BR112014005816A2 - endoglicosidase de streptococcus pyogenes e métodos de uso - Google Patents

Abstract

endoglicosidase de streptococcus pyogenes e métodos de uso a invenção proporciona uma endoglicosidase, referida como endos49 e tendo a sequência de aminoácidos seq id no: 1. endos49 foi isolado a partir de estirpe streptococcus pyogenes nz131 e é um homólogo de endos. endos49 tem atividade endoglicosidase específica em igg nativa e se unirá uma maior variedade de glicanos fc de endos. um mutante, onde o ácido glutâmico na posição 186 da seq id no: 1 foi substituído, foi produzido o referido mutante sem atividade endoglicosidase mas é capaz de se ligar à igg. métodos que utilizam endos49, deleções dos mesmos e o referido mutante, especialmente para avaliar a glicosilação de igg ou para isolar igg são divulgados.

Description

“ENDOGLICOSIDASE DE STREPTOCOCCUS PYOGENES E MÉTODOS DE USO” Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se a uma nova endoglicosidase, seus mutantes desprovidos de atividade de hidrólise de glicano, e seu uso em métodos de hidrólise do glicano de glicoproteínas. Antecedentes da Invenção

[0002] Endoglicosidase S (EndoS) é segregada por um número de serótipos de Streptococcus pyogenes e tem uma atividade específica de endoglicosidase IgG nativa por hidrólise dos glicanos conservados ligados à asparagina 297 resíduo em cadeias pesadas de IgG, Collin e Olsen, The EMBO Journal, 2001, 20, 3046-3055. EndoS é a primeira enzima bacteriana conhecida com uma especificidade única para IgG nativa. Em contraste, as atividades de outros endoglicosidases conhecidas requerem ou são reforçadas por desnaturação do substrato glicoproteína.

[0003] Os anticorpos, tais como IgG têm muitas aplicações na investigação básica, bem como no diagnóstico e no desenvolvimento de drogas. Em algumas destas aplicações, tais como o imunohistoquímica, imunoensaios, a detecção do tumor, radioterapia, estudos de cristalografia de sítios de ligação do anticorpo e imunosegmentação, é mais conveniente para utilizar fragmentos Fab de moléculas inteiras de IgG. Algumas das vantagens da utilização de fragmentos Fab são de que eles não serão afetados pelos receptores de Fc em células ou precipitar o antígeno, eles exibem uma imunogenicidade reduzida e são menos susceptíveis à fagocitose, e que os fragmentos Fab são radiomarcado mais rapidamente removido do tecido do que a IgG moléculas. Para outras aplicações, é desejável a utilização de fragmentos de Fc de IgG. Em outras aplicações, pode ser desejável a utilização de versões desglicosiladas dos anticorpos ou outras glicoproteínas.

[0004] A clivagem de IgG em fragmentos Fab e Fc é mais frequentemente realizado utilizando enzimas proteolíticas como pepsina ou papaína. Estas enzimas geralmente clivar outras proteínas, de modo que a reação de clivagem, geralmente tem de ser realizada em uma fracção de IgG purificada. Além disso, a pepsina e papaína tipicamente pegará IgG em mais de um lugar.Isto significa que os fragmentos obtidos, muitas vezes não correspondem a fragmentos completos de Fab ou de Fc, e mesmo se a clivagem resulta em fragmentos Fab e Fc, que são tipicamente susceptíveis a posterior clivagem em fragmentos menores. O isolamento de fragmentos de Fc dos fragmentos Fab é mais frequentemente realizada com proteína A ou G colunas de separação por afinidade, que utilizam as propriedades de ligação de Fc-das proteínas bacterianas A e G.

[0005] Muitos glicoproteínas diferentes têm utilidade em aplicações terapêuticas.Métodos para analisar a glicosilação destas proteínas têm utilidade na pesquisa e desenvolvimento de proteínas como agentes terapêuticos. Pode também ser desejável para proporcionar versões desglicosiladas destas proteínas. Sumário da Invenção

[0006] Os inventores identificaram um novo endoglicosidase de serotipo M49, Streptococcus pyogenes, aqui referida como EndoS49. EndoS49 foi isolada de estirpe NZ 131, uma cepa nefritogênica e altamente transformável do serotipo M49. Estirpe NZ131 é um isolado clínico de um caso de aguda pós-estreptocócica glomerulonefrite na Nova Zelândia. Ao nível da proteína, EndoS49 tem menos de 40% de identidade de EndoS, e é uma proteína de 90 kDa, em comparação com a 108kDa de EndoS. EndoS49 tem atividade deglicosilação para uma ampla gama de proteínas de EndoS.

[0007] A enzima é uma enzima de 90 kDa, que tem uma família 18 domínios catalíticos glicosídeo hidrolases. EndoS49 hidrolisa glicano em glicoproteínas humanas, e em particular, IgG1-4, e alfa-1-

microglobulina. EndoS49 pode ser utilizada na hidrólise de glicanos de glicoproteínas humanas, incluindo IgG e alfa-1-microglobulina. EndoS49 pode, assim, ser utilizado em análise de perfil glico em que a enzima é posta em contato com uma glicoproteína, e os produtos produzidos são separados para análise dos glicanos e a proteína. EndoS49 também pode ser utilizada para preparar proteínas desglicosiladas. A enzima pode ser modificado para reduzir ou remover a atividade endoglicosidase.

[0008] O polipeptídeo EndoS49 modificado que carece de atividade endoglicosidase pode ser usado em métodos para isolar glicosilada e / ou funcionalmente activa de IgG. Ao utilizar um tal polipeptídeo EndoS49 modificado em combinação com um reagente de ligação IgG adicional que é capaz de se ligar desnaturado e / ou desglicosilada IgG, os inventores também identificaram um método para a avaliação do estado de glicosilação ou a qualidade funcional de uma amostra contendo IgG.

[0009] De acordo com o presente invento, é assim proporcionado um polipeptídeo compreendendo (a) a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; (b) uma variante sua com, pelo menos, 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e possuindo atividade endoglicosidase, ou (c) um fragmento de qualquer destes que possui atividade de endoglicosidase.

[0010] A invenção também proporciona um polipeptídeo capaz de se ligar a IgG e que não tem atividade endoglicosidase compreendendo (a) a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; (b) uma variante sua com, pelo menos, 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, em que o aminoácido equivalente de ácido glutâmico na posição 186 é substituído, ou (c) um fragmento de qualquer destes.

[0011] A invenção também proporciona polinucleotídeos, vetores de expressão e células hospedeiras que codificam ou que expressam os polipeptídeos da invenção. A invenção também se relaciona com a utilização dos polipeptídeos da invenção em um processo de determinação ou para analisar o estado de glicosilação da proteína, e, em particular, de um anticorpo, em particular um anticorpo de IgG.

[0012] A invenção também proporciona um método para isolar IgG a partir de uma amostra contendo IgG, cujo método compreende: (a) contatar a referida amostra contendo IgG com um polipeptídeo EndoS49 modificado que carece de atividade endoglicosidase IgG (b) separar a referida EndoS49 da amostra contatada; obtendo-se assim IgG isolado.

[0013] Além disso, proporciona-se o método de avaliação do estado de glicosilação ou a qualidade funcional de uma amostra contendo IgG, cujo método compreende tendo uma primeira e uma segunda sub-amostra da amostra contendo IgG, e em que os passos (a) e (b) de acordo com o método acima são aplicadas ao primeiro sub-amostra, e em que os passos (a) e (b) como acima se aplicam para a segunda sub-amostra exceto o polipeptídeo EndoS49 é substituído com um reagente de ligação IgG alternativa, que é capaz de ligação desnaturado e / ou desglicosilada IgG, e que compreende ainda: (c) quantificar a quantidade de IgG ligada ao polipeptídeo EndoS49 no primeiro sub-amostra, e a quantidade de IgG ligado ao reagente de ligação Igg alternativa na segunda sub-amostra; e (d) comparar os valores de IgG ligada determinada em (c); e avaliar desse modo o estado de glicosilação ou a qualidade funcional de uma amostra contendo IgG.

[0014] A enzima modificada da presente invenção também pode ser usada em métodos para o isolamento de fragmentos de Fab ou de Fe de IgG. Os métodos da presente invenção fazer uso de uma enzima de clivagem de IgG altamente específico de S. pyogenes, IdeS (Imunoglobulina G enzima degradadora de S. pyogenes), e um polipeptídeo EndoS49.

[0015] Num método da invenção, uma amostra contendo IgG é contatada com Ides e um polipeptídeo EndoS49, o qual é um polipeptídeo EndoS49 modificado que carece de endoglicosidase atividade como descrito acima.

[0016] Nos métodos da invenção, geralmente cliva a IgG Ides em fragmentos Fab e Fc e o polipeptídeo se liga a EndoS49 os fragmentos Fc. Os fragmentos Fe são então separados dos fragmentos de Fab.

[0017] Este método é particularmente útil para o isolamento de fragmentos Fab ou fragmentos Fc de amostras compreendendo IgG purificada. Mais especificamente, é útil para o isolamento de fragmentos de Fab ou de Fc de uma amostra compreendendo a IgG purificada usando o polipeptídeo EndoS49 modificada do invento. No entanto, o método também pode ser adaptado para utilização com amostras que contêm IgG não purificada, como o soro, lisado celular ou meio de cultura de células.

[0018] Também são proporcionados kits para a realização dos métodos de acordo com a invenção. Breve Descrição das Figuras

[0019] Figura 1. Alinhamento ClustalW de EndoS49 e EndoS revela duas proteínas diferentes. EndoS49 e Endos foi alinhadas utilizando ClustalW no software MacVector. GH18 motivo catalítico (D ** D * D * E) está presente na posição 179-186 com Glul86 como resíduo catalítico.

[0020] Figura 2. EndoS49 tem atividade em glicoproteínas. A. 1 ug de EndoS49, seu mutante catalítico e as versões truncadas foram incubados com 3 ug de IgG humana em PBS durante a noite a 37 ° C e analisadas num gel de SDS-PAGE e com LCAlectin blot. B. 1

EndoS49 ug e EndoS49 (E186L) foi incubada com 3 ug de subclasses 1-4 de IgG humano e analisada como acima. C. 1 ug EndoS49 e seus mutantes foram incubados com 3 ug de alfa-1-microglobulina e analisados num gel de 10% SDS-PAGE.

