 사용될 수 있고 생산된 산물은 글리칸 및 단백질의 분석을 위해 분리된다. EndoS49는 탈글리코실화된 단백질을 제조하기 위해 사용될 수도 있다. 상기 효소는 엔도글리코시다아제 활성을 감소시키거나 제거하기 위해 변형될 수 있다.

엔도글리코시다아제 활성이 없는 변이된 EndoS49 폴리펩티드는 글리코실화된 그리고/또는 기능적으로 활성 상태의 IgG를 분리하는 방법에 사용될 수 있다. 변성된 그리고/또는 탈당화된 IgG에 결합할 수 있는 추가의 IgG-결합시약과 함께 상기 변이된 EndoS49 폴리펩티드를 이용함으로써 본 발명자들은 IgG 함유 시료의 글리코실화 상태 또는 기능적 품질을 평가하는 방법을 발견하였다.

따라서, 본 발명에 따라 하기로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다.

(a) 서열번호 1의 아미노산 서열;

(b) 서열번호 1의 아미노산 서열과 50% 이상의 상동성을 가지고 엔도글리코시다아제 활성을 가지는 변이체; 또는

(c) 엔도글리코시다아제 활성을 가지는 상기 (a), (b) 중 어느 하나의 단편.

본 발명은 IgG에 결합할 수 있고 엔도글리코시다아제 활성이 없는 하기로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다.

(a) 서열번호 2의 아미노산 서열;

(b) 서열번호 1의 아미노산 서열과 50% 이상의 상동성을 가지고 위치 186의 글루탐산이 치환된 변이체,

(c) 상기 (a), (b) 중 어느 하나의 단편.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화 또는 발현하는 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 및 숙주세포도 제공한다. 본 발명은 단백질, 특히 항체, 특히 IgG 항체의 글리코실화 상태를 결정하거나 분석하는 방법에 있어서 본 발명의 폴리펩티드의 용도에 관련이 있다.

본 발명은 하기로 이루어진 IgG-함유 시료에서 IgG를 분리함으로써 분리된 IgG를 얻는 방법을 제공한다.

(a) 상기 IgG-함유 시료를 IgG 엔도글리코시다아제 활성이 없는 변이된 EndoS49 폴리펩티드와 접촉시킨다

(b) 상기 EndoS49를 접촉시킨 시료에서 분리한다;

추가적으로 IgG-함유 시료의 글리코실화 상태 또는 기능적 품질을 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 IgG를 함유한 시료의 1차 및 2차 시료를 이용하는 것을 포함한다. EndoS49 폴리펩티드가 변성된 그리고/또는 탈당화된 IgG에 결합할 수 있는 대체 IgG-결합 시약으로 대체하는 것을 제외하고는 상기 방법에 따라 (a) 단계 및 (b) 단계를 1차 시료에 적용하고, 상기와 같이 (a) 단계 및 (b) 단계를 2차 시료에 적용한다. 나아가 하기 단계를 포함함으로써 IgG를 함유한 시료의 글리코실화 상태 또는 기능적 품질을 평가한다.

(c) 1차 시료에서 EndoS49 폴리펩티드에 결합하는 IgG의 양을 재고, 2차 시료에서 대체 IgG-결합 시약에 결합하는 IgG의 양을 잰다.

(d) (c)에서 결정한 IgG의 양을 비교한다.

본 발명의 변이 효소는 IgG의 Fab 또는 Fc 단편을 분리하는 방법에 사용할 수도 있다. 본 발명의 방법은 S. pyogenes 유래의 고특이적 IgG 절단효소, IdeS(Immunoglobulin G-degrading enzyme of S . phygenes) 및 EndoS49 폴리펩티드를 이용한다.

본 발명의 방법에서 IgG 함유시료는 IdeS 및 상기에 언급한 대로 엔도글리코시다아제 활성이 없는 변이된 EndoS49 폴리펩티드와 접촉한다.

본 발명의 방법에서 일반적으로 IdeS는 IgG를 Fab 및 Fc 단편으로 절단하고 EndoS49 폴리펩티드는 Fc 단편에 결합한다. 그 다음 Fc 단편은 Fab 단편으로부터 분리된다.

이 방법은 정제된 IgG를 포함하는 시료에서 Fab 또는 Fc 단편을 분리하는데 특히 유용하다. 더 구체적으로는 본 발명의 변이된 EndoS49 폴리펩티드를 이용하여 정제한 IgG를 포함하는 시료에서 Fab 또는 Fc를 분리하는데 유용하다. 그러나 상기 방법은 혈청, 세포 용해물 또는 세포배양 배지와 같이 비정제된 IgG를 함유하는 시료에 이용하기 위해 조정될 수 있다.

본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 키트도 제공한다.

본 발명의 EndoS49 단백질 등은 글리코실화를 분석하는 방법은 치료제로서의 단백질 연구 및 개발에 사용하는데 효과적이다.

도 1은 EndoS49 및 EndoS의 ClustralW 얼라인먼트가 2개의 다른 단백질임을 나타낸 도면이다. EndoS49 및 EndoS는 소프트웨어 MacVector에서 ClustralW를 이용하여 배열되었다. GH18 촉매적 모티프(D**D*D*E)는 촉매적 잔기 Glu186과 함께 179-186 위치에 있다.
도 2는 EndoS49의 당단백질에 활성을 보인 사진도이다. A. 1μg EndoS49, 그의 촉매적 변이체 및 결절 형태를 3 μg 인간 IgG와 37℃, PBS에서 밤새 배양하고 SDS-PAGE 겔 및 LCA lectin blot에서 분석하였다. B. 1 μg EndoS49 및 EndoS49(E186L)을 3 μg 인간 IgG의 서브클래스 1-4과 배양하고 상기와 같이 분석하였다. C. 1 μg EndoS49 및 그 변이체를 3 μg 알파-1-마이크로글로불린과 배양하고 10% SDS-PAGE에서 분석하였다.
도 3은 EndoS49가 IgG에 결합한 사진도이다. 4, 2, 1 μg EndoS49 및 그 변이체를 3 μg 알파-1-마이크로글로불린과 배양하고 10% SDS-PAGE 겔로 분석하였다.
도 4는 ndoS49 및 ndoS 유전자의 관계를 나타낸 도면이다.
도 5는 EndoS49 및 다른 박테리아 엔도글리코시다아제의 계통발생 분석을 나타낸 도면이다.
도 6은 EndoS 또는 EnsoS49로 절단 후 IdeS로 절단한 결과 아바스틴 (Avastin) 및 어비툭스 (Erbitux)의 SDS PAGE 겔 사진도이다.

서열목록의 간단한 설명

서열번호 1은 S. pyogenes의 M49 혈청형 NZ131로부터 분리한 EndoS49 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.

서열번호 2는 서열번호 1의 서열에서 유래한 변형된 EndoS49 폴리펩티드(E186L)의 아미노산 서열이다.

서열번호 3은 EndoS49 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이다.

서열번호 4는 S. pyotenes AP1에서 분리한 IdeS의 아미노산 서열이다.

폴리펩티드의 일반적인 특징

본 발명은 신규한 폴리펩티드 EndoS49에 관한 것이다. 본 발명은 박테리아 단백질 EndoS49 및 IdeS 외에도 다른 단백질을 이용하는 다양한 방법을 제공한다. 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드의 용어들은 여기에서 교체 사용이 가능하다. 본 발명의 어떤 폴리펩티드 및 방법은 엔도글리코시다아제 활성이 있는 EndoS49 폴리펩티드를 필요로 하는 반면에, 다른 폴리펩티드 및 방법은 상기 활성이 없는 변이 EndoS49 폴리펩티드를 필요로 한다는 것을 이해할 것이다.

다음에는 본 발명 폴리펩티드의 일반적인 특징, 특히 본 발명 폴리펩티드에 포함된 아미노산 서열의 변화, 대체, 변형, 파생에 관한 것이다. 여기에 기술된 바와 같이 상기 폴리펩티드의 변화, 대체, 변형, 파생은 폴리펩티드가 필요한 활성이나 특징들을 유지하는 필수조건이며 이후에 구체적으로 설명할 것이다.

본 발명 폴리펩티드의 변이체는 이후에 구체적으로 설명하게 되는 특정 수준의 아미노산 상동성으로 정의될 수 있다. 아미노산 상동성 적당한 알고리즘을 이용하여 계산될 것이다. 일반적으로 기본 구성상의 등가물 또는 그에 상응하는 서열을 확인하는 것과 같이 예를 들면 PILEUP 및 BLAST 알고리즘이 상동성을 계산하거나 서열들을 배열하는데 이용될 수 있다(Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300; Altshul, S, F et al(1990)J Mol Biol 215:403-10). BLAST 분석 수행을 위한 소프트웨어는 생물학 정보 국립센터 (National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 누구나 이용가능하다. 이 알고리즘은 요청한 서열의 길이 W에서 짧은 단어들을 식별함으로써 일치 또는 일부 양성수치 임계점수 T를 만족하는 고득점 서열일치 (High scoring sequence pair; HSPs)를 일차적으로 식별하는 것을 수반한다. T는 이웃 단어 점수 임계점 (heighbourhood word score threshold)을 말한다 (Altschul et al., supra). 이들 시작 이웃 단어의 발단은 이들을 포함하는 HSPs를 찾기 위한 초기 조사의 시발점으로 작용한다. 상기 단어의 발단은 누적 얼라인먼트 점수가 증가될 수 있을때까지 멀리 각 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 각 방향으로 단어의 발단을 확장하는 것은 하기와 같은 때에 중단된다.; 누적 얼라인먼트 점수가 양 X에 의해 최고 달성치로부터 떨어졌을 때; 하나 또는 그이상의 음성-점수 잔류물 얼라인먼트가 축적으로 인한 누적 얼라인먼트 점수가 0 또는 그이하로 내려갈 때; 또는 어느 서열의 끝이라도 닿았을때. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 얼라인먼트의 민감도와 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트값으로 단어길이(W)는 11, BLOSUM62 스코어링 메트릭스 (Henikoff and Henikoff (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915-10919를 보라.) 얼라인먼트 (B)는 50, 익스펙테이션 (E)은 10, M=5, N=4 를 사용하였고, 양쪽 스트랜드를 비교하였다.

BLAST 알고리즘은 두 서열 간의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다.; Karlin and Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5787을 보라. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 측정은 최소 합계 확률 (probability (P(N))이고, 이는 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 매치에 의한 확률이 우연히 일어날 수 있음을 제공한다. 예를 들면, 첫번째 서열과 두번째 서열을 비교한 최소 합계 확률이 1보다 작고, 바람직하게는 0.1보다 작고, 더욱 바람직하게는 0.01보다 작고, 가장 바람직하게는 0.01보다 작으면, 한 서열은 다른 서열과 유사한 것으로 여겨진다. 또한, UWGCG 패키지는 상동성을 계산하는데 사용할 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다 (예를 들면 디폴트 세팅을 사용하여) (Devereux et al(1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395).

본 발명의 폴리펩티드 변이체가 또한 대체 변이체를 포함하는 것은 잘 이해될 것이다. 대체 변이체는 바람직하게는 하나 또는 그이상의 아미노산을 동일한 수의 아미노산으로 대체하면서 보존된 아미노산 대체를 하는 것을 수반한다.

예를 들어 아미노산은 유사한 성질을 가진 아미노산, 예를 들어 다른 염기성 아미노산, 다른 산성 아미노산, 다른 중성 아미노산, 다른 전하를 띤 아미노산, 다른 친수성 아미노산, 다른 소수성 아미노산, 다른 극성 아미노산, 다른 방향족 아미노산 또는 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 적당한 치환물을 선택하기 위해 이용할 수 있는 20가지 아미노산의 특성들을 하기에 나타내었다:

본 발명에 사용되는 폴리펩티드는 주로 분리형일 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 목적에 영향을 주지 않고 주로 분리된 담체나 희석제와 혼합될 수 있다. 본 발명에 사용되는 폴리펩티드는 주로 정제형일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 50% 이상, 80%, 90%, 95%, 99% 이상 포함될 것이다.

본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 비자연발생적 아미노산을 포함하거나 화합물의 안정성을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 폴리펩티드가 합성 방법에 의해 제조될 때 상기 아미노산은 제조 중에 도입될 수 있다. 폴리펩티드는 다음에 나오는 합성이나 재조합 방법에 의해 변형될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 D-아미노산을 이용하여 생산될 수 있다. 이런 경우 아미노산은 역서열(reverse sequence)의 C 에서 N 방향으로 연결될 것이다. 이것은 당업계에서 폴리펩티드를 생산하는 관용적인 방법이다.

수많은 곁사슬 변이가 당업계에 알려져 있고 본 발명에서 구체화할 수 있는 활성이나 특징을 유지하는 폴리펩티드의 곁사슬로 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 화학적으로 변형, 예를 들어 번역 후 변이될 수 있다. 예를 들어 글리코실화, 포스포릴화 될 수 있고 변이된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 세포막 안에 넣기 위해 신호서열을 추가하도록 변이될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 분리되거나 정제되는 것에 도움이 되기 위해 유도되거나 변이될 수 있다. 따라서 본 발명의 실시예에서 본 발명에 사용된 폴리펩티드는 분리 수단에 직접적으로 또는 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 추가하도록 유도되거나 변형될 수 있다. 폴리펩티드는 결합쌍 중의 한 개를 추가하여 유도되거나 변이되고 분리 수단은 결합쌍의 다른 한 개를 추가하여 변이되거나 변이되는 시약을 포함한다. 어떤 결합쌍도 사용할 수 있다. 바람직한 실시예에서 본 발명에서 사용된 폴리펩티드는 결합쌍 중 한 개를 추가하여 유도하거나 변이되고 그 폴리펩티드는 바람직하게는 히스티딘이나 비오틴 꼬리표가 달린다. 히스티딘이나 비오틴 꼬리표의 아미노산 코딩 서열은 일반적으로 유전자 수준에서 포함되고 단백질은 E.coli에서 재조합 방법으로 발현된다. 히스티딘 또는 비오틴 꼬리표는 일반적으로 N-말단이나 C-말단 등 폴리펩티드의 한쪽 끝에 있다. 히스티딘 꼬리표는 일반적으로 6개의 히스티딘 잔기들로 구성되며, 일반적으로 7, 8, 9, 10 또는 20개까지 더 길어지거나 또는 5, 4, 3, 2 또는 1개로 더 짧아질 수 있다. 그리고 히스티딘 꼬리표는 한 개 이상의 아미노산 치환, 바람직하게는 상기 정의한 대로 보존적 치환을 포함할 수 있다.

엔도글리코시다아제 활성을 가지는 EndoS49 폴리펩티드

본 발명에서 EndoS49 폴리펩티드는 바람직하게는 엔도글리코시다아제 활성을 가지는 S. pyogenes EndoS49 또는 변이체 또는 EndoS49의 단편이다. 상기 변이체는 Streptococcus equi , Streptococcus zooepidemicus 또는 바람직하게는 Streptococcus pyogenes에서 얻은 EndoS49 폴리펩티드일 수 있다.

EndoS49 폴리펩티드는 하기로 이루어질 수 있다:

(a) 서열번호 1의 아미노산 서열;

(b) 서열번호 1의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지고 엔도글리코시다아제 활성을 가지는 변이체; 또는

상기 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 포함하거나 구성한다. 서열번호 1은 S. pyogenes에서 얻은 EndoS49의 서열이다. 본 발명의 EndoS49 폴리펩티드는 단일 서열을 추가로 포함할 수 없다.

여기에 설명한 바와 같이 변종 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 벗어났으나 EndoS49의 엔도글리코시다아제 활성을 가지는 폴리펩티드이다. 상기 변종은 펩타이드가 IgG 엔도글리코시다아제 활성을 유지하는 한 단백질 서열 내에서 대립 변종 및 단일 아미노산 또는 아미노산 그룹의 삭제, 변형 또는 첨가를 포함한다.