[0021] Figura 3. EndoS49 liga-se a IgG. 4, 2 e 1 ug de EndoS49 e seus mutantes foram imobilizadas sobre uma membrana de PVDF e incubadas com IgG humana e mais tarde com proteína G acoplada a HRP.

[0022] Figura 4. O contexto genômico de ndoS49 e NDOS. Uma comparação dos genes circundantes ndoS49 e ndoSm GÁS estirpes NZ131 (M49) e 5005 (Ml) foi realizada em MacVector.

[0023] Figura 5. A análise filogenética de EndoS49 e outras bactérias endoglicosidases. Figura 6. Página gel SDS de Avastin e Erbitux após digestão com EndoS ou EndoS49 seguido por digestão IdeS. Breve Descrição das Sequências

[0024] SEQ ID NO: 1 é uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo EndoS49 isolado a partir de S. pyogenes serotipo M49 NZ 131.

[0025] SEQ ID NO: 2 é uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo EndoS49 modificado (E186L) derivada da sequência de SEQ ID NO: 1.

[0026] SEQ ID NO: 3 é uma sequência de nucleotídeos que codifica polipeptídeo EndoS49.

[0027] SEQ ID NO: 4 é uma sequência de aminoácidos de IdeS isoladas de S. pyogenes API. Descrição Detalhada da Invenção Características gerais de polipeptídeos

[0028] A presente invenção refere-se a um novo polipeptídeo EndoS49. A invenção também fornece vários métodos que utilizam proteínas bacterianas EndoS49 e IdeS, bem como de outras proteínas. Os termos proteína, peptídeo e polipeptídeo são utilizados aqui indiscriminadamente. Deve ser entendido que certos polipeptídeos e métodos da invenção requerem um polipeptídeo tendo atividade EndoS49 endoglicosidase, ao passo que outros polipeptídeos e métodos da invenção requerem um polipeptídeo modificado EndoS49 com falta da referida atividade.

[0029] A secção que se segue refere-se a características gerais de todos os polipeptídeos da invenção, e em particular para as variações, alterações, modificações ou derivações de sequência de aminoácidos que estão incluídos dentro dos polipeptídeos do invento. Deve entender-se que estas variações, alterações, modificações ou derivações de polipeptídeos como aqui são descritos, são sujeitos ao requisito de que os polipeptídeos retem qualquer outra atividade requerida ou característica que pode ser especificado secções subsequentes desta descrição.

[0030] Variantes de polipeptídeos da invenção pode ser definida por níveis particulares de identidade de aminoácidos, que são descritos em mais pormenor nas secções seguintes desta descrição. Identidade de aminoácidos pode ser calculado utilizando qualquer algoritmo adequado. Por exemplo, os algoritmos PILEUP e BLAST pode ser usado para calcular a homologia ou alinhar sequências (como a identificação de sequências equivalentes ou correspondentes (normalmente em suas configurações padrão), por exemplo, como descrito em Altschul SF (1993) J Mol Evol 36:290 - 300;. Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10 Software para a realização de análises de BLAST está disponível ao público através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov ). Este algoritmo envolve primeiro identificar alta pontuação sequencia par (HSP), identificando palavras curtas de comprimento W na sequencia de consulta que corresponder ou satisfazer alguma pontuação limiar T positiva de valor quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequencia de banco de dados . T é referido como a palavra de vizinhança pontuação limite (Altschul et al, supra). Estes palavra de vizinhança inicial atuam como sementes de remate para iniciar buscas para encontrar HSPs contendo-os. Os acertos de palavras são estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência, tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativo pode ser aumentada. Extensões para a palavra acertos em cada direção são interrompidas quando: a pontuação alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor máximo alcançado, a pontuação acumulada vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou alinhamentos de resíduos mais negativos pontuada , ou a extremidade de qualquer sequência é atingida. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLAST utiliza como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz BLOSUM62 marcar (ver Henikoff e Henikoff (1992) Proc Natl Acad Sci EUA 89:.... 10.915-10.919) alinhamentos (B) de 50, a expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, e uma comparação de ambas as cadeias.

[0031] O algoritmo BLAST executa uma análise estatística da semelhança entre duas sequências; ver, por exemplo, Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90: 5873-5787. Uma medida da similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P (N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de polinucleotídeos ou de aminoácidos que ocorreria por acaso. Por exemplo, uma sequência é considerada semelhante a outra sequência se a probabilidade da menor soma na comparação da primeira sequência com a segunda sequência é inferior a cerca de 1, de preferência inferior a cerca de 0,1, mais preferencialmente inferior a cerca de 0,01, e mais preferivelmente menos do que cerca de 0,001. Alternativamente, o pacote UWGCG fornece o programa BESTFIT que pode ser utilizado para calcular a homologia (por exemplo utilizado nas suas configurações padrão) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387- 395).

[0032] Será entendido que as variantes de polipeptídeos da invenção também incluem variantes de substituição. Substituição variantes de preferência envolver a substituição de um ou mais aminoácidos, com o mesmo número de aminoácidos e fazer substituições conservativas de aminoácidos. Por exemplo, um aminoácido pode ser substituído por um aminoácido alternativo que tem propriedades semelhantes, por exemplo, um outro aminoácido básico, um outro aminoácido ácido, um outro aminoácido neutro, outro aminoácido com carga, um outro aminoácido hidrofílico, um outro aminoácido hidrofóbico, um outro aminoácido polar, outro aminoácido aromático ou um outro aminoácido alifático. Algumas propriedades dos 20 principais aminoácidos que podem ser usados para selecionar substituintes adequados são como se segue: Ala alifático, hidrofóbico, neutro Met hidrofóbico, neutro Cys polar, hidrofóbico, neutro Asn polar, hidrofílico, neutro Asp polar, hidrofílico, carregado (-) Pro hidrofóbico, neutro Glu polar, hidrofílico, carregado (-) Gln polar, hidrofílico, neutro Phe aromático, hidrofóbico, neutro Arg polar, hidrofílico, carregado (+) Gly alifático, neutro Ser polar, hidrofílico, neutro His aromático, polar, hidrofílico, Thr polar, hidrofílico, neutro carregado (+) Ile alifático, hidrofóbico, neutro Val alifático, hidrofóbico, neutro Lys polar, hidrofílico, carregado(+) Trp aromático, hidrofóbico, neutro Leu alifático, hidrofóbico, neutro Tyr aromático, polar, hidrofóbico

[0033] Os polipeptídeos da invenção e para o uso na presente invenção podem estar numa forma substancialmente isolada. Deve ser entendido que o polipeptídeo pode ser misturado com veículos ou diluentes que não interferem com a finalidade pretendida do polipeptídeo e ainda ser considerado como substancialmente isolado. Um polipeptídeo para utilização na invenção também podem estar numa forma substancialmente purificada,

caso em que geralmente compreende o polipeptídeo numa preparação em que mais de 50%, por exemplo mais do que 80%, 90%>, 95% ou 99%, em peso, do polipeptídeo na preparação é um polipeptídeo da invenção.

[0034] A sequência de aminoácidos dos polipeptídeos da invenção e para o uso na invenção pode ser modificado para incluir que não ocorrem naturalmente ou aminoácidos para aumentar a estabilidade do composto. Quando os polipeptídeos são produzidos por meios sintéticos, tais aminoácidos podem ser introduzidos durante produção. Os polipeptídeos também podem ser modificados após a produção de sintético ou recombinante.

[0035] Os polipeptídeos da invenção ou para utilização na invenção também podem ser produzidos usando D- aminoácidos. Em tais casos, os aminoácidos serão ligados na sequência inversa na orientação C para N. Isto é convencional na arte para a produção de tais polipeptídeos.

[0036] Um certo número de modificações da cadeia lateral são conhecidas na arte e podem ser feitas para as cadeias laterais dos polipeptídeos, os polipeptídeos sujeitos a retenção de qualquer outra atividade requerida ou como característica pode ser aqui especificados.

[0037] Também irá ser entendido que os polipeptídeos da invenção e utilizados na invenção podem ser quimicamente modificados, por exemplo, pós-translacionalmente modificados. Por exemplo, eles podem ser glicosilados, fosforilados ou modificada compreendem os resíduos de aminoácidos. Eles podem ser modificados pela adição de uma sequência de sinal para promover a inserção na membrana celular.

[0038] Os polipeptídeos da invenção também podem ser derivados ou modificados para facilitar o seu isolamento ou purificação. Assim, em uma forma de realização da invenção, o polipeptídeo para o uso na invenção é derivatizado ou modificado pela adição de um ligando que é capaz de se ligar diretamente e especificamente a um meio de separação.

[0039] Alternativamente, o polipeptídeo é derivado ou modificado por adição de um membro de um par de ligação e o meio de separação compreende um reagente que é derivatizado ou modificado pela adição de um outro membro de um par de ligação. Qualquer par de ligação adequado poderá ser utilizado. Numa forma de realização preferida, em que o polipeptídeo para o uso na invenção é derivatizado ou modificado pela adição de um membro de um par de ligação, o polipeptídeo é, de preferência marcado com histidina ou marcado com biotina. Tipicamente, a sequência de codificação de aminoácidos do marcador de histidina, ou a biotina é incluída ao nível do gene e as proteínas são expressas de forma recombinante em E. coli. O marcador de histidina ou biotina, está normalmente presente numa das extremidades do polipeptídeo, quer no N-terminal ou no C-terminal. O marcador de histidina tipicamente é composto por seis resíduos de histidina, mas que pode ser mais longo do que este, tipicamente acima de 7, 8, 9, 10 ou aminoácidos ou menos, por exemplo, 5, 4, 3, 2 ou 1 aminoácidos. Além disso, o marcador de histidina pode conter uma ou mais substituições de aminoácidos, substituições conservadoras de preferência, tal como definidos acima.

[0040] Polipeptídeo EndoS49s possuindo atividade endoglicosidase

[0041] O polipeptídeo EndoS49 neste caso é, de preferência S. pyogenes EndoS49, ou uma variante ou fragmento de S. pyogenes EndoS49 que retém atividade endoglicosidase. A variante pode ser um polipeptídeo a partir de um outro EndoS49 Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, ou, preferivelmente, Streptococcus pyogenes.

[0042] O polipeptídeo pode compreender EndoS49: (a) a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1;

(b) uma sua variante com, pelo menos, 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e possuindo atividade de endoglicosidase, ou (c) um fragmento de qualquer um destes possuindo atividade endoglicosidase.

[0043] De preferência, o polipeptídeo compreende ou consiste em, a sequência de SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 é a sequência de EndoS49 de S. pyogenes. O polipeptídeo EndoS49 da invenção pode, adicionalmente, não compreendem uma sequência de sinal.

[0044] Os polipeptídeos variantes descritas nesta secção são aquelas para as quais a sequência de aminoácidos que varia a partir de SEQ ID NO: 1, mas que retêm a atividade endoglicosidase de EndoS49. Tais variantes podem incluir variantes alélicas e a supressão, modificação ou adição de aminoácidos individuais ou grupos de aminoácidos no interior da sequência da proteína, desde que o peptídeo mantenha a atividade endoglicosidase IgG.

[0045] As sequências variantes diferem tipicamente de, pelo menos, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 100 ou mais mutações (que podem ser substituições, deleções ou inserções de aminoácidos). Por exemplo, de 1 a 100, de 2 a 50, 3 a 30 ou 5 a 20 substituições de aminoácidos, deleções ou inserções podem ser feitas, desde que o polipeptídeo modificado retém a atividade como uma endoglicosidase IgG.

[0046] As variantes da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, de preferência, conter resíduos 179-186 da SEQ ID NO: 1, e, em particular, incluem o motivo D ** D * D * E. Estes aminoácidos constituem uma família de 18 glicosídeo hidrolases domínio catalítico. O ácido glutâmico na posição 186 é essencial para a atividade enzimática. Mais preferencialmente, por conseguinte, a variante de SEQ ID NO: 1 contém o ácido glutâmico na posição equivalente à posição 186 da SEQ ID NO: 1. A variante de SEQ ID NO: 1 pode conter resíduos 179-186 da SEQ ID NO: 1 possuindo uma ou mais substituições conservativas, desde que a variante contém o ácido glutâmico na posição equivalente à posição 186 da SEQ ID NO: 1.

[0047] Tipicamente, os polipeptídeos que exibem a atividade de endoglicosidase EndoS49 com mais do que cerca de 50%, 55% ou 65% de identidade, de preferência pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e de modo particularmente preferido pelo menos 95%, pelo menos 97 % ou pelo menos 99%) de identidade, com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 são consideradas variantes da proteína A identidade de variantes de SEQ ID NO: 1 podem ser medidos ao longo de uma região de pelo menos 100, pelo menos 250 , pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 800, pelo menos 810, pelo menos 820, pelo menos 930, pelo menos 940 ou mais aminoácidos contíguos da sequência mostrada em SEQ ID NO: 1, ou mais de preferência mais do pleno comprimento de SEQ ID NO: 1.

[0048] O fragmento do polipeptídeo EndoS49 utilizada na invenção é, tipicamente, pelo menos, 400, 500, 600, 700, 750, 800, ou 825 aminoácidos de comprimento, desde que retenha a atividade endoglicosidase IgG de EndoS. De preferência, o fragmento do polipeptídeo EndoS49 utilizado na invenção abrange os resíduos 179-186 da SEQ ID NO: 1.

[0049] Os polipeptídeos para uso na presente invenção podem ser isolados a partir de qualquer organismo apropriado que expressa um polipeptídeo EndoS49 ou uma variante de um polipeptídeo EndoS49. Tipicamente, o polipeptídeo é isolado de EndoS49 EndoS49 adequados expressando estirpes de Streptococcus, de preferência, as estirpes de S. pyogenes, e em particular as de serotipo M49.

[0050] O isolamento e purificação de EndoS49 de um expressando S. pyogenes cultura, ou a partir de culturas de células que expressam outros EndoS49 é tipicamente com base na atividade endoglicosidase. De preferência, o método de purificação envolve um passo de precipitação de sulfato de amónio e um passo de cromatografia de troca iónica. De acordo com um método, o meio de cultura é fraccionado por adição de quantidades crescentes de sulfato de amônia. As quantidades de sulfato de amônia podem ser de 10 a 80%.

[0051] De preferência, o meio de cultura é fraccionado com 50% de sulfato de amónio, e o sobrenadante resultante é ainda mais precipitado com 70% de sulfato de amónio. Polipeptídeos granulado podem então ser submetido a cromatografia de troca iónica, por exemplo, numa coluna de FPLC Mono Q. As fracções eluídas podem ser ensaiadas para a atividade com endoglicosidase e as fracções de pico de atividade podem ser reunidas. As fracções podem ser analisadas por SDS-PAGE. As fracções podem ser armazenadas a -80 ° C.

[0052] Os polipeptídeos para uso na presente invenção também pode ser preparada como fragmentos de tais polipeptídeos isolados. Além disso, os polipeptídeos EndoS49 também podem ser feitas sinteticamente ou por meios recombinantes. Por exemplo, um polipeptídeo EndoS49 recombinante pode ser produzida por transfeção de células de mamíferos em cultura com um vector de expressão compreendendo uma sequência de nuclotídeos que codifica para o polipeptídeo operativamente ligado a sequências de controlo adequadas, a cultura das células, a extração e purificação do polipeptídeo EndoS49 produzido pelas células.

[0053] Os polipeptídeos da invenção EndoS49 descrito nesta atividade endoglicosidase apresentação da secção. De preferência, o polipeptídeo hidrolisa fragmentos de IgG ou IgG Fc por hidrólise de glicano ligado de um comprimento total de IgG polipeptídeo de cadeia pesada. De preferência, o polipeptídeo EndoS49 da invenção também tem endoglicosidase atividade, e é capaz de hidrólise glicano de alfa-1- microglobulina.

[0054] A atividade endoglicosidase pode ser determinada por meio de um ensaio adequado. Por exemplo, um polipeptídeo de teste pode ser incubado com a glicoproteína, tais como IgG ou alfa-1-

microglobulina, a uma temperatura adequada, tal como 37 ° C. Os materiais de partida e os produtos da reação podem então ser analisados por SDS- PAGE. Tipicamente, a massa molecular da cadeia pesada de IgG é reduzida em cerca de 3 kDa para 4kDa se o polipeptídeo de teste tem atividade endoglicosidase IgG. Outro ensaio para determinar se um polipeptídeo de teste tem atividade endoglicosidase IgG é por detecção de IgG glicosilada utilizando aglutinina de Lens culinaris lectina (ACV), opcionalmente utilizando peroxidase de rábano e substrato de peroxidase. Tipicamente, o sinal de hidratos de carbono é reduzido se o polipeptídeo de teste tem atividade endoglicosidase IgG. Outro ensaio para determinar se um polipeptídeo de teste tem atividade endoglicosidase IgG é por incubação de um polipeptídeo de teste com fragmentos de Fc de IgG purificadas, seguido por redução da amostra com ditiotreitol 10 mM e análise de espectroscopia de massa (MALDI- TOF). Endoglicosidase atividade pode também ser medido para polipeptídeos EndoS49 usando alfa-1-microglobulina no lugar de IgG nos ensaios acima mencionados.

[0055] A atividade endoglicosidase dos polipeptídeos pode ser ainda caracterizada por estudos de inibição.

[0056] O polipeptídeo EndoS49 é capaz de hidrolisar moléculas glicoproteicas presentes numa amostra retirada de um sujeito. Assim, em que o sujeito é um ser humano, o polipeptídeo EndoS49 é capaz de hidrolisar os glicanos de glicoproteínas de um objecto, como por exemplo sobre as cadeias pesadas de IgG humana ou alfa-1-microglobulina.

[0057] EndoS49 é capaz de hidrolisar a IgG humana de todas as quatro subclasses (IgGi_4). Em concretizações preferidas, o polipeptídeo EndoS49 tem a capacidade de hidrolisar a IgG humana e alfa-1- microglobulina. polipeptídeo EndoS49s que não possuem atividade endoglicosidase

[0058] O polipeptídeo EndoS49 neste exemplo podem também ser modificados de S. pyogenes EndoS49, o qual foi concebido para a falta atividade endoglicosidase, mas que possui uma atividade de ligação de IgG. Tal EndoS49 modificado é particularmente útil para os métodos aqui descritos. Por atividade de ligação a IgG que vai ser compreendido que o EndoS49 modificada se liga a IgG, ou uma variante ou fragmento do mesmo, em particular, o fragmento Fc da mesma, o que é normalmente glicosilado. Por "normalmente glicosilada" será compreendido que a molécula de IgG, ou de um seu fragmento, variante, é uma glicoproteína que compreende, pelo menos, o polipeptídeo de cadeia pesada de IgG (ou variante de fragmento) acoplado a pelo menos um grupo de hidratos de carbono como encontrada naturalmente acoplados a ocorrendo IgG moléculas. Em particular, o pelo menos um grupo de hidratos de carbono é um glicano ligado ao resíduo asparagina correspondente ao resíduo 297 de uma IgG de comprimento completo de polipeptídeo de cadeia pesada.

[0059] O polipeptídeo EndoS49 é preferencialmente construído por mutagénese dirigida ao local. Por atividade de ligação a IgG que vai ser compreendido que os polipeptídeos EndoS49 descrito nesta secção de ligação pelo menos um, preferencialmente dois, três ou todas as quatro subclasses de IgG, IgGi_ 4 . De preferência, a pelo menos uma subclasse de IgG está ligado com uma elevada afinidade e / ou especificidade elevada.

[0060] Por afinidade elevada entende-se que a afinidade de ligação constante (KD) para a interação do EndoS49 modificado com uma subclasse de IgG é superior a 0,05 μΜ, de preferência superior a 0,06 μΜ, 0,07 ou 0,08 μΜ μΜ. A atividade de ligação pode ser determinada, e a afinidade de ligação pode ser avaliada por quaisquer meios adequados. Por exemplo, por análise de interacção de plasmon de superfície de ressonância, a análise de equilíbrio de diálise, ou quaisquer métodos bioquímicos padrão em conjunção com, por exemplo, análise de Scatchard.