변이체 서열은 일반적으로 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 100 또는 그 이상의 돌연변이(아미노산의 치환, 삭제 또는 삽입)에 따라 다르다. 변종 폴리펩티드가 IgG 특이적 엔도글리코시다아제 활성을 유지한다면 예를 들어 1 내지 100, 2 내지 50, 3 내지 30 또는 5 내지 20 아미노산 치환, 제거 또는 삽입이 일어날 수 있다.

서열번호 1 아미노산 서열의 변이체는 바람직하게는 서열번호 1의 잔기 179 내지 186, 특히 모티프 D**D*D*E를 포함한다. 상기 아미노산들은 패밀리 18 글리코시드 하이드로레이즈의 촉매 도메인을 구성한다. 186번째 위치의 글루탐산은 효소적 활성에 필수적이다. 따라서 가장 바람직하게는 서열번호 1의 변이체는 서열번호 1의 186번째에 상응하는 위치에 글루탐산을 가진다. 상기 변이체가 서열번호 1의 186번째에 상응하는 위치에 글루탐산을 가진다면, 서열번호 1의 변이체는 한 개 이상의 보존적 치환을 가지는 서열번호 1의 잔기 179 내지 186을 포함한다.

일반적으로 EndoS49의 엔도글리코시다아제 활성에 50% 이상, 55% 이상 또는 65% 이상 동일하고, 바람직하게는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 동일한 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 단백질 변이체로 여겨진다. 서열번호 1의 변이체 동일성은 서열번호 1의 서열에 100 이상, 250 이상, 500 이상, 750 이상, 800 이상, 810 이상 820 이상 930 이상 940 이상 인접한, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 전체길이 영역에서 측정할 수 있다.

본 발명의 EndoS49 폴리펩티드 단편은 EndoS의 IgG 엔도글리코시다아제 활성을 유지하는 일반적으로 400, 500, 600, 700, 750, 800 또는 825개 이상의 아미노산 길이이다. 바람직하게는 본 발명에 사용된 EndoS49 폴리펩티드 단편은 서열번호 1의 잔기 179 내지 186을 포함한다.

본 발명에 사용되는 폴리펩티드는 EndoS49 폴리펩티드 또는 그의 변이체를 발현하는 생물체로부터 분리될 수 있다. EndoS49 폴리펩티드는 일반적으로 EndoS49 발현 균주 Streptococcus, 바람직하게는 S. pyogenes, 특히 그의 M49 혈청형으로부터 분리될 수 있다.

EndoS49의 분리 및 정제는 일반적으로 EndoS49를 발현하는 S. pyogenes 배양물 또는 EndoS49를 발현하는 다른 세포배양물로부터 엔도글리코시다아제 활성을 토대로 한다. 바람직하게는 정제방법은 암모늄 설페이트 침전단계 및 이온교환 크로마토그래피 단계와 관련이 있다. 한 방법에 따르면 암모늄 설페이트의 양을 증가시키면서 첨가하여 배양 배지를 분획한다. 암모늄 설페이트의 양은 10 내지 80%일 수 있다. 바람직하게는 배양 배지는 50% 암모늄 설페이트로 분획되고, 그 결과 상청액은 70% 암모늄 설페이트로 침전된다. 폴리펩티드 펠릿은 이온 교환크로마토그래피하여 예를 들어 Mono Q column 상에서 FPLC를 이용할 수 있다. 희석된 분획은 엔도글리코시다아제 활성을 위해 분석할 수 있고 피크활성 분획을 모을 수 있다. 분획들은 SDS PAGE로 분석할 수 있다. 분획들은 -80℃에서 저장할 수 있다.

본 발명에 사용된 폴리펩티드는 상기 분리된 폴리펩티드의 분획으로 제조될 수 있다. EndoS49 폴리펩티드는 합성으로 또는 재조합 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어 재조합 EndoS49 펩티드는 배지의 포유류 세포를 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한 발현벡터로 형질도입하고, 그 세포를 배양하고, 그 세포에서 생산된 EndoS49 폴리펩티드를 추출 및 정제함으로써 생산할 수 있다.

본 발명의 EndoS49 폴리펩티드는 엔도글리코시다아제 활성을 나타낸다. 바람직하게는 폴리펩티드는 IgG 중사슬 폴리펩티드 전체에 연결된 당사슬을 가수분해함으로써 IgG 또는 IgG Fc 단편을 가수분해한다. 바람직하게는 본 발명의 EndoS49 폴리펩티드는 엔도글리코시다아제 활성을 가지고 있고 알파-1-마이크로글로불린의 당사슬 가수분해를 할 수 있다.

상기 엔도글리코시다아제 활성은 적합한 분석방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어 폴리펩티드 시료는 IgG 또는 알파-1-마이크로글로불린 같은 당단백질과 37℃에서 배양될 수 있다. 출발물질 및 반응산물은 SDS PAGE에 의해 분석될 수 있다. 일반적으로 IgG 중사슬의 분자량은 시료 폴리펩티드가 IgG 엔도글리코시다아제 활성을 가진다면 대략 3 kDa 내지 4 kDa 감소한다. 시료 폴리펩티드가 IgG 엔도글리코시다아제 활성을 가지고 있는지 여부를 결정하기 위한 다른 방법은 Lens culinaris agglutinin lectin(LCA)를 이용하여, 선택적으로는 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 및 퍼옥시다아제 기질(peroxidase substrate)을 이용하여 글리코실화된 IgG를 검출하는 것이다. 일반적으로 시료 폴리펩티드가 IgG 엔도글리코시다아제 활성이 있다면 당 신호는 감소한다. 또 다른 분석방법은 시료 폴리펩티드를 정제한 IgG Fc 단편과 배양한 다음 10 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol) 및 질량분석기(MALDI-TOF)에 의하여 시료의 감소를 확인한다. 엔도글리코시다아제 활성은 상기 언급한 분석방법에서 IgG 대신에 알파-1-마이크로글로불린을 이용함으로써 측정할 수 있다.

폴리펩티드의 엔도글리코시다아제 활성은 억제연구를 특징으로 한다. EndoS49 폴리펩티드는 시료에 존재하는 당단백질 분자를 가수분해할 수 있다. 따라서 EndoS49 폴리펩티드는 인간 IgG의 중사슬 또는 알파-1-마이크로글로불린 같은 당단백질 상의 당사슬을 가수분해할 수 있다. EndoS49는 4개의 서브클래스(IgG₁ _-4)의 인간 IgG를 가수분해할 수 있다. 바람직한 실시예에서 EndoS49 폴리펩티드는 인간 IgG 및 알파-1-마이크로글로불린을 가수분해할 수 있다.

엔도글리코시다아제 활성이 결핍된 EndoS49 폴리펩티드

본 발명에서 EndoS49 폴리펩티드는 엔도글리코시다아제 활성이 결핍되었으나 IgG 결합활성을 가지도록 조작한 변형 S. pyogenes EndoS49가 될 수 있다. 상기 변형 EndoS49는 특히 여기에 기술한 방법에 유용하다. 변형 EndoS49는 IgG 결합 활성에 의하여 IgG 또는 그의 변종이나 단편, 특히 일반적으로 글리코실화되는 Fc 단편에 결합한다. IgG 분자 또는 그의 변종이나 단편은 자연발생적인 IgG 분자에 연결된 것으로 알려진 한 개 이상의 탄수화물 그룹과 연결된 IgG 폴리펩티드 중사슬을 포함하는 당단백질이다. 특히 상기 한 개 이상의 탄수화물 그룹은 전체 IgG 중사슬 폴리펩티드의 잔기 297에 해당하는 아스파라긴 잔기에 연결된 글리칸이다.

EndoS49 폴리펩티드는 바람직하게는 위치 선택적 돌연변이에 의해 조작된다. 여기에 기술된 EndoS49 폴리펩티드는 최소 한개, 바람직하게는 두 개, 세 개 또는 전체 네 개의 IgG 서브 클래스, IgG1-4에 결합한다. 바람직하게는 한 개 이상의 IgG 서브 클래스는 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합된다.

변형 EndoS49와 IgG 서브 클래스 간 결합의 결합친화도 상수(K_D)는 0.05μM 이상, 바람직하게는 0.06μM, 0.07μM 또는 0.08μM 이상이다. 적당한 방법에 의해 결합활성을 결정하고 결합친화도를 평가할 수 있다. 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 상호작용해석, 평형투석 또는 스캐차드 분석과 결합된 표준 생화학적 방법이 있다.

변이체는 다른 세균의 EndoS49 폴리펩티드로부터 유래될 수도 있고 상기 변이체가 엔도글리코시다아제 활성이 결핍되었으나 IgG 결합활성을 가지는 것을 예외로 하는 것이 앞서 기술되었다. 변형 EndoS49 폴리펩티드는 하기를 포함할 수 있다:

(a) 서열번호 2의 아미노산 서열;

(b) 서열번호 2의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지고 엔도글리코시다아제 활성이 없는 변이체; 또는

(c) 엔도글리코시다아제 활성이 없는 상기 (a), (b) 중 어느 하나의 단편.

바람직하게는 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 포함하거나 구성한다. 서열번호 2는 서열번호 1의 서열에서 유래되었으나 서열번호 1의 186 위치에서 글루탐산(E)이 류신(L)으로 치환되어 엔도글리코시다아제 활성이 결핍되도록 조작되었다. 앞서 기술한 바와 같이 상기 폴리펩티드는 일반적으로 IgG-결합 활성을 가진다.

여기에 설명한 바와 같이 변종 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 벗어났으나 EndoS49의 엔도글리코시다아제 활성은 결핍되고 IgG-결합 활성은 가지는 폴리펩티드이다. 상기 변종은 펩타이드가 상기 특성을 유지하는 한 단백질 서열 내에서 대립 변종 및 단일 아미노산 또는 아미노산 그룹의 삭제, 변형 또는 첨가를 포함한다.

변이체 서열은 일반적으로 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 100 또는 그 이상의 돌연변이(아미노산의 치환, 삭제 또는 삽입)에 따라 다르다. 변종 폴리펩티드가 엔도글리코시다아제 활성은 결핍되고 IgG-결합 활성은 유지한다면 예를 들어 1 내지 100, 2 내지 50, 3 내지 30 또는 5 내지 20 아미노산 치환, 제거 또는 삽입이 일어날 수 있다.

일반적으로 50% 이상, 55% 이상 또는 65% 이상 동일하고, 바람직하게는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 서열번호 2의 아미노산 서열과 동일하고 엔도글리코시다아제 활성은 결핍되고 IgG-결합 활성은 유지하는 변이체 서열을 단백질 변이체로 여겨진다. 서열번호 2의 변이체 동일성은 서열번호 2의 서열에 100 이상, 250 이상, 500 이상, 750 이상, 800 이상, 820 이상 830 이상 인접한, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 전체길이 영역에서 측정할 수 있다.

본 발명의 EndoS49 폴리펩티드 단편은 EndoS의 엔도글리코시다아제 활성은 결핍되고 IgG-결합 활성은 유지하는 한, 일반적으로 400, 500, 600, 700, 750, 800 또는 830개 이상의 아미노산 길이이다. 바람직하게는 본 발명에 사용된 EndoS49 폴리펩티드 단편은 서열번호 1의 잔기 179 내지 186을 포함한다.

대체적인 방법으로 원하는 성질을 가진 EndoS49 단백질은 EndoS49 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드를 교체한 후 적절한 시스템에서 상기 뉴클레오티드를 발현시켜 생산할 수 있다. 적절한 방법은 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드의 위치-지정 돌연변이생성을 포함한다. 이 기술은 단백질 기능연구에 널리 사용되고 있다. 이 기술은 전형적으로 올리고뉴클레오티드 기준이며 하기의 단계를 수반한다.:

(1) 얻고자 하는 단백질을 암호화하는 DNA를 플라스미드 벡터 내로 클로닝하는 단계.

(2) 단일가닥 생산을 위해 플라스미드 DNA를 변성하는 단계.

(3) 변성시킨 DNA를 타겟 서열과는 상보적이면서 원하는 변이(들)(점 변이, 결실, 삽입)는 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드 (또는 올리고뉴클레오티드들)와 접촉시켜 합성 올리고뉴클레오티드가 타겟 부위에 어넬링되는 단계.

(4) 플라스미드 DNA 가닥을 주형으로 사용하여 DNA 중합효소에 의해 변이 가닥을 신장시키는 단계.

(5)E. coli로 형질전환시켜서 이형이중가닥(변이된/변이되지 않은 가닥)을 전파시키는 단계.

전파후 생산된 이형이중가닥의 50%는 변이체이고 나머지 50%는 "자연형"(변이되지 않음)이다. 선택과 농축방법은 변이체의 생산을 증대시키기 위해 사용된다. 예를 들면, 원래의 비변이성 가닥은 메틸화 DNA만 절단하는 제한효소 (DpnI)로 처리될 수 있다. 새로이 합성된 가닥들은 메틸화되지 않은 반면, 원래의 가닥은 메틸화 되었으므로(만약 올바른 E. coli 환경에서 정제되었다면), 이는 E. coli로 형질전환시키기 전에 반응에서 원래의 가닥을 제거한다.

또다른 위치-지정 돌연변이형성은 하기의 단계를 포함한다.:

(1) 특정 변이형성 프라이머를 사용한 PCR 또는 error-prone PCR 후 원하는 돌연변이 또는 단백질 가능의 소실/획득의 스크리닝하는 단계.

(2) E. coli 변이주 (DNA 교정 시스템이 결여된)으로 원하는 유전자를 가진 플라스미드를 도입한 후 원하는 돌연변이 또는 단백질 가능의 소실/획득의 스크리닝하는 단계.

(3) 원하는 돌연변이를 가진 부분적 또는 전체 유전자를 화학합성한 후 적절한 단백질 발현 시스템을 도입하는 단계.

또한, 원하는 성질을 가진 EndoS49 단백질은 DNA에 독립적인 방법으로 생산될 수 있는데, 원하는 돌연변이를 가진 폴리펩티드의 부분적 화합합성을 포함한다.

본 발명에 사용되는 폴리펩티드는 이러한 폴리펩티드의 단편으로서 준비될 수 있다. 더 나아가, EndoS49 폴리펩티드는 합성적으로 또는 재조합 수단으로 만들 수 있다. 예를 들면, 재조합 EndoS49 폴리펩티드는 포유류 세포에 적절한 제어서열 (control sequence)과 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현벡터를 감염시키고 상기 세포를 배양하고, 세포에 의해 생산된 EndoS49 폴리펩티드를 추출 및 정제하여 생산될 수 있다.

상기 EndoS49 폴리펩티드는 어떤 대상에서 채취한 시료에 존재하는 IgG 분자와 결합한다. 따라서, 상기 대상은 인간일때, EndoS49 폴리펩티드는 인간 IgG와 결합할 수 있다. EndoS49는 4개의 모든 서브클래스 (IgG₁ _-4)의 IgG와 결합할 수 있다.

폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주세포

본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 약학적 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 (a) 서열번호 3의 코딩 서열 또는 그의 상보적인 서열; (b) 염격한 조건 하에 서열 (a)에 혼성화 결합하는 서열; (c) 유전자 암호의 결과 서열 (a) 또는 (b)에 복수대응하는 서열; (d) 서열 (a), (b) 또는 (c)에 60% 일치하는 서열; 및 (e) 상기 서열들의 단편들.

폴리뉴클레오티드는 일반적으로 DNA이다. 그러나 본 발명은 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단일 또는 이중가닥일 수 있고 합성 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 코딩 서열 또는 그에 상보적 서열에 혼성화 결합할 수 있다. background 혼성화는 DNA 라이브러리에 있는 다른 DNA 때문에 일어날 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3의 코딩 서열 또는 그에 상보적 서열 사이의 상호작용에 의해 발생된 시그널 수준은 일반적으로 10 배 이상, 바람직하게는 100 배 이상 다른 폴리펩티드와 서열번호 3의 코딩 서열 사이의 상호작용만큼 강하다. 상호작용의 세기는 ³²P 같은 탐침을 방사선 동위원소로 써서 식별함으로써 측정할 수 있다. 그러나 상기 혼성화는 당업계에 알려진 어느 조건(Sambrook et al, 1989)에서도 수행될 수 있다. 예를 들어 high stringency가 요구된다면 60℃ 내지 65℃에서 0.1 내지 0.2×SSC를 포함하는 조건이 적당하다. lower stringency가 요구된다면 60℃에서 2×SSC를 포함하는 조건이 적당하다.

서열번호 3의 코딩 서열은 뉴클레오티드 치환, 예를 들어 1, 2 또는 3부터 10, 25, 50 또는 100개의 치환에 의해 변형될 수 있다. 그렇지 않으면 서열번호 3에 기재된 폴리뉴클레오티드는 추가적으로 한 개 이상의 삽입 및/또는 삭제 및/또는 한쪽이나 양쪽 끝의 연장에 의해 변형될 수 있다. 신호서열 같은 추가적인 서열도 포함될 수 있다. 변형된 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 엔도글리코시다아제 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 EndoS49 폴리펩티드의 에피토프 영역을 암호화한다. 예를 들어 상기 표에 나타낸 대로 변이된 서열이 번역될 때 Degenerate 치환 및/또는 치환의 결과 보존적인 아미노산 치환이 이루어진다.

서열번호 3의 DNA 코딩 서열에 선택적으로 혼성화 결합할 수 있는 뉴클레오티드 서열은 최소 20, 바람직하게는 최소 30, 최소 40, 최소 60, 더욱 바람직하게는 최소 100개의 인접한 뉴클레오티드 또는 가장 바람직하게는 서열번호 3의 전체길이에서 서열번호 3의 코딩 서열에 일반적으로 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 동일한 서열을 가진다. 서열의 동일성 또는 유사성을 계산하는 방법은 본 발명의 폴리펩티드에 관련하여 상기에 자세히 나타낸다.

상기 언급한 서열 동일성의 정도 및 최소 크기를 조합하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 정의하는데 이용할 수 있다. 더욱 엄격한 조건 하에서(즉, 길이가 더욱 긴 범위에서 더 높은 서열 동일성) 이루어지는 것이 바람직하다. 따라서 예를 들어 25개, 바람직하게는 30개 뉴클레오티드 서열의 90% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 한 측면을 형성하고 40개 뉴클레오티드 서열의 95% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드도 마찬가지이다.

탐침 또는 프라이머처럼 유용한 폴리뉴클레오티드 단편은 바람직하게는 뉴클레오티드 10 이상, 바람직하게는 15 이상 또는 20 이상, 예를 들어 25 이상, 30 이상 또는 40 이상일 수 있다. 일반적으로는 최대 40, 50, 60, 70, 100 또는 150개일 것이다. 탐침 및 단편들은 예를 들어 200, 300, 400, 500, 600, 700개 뉴클레오티드처럼 150개 길이보다 더욱 길이가 길 수 있고 또는 서열번호 3의 코딩서열의 5 또는 10 뉴클레오티드처럼 적은 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 재조합을 이용하여, 합성으로 또는 당업자라면 이용할 수 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표준적인 기술에 의해 복제될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 분리된 및/또는 정제된 형태로 제공된다.

프라이머는 일반적으로 한번에 뉴클레오티드 한 개씩 핵산 서열을 제조하는 방법에 관련된 합성방법으로 제조될 것이다. 자동화 기술을 이용하여 이를 수행하는 기법은 당업계에서 쉽게 이용가능하다.

길이가 더 긴 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 재조합 방법, 예를 들어 PCR(polymerase chain reaction) 복제기술을 이용하여 제조될 수 있다. 이 방법은 복제하고자 하는 ndoS49 유전자 영역에 결합하는 한 쌍의 프라이머를 제작하고, 상기 프라이머를 세균 세포에서 얻은 DNA에 접촉하고, 원하는 영역의 증폭을 일으키는 조건 하에서 PCR을 수행하고, 증폭된 단편을 분리하고(예를 들어 아가로스 젤 상에서 반응 혼합물을 정제함), 증폭된 DNA를 회복시키는 것과 관련 있다. 상기 프라이머는 적합한 제한효소 인식위치를 포함하여 증폭된 DNA가 적합한 클로닝 벡터안으로 복제될 수 있게 설계할 수 있다.

일반적으로 여기에 언급한 기술들은 당업계에 알려져 있으나 특히 Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989)을 참고할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 in vitro상에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생산하는 데 이용한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 PCR 프라이머, 얼터너티브 증폭반응을 위한 프라이머 등 프라이머, 방사성 또는 비방사성 표지를 이용한 종래의 방법으로 표지를 나타내는 탐침으로서 사용되거나 벡터 안으로 복제될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머는 표지를 나타낼 수 있다. 적당한 표지는 ³²P 또는 ³⁵S 같은 방사성 동위원소, 효소 표지 또는 바이오틴 같은 다른 단백질 표지를 포함한다. 상기 표지는 본 발명의 폴리뉴클레오티드나 프라이머에 부가될 수 있고 잘 알려진 기술을 이용하여 그 자체를 검출할 수 있다.

표지 또는 비표지한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머 또는 그의 단편은 시료 내 ndoS49를 검출 또는 서열분석하기 위해 핵산을 기본으로 하는 실험에서 당업자에게 이용될 수 있다.

상기 검출실험은 일반적으로 혼성화 조건에서 DNA 또는 RNA를 함유하는 시료를 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머를 포함하는 탐침과 접촉시키고 시료 내 탐침과 핵산 사이에 형성된 duplex를 검출하는 것을 포함한다. 상기 검출은 PCR 기술을 이용하거나 탐침을 고체 받침 상에 고정화시키고 탐침에 혼성화 결합하지 않은 시료 내 핵산을 제거한 다음 탐침에 혼성화된 핵산을 검출함으로써 수행할 수 있다. 대안으로는, 시료 핵산이 고체 받침에 고정화되고 상기 받침에 결합한 탐침의 양을 검출할 수 있다.

본 발명의 탐침은 편리하게도 적당한 용기에 시료시트의 형태로 포장될 수 있다. 상기 키트에서 탐침은 키트가 설계된 분석 포맷이 결합을 필요로 하는 고체 받침에 결합할 수 있다. 키트는 검사할 시료를 처리, 시료 내의 핵산에 탐침을 혼성화시키는 적당한 시약, 조절 시약, 설명서 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 복제가능한 벡터에 통합할 수 있다. 상기 벡터는 양립가능한 숙주세포에서 핵산을 복제하는데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 복제가능한 벡터 안으로 넣고, 상기 벡터를 숙주 세포 안으로 넣고, 벡터의 복제를 야기하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 성장시킴으로써 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 제조될 수 있다.

바람직하게는 상기 벡터는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현벡터이다. 상기 발현 벡터는 분자생물학계에서 일상적으로 구성되고 예를 들어 플라스미드 DNA 및 적절한 개시제, 프로모터, 인헨서 및 단백질 발현을 위해 필요할 수 있고 정확한 방향으로 배치된 다른 요소의 사용에 관련이 있다. 다른 적당한 벡터는 당업자에게 명백할 것이다. 이 점에서 추가 예로서 Sambrook et al., 1989를 참조한다.

본 발명에 따라 폴리뉴클레오티드는 안티센스 RNA의 생산을 위해 안티센스 방향으로 상기 기술된 벡터 안에 끼워 들어갈 수 있다. 안티센스 RNA 또는 다른 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 간섭 RNA, iRNA를 합성으로 제조할 수 있다. 상기 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 iRNA는 본 발명의 분석에서 시료 화합물로서 사용될 수 있고, 인간 또는 동물의 치료방법에 유용할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 사용되는 폴리뉴클레오티드는 벡터에서 숙주세포에 의해 코딩서열을 발현할 수 있는 제어서열(control sequence)에 작동가능하게 연결된다. 즉, 상기 벡터는 발현 벡터이다. 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"는 구성요소가 정해진 방법으로 기능하도록 허용하는 관계에 놓인 병렬을 나타낸다. 코딩서열에 "작동가능하게 연결된" 프로모터 등 조절서열은 코딩서열의 발현이 조절서열과 공존하는 조건 하에 일어나는 방법으로 배치된다.

예를 들어 벡터는 복제개시점, 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 선택적으로 그 프로모터의 조절자를 가지는 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 한 개 이상의 선택가능한 마커 유전자, 예를 들어 박테리아 플라스미드의 경우 앰피실린 저항 유전자 또는 매개진균용 저항유전자를 포함할 수 있다.

프로모터 및 다른 발현조절신호는 숙주세포와 공존하기 위해 어떤 발현이 고안되는지에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어 효모 프로모터는 S. cerevisiae GAL4 및 ADH 프로모터, S. pombe nmt1 및 adh 프로모터를 포함한다. 포유류 프로모터는 카드뮴 같은 중금속에 반응하여 유도될 수 있는 메탈로티오테인 프로모터를 포함한다. 바이러스 프로모터는 SV40 라지 T 항원 프로모터 또는 아데노바이러스 프로모터를 이용할 수 있다. 모든 프로모터들은 당업계에서 손쉽게 이용가능하다.

포유류 프로모터로 β-액틴 프로모터를 사용할 수 있다. 조직-특이적인 프로모터는 특히 바람직하다. 바이러스 프로모터로는 Moloney 쥐백혈병바이러스 긴말단반복순서(MMLV LTR), 라우스 육종바이러스(RSV) LTR 프로모터, SV40 프로모터, 사람 거대세포바이러스(CMV) IE 프로모터, 아데노바이러스, HSV 프로모터(HSV IE 프로모터) 또는 HPV 프로모터, 특히 HPV 업스트림 조절영역(URR)을 이용할 수 있다. 바이러스 프로모터는 당업계에서 손쉽게 이용가능하다.

발현벡터는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 발현하기 위해 적당한 숙주세포 안으로 형질도입될 수 있다. 상기 기술한 대로 발현벡터로 형질전환 또는 형질주입된 숙주세포는 폴리펩티드 또는 단편의 발현이 가능한 조건하에 배양되고 발현된 폴리펩티드 또는 단편은 회복된다. 상기 기술한 대로 분리 및 정제할 수 있다. 숙주세포는 벡터와 공존하기 위해 선택될 것이고, 바람직하게는 세균일 것이다. 숙주세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 비인간 동물 또는 식물의 세포일 수 있다.

IdeS

IdeS는 인간 병원체 S. pyogenes에 의해 생성된 세포 외 시스테인 분해효소로서 WO 03/051914에 기술되었다. IdeS는 본래 group A 연쇄상구균 M1 혈청형에서 분리되었으나 ides 유전자는 실험한 모든 group A 연쇄상구균에서 확인되었다. IdeS는 세포 외에서 기질특이성이 높고 오직 기질 IgG만 결합한다. IdeS는 인간 IgG의 경첩 부위(hinge region)에 단일 단백질 분해성 절단을 촉매한다. 이 단백질 분해는 옵소닌에 의한 식균 작용을 방해하고 group A 연쇄상구균의 사멸을 방해한다. IdeS는 다양한 동물에서 IgG의 일부 서브클래스를 절단하고 효율적으로 IgG를 Fc 및 Fab 단편으로 바꾼다. ides 유전자는 GST 융합 단백질처럼 복제되어 E. coli에서 발현되었다.

본 발명에 사용되는 IdeS 폴리펩티드는 바람직하게는 시스테인 프로테아제 활성을 유지하는 S. pyogenes 또는 S. pyogenes 변이체의 단편이다. 변이체는 다른 세균 같은 생물체의 IdeS 폴리펩티드일 수 있다. 상기 세균은 바람직하게는 Streptococcus이다. Streptococcus는 바람직하게는 group A Streptococcus, group C Streptococcus 또는 group G Streptococcus이다. 특히 변이체는 S. equii나 S. zooepidemicus 같은 group C Streptococcus의 IdeS 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 변이체는 Pseudomonas putida 유래일 수 있다.

IdeS 폴리펩티드는

(a) 서열번호 4의 아미노산 서열;

(b) 서열번호 4의 서열과 50% 이상의 상동성을 가지고 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 가지는 변이체; 또는

(c) IgG 시스테인 프로테아제 활성을 가지는 상기 (a), (b) 중 어느 한 개의 단편

을 포함할 수 있다.

바람직하게는 IdeS 폴리펩티드는 서열번호 4의 서열을 포함 또는 구성한다. 서열번호 4는 신호서열이 없는 IdeS의 활성형(mature form) 서열이다.

서열번호 4의 서열과는 다른 아미노산이지만 IdeS와 동일한 시스테인 프로테아제 활성을 나타내는 변이체이다. 일반적으로, 서열번호 4의 아미노산 서열과 50%, 55% 또는 65% 이상 동일하고, 바람직하게는 70%, 80%, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95%, 97%, 99% 이상 동일한 폴리펩티드는 그 단백질의 변이체로 여긴다. 상기 변이체는 펩티드가 IdeS의 기본적인 기능성을 유지하는 한 단백질 서열 내에 대립 변이체, 단일 아미노산이나 아미노산 그룹의 삭제, 변이 또는 첨가를 포함할 수 있다.

서열번호 4의 변이체는 서열번호 4의 서열에 50 이상, 75 이상, 100 이상, 150 이상, 200 이상, 250 이상, 275 이상, 300 이상 또는 더 인접한 아미노산 영역 또는 더욱 바람직하게는 서열번호 4의 전체길이 영역에서 동일성을 측정할 수 있다.

서열번호 4의 아미노산 서열 변이체는 바람직하게는 서열번호 4의 잔기 Lys-55 및/또는 Cys-65 및/또는 His-233 및/또는 Asp-255 및/또는 Asp-257을 포함한다. 가장 바람직하게는 서열번호 4의 변이체는 서열번호 4의 잔기 Lys-55, Cys-65, His-233, Asp-255 및 Asp-257의 각각을 포함한다.

변이체 서열은 일반적으로 1, 2, 5, 10, 20, 30, 50 또는 그 이상의 (아미노산의 치환, 결실 또는 추가일 수 있는) 돌연변이에 따라 다르다. 예를 들어 1부터 50까지, 2부터 30까지, 3부터 20까지, 5부터 10까지 아미노산의 치환, 결실 또는 부가가 일어난다. 변이된 폴리펩티드는 IgG-특이적 시스테인 프로테아제 활성을 계속 유지한다. 바람직하게는 변이체 폴리펩티드는 일반적으로 시스테인 프로테아제 내에서 발견되는 간격에 시스테인 잔기 및 히스티딘 잔기를 포함한다. 예를 들어 서열번호 4에서 상기 잔기들은 일반적으로 시스테인 프로테아제에서 발견되는 것과 같이 약 130개의 아미노산 간격으로 발견된다.

본 발명에 사용되는 IdeS 폴리펩티드 단편은 IdeS의 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 유지하는 한 일반적으로 아미노산 길이 최소 10, 예를 들어 최소 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상이고 아미노산 길이 최대 100, 150, 200, 250 또는 300까지이다. 바람직하게는 본 발명에 사용된 IdeS 폴리펩티드 단편은 서열번호 4의 잔기 Lys-55 및/또는 Cys-65 및/또는 His-233 및/또는 Asp-255 및/또는 Asp-257을 포함한다. 가장 바람직하게는 상기 단편은 서열번호 4의 잔기 Lys-55, Cys-65, His-233, Asp-255 및 Asp-257의 각각을 포함한다.

본 발명에 따라 사용된 IdeS 폴리펩티드는 면역글로불린 시스테인 프로테아제 활성, 특히 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 보인다. 바람직하게는 상기 폴리펩티드는 IgG를 경첩 부위(hinge region)에서, 특히 중사슬의 경첩 부위(hinge region)에서 절단한다. IgG 절단 결과 Fc 및 Fab 단편이 생성된다. 바람직하게는 그 활성은 IgG에 특이적이다. 시스테인 프로테아제 활성은 적당한 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어 폴리펩티드 시료는 37℃와 같이 적당한 온도에서 IgG와 배양될 수 있다. 출발물질 및 반응생성물은 원하는 IgG 절단 생성물이 존재하는지 확인하기 위해 SDS PAGE에 의해 분석될 수 있다. 일반적으로 이 절단 생성물은 31 kDa 단편이다. 절단 생성물은 절단이 IgG의 경첩 부위에 일어났는지 확인하기 위해 N-말단 서열분석을 할 수 있다. 바람직하게는 N-말단 서열은 GPSVFLFP 서열을 포함한다.