[0061] A variante pode ser derivado de um polipeptídeo EndoS49 de outro organismo, tal como uma outra bactéria, como está descrito na secção anterior, com a exceção de que a variante não tem,

neste caso, endoglicosidase atividade mas possui uma atividade de ligação de IgG. O polipeptídeo modificado pode compreender EndoS49: (a) a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; (b) uma sua variante com, pelo menos, 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, que não possui atividade de endoglicosidase, ou (c) um fragmento de qualquer destes, que carece de atividade endoglicosidase. De preferência, o polipeptídeo compreende ou consiste em, a sequência de SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 é derivado a partir da sequência de SEQ ID NO: 1, mas foi modificado para falta atividade endoglicosidase pela substituição de ácido glutâmico (E) por leucina (L) na posição 186 da SEQ ID NO: 1. Tais polipeptídeos tipicamente possuem atividade de ligação a IgG, como descrito acima.

[0062] Os polipeptídeos variantes descritas nesta secção são aquelas para as quais a sequência de aminoácidos que varia a partir de SEQ ID NO: 2, mas que carecem de atividade endoglicosidase e retêm a atividade de ligação Igg. Tais variantes podem incluir variantes alélicas e a supressão, modificação ou adição de aminoácidos individuais ou grupos de aminoácidos no interior da sequência da proteína, desde que o peptídeo mantenha as características acima referidas.

[0063] As sequências variantes diferem tipicamente de, pelo menos, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 100 ou mais mutações (que podem ser substituições, deleções ou inserções de aminoácidos). Por exemplo, de 1 a 100, de 2 a 50, 3 a 30 ou 5 a 20 substituições de aminoácidos, deleções ou inserções podem ser feitas, desde que o polipeptídeo modificado carece endoglicosidase atividade e retém a atividade de ligação IgG.

[0064] Tipicamente, os polipeptídeos, que não possuem atividade endoglicosidase e retêm a atividade de ligação a IgG com mais do que cerca de 50%, 55% ou 65% de identidade, de preferência pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e de modo particularmente preferido pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade, com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 são consideradas variantes da proteína A identidade de variantes de SEQ ID NO: 2 pode ser medida ao longo de uma região de pelo menos 100, em pelo menos 250, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 800, pelo menos 820, pelo menos 830 ou mais aminoácidos contíguos da sequência mostrada em SEQ ID NO: 2, ou mais, de preferência ao longo do comprimento total de SEQ ID NO: 2.

[0065] O fragmento do polipeptídeo EndoS49 utilizada na invenção é, tipicamente, pelo menos, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800 ou 830 aminoácidos de comprimento, enquanto que lhe falta a atividade endoglicosidase e retém a atividade de ligação IgG.

[0066] Num método alternativo, uma proteína EndoS49 com as características desejadas podem ser produzidas por alteração de um nucleótido que codifica para uma proteína EndoS49, e em seguida, expressando o referido nucleótido num sistema adequado. Os métodos adequados incluem a mutagénese dirigida ao sítio do nucleótido que codifica a proteína. Esta técnica tem sido amplamente utilizados no estudo das funções das proteínas. A técnica é geralmente à base de oligonucleótido e envolve os seguintes passos: (1) A clonagem do ADN que codifica a proteína de interesse num vector de plasmídeo. (2) Desnaturação do ADN de plasmídeo para a produção de cadeias simples. (3) O contato do ADN desnaturado com um oligonucleótido sintético (ou oligonucleotídeos) complementar à sequência alvo, mas que incorpora a mutação desejada (s) (mutação pontual, deleção, ou inserção), de tal forma que a síntese oligonucleótido hibrida com a região alvo. (4) A extensão da cadeia mutada por um ADN-polimerase de utilizar a cadeia de ADN de plasmídeo como o molde.

(5) Propagação do heteroduplex (mutado / cadeia não mutada), por transformação em E. coli.

[0067] Depois de propagação, cerca de 50% dos heteroduplexes produzidos são mutantes e os outros 50% são do tipo "selvagem" (sem mutação). Os métodos de seleção e de enriquecimento são utilizadas para favorecer a produção de mutantes. Por exemplo, o cordão não mutado parental pode ser digerido com uma enzima de restrição que apenas digerem ADN metilado (Dpnl). Isso permite a remoção da fita parental a partir da reação antes da transformação de E. coli por uma vez os fios recém- sintetizadas são não-metilado, enquanto a vertente dos pais (se purificada do fundo correta de E. coli) é metilado.

[0068] Alternativas para a mutagênese dirigida ao local incluem: (1) Reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores mutagênicos métodos específicos, ou PCR propenso a erros com a triagem posterior para mutações desejadas ou perda / ganho de função da proteína baseado. (2) Introdução de um plasmídeo que alberga o gene de interesse numa estirpe de E. coli mutante (deficientes em sistemas de revisão de ADN) e subsequente selecção de mutações desejadas ou perda / ganho da função da proteína. (3) A síntese química de genes parciais ou integrais contendo as mutações desejadas e subsequente introdução em um sistema de expressão de proteína apropriada.

[0069] Alternativamente, uma proteína EndoS49 com as características desejadas pode ser produzido por métodos de ADN independente, os quais incluem a síntese química de partes de um polipeptídeo com a mutação desejada.

[0070] Os polipeptídeos para uso na presente invenção também pode ser preparada como fragmentos de tais polipeptídeos isolados. Além disso, os polipeptídeos EndoS49 também podem ser feitas sinteticamente ou por meios recombinantes. Por exemplo, um polipeptídeo EndoS49 recombinante pode ser produzida por transfecção de células de mamíferos em cultura com um vector de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica para o polipeptídeo operativamente ligado a sequências de controlo adequadas, a cultura das células, a extração e purificação do polipeptídeo EndoS49 produzido pelas células.

[0071] O polipeptídeo EndoS49 é capaz de se ligar a moléculas de IgG presentes em uma amostra feita a partir de um sujeito. Assim, em que o sujeito é um ser humano, o polipeptídeo EndoS49 é capaz de se ligar a IgG humana.EndoS49 é capaz de se ligar a IgG humana de todas as quatro subclasses (IgGi_4). Polinucleotídeos, vetores e células hospedeiras

[0072] A invenção também diz respeito a polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos acima, e a sua utilização em medicina. Em particular, a invenção refere-se a polinucleotídeos que compreendem ou que consistem em (a) a sequência de codificação de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar da mesma, (b) a sequência que hibrida sob condições rigorosas com as sequências definidas em (a), (c) sequência que é degenerada como resultado do código genético para sequenciar, como definido em (a) ou (b), (d) a sequência ter pelo menos 60% de identidade com as sequências definidas em (a), (b) ou (c) e (e) fragmentos das sequências de cima.

[0073] Tipicamente, o polinucleotídeo é ADN. No entanto, a invenção pode compreendem os polinucleotídeos de ARN. Os polinucleotídeos podem ser simples ou dupla fita, e podem incluir dentro deles nucleotídeos sintéticos ou modificados.

[0074] Um polinucleotídeo da invenção pode hibridar com a sequência de codificação ou o complemento da sequência de codificação de SEQ ID NO: 3 a um nível significativamente acima do fundo. Hibridação de fundo pode ocorrer, por exemplo, devido a outros DNAs presentes numa biblioteca de ADN. O nível de sinal gerado pela interação entre um polinucleotídeo da invenção e a sequência de codificação ou complemento da sequência de codificação de SEQ ID NO: 3 é tipicamente pelo menos 10 vezes, preferencialmente pelo menos 100 vezes, tão intenso quanto as interacções entre outros polinucleotídeos e a sequência de codificação de SEQ ID NO: 3. A intensidade da interação pode ser medida, por exemplo, por rádio etiquetar a sonda, por exemplo, com 32 P. Hibridação selectiva pode ser obtida, tipicamente utilizando as condições de meio de elevado rigor. No entanto, tal hibridação pode ser efetuada sob quaisquer condições adequadas conhecidas na arte (ver Sambrook et al, 1989. Por exemplo, as condições adequadas se rigor elevado é necessário incluir de 0,1 a 0,2 x SSC a 60 ° C até 65 ° C condições adequadas see menor rigor é necessário incluir 2 x SSC a 60 ° C.

[0075] A sequência de codificação de SEQ ID NO: 3 pode ser modificada através de substituições de nucleotídeos, por exemplo, a partir de 1, 2 ou 3 a 10, 25, 50 ou 100 substituições. O polinucleotídeo da SEQ ID NO: 3, podem alternativamente ou adicionalmente ser modificado por uma ou mais inserções e / ou eliminações e / ou por uma extensão numa ou em ambas as extremidades. Sequências adicionais, tais como sequências de sinal também pode ser incluído. O polinucleotídeo modificado geralmente codifica um polipeptídeo que tem atividade de endoglicosidase .Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica uma porção de epítopo de um EndoS49 polipeptídeo. Substituições degeneradas pode ser feito e / ou substituições podem ser feitas, que resultaria numa substituição de aminoácidos conservativa quando a sequência modificada é traduzida, por exemplo como mostrado na tabela acima.

[0076] Uma sequência de nucleotídeos que é capaz de hibridar seletivamente com o complemento da sequência de codificação de ADN da SEQ ID NO: 3 tem geralmente pelo menos 60%, pelo menos 70%,

pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de codificação de SEQ ID NO: 3 ao longo de uma região de pelo menos 20, preferencialmente pelo menos 30, por exemplo, pelo menos 40, pelo menos 60, mais preferencialmente pelo menos 100 nucleotídeos contíguos ou mais preferivelmente sobre toda a extensão de SEQ ID NO: 3. Os métodos para o cálculo de identidade de sequência ou similaridade são discutidos em mais pormenor acima em relação aos polipeptídeos do invento.