폴리펩티드의 시스테인 프로테아제 활성은 억제연구를 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 상기 활성은 프로테아제 억제제(protease inhibitor) 펩티드 파생물 Z-LVG-CHN2 및/또는 요오드아세트산(iodoacetic acid)에 의해 억제된다. 그러나 상기 활성은 대개 E64에 의해 억제되지 않는다.

폴리펩티드의 시스테인 프로테아제 활성은 대개 IgG-특이적이므로 상기 폴리펩티드는 IgG 절단을 허용하는 조건에서 면역 글로불린과 배양했을 때 Ig의 다른 클래스, 즉 IgM, IgA, IgD 및 IgE를 분해하지 않을 것이다. IdeS 폴리펩티드는 인간 IgG를 절단할 수 있다. 바람직한 실시예에서 상기 폴리펩티드는 인간, 토끼, 쥐 또는 염소 IgG를 절단할 수 있다.

본 발명에 사용된 IdeS 폴리펩티드는 IdeS 폴리펩티드를 발현하는 적당한 생물로부터 분리할 수 있다. 일반적으로 IdeS 폴리펩티드는 적당한 IdeS 발현 균주 S. pyogenes로부터 분리한다. 적당한 생물 및 균주는 많은 기술에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어 S. pyogenes 균주는 초기에 ides 유전자의 존재 유무를 위해 실험에 이용될 수 있다. ides 유전자의 존재 유무는 프라이머를 이용하여 PCR에 의하여 또는 S. pyogenes 균주의 genomic DNA에 탐침을 혼성화하여 확인할 수 있다.

S. pyogenes 균주가 발현하는 활성 IdeS는 배양물 상청액에서 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 분석함으로써 확인할 수 있다. 바람직하게는 SpeB 시스테인 프로테아제 활성을 억제하기 위해 억제제 E64를 상청액에 첨가한다. 5종 이상의 균주: AP1, AP12, AP55, KTL3 및 SF370 균주가 활성 IdeS를 발현한다. 바람직하게는 발현 균주는 AP1, AP12 및 AP55로부터 선택된다.

발현 균주 S. pyogenes 배양물 또는 IdeS를 발현하는 다른 세포 배양물로부터 IdeS의 분리 및 정제는 일반적으로 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 기본으로 한다. 바람직하게는 상기 정제방법은 암모늄 설페이트 침전 단계 및 이온 교환 크로마토그래피 단계에 관련이 있다. 한 가지 방법에 따르면, 첨가하는 암모늄 설페이트의 양을 증가시킴으로써 배양 배지를 분획한다. 암모늄 설페이트의 양은 10 내지 80%일 수 있다. 바람직하게는 배양 배지는 50% 암모늄 설페이트로 분획되어 그 상청액이 70% 암모늄 설페이트로 침전된다. 펠릿 폴리펩티드는 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어 Mono Q column 상에 FPLC를 하게 되어 있다. IgG 시스테인 프로테아제 활성에 대하여 알기 위해 희석한 분획들을 분석할 수 있고 피크 활성의 분획들을 모을 수 있다. 분획들을 SDS PAGE로 분석할 수 있다. 예를 들어 N-말단 서열은 SDS PAGE 단백질 밴드로부터 얻을 수 있다. 분획들은 -20℃에 저장될 수 있다.

EndoS49 의 엔도글리코시다아제 활성을 이용하는 방법

본 발명에 기술한 바와 같이, EndoS49는 엔도글리코시다아제 활성을 가지고 IgG 및 알파-1-마이크로글로불린을 포함하는 당단백질의 글리칸을 가수분해할 수 있다. 따라서 본 발명은 당단백질, 특히 IgG 및 알파-1-마이크로글로불린의 탈당화 방법, 특히 당단백질의 글리칸을 가수분해하는 방법을 제공한다. 일반적으로 상기 방법은 당단백질을 함유하는 시료를 EndoS49와 함께 엔도글리코시다아제 활성이 가능한 조건 하에 배양하는 것을 포함한다. 적당한 조건은 EndoS49의 농도가 최소 1μg/ml, 2μg/ml, 4μg/ml, 6μg/ml, 8μg/ml, 10μg/ml, 12μg/ml, 15μg/ml 또는 20μg/ml, 바람직하게는 최소 10μg/ml의 사용을 포함한다. 적당한 조건은 시료를 EndoS49와 최소 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 70분, 80분, 90분 또는 120분, 바람직하게는 60분 동안 배양하는 것을 포함한다. 배양은 바람직하게는 상온에서, 더욱 바람직하게는 대략 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃ 또는 45℃, 그리고 가장 바람직하게는 대략 37℃에서 일어난다.

상기 방법들은 그 자체로 연구나 치료에 유용한 탈당화된 당단백질을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 상기 방법들은 예를 들어 글리코맵핑이나 글리코프로파일링에서 당단백질 상의 글리칸을 특징짓기 위해 이용될 수 있다. 상기 글리코맵핑 및 글리코프로파일링은 특히 IgG 분자같은 항체분자, 예를 들어 단일클론 IgG 분자의 분석에 유용하다. 일반적으로 상기 방법은 단백질의 글리칸을 가수분해하기 위해 단백질을 EndoS49와 함께 배양하는 것에 관련이 있다. 그 다음에 글리칸 및 단백질 또는 폴리펩티드는 적당한 기술, 예를 들어 HPLC 또는 겔 크로마토그래피를 이용하여 분리된다. 분리된 부분은 질량분석기, HPLC, 겔 크로마토그래피, 겔 전기영동, 분광법, 모세관 전기이동 및 글리칸 및/또는 단백질의 분석을 위한 기타 표준실험방법을 이용하여 분석할 수 있다.

본 발명의 다른 방법에 따르면 IdeS 같은 효소를 추가로 이용할 수 있으므로 본 발명에 기술된 방법 및 기술을 이용하여 항체의 Fc 상의 글리칸이 더 자세히 분석될 수 있다.

예를 들면 면역글로불린의 푸코실화를 분석한다. IgG 분자의 Fc 글리칸 상의 푸코실화 정도는 IgG 신약 후보물질의 치료 가능성에 중요하다. 푸코실화된 IgG 분자는 치료적 IgG 분자의 ADCC(nn) 효과를 증가시킨다. 따라서 본 발명에 따라 EndoS49를 이용하여 IgG의 Fc 글리칸에서 푸코오스의 양을 분석하는 방법을 제공한다.

일반적으로 상기 방법은 EndoS49의 엔도글리코시다아제 활성을 허용하는 조건 하에서 당단백질, 이 경우에 면역 글로불린을 EndoS49와 함께 배양하는 것을 포함한다. 적당한 조건은 최소 1μg/ml, 2μg/ml, 4μg/ml, 6μg/ml, 8μg/ml, 10μg/ml, 12μg/ml, 15μg/ml 또는 20μg/ml, 바람직하게는 최소 10μg/ml 농도의 EndoS49 사용을 포함한다. 적당한 조건은 시료를 EndoS49와 최소 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 70분, 80분, 90분 또는 120분, 바람직하게는 60분 동안 배양하는 것을 포함한다. 배양은 바람직하게는 상온에서, 더욱 바람직하게는 대략 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃ 또는 45℃, 그리고 가장 바람직하게는 대략 37℃에서 일어난다. EndoS49와 반응한 후 또는 동일한 반응혼합물에서 면역 글로불린 분자를 F(ab')2 및 Fc로 나누는 단백질 분해를 유도하기 위해 IdeS를 첨가할 수 있다. 상기 두 개의 단편은 질량 분석기 안으로 들어가기 전에 분리 방법을 이용하여 분리된다. 글리칸 절단 이후 GlcNAc 및 core Fuc 잔기는 Asn의 컨센서스 Fc/2 글리코실화 부위에 붙는다. 비푸코실화된 면역 글로불린은 푸코실화되지 않으므로 분해 후에 일부 Fc/2는 GlcNAc 만을 함유할 것이다. 푸코오스가 없을 때 특유의 질량의 차이(-146 Da)는 디콘볼루션 질량 스펙트럼에서 쉽게 눈에 띈다. 따라서 EndoS49의 사용은 IgG의 핵심적인 비푸코실화 정도를 직접 측정하는 것을 용이하게 한다.

시료에서 IgG 의 존재 또는 부재를 확인하거나 IgG 를 함유하는 시료로부터 IgG를 분리하는 방법

IgG의 분리 및/또는 확인은 종래의 기술에서는 전형적으로 단백질 G나 단백질 A와 같은 시약을 사용하여 수행되었다. 세균 단백질은 IgG와 잘 반응한다. 그러나, 단백질 A가 모든 서브클래스의 IgG (IgG₁ _-4)에 결합하는 것은 아니고, 단백질 A와 단백질 G는 탈글리코실화 및/또는 변성된 비활성 IgG와 글리코실화 및/또는 자연적이고 기능적으로 활성화된 IgG를 분별하기 불가능하다. 이와는 대조적으로, 본 발명자들은 IgG 엔도글리코시다이제 활성이 결핍된 EndoS49 폴리펩티드가 전형적으로 높은 친화력으로 4개의 모든 IgG 서브클래스와 결합하고; 일반적으로 글리코실화 IgG 즉 자연적이고 기능적으로 활성화된 형태는 선택적임을 규명하였다.

따라서, 본 발명은 시료에서 IgG의 존재 또는 부재를 확인하는데 개선된 방법을 제공하는데, 상기 방법은 IgG 엔도글리코시다이제 활성이 결핍된 EndoS49 폴리펩티드를 접촉시키고, 접촉한 시료에서 상기 EndoS49를 분리하고, 이로써 IgG의 존재 또는 부재를 확인하고 선택적으로는 IgG가 존재할 때 분리된 IgG를 수획하는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 IgG를 함유하는 시료로부터 IgG를 분리하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 시료를 IgG 엔도글리코시다이제 활성이 결핍된 EndoS49 폴리펩티드와 접촉시키고, 접촉한 시료에서 상기 EndoS49를 분리하고, 이로 인해 분리된 IgG를 얻는 단계를 포함한다.

상기 시료는 EndoS49 폴리펩티드와 시료가 상호작용이 일어나기 적합하며 IgG 결합활성이 발생하는 조건 즉 IgG-EndoS49 폴리펩티드 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에서 접촉한다. 적합한 조건은 EndoS49를 적어도 1㎍/ml, 2㎍/ml, 4㎍/ml, 6㎍/ml, 8㎍/ml, 10㎍/ml, 12㎍/ml, 15㎍/ml, 또는 20㎍/ml의 농도, 바람직하게는 10㎍/ml의 농도로 사용되는 것을 포함한다. 적합한 조건은 또한 시료와 EndoS49의 배양을 적어도 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 70분, 80분, 90분 또는 120분, 바람직하게는 적어도 60분 이상을 배양하는 것을 포함한다. 배양은 바람직하게는 실온에서 이루어지고, 더욱 바람직하게는 약 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃에서 이루어지며, 가장 바람직하게는 37℃에서 이루어진다.

본 방법에서 EndoS49의 특징적인 장점은 EndoS49가 정상적으로 글리코실화된 IgG에 결합한다는 것이다. IgG와 결합하는 다른 약품들의 IgG 결합력은 전형적으로 IgG 당단백질의 변성을 요구하거나 이에 의해 촉진된다. 이는 IgG를 함유하는 시료를 산으로 처리할 때 달성된다. 이러한 처리는 일부 항체(산 민감성 항체들)를 손상시키거나 변성시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 이러한 처리를 필요로 하지 않기 때문에, 상기 방법은 시료로부터 원래의 형태로 산 민감성 IgG를 분리하는데 특히 적합하다.

EndoS49는 어떠한 적합한 방법에 의해서도 시료에서 분리될 수 있다. 시료에서 EndoS49를 제거하는 바람직한 방법은 상기에서 기재한 바와 같이 유도되거나 변형된 EndoS49를 사용하는 것을 포함한다.

바람직한 변형은 히스티딘 테그를 첨가하는 것을 포함한다. 히스티딘 테그의 존재는 폴피펩티드가 높은 친화력으로 시약이나 니켈, 구리 또는 아연 이온을 그 표면에 가지는 킬레이팅 그룹을 함유하는 분리 수단에 결합하는 것을 의미한다. 히스티딘 테그는 이들 금속 이온에 강하게 결합한다. 이러한 시약은 따라서 시료로부터 EndoS49를 분리하는데 사용될 수 있다.

또다른 바람직한 변형은 바이오틴 테그의 첨가를 포함한다. 바이오틴 테그의 존재는 폴피펩티드가 높은 친화력으로 시약이나 스트렙트아비딘을 포함하는 분리 수단에 결합하는 것을 의미한다. 바이오틴 테그는 스트렙트아비딘에 강하게 결합한다. 이러한 시약은 따라서 시료로부터 EndoS49를 분리하는데 사용될 수 있다.

바람직한 시약 또는 분리수단으로는 EndoS49 폴리펩티드에 결합할 수 있는 자기성 입자 집단이 있다. 예를 들면, EndoS49 폴리펩티드는 히스티딘 테그, 니켈, 구리 또는 아연 이온을 그 표면에 가지는 킬레이팅 그룹을 함유하는 자기성 입자로 유도된다. 또는, EndoS49 폴리펩티드는 바이오틴 테그, 그 표면에 스트렙트아비딘을 그 표면에 가지는 자기성 입자로 유도된다.

따라서, 시료로부터 EndoS49를 제거하는 바람직한 방법은 상기에 기재된 바와 같이 자기성 입자 집단을 사용하여 시료에서 자기영역 분리를 수행하는 것을 포함한다. 자기성 입자는 바람직하게는 자기성 나노입자이고 자기영역 분리는 바람직하게는 고-구배 자기성 영역 분리 (high-gradient magnetic field separation)이다.

어떠한 적절한 분리수단도 사용 가능함은 이해될 것이다. 예를 들면, 대체가능한 수단이 하기 단락에 기재되어 있다.

접촉된 시료의 EndoS49는 적절한 수단으로 결합된 IgG의 존재 또는 부재를 확인할 수 있다.

예를 들면, EndoS49의 분자량이 분석될 수 있다. IgG에 결합된 EndoS49는 IgG에 결합되지 않은 EndoS49보다 더 큰 분자량을 가진다. 따라서, 적절한 방법은 분자량에 따라 단백질의 종류를 분별 할 수 있는 방법을 포함하여야 하며, 예를 들면 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏, Mass spectrophotometer 등이다. 또는, 상기 웨스턴 블랏은 IgG 특이적 항체나 특정 IgG 서브클래스 특이적 항체를 사용하여 IgG의 존재를 직접 분석할 수 있다. 이러한 방법에 의한 블랏에서 단백질을 검출하는 것은 종래에 널리 사용된 기술이다.

IgG에 결합된 EndoS49의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 다른 적절한 수단은 EndoS49를 연결 효소(즉, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase)로 연결된 IgG 또는 IgG와 결합한 단백질과 배양하고 형광/발색 기질을 첨가하는 것을 포함한다. 이 경우, 발색표지의 표시는 IgG의 존재를 지적하고, IgG의 정량은 발색의 강도에 비례한다. 이러한 방법에 의한 단백질의 검출은 종래에 널리 사용된 기술이다.

EndoS49에 결합한 IgG의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 추가적인 적절한 수단은 우선 EndoS49로부터 결합된 IgG를 분리하여 상기의 방법 또는 어떠한 적절한 방법에 의해서 EndoS49를 각각 분석/검출할 수 있도록 하는 것을 포함한다. IgG는 적절한 수단에 의해서 EndoS49로부터 분리될 수 있다.

적절한 수단은 시료를 적절한 용출 완충액과 함께 EndoS49와 접촉시켜 EndoS49로부터 IgG를 용출하는 것을 포함한다. 용출 완충액 선택은 전형적으로 EndoS49에 결합한 IgG가 알려진 것인지 또는 산에 민감성인지 즉, 산과 접촉하여 변성되거나/불활성화 되는지에 따른다.

항체가 산 민감성이 아닐 경우에는, 전형적으로 낮은 pH의 용출 완충액을 사용하는 용출 프로토콜이 적용된다. 이러한 유형의 용출 프로토콜은 종래에 잘 알려진 것이다. 상기 용출 완충액은 전형적으로 pH 3이하의 pH를 가지며, 가장 바람직하게는 pH 2 이하이다. 바람직한 실시예에서는 pH 2의 0.1 M 글리신을 포함한다. 또한, 선택적으로 이러한 완충액은 전형적으로 하기에 기재된 것 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.:

- 바람직하게는 약 0.5 M 내지 1 M 농도의 나트륨 또는 칼륨염;

- 음성 IgG의 Asn-297과 연관된 글리칸과 유사한 구조를 가진 모노-, 디- 또는 폴리-사카라이드

또는 이들의 조합들.

그러나, 상기에서 대략 언급했듯이, 본 발명의 방법은 특히 산 민감성 항체의 검출/분리에 적합하다. EndoS49에 결합한 IgG가 알려진 것이거나 산 민감성으로 의심되는 경우에는 따라서 낮은 pH가 필요없는 융출 완충액과 프로토콜이 사용된다. 이러한 프로토콜은 또한 종래에 잘 알려져 있었고 EndoS49와의 결합에 있어서 결합된 IgG와 경쟁하는 분자를 포함하는 완충액을 제공하는 원칙에 기초한다. 적절한 경쟁 용출 완충액은 따라서 전형적으로 하나 또는 그이상의 음성 IgG의 Asn-297과 연관된 글리칸과 유사한 구조를 가진 모노-, 디- 또는 폴리-사카라이드를 포함한다. 매우 바람직한 용출 완충액은 약 0.25 M 내지 약 0.5 M 농도로, 바람직하게는 pH 5.3 내지 8.3인 수크로스를 포함한다. 바람직한 용출 완충액의 예로는 pH7.4의 PBS 내의 0.25M 수크로스; pH7.4인 PBS 내의 0.5M 수크로스; pH5.3인 PBS 내의 0.25M 수크로스; pH8.5인 PBS 내의 0.25M 수크로스; 및 pH7.4인 PBS 내의 0.25M 수크로스, 0.25M 말토스가 있다.

추가적으로 또는 선택적으로 상기 경쟁 용출 완충액은 전형적으로 나트륨 또는 칼륨염을 포함하고, 바람직하게는 0.5M 내지 1M의 농도이다.

상기에서 언급되었던 EndoS49로부터 결합된 IgG를 분리하는 수단은 또한 분리된 IgG를 얻는데도 사용될 수 있다.

IgG 를 함유하는 시료의 글리코실화 상태 및/또는 기능적 정량을 평가하는 방법

본 발명에서 변형되지 않은 형태의 EndoS49 폴리펩티드는 IgG의 글리칸을 가수분해하는 능력을 가진다. 또한, 상기에서 언급한 바와 같이, IgG 엔도글리코시다이제 활성이 결핍되고 IgG에 결합하는 능력을 가진 본 발명의 EndoS49 폴리펩티드는 글리코실화된 및/또는 자연적이고, 기능적으로 활성인 IgG에 특이적이다. 따라서, EndoS49 폴리펩티드는 당단백질, 특히 IgG 항체의 글리코실화 상태를 분석하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라 IgG 항체는 엔도글리코시다이제 활성을 가진 본 발명의 EndoS49 폴리펩티드와 배양된다. 얻어진 산물은 HPLC, mass spectrophotometer, 겔 크로마토그래피, 겔 전기영동, spectrophotometer, 모세관 전기영동을 포함한 적합한 어떠한 방법으로도 분석할 수 있다. 이러한 분석 방법은 어떠한 단백질 준비단계에서도 수행될 수 있는데, 예를 들면, 방출검사 및 생산공정에 있어서 품질관리는 물론 약물후보 스크리닝 단계 및 생물학적 약물의 생산공정 개발단계에서도 수행될 수 있다.

엔도글리코시다이제 활성을 제거하거나 감소시켜 변형되었거나, 자연적인 형태에서 IgG에 결합하는 능력을 유보시킨 EndoS49 폴리펩티드는 또한 글리코매핑에 유용하고 특히 당 단백질의 분석 특히 IgG 구조 분석에 유용하다.

예를 들면, EndoS49 폴리펩티드를 사용하고 선택적으로 대체 IgG-결합 시약d을 함께 사용하여, 본 발명은 IgG를 함유하는 시료의 글리코실레이션 상태 또는 기능적 정량을 분석하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 IgG를 함유하는 시료로부터 1차 및 2차 시료를 채취하고, 상기 1차 및 2차 시료를 이후 기재될 방법에 따라 EndoS49 폴리펩티드와 접촉하고, 2차 시료를 글리코실화되지 않고/않거나 변성되었고 불활성인 IgG에 결합하는 대체 IgG 결합 시약과 접촉하고 이후 1차 시료에서 EndoS49 폴리펩티드에 결합한 IgG의 양을 정량하고, 2차 시료에서 대체 IgG 결합 시약에 결합한 IgG를 정량한다. 최종적으로 1차 및 2차 시료에서 결합된 IgG의 양을 비교분석하면, IgG를 함유한 시료 내의 글리코실레이션 상태 또는 기능적 정량이 분석될 수 있다.

대체 IgG 결합 시약은 전형적으로 IgG의 모든 형태(자연적인 또는 변성된)와 결합하는 단백질 A 또는 단백질 G이다. 이 경우, 상기 시약에 결합한 IgG의 양은 2차 시료에서 전체 IgG를 나타낸다. EndoS49 폴리펩티드는 글리코실화되고/되거나 자연적이고 기능적으로 활성화된 IgG에만 결합하고, 따라서 EndoS49에 결합한 IgG의 양은 1차 시료에 존재하는 글리코실화 되고/되거나 자연적이고 기능적으로 활성화된 IgG를 나타낸다. 2차 시료의 전체 IgG의 농도와 1차 시료의 자연적인 IgG의 농도를 비교하면 당업자는 글리코실화 되고/되거나 자연적이고 기능적으로 활성화된 IgG가 나타나는 원래의 시료에서의 IgG 비중을 반영하는 비율을 얻음을 알 수 있다.

또다른 실시예에서, 대체 IgG 결합 시약은 글리코실화 되지 않고/않거나 변성된 IgG에 특이적일 수 있다. 이러한 시약은 예를 들면 항체일 수 있다. 따라서, 본 실시에에서는 글리코실화 되고/되거나 자연적이고 기능적으로 활성화된 IgG가 나타나는 원래의 시료에서의 IgG의 비중이 하기 식에 의해 평가될 수 있다.:

1차 시료에서 IgG 의 양/(1차 시료의 IgG 의 양 + 2차 시료의 IgG 의 양)

상기 방법에서 시료는 폴리펩티드 또는 시약이 시료와 상호작용하기 적합한 조건 하에 EndoS49 폴리펩티드 또는 대체 IgG 결합 시약과 접촉하여 IgG 결합 활성이 생기도록 한다. 적합한 조건은 예를 들면 하기 단락에 기재된 것에 상응하는 것이다.

IgG 를 함유하는 시료로부터 IgG Fab 또는 Fc 단편을 분리하는 방법

본 발명의 방법은 IgG를 함유하는 시료로부터 Fab 단편을 분리하는데 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명은 IgG를 함유하는 시료로부터 IgG의 Fab 단편을 분리하는 방법을 제공하는데, 이때 상기 방법은

(a) IdeS 및 EndoS49 폴리펩티드를 IgG를 함유하는 시료와 접촉시키고,

(b) 상기 IdeS 및 EndoS49 폴리펩티드를 접촉된 시료로부터 분리하는 것을 포함하고, 상기 방법으로 Fab 단편을 분리하는 방법을 제공한다.

시료로부터 IdeS 및 EndoS49 폴리펩티드를 분리하는 바람직한 방법은 상기에 기술한 바와 같이 유도되거나 변형된 IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드를 사용하는 것을 포함한다. 동일한 또는 다른 변형은 각각의 IdeS 및 EndoS49 폴리펩티드에 사용될 수 있다.

바람직한 변형은 히스티딘 테그의 첨가를 포함한다. 히스티딘 테그의 존재는 폴리펩티드가 시약이나 표면에 니켈, 구리 또는 아연 이온을 가진 킬레이팅 그룹을 함유하는 분리수단과 높은 친화력으로 결합함을 의미한다. 이러한 시약은 따라서 IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드를 시료로부터 분리시키는데 사용할 수 있다.

또다른 바람직한 변형은 바이오틴 테그의 첨가를 포함한다. 바이오틴 테그의 존재는 폴리펩티드가 시약이나 스트렙트아비딘을 포함하는 분리수단과 높은 친화력으로 결합함을 의미한다. 바이오틴 테그는 스트렙트아비딘과 강하게 결합한다. 이러한 시약은 따라서 IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드를 시료로부터 분리시키는데 사용할 수 있다.

바람직한 시약 또는 분리수단으로는 EndoS49 폴리펩티드에 결합할 수 있는 자기성 입자 집단이 있다. 예를 들면, IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드가 히스티딘 테그로 유도되었을때, 자기성 입자는 그 표면에 니켈, 구리 또는 아연 이온을 가진 킬레이팅 그룹을 표면에 함유한다. 동시에, IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드가 바이오틴 테그로 유도되었을때, 자기성 입자는 그 표면에 스트렙트아비딘을 표면에 함유한다.

따라서, 시료로부터 EndoS49를 제거하는 바람직한 방법은 상기에 기술한 자기성 입자 집단 사용과 시료에서 자기성 영역 분리를 수행하는 것을 포함한다. 자기성 입자는 바람직하게는 자기성 나노입자이고, 자기성 영역 분리는 바람직하게는 고-구배 자기성 영역 분리 (high-gradient magnetic field separation)이다.

따라서, 상기 방법의 (a) 단계는 바람직하게는 IdeS 및 EndoS49 폴리펩티드에 결합할 수 있는 자기성 나노입자 집단과 시료를 접촉하는 것을 추가적으로 포함하고, (b) 단계는 시료의 자기성 영역 분리를 수행하는 것을 추가적으로 포함한다.

EndoS49 폴리펩티드는 바람직하게는 엔도글리코시다이제 활성이 결핍된 변형된 EndoS49 폴리펩티드이다.

상기 실시예에서 IgG를 함유하는 시료는 전형적으로 정제된 또는 분리된 IgG를 포함한다. "정제된 또는 분리된 IgG"란 일반적으로 시판되는 수준의 순도를 가진 IgG를 의미한다. IgG는 전형적으로 혈청 같은 시료나 재조합 IgG의 경우는 세포 융해물로부터 분리된다.

분리는 어떠한 적절한 방법으로도 수행될 수 있는데, 바람직하게는 상기에 기술한 바와 같이 엔도글리코시다이제 활성이 결핍된 변형된 EndoS49 폴리펩티드를 사용한 IgG를 분리하는 방법이다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에서는 상기에 기술된 방법에서 (a) 단계 이전에,

(i) 엔도글리코시다이제 활성이 결핍된 변형된 EndoS49 폴리펩티드를 IgG를 함유하는 시료와 접촉시켜 IgG-EndoS49 폴리펩티드 복합체를 형성하고,

(ii) 상기 IgG-EndoS49 폴리펩티드 복합체를 접촉한 시료로부터 분리하고,

(iii) 상기 IgG-EndoS49 폴리펩티드 복합체로부터 IgG를 용출하여 IgG를 함유하는 시료를 얻고,

이때 (a) 단계와 (b) 단계는 (iii) 단계에서 얻은 IgG를 함유하는 시료로 수행한다.

본 발명의 또다른 실시예에서는 방법을 수행하기 전에 IgG를 정제할 필요없이 IgG를 함유하는 시료로부터 Fab 단편을 분리하도록 변형되었다. 이 방법은 비정제 IgG를 포함하는 시료, 예를 들면 전혈청, 세포 융해물 또는 세포 배양액과 같은 시료로도 수행가능하다. 본 실시예에서 본 방법은

(a) IgG를 함유하는 시료를 EndoS49 폴리펩티드와 접촉시켜 IgG-EndoS49 폴리펩티드 복합체를 형성하도록 하고,

(b) 상기 IgG-EndoS49 폴리펩티드 복합체를 접촉한 시료로부터 분리시키고,

(c) IdeS를 (b)단계의 IgG-EndoS49 폴리펩티드 복합체에 첨가하고;

(d) 상기 IdeS와 상기 EndoS49 폴리펩티드를 (c) 단계의 혼합물로부터 분리하여 Fab 단편을 분리하는 단계를 포함한다.

상기의 IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드를 시료/혼합물로부터 분리하는 방법은 바람직하게는 상기에 기술한 바와 같이 유도되거나 변형된 IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드를 사용하는 것을 포함한다. 동일하거나 다른 변형이 IdeS와 EndoS49 폴리펩티드 각각에 사용될 수 있다.

바람직한 시약 또는 분리수단은 IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드에 결합할 수 있는 자기성 입자 집단이다. 예를 들면, IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드가 히스티딘 테그로 유도되었을때, 자기성 입자는 그 표면에 니켈, 구리 또는 아연 이온을 가진 킬레이팅 그룹을 표면에 함유한다. 동시에, IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드가 바이오틴 테그로 유도되었을때, 자기성 입자는 그 표면에 스트렙트아비딘을 표면에 함유한다.

따라서, 상기 방법의 (a) 단계는 바람직하게는 시료를 EndoS49 폴리펩티드에 결합할 수 있는 자기성 나노입자 집단과 접촉하는 것을 추가적으로 포함하고, (c) 단계는 (b) 단계에서 얻은 IgG-EndoS49 폴리펩티드 복합체와 IdeS 및 EndoS49 폴리펩티드에 결합할 수 있는 자기성 나노입자 집단이 접촉하는 것을 추가적으로 포함하고, 이때 (b)와 (d) 단계는 각각 (a) 단계의 시료에 대한 그리고 (c) 단계에서 얻은 혼합물의 자기영역 분리를 수행하는 것을 포함한다.

어떠한 적절한 분리수단도 사용될 수 있음은 이해될 것이다. 예를 들면, 순차적으로 FcγRs가 IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드의 분리에 적용될 수 있는 IgG 분자를 세포 집단의 분리를 위한 방법과 관련된 부분에서 기재된 대체적인 수단들이다.

상기 실시예에서 EndoS49 폴리펩티드는 바람직하게는 엔도글리코시다이제 활성이 결핍된 변형된 EndoS49 폴리펩티드이다.

본 발명의 상기 방법은 IgG를 함유한 시료로부터 Fc 단편을 분리하는데에도 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다.

(a) 상기 IgG를 함유한 시료와 IdeS를 접촉하고;

(b)(a) 단계에서 얻은 혼합물로부터 IdeS를 분리하여 Fab와 Fc 단편을 분리하고;

(c) 상기 Fab와 Fc 단편을 EndoS49 폴리펩티드와 접촉시켜 Fc 단편-EndoS49 폴리펩티드 복합체를 형성하게 하고;

(d) 상기 Fc 단편-EndoS49 폴리펩티드 복합체를 (c) 단계에서 얻은 혼합물로부터 분리하고;

(e) (d) 단계에서 얻은 혼합물로부터 Fc 단편을 Fc 단편-EndoS49 폴리펩티드 복합체로부터 분리하는 단계.