[0077] Qualquer combinação dos graus acima mencionados da identidade de sequência e tamanhos mínimos podem ser utilizados para definir os polinucleotídeos da invenção, com as combinações mais rigorosas (isto é, maior identidade de sequência ao longo de comprimentos mais longos) sendo preferidos. Assim, por exemplo, um polinucleotídeo que tem, pelo menos, 90%> de identidade de sequência com mais de 25, de preferência mais de 30 nucleotídeos formam um aspecto da invenção, assim como um polinucleotídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com mais de 40 nucleotídeos.

[0078] Fragmentos de polinucleotídeos, tais como as que são adequadas para utilização como sondas ou iniciadores será de preferência pelo menos 10, preferencialmente pelo menos 15 ou pelo menos 20, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 30 ou pelo menos 40 nucleotídeos de comprimento. Eles normalmente será de até 40, 50, 60, 70, 100 ou 150 nucleotídeos de comprimento. As sondas e fragmentos podem ter mais de 150 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, até 200, 300, 400, 500, 600, 700 nucleotídeos de comprimento, ou mesmo até alguns nucleotídeos, tais como cinco ou dez nucleotídeos, aquém da codificação sequência de SEQ ID NO: 3.

[0079] Os polinucleotídeos de acordo com a invenção pode ser produzido de forma recombinante, sinteticamente, ou por quaisquer meios disponíveis para os especialistas na arte. Eles podem também ser clonados por técnicas convencionais. Os polinucleotídeos são tipicamente proporcionados na forma isolada e / ou purificada.

[0080] Em geral, os iniciadores serão produzidos por meios sintéticos, envolvendo uma etapa de fabrico sensato do ácido nucleico de sequência nucleotídica desejada uma de cada vez. Técnicas para conseguir isto utilizando técnicas automatizadas estão prontamente disponíveis na arte.

[0081] Polinucleotídeos mais longos geralmente serão produzidos usando meios recombinantes, por exemplo, utilizando PCR (reação em cadeia da polimerase), técnicas de clonagem. Isto irá envolver fazer um par de iniciadores (por exemplo, de cerca de 15-30 nucleotídeos) para uma região do gene ndoS49 que se deseja clonar, colocar os iniciadores em contato com o ADN obtido a partir de uma célula bacteriana, realização de uma reação em cadeia com polimerase sob condições que provocam a amplificação da região desejada, isolar o fragmento amplificado (por exemplo, purificando a mistura de reação sobre um gel de agarose) e recuperando o ADN amplificado. Os iniciadores podem ser concebidos para conter locais de reconhecimento de enzimas de restrição adequadas de modo a que o ADN amplificado pode ser clonado num vector de clonagem adequado.

[0082] Embora, em geral, as técnicas aqui mencionadas são bem conhecidos na arte, pode ser feita referência em particular a Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

[0083] Os polinucleotídeos de acordo com a invenção têm utilidade na produção de polipeptídeos de acordo com o invento, que pode ter lugar in vitro. Os polinucleotídeos da invenção podem ser utilizados como um iniciador, por exemplo, um iniciador de PCR, um iniciador para uma reação de amplificação alternativa, uma sonda, por exemplo marcado com um marcador revelador por meios convencionais utilizando marcadores radioativos ou não radioativos, ou o polinucleotídeos podem ser clonados em vectores.

[0084] Os polinucleotídeos ou iniciadores da invenção pode carregar uma etiqueta reveladora. Etiquetas adequadas incluem radioisótopos, tais como 32 P ou 35 S, marcadores de enzima, ou outras etiquetas proteicas, como biotina. Essas etiquetas podem ser adicionadas aos polinucletídeos ou iniciadores da invenção e podem ser detectadas utilizando técnicas conhecidas per se.

[0085] Os polinucleotídeos ou iniciadores da invenção ou seus fragmentos, marcados ou não marcados, podem ser utilizados por um perito na arte em testes baseados em ácido nucleico para detecção e sequenciação ndoS49 numa amostra.Tais testes para detectar compreendem geralmente trazendo uma amostra contendo o DNA ou RA em contato com uma sonda compreendendo um polinucleotídeo ou iniciador da invenção, sob condições de hibridação e detectar qualquer duplex formado entre a sonda e o ácido nucleico na amostra. Tal detecção pode ser conseguida usando técnicas tais como PCR ou por imobilização da sonda sobre um suporte sólido, a remoção do ácido nucleico na amostra que não está hibridado com a sonda, e em seguida, a detecção de ácido nucleico que foi hibridado com a sonda. Alternativamente, o ácido nucleico da amostra pode ser imobilizado sobre um suporte sólido, e a quantidade de sonda ligada a um tal suporte pode ser detectada.

[0086] A invenção pode, convenientemente, ser acondicionadas na forma de um kit de teste num recipiente adequado. Em tais kits da sonda pode ser ligada a um suporte sólido onde o formato de ensaio para o qual o kit foi concebido requer tal ligação. O kit também pode conter reagentes adequados para tratar a amostra a ser sondada, hibridar a sonda de ácido nucleico na amostra, reagentes de controlo, instruções e semelhantes.

[0087] Os polinucleotídeos da invenção podem ser incorporados num vector replicável recombinante. O vector pode ser usado para replicar o ácido nucleico numa célula hospedeira compatível. Assim, os polinucleotídeos da invenção podem ser feitas através da introdução de um polinucleotídeo da invenção num vector replicável, introdução do vector numa célula hospedeira compatível e crescimento da célula hospedeira sob condições que provocam a replicação do vetor.

[0088] De preferência, o vector é um vector de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção. Tais vectores de expressão são construídos rotineiramente na arte da biologia molecular e podem, por exemplo, envolver o uso de DNA de plasmídeo e iniciadores apropriados, promotores, intensificadores e outros elementos, que podem ser necessários, e que está posicionada com a orientação correcta, a fim de para permitir a expressão da proteína. Outros vectores adequados serão evidentes para os peritos na arte. A título de exemplo adicional, a este respeito referimo-nos a Sambrook et al. 1989.

[0089] Os polinucleotídeos de acordo com a invenção também pode ser inserido nos vectores descritos antes, numa orientação anti-sentido, a fim de proporcionar a produção de ARN anti- sentido. ARN anti-sentido ou outros polinucleotídeos anti-sentido ou ARN de interferência, RNAi pode também ser produzido por meios sintéticos. Tais polinucleotídeos anti-sentido ou RNAi podem ser utilizados como compostos de teste nos ensaios da invenção, ou podem ser úteis num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia.

[0090] De preferência, um polinucleotídeo da invenção ou para utilização na presente invenção num vector está operacionalmente ligado a uma sequência de controlo que é capaz de proporcionar a expressão da sequência de codificação pela célula hospedeira, isto é, o vector é um vector de expressão. O termo "operativamente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão numa relação que lhes permite funcionar no seu modo pretendido. Uma sequência reguladora, como um promotor, "operativamente ligado" a uma sequência de codificação está posicionado de tal maneira que a expressão da sequência de codificação é conseguida sob condições compatíveis com a sequência reguladora.

[0091] Os vectores podem ser, por exemplo, plasmídicos, de vírus ou fago fornecidos com vectores de uma origem de replicação, opcionalmente um promotor para a expressão do referido polinucleotídeo e opcionalmente um regulador do promotor. Os vectores podem conter um ou mais genes marcadores selecionáveis, por exemplo um gene de resistência à ampicilina no caso de um plasmídeo bacteriano ou um gene de resistência para um vector de fungos.

[0092] Os promotores e outros sinais de regulação da expressão podem ser selecionados para serem compatíveis com a célula hospedeira para a qual a expressão é desenhado. Por exemplo, os promotores de leveduras incluem S. cerevisiae GAL4 e promotores de ADH, S. promotor \ e promotor ADH. Os promotores de mamífero incluem o promotor de metalotioneína que pode ser induzido em resposta a metais pesados, como o cádmio. Os promotores virais tais como os de SV40 grande T antigénio promotor ou promotores de adenovírus também pode ser utilizado.Todos esses promotores estão prontamente disponíveis na arte.

[0093] Os promotores de mamífero, tais como promotores β-actina, pode ser utilizado. Os promotores específicos de tecido são especialmente preferidos. Promotores virais também podem ser usados, por exemplo, o vírus da leucemia murina de Moloney de repetição terminal longa (MMLV LTR), o vírus do sarcoma de Rous (RSV), o promotor LTR, o promotor de SV40, o humano citomegalovírus (CMV) promotor de IE, adenovírus, promotores de HSV (tal como os promotores de HSV IE), ou promotores de HPV, particularmente a região reguladora a montante de HPV (URR). Promotores virais estão prontamente disponíveis na arte.

[0094] Os vectores de expressão podem ser transformados numa célula hospedeiro adequada para proporcionar a expressão de um fragmento de polipeptídeo ou polipeptídeo da invenção. A célula hospedeira, transformada ou transfectada com um vector de expressão como descrito acima, é cultivada em condições que permitem a expressão do polipeptídeo ou fragmento, e o polipeptídeo ou fragmento expressa é recuperada. O isolamento e a purificação pode ser realizada como descrito acima. As células hospedeiras serão escolhidas para serem compatíveis com o vector e de preferência irá ser de origem bacteriana. As células hospedeiras também podem ser células de um animal não-humano, ou uma planta transformada com um polinucleotídeo da invenção. IdeS

[0095] IdeS é uma protease de cisteína extracelular produzida pelos agentes patogénicos humanos S. pyogenes e é descrita em WO 03/051914. Ides foi originalmente isolado a partir de um grupo de uma estirpe de estreptococos do serotipo Ml, mas o gene ides foi agora identificado em todos os grupos testados A estirpes de estreptococos. Ides tem um extraordinariamente alto grau de especificidade de substrato, com o seu substrato apenas identificado o IgG. Ides catalisa uma única clivagem proteolítica na região inferior da dobradiça de IgG humana. Esta degradação proteolítica promove inibição da opsonofagocitose e interfere com a morte do grupo A Streptococcus. IDEs também cliva algumas subclasses de IgG em vários animais e eficiente converte IgG em fragmentos Fc e Fab. O gene ides foi clonado e expresso em E. coli como uma proteína de fusão GST.