상기에 언급된 바와 같이 어떠한 적절한 분리수단도 사용가능함은 이해될 것이다. 그러나, 상기에서 시료/혼합물로부터 IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드를 분리하는 방법은 바람직하게는 상기에 언급된 바와 같이 유도되거나 변형된 IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드를 사용하는 것을 포함한다.

바람직하게는, 상기 방법의 (a) 단계는 시료를 IdeS에 결합할 수 있는 자기성 나노입자 집단과 접촉하는 것을 추가적으로 포함하고, (c) 단계는 (b) 단계에서 얻은 Fab 와 Fc 단편과 EndoS49 폴리펩티드에 결합할 수 있는 자기성 나노입자 집단이 접촉하는 것을 추가적으로 포함하고, 이때 (b)와 (d) 단계는 각각 (a) 단계의 시료에 대한 그리고 (c) 단계에서 얻은 혼합물에 대한 자기영역 분리를 수행하는 것을 포함한다.

상기 EndoS49 폴리펩티드는 바람직하게는 엔도글리코시다이제 활성이 결핍된 변형된 EndoS49 폴리펩티드이다.

또다른 실시예에서, Fc 단편은 하기의 단계를 포함하는 방법으로 IgG를 함유하는 시료로부터 분리될 수 있다.

(a) IgG를 함유하는 시료를 IdeS 및 EndoS49 폴리펩티드와 접촉하고;

(b) (a) 단계에서 얻은 혼합물로부터 EndoS49 폴리펩티드를 분리하여 Fc 단편을 얻는 단계.

상기에 언급된 바와 같이 어떠한 적절한 분리수단도 사용가능함은 이해될 것이다. 그러나, 바람직하게는 상기 방법의 (a) 단계는 추가적으로 시료를 IdeS가 아니라 EndoS49 폴리펩티드에 결합할 수 있는 자기성 나노입자 집단과 접촉하는 것을 추가적으로 포함하고, 이때 (b) 단계는 (a) 단계에서 얻은 혼합물의 자기영역 분리를 수행하는 것을 포함한다.

바람직하게는 IdeS 및/또는 EndoS49 폴리펩티드는 상기에 언급된 바와 같이 서로다른 변형이 각각에 적용된다는 조건 하에 유도되거나 변형된 것이다. 예를 들면, IdeS는 히스티딘 테그의 첨가에 의해 변형되어 표면에 니켈, 구리 또는 아연 이온 등의 킬레이팅 그룹을 함유한 자기성 입자 집단에 결합하고, EndoS49 폴리펩티드는 바이오틴 테그의 첨가에 의해 변형되어 표면에 스트렙트아비딘을 함유한 자기성 입자 집단에 결합한다. EndoS49 폴리펩티드는 바람직하게는 엔도글리코시다이제 활성이 결핍된 변형된 EndoS49 폴리펩티드이다.

Fab 단편의 분리방법과 유사하게, IgG를 함유하는 시료에서 Fc 단편을 분리하는 방법에서도 정제 또는 분리된 IgG가 전형적으로 포함됨을 인지해야 한다. IgG를 분리하는 바람직한 방법은 상기에 기재한 바와 같이 (i) 내지 (iii) 단계에 기술되어 있다.

키트

본 발명은 IgG를 함유하는 시료로부터 IgG를 분리하는 키트를 제공하고,

(a) 엔도글리코시다이제 활성이 결핍된 본 발명에 따른 EndoS49 폴리펩티드와; 선택적으로

(b) 시료로부터 상기 EndoS49 폴리펩티드를 분리하는 수단을 포함한다.

본 발명은 시료에서 IgG의 존재여부를 확인하는 키트를 제공하고,

본 발명은 IgG를 함유하는 시료의 글리코실화 상태 및/또는 기능적 품질을 평가하는 키트를 제공하고,

(b) 변성 및/또는 데글리코실화된 IgG와 결합할 수 있는 대체 IgG 결합 시약;

(c) 시료로부터 상기 EndoS49 폴리펩티드를 분리하는 수단; 및

(d) 시료로부터 상기 대체 IgG 결합 시약을 분리하는 수단을 포함한다.

상기 대체 IgG 결합 시약은 단백질 G 및/또는 단백질 A 및/또는 단백질 A/G 를 포함한다.

본 발명은 또한 IgG의 Fab 또는 Fc 단편을 분리하는 키트를 제공하고,

(a) IdeS;

(b) EndoS49 폴리펩티드; 및

(c) 시료로부터 상기 IdeS 및 EndoS49 폴리펩티드를 분리하는 수단을 포함한다.

바람직한 실시예에서, 키트는 추가적으로 본 발명에 따른 엔도글리코시다이제 활성이 결핍된 EndoS49 폴리펩티드와 시료로부터 상기 EndoS49 폴리펩티드를 분리하는 수단을 포함한다. EndoS49 폴리펩티드는 바람직하게는 본 발명에 따른 엔도글리코시다이제 활성이 결핍된 EndoS49 폴리펩티드이다.

상기 키트에 대한 바람직한 일 실시예는 추가적으로 본 발명의 방법에 따른 사용법을 포함한다. 또한 바람직한 실시예는 EndoS49 폴리펩티드, 대체 IgG 결합 시약, IdeS 폴리펩티드 또는 시료로부터 EndoS49 폴리펩티드를 분리하는 수단이 자기성 나노 입자 집단이고, 각 집단은 적어도 하나의 지정된 폴리펩티드/시약/단백질과 결합할 수 있음을 포함한다. 이 실시예에서는 키트가 전형적으로 시료에서 자기성 영역 분리를 수행하는 법에 대한 설명을 추가적으로 포함한다.

상기 방법 및 키트의 바람직한 실시예들에서 사용된 폴리펩티드/시약/단백질은 친화도 테그로 유도되며 상기 폴리펩티드의 분리를 돕기위해 바람직하게는 히스티딘 테그로 유도된다.

하기의 실시예로 본 발명을 상세히 설명한다.

실시예 1

재료 및 방법

박테리아 균주 및 배양

M49 혈청형의 GAS 균주 NZ131의 게놈을 시퀸싱하고 이 균주를 본 실험의 대조균주로 선택하였다 (McShan et al., 2008) (Chaussee et al., 1999). GAS 균주 NZ131은 혈액 한천에서 증식시키고 Escherichia coli 균주 Top10 (Invitrogen) 및 BL21 pLysS (Invitrogen)은 LB (Lysogeny broth) 한천에서 증식시켰다. E. coli Top10 세포에서 선택을 위하여 카베니실린 (carbenicillin)을 100㎍/mL 농도로 사용하고, E. coli BL21 pLysS에서는 100㎍/mL 농도의 카베니실린 및 34㎍/mL 농도의 클로람페니콜 (chloramphenicol)이 사용되었다. E. coli는 37℃, 공기가 있는 상태에서 LB 내에서 밤새 배양하였다. GAS 균주 NZ131의 게놈 DNA 준비는 Puregene DNA Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 수행하였다.

형질전환은 42℃에서 30초간 열쇼크를 주어 수행하였다. E. coli로부터 플라스미드 준비는 Plasmid Miniprep Kit I (E.Z.N.A)를 사용하여 수행하였다. 본 실험에 사용된 모든 프라이머는 표 2에 도시하였다.

EndoS49 의 재조합 발현

E. coli 내에서 EndoS49의 재조합 발현은 ndoS49-FBamHI 프라이머, CTGTAAGGATCCAGGAGAAGACTG, 와 ndoS49-R-XhoI 프라이머, GAAACCTCGAGTCTTTGTAATCGTAGGACTT를 사용하여 M49 혈청형의 A Streptococcus 균주 NZ131 ndoS49 유전자의 PCR 증폭으로 수행되었다. ndoS49 유전자 단편은 제한효소 BamH과 XhoI에 분해되고 DNA ligase T4 (Fermentas)를 사용하여 발현 벡터 pGEX-5X-3 (Amersham Biosciences) 내로 삽입된다. 상기 발현벡터는 E. coli Top10 컴피턴트 세포에서 형질전환되고 재조합 세포는 100㎍/mL의 카베니실린이 함유된 플레이트에서 배양하여 ndoS49-F-BamHI 과 ndoS49-R-XhoI 프라이머들을 사용하여 PCR로 스크리닝하였다. 양성 클론을 분리하고 pGEX-ndoS49 플라스미드를 정제하여 상기에 언급한 바와 같이 E. coli 발현균주 BL21pLysS에서 형질전환하였다.

하나의 재조합 클론은 항생제와 함께 37℃에서 밤새 배양되고 항생제가 있는 LB 배지에서 1:20으로 희석되어 3시간동안 배양되었다. EndoS49 단백질의 발현은 0.1mM의 IPTG 존재하에서 3시간동안 유도되었다. 세포들을 수획하고 BugBuster Protein Extraction Reagent (Novagen)으로 용융하였다. 재조합 GST-EndoS49는 Glutathione Sepharose 4B (GE Halthcare)를 사용하여 컬럼에서 정제되고 환원된 glutathione과 함께 용출되었다.

EndoS49 의 돌연변이형성

186번째 글루탐산(Glu-186)을 류신으로 돌연변이시키는 위치지정 돌연변이형성(E186L)이 사용자 메뉴얼에 따라 QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)을 사용하여 수행되었다. 사용된 돌연변이용 프라이머는 CTAGATATTGATATTCTTCACGAATTTACGAAC를 상기 서열의 상보서열과 함께 사용하였고, 플라스미드 pGEX-ndoS49 (밑줄친 곳에서 돌연변이됨)을 사용하였다. 이로써, pGEX-EndoS49(E186L)이 생성되었고, EndoS49에서 기재한 바와 같이 시퀀싱후 재조합 EndoS49(E186L)이 발현되고 정제되었다. 절단된 버전의 EndoS49는 BamHI 및 XhoI의 제한효소부위를 포함하는 primersndoS49 (truncl-5)와 함께 GAS NZ131로부터 ndoS49 유전자의 일부를 증폭하여 구성되었다 (표 2). 단편들은 절단되고, 상기에 언급한대로 pGEX 벡터 내로 접합되고, 순차적으로 E. coli Top10과 BL21 pLysS 내로 형질전환된 후 항생제와 함께 배양되었다. 단백질들은 상기에 언급한 대로 생산되었고, 80 kDa의 EndoS49(trunc1), 70 kDa의 EndoS49(trunc2), 60 kDa의 EndoS49(trunc3), 50 kDa의 EndoS49(trunc4)및 42 kDa의 EndoS49(trunc5)을 정제하였다.

당단백질 글리칸 가수분해 어세이

1㎍의 재조합 EndoS49 및 이의 돌연변이체를 각 당단백질 3㎍과 함께 20μL의 PBS에서 37℃ 조건 하에서 밤새 배양하였다. 글리칸 가수분해는 10% SDS PAGE 겔에서 분석하였고, 이어서 이전에 언급된 바대로 (Collin and Olsen, 2001a) LCAlectin blot으로 분석하였다.

슬롯- 블랏 분석

EndoS49 및 이의 돌연변이체는 Millipore slot blot equipment를 사용하여 메탄올 활성화된 PVDF 멤브레인에서 슬롯당 4, 2, 1 ㎍씩 PBS에서 부동화 (immobilized)되었다. 멤브레인은 5% 스킴밀크(Difco)로 실온에서 1시간동안 블로킹시켰다. 수세는 PBST로 10분씩 3회 수행하였다. 멤브리인은 10㎍의 인간 IgG(Sigma)가 첨가된 0.5% 스킴밀크로 37℃에서 1시간동안 배양하고 수세하였다. 5㎍의 단백질 G가 콘주게이트된 horseradish peroxidase를 멤브레인에 첨가하고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 멤브레인을 수세한 후, Supersignal West Pico Chemiluminiscent Substrate (Thermo Scientific)으로 현상하였다.

생물학적 정보분석

ndoS49 및 ndoS 유전자는 EndoS49 및 EndoS로 번역되어 MacVector 소프트웨어(Mac Vector Inc.)상의 ClustalW 알고리즘을 사용하여 비교하였다. NCBI PubMed로부터 하기와 같은 단백질 서열을 사용하여 MacVector에서 계통수를 구축하였다.: EndoS (AF296340), EndoE (AAR20477), EndoH (NP_631673), EndoC (ADC53484), EndoF2 (P36912), EndoF3 (P36913) (Collin and Olsen, 2001b) (Collin and Fischetti, 2004) (Tarentino and Plummer, 1974) (Tarentino et al., 1993).

ndoS49 의 PCR 스크리닝

GAS로부터 ndoS49 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 디자인하고 ndoS49-F (AAAACGCGGACCACTATATGC) 및 ndoS49-R (AAACGTTGTCCGAGGATTTG)라고 표기하였다. 42개의 GAS 균주를 혈액 한천배지에 접종하여 5% CO₂ 존재하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 단일 콜로니들을 얻어 20μL의 99℃ 멸균수에서 10분간 용융시켰다. 이 용융액은 42개의 GAS 균주에서 ndoS49를 검출하기 위한 PCR의 template로 사용되었다. 양성 대조군으로 recA 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 디자인하고 recA-F (AGCCCTTGATGATGCTTTG) 및 recA-R (AACAATTCTGGGTGATCGG)라고 표기하였다. 양성 대조군으로는 GAS 균주 NZ131(M49) 및 AP1(M1)의 게놈 DNA를 template로 사용하였다.

결과

ClustalW 분석으로 2개의 서로다른 효소를 확인하였다.: EndoS49 및 EndoS

ndoS49 및 ndoS 유전자는 가상으로 번역되어 ClustalW 알고리즘을 사용하여 비교되었다. 유전자 수준에서 동일성은 50% 였고, 단백질 수준에서는 37% 였다. ClustalW 분석은 (거의) 동일한 시그날 펩티드 서열과 보존된 18개의 글리코시드 가수분해효소 촉매 도메인(glycoside hydrolase catalytic domain: DGLDIDIE) 페밀리를 확인하였다(도 1). EndoS의 실험분석은 트립토판이 글리칸 가수분해 활성에 결정적임을 보여준다(Allhorn et al., 2008). 이들 트립토판은 또한 EndoS49에서도 보존되어 있다.

재조합 EndoS49 는 인간 당단백질에 대해서 글리칸 가수분해 활성을 보인다.

90kDa의 EndoS49는 성공적으로 E. coli BL21에서 재조합 발현되고 GST-테그를 사용하여 용해성 분획으로부터 정제되었다. GH18 모티프(E186)의 글루탐산이 류신(L)으로 대체된 촉매 돌연변이인 EndoS49(E186L)이 구축되고 동일한 방법으로 정제되었다. 상기 단백질의 활성을 맵핑하기 위해 효소의 5-카르복시 말단 단절 버전을 구축하고 80 kDa의 EndoS49(trunc1), 70 kDa의 EndoS49(trunc2), 60 kDa의 EndoS49(trunc3), 50 kDa의 EndoS49(trunc4) 및 42 kDa의 EndoS49(trunc5)로 명명하였다. 이들 효소의 집합은 인간 당단백질에 대해서 EndoS49의 글리칸 가수분해 활성을 분석하기 위하여 사용되었다. 먼저, 효소들을 인간 IgG와 함께 밤새 배양하고 SDS-PAGE 겔과 LCA 렉틴 블랏으로 분석하고 IgG의 글리칸에서 만노스 구조를 검색하였다. 겔 결과는 EndoS49를 처리한 것에서 IgG의 중연쇄가 4kDa 이동하였음을 보여주었고 LCA 렉틴 블랏은 이 이동이 N-linked 글리칸의 결핍로 인한 것임으로 확인해주었다 (도 2A). EndoS49(E186L)은 어떠한 이동도 어떠한 글리칸 조성의 변화도 보이지 않았고 이는 E186이 EndoS49의 촉매 활성에 결정적인 역할을 함을 보여주었다. 절단된 효소에 대해서는, EndoS49(trnc1-4)가 IgG의 글리칸에 대해 활성을 보였으나, 가장 작은 크기의(42 kDa) EndoS49(trunc5)는글리칸 가수분해 활성을 보이지 않았다 (도 2A).

EndoS49에 의한 IgG 탈글리코실화에 대한 추가적인 분석은 IgG₁ _-4를 EndoS49 및 EndoS49(E186L)와 밤새 배양하여 수행하였다. IgG의 서브클래스를 상기와 같이 분석하였고 EndoS49가 4개의 모든 서브클래스의 IgG에 활성이 있음을 보여주었고, 이전 결과와 같이 촉매 돌연변이는 활성을 보이지 않았다 (도 2B). 알파-1-마이크로글로블린과 효소 집합, 헤비 글리코실화 인간 혈청 단백질과 상기 효소 집합의 배양, SDS-PAGE에 의한 분석은 당단백질에 대한 EndoS49의 글리칸 가수분해 활성을 보여주었다 (도 2C). EndoS49의 특성을 더 규명하기 위하여 형광 4-메틸 움벨리페릴 (4-methylumbelliferyl)에 결합된 N-아세틸-베타-D-글루코사미니드 (N-acetyl-beta-D-glucosaminide)로 구성된 모델 기질을 EndoS49와 1, 2, 3, 4 및 16 시간동안 배양하고 형광을 측정하였다. 형광은 당이 쪼개어지면 증가하는데 이러한 증가는 관찰되지 않았고 (데이타는 보여지지 않음) 이로써 EndoS49가 당단백질을 기질로 할때만 활성을 보임을 시사하였다.

IgG 에 결합하는 EndoS49

EndoS49가 IgG에 대하여 글리칸 가수분해 활성을 가진다는 발견은 발명자들이 상기 효소가 IgG에 결합한다고 생각하게 하였다. 이는 EndoS49, 이들의 촉매 돌연변이와 절단된 버전들을 PVDF에서 부동화시키고 IgG와 배양하고 Horseradish-peroxidase (HRP)가 결합된 단백질 G와 결합하여 검출하는 슬롯 블랏 분석으로 평가되었다. 상기 슬롯 블랏은 촉매 돌연변이 EndoS49 (E186L)에 의해서 IgG에 결합하는 것이 증가됨을 보여주었다 (도 3).

ndoS49 유전자는 M49 혈청형의 GAS 균주에 존재한다.

ndoS49가 M49 혈청형 외의 다른 혈청형에서도 존재하는지를 규명하고자 PCR을 이용하여 선택된 GAS 균주에서 ndoS49 유전자의 존재를 분석하였다. 모든 GAS 균주에 존재하는 recA 유전자를 양성 대조군으로 증폭하고, ndoS49-F 및 ndoS49-R 프라이머를 사용하여 용해물을 PCR하였다. 상기 ndoS49 유전자는 M49 혈청형과 M60 혈청형 균주에서 증폭되었고 다른 혈청형에서는 증폭되지 않았다 (표 1).

GAS 균주 NZ131 (M49) 및 MGAS5005(M1)의 시퀀싱된 게놈에서 ndoS49 및 ndoS 주변의 유전자를 비교하였고, 상기 유전자들이 동일한 게놈 체계로 배열되어 있고 주변 유전자들이 고도로 보존되어 있음을 발견하였다 (도 4). 총장 EndoS49는 이전에 기술된 엔도글리코시다이제들(EndoS, EndoC, EndoH, EndoE, EndoF2, EndoF3)과 비교하였고 계통수가 구축되었다 (도 5). 이는 EndoS 및 EndoC가

EndoS 및 EndoS49보다 더 가까움을 시사하였고 Streptococcus 유래의 엔도글리코시다이제가 다른 세균의 효소보다 더 가까움을 시사하였다.

혈청형별 GAS 균주에서 ndoS49의 존재

균주명	혈청형	*ndoS49*	*recA*
5448	M1	-	+
SF370	M1	-	+
ACN1	M1	-	+
ACN2	M2	-	+
ANC3	M3	-	+
20224	M3	-	+
ACN4	M4	-	+
ACN5	M5	-	+
Manfredo	M5	-	+
ACN6	M6	-	+
AP6	M6	-	+
ACN9	M9	-	+
ACN11	M11	-	+
ACN12	M12	-	+
ACN18	M18	-	+
ACN19	M19	-	+
ACN22	M22	-	+
ACN24	M24	-	+
ACN28	M28	-	+
NZ131	M49	+	+
3487-05	M49	+	+
AW1	M49	+	+
AW2	M49	+	+
AW3	M49	+	+
AW4	M49	+	+
AW6	M49	+	+
AW7	M49	+	+
AW8	M49	+	+
AW9	M49	+	+
AW10	M49	+	+
AW11	M49	+	+
AW12	M49	+	+
AW13	M49	+	+
ACN49	M49	+	+
AP49	M49	+	+
CS101	M49	+	+
AP53	M53	-	+
ALAB49	M53	-	+
ACN55	M55	-	+
ACN57	M57	-	+
ACN60	M60	+	+
AP74	M74	-	+

실험에 사용된 프라이머들

프라이머 이름	서열 (5’-3’)
ndoS49 -F- BamHI	CTGTAAGGATCCAGGAGAAGACTG
ndoS49 -R- XhoI	GAAACCTCGAGTCTTTGTAATCGTAGGACTT
ndoS49 ( E186L )-F	CTAGATATTGATATTCTTCACGAATTTACGAAC
ndoS49 ( E186L )-R	GTTCGTAAATTCGTGAAGAATATCAATATCTAG
ndoS49 ( trunc1 )-R- XhoI	ATTTCTCGAGCTGAAGACGTCCTTTAGCCACG
ndoS49 ( trunc2 )-R- XhoI	TAAACTCGAGCCCCATCAGAAACATCTACTAAG
ndoS49 ( trunc3 )-R- XhoI	ATTTTCTCGAGGCATTATCAACATCATAATGACC
ndoS49 ( trunc4 )-R- XhoI	TAAACTCGAGCCAGTCATGCCTACCATAACAAGCTCAGC
ndoS49 ( trunc5 )-R- XhoI	ATTTCTCGAGCTGTCCAACTTGTTGAATG
ndoS49 -F	AAAACGCGGACCACTATATGC
ndoS49 -R	AAACGTTGTCCGAGGATTTG
recA -F	AGCCCTTGATGATGCTTTG
recA -R	AACAATTCTGGGTGATCGG

EndoS49 의 단백질 서열

NCBI 대조 서열

NZ131 게놈: NC_011375.1

ndoS49 유전자 서열: NC_011375.1

EndoS49 단백질 서열: YP_002286383.1

EndoS49 단백질 서열:

MDKHLLVKRTLGCVCAATLMGAALATHHDSLNTVKAEEKTVQTG

KTDQQVGAKLVQEIREGKRGPLYAGYFRTWHDRASTGIDGKQQHPENTMAEVPKEVDI

LFVFHDHTASDSPFWSELKDSYVHKLHQQGTALVQTIGVNELNGRTGLSKDYPDTPEG

NKALAAAIVKAFVTDRGVDGLDIDIEHEFTNKRTPEEDARALNVFKEIAQLIGKNGSD

KSKLLIMDTTLSVENNPIFKGIAEDLDYLLRQYYGSQGGEAEVDTINSDWNQYQNYID

ASQFMIGFSFFEESASKGNLWFDVNEYDPNNPEKGKDIEGTRAKKYAEWQPSTGGLKA

GIFSYAIDRDGVAHVPSTYKNRTSTNLQRHEVDNISHTDYTVSRKLKTLMTEDKRYDV

IDQKDIPDPALREQIIQQVGQYKGDLERYNKTLVLTGDKIQNLKGLEKLSKLQKLELR

QLSNVKEITPELLPESMKKDAELVMVGMTGLEKLNLSGLNRQTLDGIDVNSITHLTSF

DISHNSLDLSEKSEDRKLLMTLMEQVSNHQKITVKNTAFENQKPKGYYPQTYDTKEGH

YDVDNAEHDILTDFVFGTVTKRNTFIGDEEAFAIYKEGAVDGRQYVSKDYTYEAFRKD

YKGYKVHLTASNLGETVTSKVTATTDETYLVDVSDGEKVVHHMKLNIGSGAIMMENLA

KGAKVIGTSGDFEQAKKIFDGEKSDRFFTWGQTNWIAFDLGEINLAKEWRLFNAETNT

EIKTDSSLNVAKGRLQILKDTTIDLEKMDIKNRKEYLSNDENWTDVAQMDDAKAIFNS

KLSNVLSRYWRFCVDGGASSYYPQYTELQILGQRLSNDVANTLKD

실시예 2

단클론 Ig 분자는 Fc 글리칸에서 미세한 변화를 보여줄 수 있고, 그 결과 Fc 글리칸은 Fc 글리칸의 비동일형 풀(inhomogeneous pool)로 나타날 수 있다. 대부분의 글리칸은 동일하지만 소수는 탄화수소 구조가 구성에 있어서 다양성을 보여줄 수 있다. 상기 다양성은 Fc 부분이 인간 또는 인간화된 또는 다른 종의 Fc 부분에서 기인할 수도 있고 세포주 및 세포배양조건의 선택에 기인할 수도 있다. 본 실시예에서는 두 개의 잘 알려진 Ig 기반 약물인 아바스틴 (Avastin)과 어비툭스 ( Erbitux)를 EndoS 및 EndoS49와 함께 탈글리코실화시켰다. 시료들은 EndoS 및 EndoS49와 함께 하기의 조건으로 배양하였다.

배양조건표

레인	시료	Erbitux 100㎍	Avastin 100㎍	EndoS 0.1 mg/ml (μL)	EndoS49 0.1 mg/ml (μL)	ideS 1㎍
1	MW 기준	-	-	-	-	-
2		-	+	5	-	+
3		-	+	50	-	+
4		-	+	-	5	+
5		-	+	-	50	+
6		-	+	-	-	+
7		+	-	5	-	+
8		+	-	50	-	+
9		+	-	-	5	+
10		+	-	-	50	+
11		+	-	-	-	+
12	MW 기준	-	-	-	-	-

실험결과는 도 6에 나타나 있다. EndoS49가 EndoS보다 Fc 글리칸이 더 다양하게 쪼개지도록 하는 잠재력을 가짐을 발견하였다. 이러한 효소 활성의 잠재적인 차이에 따른 효과를 최소화하기 위해 배양을 하룻밤동안으로 국한하지 않는다고 해도 EndoS 효소는 완전히 어비툭스 Fc 글리칸을 탈글리코실화 시키지 못했다. 그러나, EndoS49는 완전한 탈글리코실화 프로파일을 보이며 면역 글로블린의 글리칸 프로파일링에 있어서 선호되는 효소인 것이다.