[0096] O polipeptídeo Ides para utilização nos métodos da invenção é preferencialmente S. pyogenes Ides, ou uma variante ou fragmento de S. pyogenes Ides que retém a atividade de protease de cisteína. A variante pode ser um polipeptídeo Ides de outro organismo, tal como uma outra bactéria. A bactéria é de preferência um Streptococcus. O Streptococcus é de preferência um grupo de um Streptococcus, um Streptococcus do grupo C ou Streptococcus do grupo G. Em particular, a variante pode ser um polipeptídeo Ides de um Streptococcus do grupo C, tais como S. equii ou S. zooepidemicus. Em alternativa, a variante pode ser de Pseudomonas putida. O polipeptídeo IdeS pode incluir (a) a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; (b) uma sua variante com, pelo menos, 50% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 e tendo atividade de protease de cisteína de IgG, ou (c) um fragmento de qualquer um destes possuindo atividade de protease de cisteína de IgG.

[0097] De preferência, o polipeptídeo IdeS compreende ou consiste em, a sequencia de SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 4 é a sequência da forma madura do Ides, sem a sequência de sinal.

[0098] Ides polipeptídeos variantes são aquelas para as quais a sequência de aminoácidos que varia a partir de SEQ ID NO: 4, mas que exibem a mesma atividade de protease de cisteína de IgG como Ides. Tipicamente, polipeptídeos com mais do que cerca de 50%, 55% ou 65%> de identidade, de preferência pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e de modo particularmente preferido pelo menos 95%), pelo menos 97% ou pelo menos 99 % de identidade, com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 são consideradas variantes da proteína. Tais variantes podem incluir variantes alélicas e a supressão, modificação ou adição de aminoácidos individuais ou grupos de aminoácidos no interior da sequência da proteína, desde que o peptídeo mantenha a funcionalidade básica do Ides. A identidade de variantes de SEQ ID NO: 4 pode ser medida ao longo de uma região de pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 275, pelo menos 300 ou mais aminoácidos contíguos da sequência mostrada em SEQ ID NO: 4, ou mais, de preferência ao longo do comprimento total de SEQ ID NO: 4.

[0099] As variantes da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, de preferência, conter resíduos Lys-55 e / ou Cys-65 e / ou His-

233 e / ou a Asp-255 e / ou a Asp-257 da SEQ ID NO: 4. Mais preferivelmente, a variante de SEQ ID NO: 4 contém cada um dos resíduos Lis-55, Cys-65, His- 233, Asp-255 e Asp-257 da SEQ ID NO: 4.

[00100] As sequências variantes diferem tipicamente de, pelo menos, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 50 ou mais mutações (que podem ser substituições, deleções ou inserções de aminoácidos). Por exemplo, de 1 a 50, 2 a 30, 3 a 20 ou 5 a 10 substituições de aminoácidos, deleções ou inserções podem ser feitas. O polipeptídeo modificado retém a atividade como uma cisteína protease específica do IgG. De preferência, os polipeptídeos variantes de compreender um resíduo de cisteína e um resíduo de histidina a um espaçamento tipicamente encontrado em proteases de cisteína. Por exemplo, em SEQ ID NO: 4, estes resíduos são encontrados num espaçamento de cerca de 130 aminoácidos, que é tipicamente encontrado em proteases de cisteína.

[00101] O fragmento dos Ides polipeptídeo usado no invento é, tipicamente, pelo menos 10, por exemplo, pelo menos 15, 20, 25, 30, 40, 50 ou mais aminoácidos de comprimento, até 100, 150, 200, 250 ou 300 aminoácidos ácidos de comprimento, desde que retenha a atividade de protease de cisteína de IgG de Ides. De preferência, o fragmento de o Ides polipeptídeo utilizado no presente invento abrange os resíduos de Lys-55 e / ou Cys-65 e / ou His-233 e / ou a Asp-255 e / ou a Asp-257 da SEQ ID NO:

4. Mais preferivelmente, o fragmento compreende cada um dos resíduos de Lys-55, Cys-65, His-233, Asp-255 e Asp-257 da SEQ ID NO: 4.

[00102] Polipeptídeos IDEs para utilização, em conformidade com a exibição invenção a atividade de protease de cisteína de imunoglobulina, e, em particular, a atividade de protease de cisteína de IgG.De preferência, as IgG cliva polipeptídicas da região charneira e, mais particularmente, na região da dobradiça da cadeia pesada. A clivagem resulta na produção de fragmentos Fab e Fc de IgG. De preferência, a atividade é específico para a IgG. A atividade de protease de cisteína pode ser determinada por meio de um ensaio adequado. Por exemplo, um polipeptídeo de teste podem ser incubadas com IgG a uma temperatura adequada, tal como 37 ° C. Os materiais de partida e os produtos da reação podem então ser analisados por SDS-PAGE para determinar se o produto de clivagem de IgG desejado está presente. Normalmente, este produto de clivagem é a 3 lkDa fragmento. Normalmente não há uma maior degradação de IgG após esta primeira clivagem. O produto da clivagem pode ser submetido a sequenciação N-terminal para verificar que a clivagem ocorreu na região de charneira de IgG. De preferência, a sequência N-terminal compreende a sequência GPSVFLFP.

[00103] A atividade de protease de cisteína de polipeptídeos, pode ser ainda caracterizada por estudos de inibição. De preferência, a atividade é inibida pelo peptídeo derivado Z-LVG-CFIN 2 e / ou por ácido iodoacético ambos os quais são inibidores de protease. No entanto, a atividade em geral, não é inibida por E64

[00104] A atividade de protease de cisteína de polipeptídeos é geralmente IgG específico em que os polipeptídeos não podem degradar as outras classes de Ig, ou seja, IgM, IgA, IgD e IgE, quando incubado com estas imunoglobulinas em condições que permitem a clivagem do IgG. O polipeptídeo Ides é capaz de clivar a IgG humana. Em concretizações preferidas, o polipeptídeo tem a capacidade de clivar humano, coelho, rato ou IgG de cabra.

[00105] Ides polipeptídeos para uso na presente invenção podem ser isolados a partir de qualquer organismo apropriado que expressa um polipeptídeo Ides. Normalmente, o polipeptídeo IDEs é isolado do IDES adequados expressando cepas de S. pyogenes. Os organismos adequados e as tensões podem ser identificados por um número de técnicas. Por exemplo, as estirpes de S. pyogenes pode, inicialmente, ser testado para a presença de um gene de ides. A presença do gene ides pode, então, ser verificada por meio de PCR utilizando os iniciadores ou por hibridação das sondas com o DNA genómico da estirpe de S. pyogenes.

[00106] Cepas de S. pyogenes que expressam Ides activos podem ser identificados através de ensaio para a atividade de protease de cisteína de IgG no sobrenadante de cultura. Preferencialmente inibidor E64 é adicionada ao sobrenadante para inibir qualquer atividade de protease de cisteína SpeB. Pelo menos cinco estirpes expressar IDEs ativos: cepas API, AP12, AP55, KTL3 e SF370. De preferência, a estirpe que expressa é seleccionada a partir de API, API 2 e AP55.

[00107] O isolamento e purificação de Ides a partir de uma expressão de S. pyogenes cultura, ou a partir de culturas de células que expressam outros Ides é tipicamente com base na atividade de protease de cisteína de IgG. De preferência, o método de purificação envolve um passo de precipitação de sulfato de amónio e um passo de cromatografia de troca iónica. De acordo com um método, o meio de cultura é fraccionado por adição de quantidades crescentes de sulfato de amónio. As quantidades de sulfato de amónio pode ser de 10 a 80%.

[00108] De preferência, o meio de cultura é fraccionado com 50% de sulfato de amónio, e o sobrenadante resultante é ainda mais precipitado com 70% de sulfato de amónio. Polipeptídeos granulado podem então ser submetido a cromatografia de troca iónica, por exemplo, numa coluna de FPLC Mono Q. As fracções eluídas podem ser analisadas para IgG cisteína atividade de proteases e frações pico de atividade podem ser agrupadas. As fracções podem ser analisadas por SDS-PAGE. Por exemplo, uma sequência N-terminal pode ser obtida a partir da banda de proteína SDS- PAGE. As fracções podem ser armazenadas a -20 ° C. Métodos que utilizam a atividade de endoglicosidase EndoS49

[00109] Tal como aqui descrito, tem EndoS49 endoglicosidase atividade e é capaz de hidro Ylse o glicano de glicoproteínas incluindo IgG e alfa-1-microglobulina. A presente invenção proporciona assim métodos para a desglicosilação de glicoproteínas, e em particular, a hidrólise do glicano de glicoproteínas, e em particular, a partir de IgG e de alfa-1- microglobulina. Tipicamente, um tal método compreende a incubação de uma amostra que contém a glicoproteína com EndoS49 com uma glicoproteína, em condições que permitem a atividade endoglicosidase. As condições adequadas incluem a utilização de EndoS49 a uma concentração de pelo menos 1 ug / ml, 2 ng / ml, 4 ng / ml, 6 mg / ml, 8 ug / ml, 10 ug / ml, 12 ug / ml, 15 ug / ml ou 20 ug / ml, de preferência pelo menos 10 ug / ml. As condições adequadas incluem a incubação da amostra com EndoS49 durante pelo menos 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 60 minutos, 70 minutos, 80 minutos, 90 minutos ou 120 minutos, preferivelmente pelo menos 60 minutos. A incubação tem lugar de preferência à temperatura ambiente, mais preferencialmente a cerca de 20 ° C, 25 ° C, 30 ° C, 35 ° C, 40 ° C ou 45 ° C, e mais preferencialmente a cerca de 37 ° C.

[00110] Estes métodos podem ser usados para fornecer glicoproteínas desglicosiladas, que podem eles próprios ser úteis em investigação ou terapia. Estes métodos também podem ser utilizados para caracterizar glicanos em glicoproteínas, por exemplo, em ou glicomapeamento. Tal glicomapeamento glicoperfil e é particularmente útil para as moléculas de anticorpos, tais como as moléculas de IgG, por exemplo, na análise de moléculas de IgG monoclonal. Tipicamente, os métodos envolvidos incubando a proteína com a EndoS49 hidrolase os glicanos da proteína. Subsequentemente, os glicanos e a proteína ou o polipeptídeo são separadas, por exemplo, utilizando qualquer técnica adequada, tal como HPLC ou cromatografia em gel. As porções separadas podem então ser analisados por meio de qualquer método adequado, tais como espectrometria de massa, HPLC, cromatografia em gel, electroforese em gel, espectrometria, electroforese capilar e outras técnicas padrão de laboratório para a análise de glicanos e / ou proteínas.

[00111] De acordo com outros métodos da presente invenção, os métodos também podem compreender a utilização de enzimas adicionais, tais como Ides assim que os glicanos sobre a porção Fc do anticorpo pode ser analisado em mais pormenor, utilizando os métodos e as técnicas aqui descritas.

[00112] Um exemplo é o de analisar a fucosilação de uma imunoglobulina. O grau de fucosilação sobre os glicanos de Fc em uma molécula de IgG é importante para o potencial terapêutico de um candidato a fármaco IgG. Moléculas de IgG Afucosylated aumentar o efeito de ADCC (nn) da molécula de IgG terapêutico. Assim, de acordo com a presente invenção, proporciona-se um método para analisar a quantidade de fucose nos glicanos Fc de uma IgG, utilizando EndoS49.

[00113] Tipicamente, um tal método compreende a incubação de uma glicoproteína, neste caso uma imunoglobulina, com EndoS49 sob condições que permitem que a atividade de endoglicosidase EndoS49. As condições adequadas incluem a utilização de EndoS49 a uma concentração de pelo menos 1 ug / ml, 2 ng / ml, 4 ng / ml, 6 mg / ml, 8 ug / ml, ug / ml, 12 ug / ml, 15 ug / ml ou 20 ug / ml, de preferência pelo menos 10 ug / ml. As condições adequadas incluem a incubação da amostra com EndoS49 durante pelo menos 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 60 minutos, 70 minutos, 80 minutos, 90 minutos ou 120 minutos, preferivelmente pelo menos 60 minutos. A incubação tem lugar de preferência à temperatura ambiente, mais preferencialmente a cerca de 20 ° C, 25 ° C, 30 ° C, 35 ° C, 40 ° C ou 45 ° C, e mais preferencialmente a cerca de 37 ° C. IDEs podem ser adicionados após a reação com EndoS49, ou na mesma mistura de reação, para induzir a proteólise, dividir a molécula de imunoglobulina para o F (ab ') 2 e Fe. Os dois fragmentos são separadas usando um método de separação antes da injeção em um espectrômetro de massa. Após clivagem de glicano, um resíduo GlcNAc e núcleo Fuc permanecer ligado a Asn na consenso Fc / 2 local de glicosilação. Uma vez que uma imunoglobulina não é núcleo fucosilado, alguns Fc / 2 irá conter apenas um GlcNAc após a digestão. A diferença de massa característica (-146 Da) resultante da ausência de fucose é facilmente perceptível no espectro de massa. Utilização de EndoS49, portanto, facilita a estimativa direta do grau de núcleo afucosilação de IgG. Método para determinar a presença ou ausência de IgG numa amostra, ou para isolar IgG a partir de uma amostra contendo IgG.

[00114] O isolamento e / ou detecção de anticorpos IgG é tipicamente levada a cabo na arte, utilizando agentes tais como Proteína G ou Proteína A. As proteínas bacterianas interagem bem com IgG. No entanto, a proteína A não se liga a todas as quatro subclasses de IgG (IgG 1- 4 ), e tanto a proteína A e proteína G não são capazes de discriminar entre não glicosilada e / ou desnaturada, inativa IgG e glicosilada e / ou nativa, IgG funcionalmente ativa. Por contraste, os presentes inventores identificaram que polipeptídeo EndoS49s que não possuem atividade endoglicosidase IgG tipicamente ligam todas as quatro subclasses de IgG com afinidade elevada, e são seletivos para IgG normalmente glicosiladas, isto é, IgG, na sua forma nativa, funcionalmente ativa.

[00115] Por conseguinte, a presente invenção proporciona um método melhorado para a determinação da presença ou ausência de IgG numa amostra, método esse que compreende o contato da referida amostra com um polipeptídeo que carece de IgG EndoS49 atividade endoglicosidase, separar a referida EndoS49 a partir da amostra em contato, e determinando-se assim a presença ou a ausência de IgG e, opcionalmente, em que a IgG está presente, a obtenção de IgG isolada. Por conseguinte, a invenção também fornece um método para isolar IgG a partir de uma amostra contendo IgG, cujo método compreende o contato da referida amostra com um polipeptídeo que carece de atividade EndoS49 endoglicosidase IgG, separar a referida EndoS49 a partir da amostra em contato, e, assim, a obtenção de IgG isolada.

[00116] As amostras acima são contatadas com polipeptídeo EndoS49 sob condições adequadas para a interação entre o polipeptídeo e a amostra ter lugar e a atividade de ligação de IgG a ocorrer, ou seja, para permitir a formação de um complexo polipeptídeo IgG-EndoS49. As condições adequadas incluem a utilização de EndoS49 a uma concentração de pelo menos 1 ug / ml, 2 ng / ml, 4 ng / ml, 6 mg / ml, 8 ug / ml, 10 ug / ml, 12 ug / ml, 15 ug / ml ou 20 ug / ml, de preferência pelo menos 10 ug / ml. As condições adequadas incluem a incubação da amostra com EndoS49 durante pelo menos 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 60 minutos, 70 minutos, 80 minutos, 90 minutos ou 120 minutos, preferivelmente pelo menos 60 minutos. A incubação tem lugar de preferência à temperatura ambiente, mais preferencialmente a cerca de 20 ° C, 25 ° C, 30 ° C, 35 ° C, 40 ° C ou 45 ° C, e mais preferencialmente a cerca de 37 ° C.

[00117] Uma vantagem particular de EndoS49 nestes métodos é de que se liga especificamente a EndoS49 normalmente glicosilada IgG. As atividades de ligação a IgG de outros agentes de ligação de IgG normalmente requerem ou são reforçadas por desnaturação da glicoproteína IgG. Isto é tipicamente conseguido tratando uma amostra contendo IgG com ácido. Este tratamento pode danificar ou desnaturar alguns anticorpos (anticorpos sensíveis a ácidos). Uma vez que o método da invenção não requer tal tratamento, o método é particularmente adequado para isolar sensível ao ácido IgG na sua forma nativa a partir de uma amostra.

[00118] O EndoS49 pode ser separado da amostra contatada por qualquer método adequado. Um método preferido para a remoção do EndoS49 a partir de uma amostra compreende usando uma EndoS49 que é derivatizado ou modificado, como descrito acima.

[00119] Uma modificação preferida compreende a adição de um marcador de histidina. A presença de um marcador de histidina significa que o polipeptídeo liga-se com uma elevada afinidade para um reagente ou meios de separação contendo grupos quelantes sobre a sua superfície, que transportam um níquel, cobre ou iões de zinco. O marcador de histidina liga-se fortemente a estes iões metálicos. Tal reagente pode, portanto, ser utilizado para separar uma amostra de EndoS49.

[00120] Outra modificação preferida compreende a adição de uma etiqueta de biotina. A presença de uma etiqueta de biotina significa que o polipeptídeo liga-se com uma elevada afinidade para um reagente ou de separação compreendendo os meios de estreptavidina. O tag de biotina liga-se fortemente a estreptavidina. Tal reagente pode, portanto, ser utilizado para separar uma amostra de EndoS49.

[00121] Os reagentes preferidos ou meios de separação são populações de partículas magnéticas capazes de se ligarem ao polipeptídeo EndoS49. Por exemplo, onde o polipeptídeo EndoS49 é derivatizada com um marcador de histidina, as partículas magnéticas conter nos seus grupos superfície quelantes que transportam um níquel, cobre ou iões de zinco. Alternativamente, quando o polipeptídeo EndoS49 é derivatizado com uma marca de biotina, as partículas magnéticas conter na sua superfície de estreptavidina.

[00122] Deste modo, um método preferido de remoção EndoS49 partir de uma amostra compreende a utilização de uma população de partículas magnéticas tal como descrito acima e a realização de separação de campo magnético sobre a amostra. As partículas magnéticas são de preferência nanopartículas magnéticas, e a separação do campo magnético é, de preferência a separação maior gradiente de campo magnético.

[00123] Deve entender-se que podem ser utilizados quaisquer meios de separação adequados. Por exemplo, os meios alternativos descritos na seção anterior.

[00124] O EndoS49 da amostra contatada pode ser avaliada quanto à presença ou ausência de IgG ligada por qualquer meio adequado. Por exemplo, o peso molecular do EndoS49 podem ser analisados.

[00125] EndoS49 ligado a IgG têm um peso molecular mais elevado do que EndoS49 não ligada a IgG. Consequentemente métodos adequados incluem qualquer método capaz de discriminar espécies de proteína em peso, por exemplo, SDS-PAGE e Western Blot, espectrometria de massa, etc Alternativamente, o Western Blot acima pode ser diretamente analisada para a presença de IgG utilizando anticorpos ou anticorpos IgG específicos específico para um determinado sub-classe IgG. Detecção de proteínas de uma mancha desta maneira é uma técnica amplamente utilizada na arte.

[00126] Outros meios adequados para a detecção da presença ou ausência de IgG ligada a EndoS49 incluem incubar a EndoS49 com os anticorpos para a IgG ou proteínas de ligação de IgG-com enzimas acopladas (por exemplo, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina), seguido pela adição de substratos fluorogénicos / cromogénicos. Neste exemplo, o desenvolvimento de um sinal de cor indica a presença de anticorpos IgG, com a quantidade de IgG foi proporcional à intensidade do sinal. Detecção de proteínas desta maneira é uma técnica amplamente utilizada na arte.

[00127] Além disso os meios adequados para a detecção da presença ou ausência de IgG ligada a EndoS49 compreendem primeira separação de IgG ligada EndoS49 de modo que possa ser analisada / detectado independentemente do EndoS49 por qualquer um dos métodos acima referidos ou qualquer outro método adequado. IgG pode ser separada do EndoS49 por quaisquer meios adequados.