<110> GENOVIS AB <120> ENDOGLYCOSIDASE FROM STREPTOCOCCUS PYOGENES AND METHODS USING IT <130> YLIP140307SE <150> GB 1115841.7 <151> 2011-09-13 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 843 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 1 Met Asp Lys His Leu Leu Val Lys Arg Thr Leu Gly Cys Val Cys Ala 1 5 10 15 Ala Thr Leu Met Gly Ala Ala Leu Ala Thr His His Asp Ser Leu Asn 20 25 30 Thr Val Lys Ala Glu Glu Lys Thr Val Gln Thr Gly Lys Thr Asp Gln 35 40 45 Gln Val Gly Ala Lys Leu Val Gln Glu Ile Arg Glu Gly Lys Arg Gly 50 55 60 Pro Leu Tyr Ala Gly Tyr Phe Arg Thr Trp His Asp Arg Ala Ser Thr 65 70 75 80 Gly Ile Asp Gly Lys Gln Gln His Pro Glu Asn Thr Met Ala Glu Val 85 90 95 Pro Lys Glu Val Asp Ile Leu Phe Val Phe His Asp His Thr Ala Ser 100 105 110 Asp Ser Pro Phe Trp Ser Glu Leu Lys Asp Ser Tyr Val His Lys Leu 115 120 125 His Gln Gln Gly Thr Ala Leu Val Gln Thr Ile Gly Val Asn Glu Leu 130 135 140 Asn Gly Arg Thr Gly Leu Ser Lys Asp Tyr Pro Asp Thr Pro Glu Gly 145 150 155 160 Asn Lys Ala Leu Ala Ala Ala Ile Val Lys Ala Phe Val Thr Asp Arg 165 170 175 Gly Val Asp Gly Leu Asp Ile Asp Ile Glu His Glu Phe Thr Asn Lys 180 185 190 Arg Thr Pro Glu Glu Asp Ala Arg Ala Leu Asn Val Phe Lys Glu Ile 195 200 205 Ala Gln Leu Ile Gly Lys Asn Gly Ser Asp Lys Ser Lys Leu Leu Ile 210 215 220 Met Asp Thr Thr Leu Ser Val Glu Asn Asn Pro Ile Phe Lys Gly Ile 225 230 235 240 Ala Glu Asp Leu Asp Tyr Leu Leu Arg Gln Tyr Tyr Gly Ser Gln Gly 245 250 255 Gly Glu Ala Glu Val Asp Thr Ile Asn Ser Asp Trp Asn Gln Tyr Gln 260 265 270 Asn Tyr Ile Asp Ala Ser Gln Phe Met Ile Gly Phe Ser Phe Phe Glu 275 280 285 Glu Ser Ala Ser Lys Gly Asn Leu Trp Phe Asp Val Asn Glu Tyr Asp 290 295 300 Pro Asn Asn Pro Glu Lys Gly Lys Asp Ile Glu Gly Thr Arg Ala Lys 305 310 315 320 Lys Tyr Ala Glu Trp Gln Pro Ser Thr Gly Gly Leu Lys Ala Gly Ile 325 330 335 Phe Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Val Pro Ser Thr 340 345 350 Tyr Lys Asn Arg Thr Ser Thr Asn Leu Gln Arg His Glu Val Asp Asn 355 360 365 Ile Ser His Thr Asp Tyr Thr Val Ser Arg Lys Leu Lys Thr Leu Met 370 375 380 Thr Glu Asp Lys Arg Tyr Asp Val Ile Asp Gln Lys Asp Ile Pro Asp 385 390 395 400 Pro Ala Leu Arg Glu Gln Ile Ile Gln Gln Val Gly Gln Tyr Lys Gly 405 410 415 Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Thr Leu Val Leu Thr Gly Asp Lys Ile 420 425 430 Gln Asn Leu Lys Gly Leu Glu Lys Leu Ser Lys Leu Gln Lys Leu Glu 435 440 445 Leu Arg Gln Leu Ser Asn Val Lys Glu Ile Thr Pro Glu Leu Leu Pro 450 455 460 Glu Ser Met Lys Lys Asp Ala Glu Leu Val Met Val Gly Met Thr Gly 465 470 475 480 Leu Glu Lys Leu Asn Leu Ser Gly Leu Asn Arg Gln Thr Leu Asp Gly 485 490 495 Ile Asp Val Asn Ser Ile Thr His Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ser His 500 505 510 Asn Ser Leu Asp Leu Ser Glu Lys Ser Glu Asp Arg Lys Leu Leu Met 515 520 525 Thr Leu Met Glu Gln Val Ser Asn His Gln Lys Ile Thr Val Lys Asn 530 535 540 Thr Ala Phe Glu Asn Gln Lys Pro Lys Gly Tyr Tyr Pro Gln Thr Tyr 545 550 555 560 Asp Thr Lys Glu Gly His Tyr Asp Val Asp Asn Ala Glu His Asp Ile 565 570 575 Leu Thr Asp Phe Val Phe Gly Thr Val Thr Lys Arg Asn Thr Phe Ile 580 585 590 Gly Asp Glu Glu Ala Phe Ala Ile Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Gly 595 600 605 Arg Gln Tyr Val Ser Lys Asp Tyr Thr Tyr Glu Ala Phe Arg Lys Asp 610 615 620 Tyr Lys Gly Tyr Lys Val His Leu Thr Ala Ser Asn Leu Gly Glu Thr 625 630 635 640 Val Thr Ser Lys Val Thr Ala Thr Thr Asp Glu Thr Tyr Leu Val Asp 645 650 655 Val Ser Asp Gly Glu Lys Val Val His His Met Lys Leu Asn Ile Gly 660 665 670 Ser Gly Ala Ile Met Met Glu Asn Leu Ala Lys Gly Ala Lys Val Ile 675 680 685 Gly Thr Ser Gly Asp Phe Glu Gln Ala Lys Lys Ile Phe Asp Gly Glu 690 695 700 Lys Ser Asp Arg Phe Phe Thr Trp Gly Gln Thr Asn Trp Ile Ala Phe 705 710 715 720 Asp Leu Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Glu Trp Arg Leu Phe Asn Ala 725 730 735 Glu Thr Asn Thr Glu Ile Lys Thr Asp Ser Ser Leu Asn Val Ala Lys 740 745 750 Gly Arg Leu Gln Ile Leu Lys Asp Thr Thr Ile Asp Leu Glu Lys Met 755 760 765 Asp Ile Lys Asn Arg Lys Glu Tyr Leu Ser Asn Asp Glu Asn Trp Thr 770 775 780 Asp Val Ala Gln Met Asp Asp Ala Lys Ala Ile Phe Asn Ser Lys Leu 785 790 795 800 Ser Asn Val Leu Ser Arg Tyr Trp Arg Phe Cys Val Asp Gly Gly Ala 805 810 815 Ser Ser Tyr Tyr Pro Gln Tyr Thr Glu Leu Gln Ile Leu Gly Gln Arg 820 825 830 Leu Ser Asn Asp Val Ala Asn Thr Leu Lys Asp 835 840 <210> 2 <211> 843 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 2 Met Asp Lys His Leu Leu Val Lys Arg Thr Leu Gly Cys Val Cys Ala 1 5 10 15 Ala Thr Leu Met Gly Ala Ala Leu Ala Thr His His Asp Ser Leu Asn 20 25 30 Thr Val Lys Ala Glu Glu Lys Thr Val Gln Thr Gly Lys Thr Asp Gln 35 40 45 Gln Val Gly Ala Lys Leu Val Gln Glu Ile Arg Glu Gly Lys Arg Gly 50 55 60 Pro Leu Tyr Ala Gly Tyr Phe Arg Thr Trp His Asp Arg Ala Ser Thr 65 70 75 80 Gly Ile Asp Gly Lys Gln Gln His Pro Glu Asn Thr Met Ala Glu Val 85 90 95 Pro Lys Glu Val Asp Ile Leu Phe Val Phe His Asp His Thr Ala Ser 100 105 110 Asp Ser Pro Phe Trp Ser Glu Leu Lys Asp Ser Tyr Val His Lys Leu 115 120 125 His Gln Gln Gly Thr Ala Leu Val Gln Thr Ile Gly Val Asn Glu Leu 130 135 140 Asn Gly Arg Thr Gly Leu Ser Lys Asp Tyr Pro Asp Thr Pro Glu Gly 145 150 155 160 Asn Lys Ala Leu Ala Ala Ala Ile Val Lys Ala Phe Val Thr Asp Arg 165 170 175 Gly Val Asp Gly Leu Asp Ile Asp Ile Leu His Glu Phe Thr Asn Lys 180 185 190 Arg Thr Pro Glu Glu Asp Ala Arg Ala Leu Asn Val Phe Lys Glu Ile 195 200 205 Ala Gln Leu Ile Gly Lys Asn Gly Ser Asp Lys Ser Lys Leu Leu Ile 210 215 220 Met Asp Thr Thr Leu Ser Val Glu Asn Asn Pro Ile Phe Lys Gly Ile 225 230 235 240 Ala Glu Asp Leu Asp Tyr Leu Leu Arg Gln Tyr Tyr Gly Ser Gln Gly 245 250 255 Gly Glu Ala Glu Val Asp Thr Ile Asn Ser Asp Trp Asn Gln Tyr Gln 260 265 270 Asn Tyr Ile Asp Ala Ser Gln Phe Met Ile Gly Phe Ser Phe Phe Glu 275 280 285 Glu Ser Ala Ser Lys Gly Asn Leu Trp Phe Asp Val Asn Glu Tyr Asp 290 295 300 Pro Asn Asn Pro Glu Lys Gly Lys Asp Ile Glu Gly Thr Arg Ala Lys 305 310 315 320 Lys Tyr Ala Glu Trp Gln Pro Ser Thr Gly Gly Leu Lys Ala Gly Ile 325 330 335 Phe Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Val Pro Ser Thr 340 345 350 Tyr Lys Asn Arg Thr Ser Thr Asn Leu Gln Arg His Glu Val Asp Asn 355 360 365 Ile Ser His Thr Asp Tyr Thr Val Ser Arg Lys Leu Lys Thr Leu Met 370 375 380 Thr Glu Asp Lys Arg Tyr Asp Val Ile Asp Gln Lys Asp Ile Pro Asp 385 390 395 400 Pro Ala Leu Arg Glu Gln Ile Ile Gln Gln Val Gly Gln Tyr Lys Gly 405 410 415 Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Thr Leu Val Leu Thr Gly Asp Lys Ile 420 425 430 Gln Asn Leu Lys Gly Leu Glu Lys Leu Ser Lys Leu Gln Lys Leu Glu 435 440 445 Leu Arg Gln Leu Ser Asn Val Lys Glu Ile Thr Pro Glu Leu Leu Pro 450 455 460 Glu Ser Met Lys Lys Asp Ala Glu Leu Val Met Val Gly Met Thr Gly 465 470 475 480 Leu Glu Lys Leu Asn Leu Ser Gly Leu Asn Arg Gln Thr Leu Asp Gly 485 490 495 Ile Asp Val Asn Ser Ile Thr His Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ser His 500 505 510 Asn Ser Leu Asp Leu Ser Glu Lys Ser Glu Asp Arg Lys Leu Leu Met 515 520 525 Thr Leu Met Glu Gln Val Ser Asn His Gln Lys Ile Thr Val Lys Asn 530 535 540 Thr Ala Phe Glu Asn Gln Lys Pro Lys Gly Tyr Tyr Pro Gln Thr Tyr 545 550 555 560 Asp Thr Lys Glu Gly His Tyr Asp Val Asp Asn Ala Glu His Asp Ile 565 570 575 Leu Thr Asp Phe Val Phe Gly Thr Val Thr Lys Arg Asn Thr Phe Ile 580 585 590 Gly Asp Glu Glu Ala Phe Ala Ile Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Gly 595 600 605 Arg Gln Tyr Val Ser Lys Asp Tyr Thr Tyr Glu Ala Phe Arg Lys Asp 610 615 620 Tyr Lys Gly Tyr Lys Val His Leu Thr Ala Ser Asn Leu Gly Glu Thr 625 630 635 640 Val Thr Ser Lys Val Thr Ala Thr Thr Asp Glu Thr Tyr Leu Val Asp 645 650 655 Val Ser Asp Gly Glu Lys Val Val His His Met Lys Leu Asn Ile Gly 660 665 670 Ser Gly Ala Ile Met Met Glu Asn Leu Ala Lys Gly Ala Lys Val Ile 675 680 685 Gly Thr Ser Gly Asp Phe Glu Gln Ala Lys Lys Ile Phe Asp Gly Glu 690 695 700 Lys Ser Asp Arg Phe Phe Thr Trp Gly Gln Thr Asn Trp Ile Ala Phe 705 710 715 720 Asp Leu Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Glu Trp Arg Leu Phe Asn Ala 725 730 735 Glu Thr Asn Thr Glu Ile Lys Thr Asp Ser Ser Leu Asn Val Ala Lys 740 745 750 Gly Arg Leu Gln Ile Leu Lys Asp Thr Thr Ile Asp Leu Glu Lys Met 755 760 765 Asp Ile Lys Asn Arg Lys Glu Tyr Leu Ser Asn Asp Glu Asn Trp Thr 770 775 780 Asp Val Ala Gln Met Asp Asp Ala Lys Ala Ile Phe Asn Ser Lys Leu 785 790 795 800 Ser Asn Val Leu Ser Arg Tyr Trp Arg Phe Cys Val Asp Gly Gly Ala 805 810 815 Ser Ser Tyr Tyr Pro Gln Tyr Thr Glu Leu Gln Ile Leu Gly Gln Arg 820 825 830 Leu Ser Asn Asp Val Ala Asn Thr Leu Lys Asp 835 840 <210> 3 <211> 2532 <212> DNA <213> Streptococcus pyogenes <400> 3 atggataaac atttgttggt aaaaagaaca ctagggtgtg tttgtgctgc aacgttgatg 60 ggagctgcct tagcgaccca ccatgattca ctcaatactg taaaagcgga ggagaagact 120 gttcaaacag gaaagacaga tcagcaggtt ggtgctaaat tggtacagga aatccgtgaa 180 ggaaaacgcg gaccactata tgctggttat tttaggacat ggcatgatcg tgcttcaaca 240 ggaatagatg gtaaacagca acatccagaa aatactatgg ctgaggtccc aaaagaagtt 300 gatatcttat ttgtttttca tgaccataca gcttcagata gtccattttg gtctgaatta 360 aaggacagtt atgtccataa attacatcaa cagggaacgg cacttgttca gacaattggt 420 gttaacgaat taaatggacg tacaggttta tctaaagatt atcctgatac tcctgagggg 480 aacaaagctt tagcagcagc cattgtcaag gcatttgtaa ctgatcgtgg tgtcgatgga 540 ctagatattg atattgagca cgaatttacg aacaaaagaa cacctgaaga agatgctcgt 600 gctctaaatg tttttaaaga gattgcgcag ttaataggta aaaatggtag tgataaatct 660 aaattgctca tcatggacac taccctaagt gttgaaaata atccaatatt taaagggata 720 gcggaagatc ttgattatct tcttagacaa tattatggtt cacaaggtgg agaagctgaa 780 gtggatacta taaactctga ttggaaccaa tatcagaatt atattgatgc tagccagttc 840 atgattggat tctccttttt tgaagaatct gcgtccaaag ggaatttatg gtttgatgtt 900 aacgaatacg accctaacaa tcctgaaaaa gggaaagata ttgaaggaac acgtgctaaa 960 aaatatgcag agtggcaacc tagtacaggt ggtttaaaag caggtatatt ctcttatgct 1020 attgatcgtg atggagtggc tcatgttcct tcaacatata aaaataggac tagtacaaat 1080 ttacaacggc atgaagtcga taatatctca catactgact acaccgtatc tcgaaaatta 1140 aaaacattga tgaccgaaga caaacgctat gatgtcattg atcaaaaaga cattcctgac 1200 ccagcattaa gagaacaaat cattcaacaa gttggacagt ataaaggcga tttggaacgt 1260 tataacaaga cattggtgct tacaggagat aagattcaaa atcttaaagg actagaaaaa 1320 ttaagcaagt tacaaaaatt agagttgcgc cagctatcta acgttaaaga aattactcca 1380 gaacttttgc cggaaagcat gaaaaaagat gctgagcttg ttatggtagg catgactggt 1440 ttagaaaaac taaaccttag tggtctaaat cgtcaaactt tagacggtat agacgtgaat 1500 agtattacgc atttgacatc atttgatatt tcacataata gtttggactt gtcggaaaag 1560 agtgaagacc gtaaactatt aatgactttg atggagcagg tttcaaatca tcaaaaaata 1620 acggtgaaaa atacggcttt tgaaaatcaa aaaccgaaag gttattatcc tcagacgtat 1680 gataccaaag aaggtcatta tgatgttgat aatgcagaac atgatatttt aactgatttt 1740 gtttttggaa ctgttactaa acgtaatacc tttattggag acgaagaagc atttgctatc 1800 tataaagaag gagctgtcga tggtcgacaa tatgtgtcta aagactatac ttatgaagct 1860 tttcgtaaag actataaagg ttacaaggtt catttaactg cttctaacct aggagaaaca 1920 gttacttcta aggtaactgc tactactgat gaaacttact tagtagatgt ttctgatggg 1980 gaaaaagttg ttcaccacat gaaactcaat ataggatctg gtgccatcat gatggaaaat 2040 ctggcaaaag gggctaaagt gattggtaca tctggggact ttgagcaagc aaagaagatt 2100 ttcgatggtg aaaagtcaga tagattcttc acttggggac aaactaactg gatagctttt 2160 gatctaggag aaattaatct tgcgaaggaa tggcgtttat ttaatgcaga gacaaatact 2220 gaaataaaga cagatagtag cttaaacgtg gctaaaggac gtcttcagat tttaaaagat 2280 acaactattg atttagaaaa aatggacata aaaaatcgta aagagtatct gtcgaatgat 2340 gaaaattgga ctgatgttgc tcagatggat gatgcaaaag cgatatttaa tagtaaatta 2400 tccaatgttt tatctcggta ttggcggttt tgtgtagatg gtggagctag ctcttattac 2460 cctcaatata ccgaacttca aatcctcgga caacgtttat caaatgatgt cgctaatacg 2520 ctgaaggatt ga 2532 <210> 4 <211> 310 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 4 Asp Ser Phe Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro 1 5 10 15 Tyr His Val Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn 20 25 30 Phe Thr Gln Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln 35 40 45 Gly Trp Tyr Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu 50 55 60 Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln 65 70 75 80 Asn Lys Asp Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln 85 90 95 Lys Ile Asn Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile 100 105 110 Asp Thr Lys Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys 115 120 125 Glu Lys Ala Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro 130 135 140 Asp His Val Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr 145 150 155 160 Asn His Gly Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly 165 170 175 Gly Ile Phe Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu 180 185 190 Thr Ser Arg His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp 195 200 205 Leu Ile Lys Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His 210 215 220 Thr Tyr Ala Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala 225 230 235 240 Asp Phe Asp Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser 245 250 255 Asp Ser Asn Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn 260 265 270 Ser Ala Gly Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn 275 280 285 Ile Gly Ala Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp 290 295 300 Ser Trp Asn Gln Thr Asn 305 310 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleavage product <400> 5 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 1 5 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ctgtaaggat ccaggagaag actg 24 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gaaacctcga gtctttgtaa tcgtaggact t 31 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ctagatattg atattcttca cgaatttacg aac 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gttcgtaaat tcgtgaagaa tatcaatatc tag 33 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 atttctcgag ctgaagacgt cctttagcca cg 32 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 taaactcgag ccccatcaga aacatctact aag 33 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 attttctcga ggcattatca acatcataat gacc 34 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 taaactcgag ccagtcatgc ctaccataac aagctcagc 39 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 atttctcgag ctgtccaact tgttgaatg 29 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 aaaacgcgga ccactatatg c 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 aaacgttgtc cgaggatttg 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 agcccttgat gatgctttg 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 aacaattctg ggtgatcgg 19 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GH18 catalytic motif present from residues 179 to 186 of SEQ ID; Xaa refers to an unconserved amino acid <400> 19 Asp Xaa Xaa Asp Xaa Asp Xaa Glu 1 5

Claims

하기 (a) 또는 (b) 중에서 선택되는 폴리펩티드와 IgG 항체를 함께 배양하는 단계를 포함하는 IgG 항체의 완전한 탈당화 방법:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열;
(b) 서열번호 1의 아미노산 서열의 영역 내 적어도 810개 이상 인접한 아미노산과의 상동성이 적어도 97% 이상이며 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 엔도글리코시다아제 활성을 갖는 변이체.
제1항의 방법에 있어서, 상기 배양으로 발생한 산물을 분석하여 IgG 항체의 글리코실화 프로파일을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제2항의 방법에 있어서,
(a) 항체를 상기 폴리펩티드와 접촉하여 항체의 글리칸이 가수분해되도록 하는 단계;
(b) 탈당화된 단백질로부터 글리칸을 분리하는 단계;
(c) 생산된 글리칸 및/또는 탈당화된 단백질을 분석하는 단계
를 포함하는 것이 특징인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론 IgG 항체를 포함하는 것이 특징인 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제