[00128] Os meios adequados incluem-se a eluição da IgG da EndoS49 contactando o EndoS49 a partir da amostra em contato com um tampão de eluição adequado. A escolha do tampão de eluição normalmente dependerá se ou não a IgG ligada a EndoS49 é conhecido ou suspeito de ser inativada pelo contato com ácidos sensíveis ao ácido, ou seja desnaturado.

[00129] Quando o anticorpo não é sensível a ácido, um protocolo de eluição utilizando um tampão de eluição de pH baixo, podem tipicamente ser empregados. Protocolos de eluição deste tipo são bem conhecidas na arte. Tais tampões de eluição têm um pH tipicamente abaixo de cerca de pH 3, com maior preferência abaixo de cerca de pH 2. Os exemplos preferidos incluem glicina 0,1 M a pH 2. Em adição, ou, opcionalmente, tais tampões de eluição podem compreender tipicamente, pelo menos, um dos seguintes:

[00130] - Sais de sódio ou potássio, de preferência numa concentração de cerca de 0,5 M e cerca de 1M;

[00131] - Mono-, di-ou polissacáridos com estruturas semelhantes ao glicano associada com Asn-297 em IgG nativa;

[00132] ou qualquer combinação dos mesmos. No entanto, como descrito acima, os métodos da invenção são particularmente adequados para a detecção / isolamento de anticorpos sensíveis ao ácido. Onde a IgG ligada a EndoS49 é conhecido ou suspeito de ser sensível aos ácidos, por conseguinte, é preferível utilizar tampões e protocolos que não requerem um pH baixo de eluição. Tais protocolos são também conhecidos na arte e são baseadas no princípio de proporcionar um tampão que compreende uma molécula que compete com o IgG ligado por ligação a EndoS49, conduzindo assim à libertação de IgG ligada. Adequados tampões de eluição competição, pois, compreender tipicamente um ou mais mono-, polissacarídeos com estruturas semelhantes ao glicano associada com Asn-297 em IgG nativa di-, ou. Tampões de eluição particularmente preferidos compreendem sacarose a cerca de 0,25 M a cerca de 0,5 M, de preferência com pH de cerca de 5,3 a cerca de 8,3. Exemplos de tampões de eluição específicos preferidos incluem, por exemplo:

[00133] 0,25 M de sacarose, em PBS pH 7,4; Sacarose 0,5 M, em PBS pH 7,4; Sacarose 0,25 M, em PBS pH5.3; Sacarose 0,25 M, em PBS pH 8,5 e 0,25 M de sacarose, maltose 0,25 M, em PBS pH 7,4.

[00134] Em adição, ou, opcionalmente, tais tampões de eluição competição pode compreender tipicamente os sais de sódio ou potássio, de preferência numa concentração de cerca de 0,5 M e cerca de 1M.

[00135] Também podem ser utilizados os meios de separação de IgG ligada a partir EndoS49 como descrito acima, para obter isolado de IgG.

[00136] Método de avaliação do estado de glicosilação e / ou qualidade funcional de uma amostra contendo IgG

[00137] Os polipeptídeos EndoS49 da invenção na forma não modificada tem a capacidade de hidrolisar o glicano de IgG.Além disso, como descrito acima, os polipeptídeos do invento EndoS49 desprovidos de atividade endoglicosidase IgG e possuindo atividade de ligação a IgG são específicos para glicosilada e / ou nativa, IgG funcionalmente ativa.

[00138] Assim, os polipeptídeos EndoS49 pode ser utilizado para analisar o estado de glicosilação de uma glicoproteína, e, em particular, um anticorpo de IgG.

[00139] De acordo com um aspecto da invenção, um anticorpo IgG é incubado com um polipeptídeo EndoS49 da invenção que tem atividade endoglicosidase.

[00140] Os produtos obtidos podem ser analisados através de quaisquer técnicas adequadas, incluindo HPLC, espectrometria de massa, cromatografia em gel, electroforese em gel, espectrofotometria, electroforese capilar. Tais métodos de análise pode ser realizada em qualquer fase da preparação de uma proteína, por exemplo, durante a triagem de drogas candidatas, durante o desenvolvimento de processos de produção de medicamentos biológicos, bem como um controlo de qualidade em ensaios de libertação e, durante a produção.

[00141] Os polipeptídeos EndoS49 que foram modificadas para remover ou reduzir a atividade de endoglicosidase, ou que retêm a capacidade de se ligar a IgG na sua forma nativa pode também ser útil em glicomapeamento, e, em particular, a análise da glicoproteina, e em particular a estrutura de IgG.

[00142] Por exemplo, usando os referidos polipeptídeos EndoS49, opcionalmente em combinação com um reagente de ligação Igg alternativa, a presente invenção proporciona um método para avaliar o estado de glicosilação ou a qualidade funcional de uma IgG contendo a amostra, o qual compreende, tendo uma primeira e uma segunda sub - amostra da amostra contendo IgG, contactando a primeira sub-amostra com um polipeptídeo EndoS49 como descrito na secção anterior, e a segunda sub- amostra com um reagente de ligação Igg alternativa que é capaz de se ligar não glicosilada e / ou desnaturada, inactiva IgG, e em seguida quantificando a quantidade de IgG ligada ao polipeptídeo EndoS49 no primeiro sub-amostra, e a quantidade de IgG ligado ao reagente de ligação Igg alternativa na segunda sub-amostra. Finalmente, comparando ambas as quantidades de IgG ligada determinados no primeiro e segundo sub-amostras, o estado de glicosilação ou a qualidade funcional de uma IgG contendo a amostra pode ser avaliada.

[00143] O reagente de ligação Igg alternativa é tipicamente de Proteína A ou Proteína G, que se ligam a todas as formas (nativas ou desnaturadas) de IgG. Neste exemplo, a quantidade de IgG ligada ao referido reagente representa, por conseguinte, a IgG total presente na segunda sub-amostra. O polipeptídeo EndoS49 liga-se apenas a glicosilada e / ou nativa, IgG funcionalmente activa, e, por conseguinte, a quantidade de IgG ligada a EndoS49 representa apenas a glicosilada e / ou nativa, presente IgG funcionalmente activa no primeiro sub-amostra. Por comparação da concentração de anticorpos IgG totais a partir da segunda sub-amostra com a concentração de IgG nativa no primeiro exemplo, o perito na arte irá reconhecer que se obtém uma proporção que reflecte a proporção de IgG na amostra original que está presente na sua glicosilada e / ou forma nativa, funcionalmente ativo.

[00144] Noutro enquadramento, o reagente de ligação Igg alternativa podia ser específica para a não glicosilada e / ou desnaturada IgG. Tal reagente pode ser, por exemplo, um anticorpo. Por conseguinte, nesta forma de realização, a proporção de IgG na amostra original que está presente na sua forma glicosilada e / ou nativa, funcionalmente activo pode ser avaliada pela fórmula: Quantidade de IgG no primeiro sub-amostra / (quantidade de IgG no primeiro sub amostra + Quantidade de IgG no segundo sub-amostra)

[00145] Os exemplos dos métodos acima são contatadas com polipeptídeo EndoS49 ou reagente alternativo de ligação Igg sob condições adequadas para a interacção entre o polipeptídeo ou o reagente e a amostra para ocorrer e atividade de ligação de IgG a ocorrer. Condições adequadas são, por exemplo, equivalentes aos estabelecidos na seção anterior. Método para o isolamento de Fab de IgG ou fragmentos Fe de uma amostra contendo IgG

[00146] Os métodos da presente invenção pode ser usado para isolar os fragmentos de Fab a partir de amostras contendo IgG. Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um método para isolar os fragmentos Fab de IgG a partir de uma amostra contendo IgG, cujo método compreende: (a) fazer contatar a referida amostra contendo IgG com Ides, e um polipeptídeo EndoS49; (b) separar disse IDEs e disse polipeptídeo EndoS49 a partir da amostra contatada, e isolando fragmentos Fab.

[00147] Os métodos preferidos para a separação do Ides e polipeptídeo EndoS49 a partir de uma amostra utilizando um Ides compreende e / ou polipeptídeo EndoS49 que é derivatizada ou modificados tal como descrito acima. A modificação do mesmo ou um diferente pode ser usado em cada um dos Ides e o polipeptídeo EndoS49.

[00148] Uma modificação preferido compreende a adição de um marcador de histidina. A presença de um marcador de histidina significa que o polipeptídeo liga-se com uma elevada afinidade para um reagente ou meios de separação contendo grupos quelantes sobre a sua superfície, que transportam um níquel, cobre ou iões de zinco. O marcador de histidina liga-se fortemente a estes iões metálicos. Tal reagente pode, portanto, ser usadas para Ides separadas e / ou polipeptídeo EndoS49 a partir de uma amostra.

[00149] Outra modificação preferido compreende a adição de uma etiqueta de biotina. A presença de uma etiqueta de biotina significa que o polipeptídeo liga-se com uma elevada afinidade para um reagente ou de separação compreendendo os meios de estreptavidina. O tag de biotina liga-se fortemente a estreptavidina. Tal reagente pode, portanto, ser usadas para Ides separadas e / ou polipeptídeo EndoS49 a partir de uma amostra. Os reagentes preferidos ou meios de separação são populações de partículas magnéticas capazes de se ligarem ao polipeptídeo EndoS49. Por exemplo, onde o Ides e / ou polipeptídeo EndoS49 polipeptídeo é derivatizada com um marcador de histidina, as partículas magnéticas conter nos seus grupos superfície quelantes que transportam um níquel, cobre ou iões de zinco.Alternativamente, onde o Ides e / ou polipeptídeo EndoS49 polipeptídeo é derivatizado com uma marca de biotina, as partículas magnéticas conter na sua superfície de estreptavidina.

[00150] Deste modo, um método preferido de remoção EndoS49 partir de uma amostra compreende a utilização de uma população de partículas magnéticas tal como descrito acima e a realização de separação de campo magnético sobre a amostra. As partículas magnéticas são de preferência nanopartículas magnéticas, e a separação do campo magnético é, de preferência a separação maior gradiente de campo magnético.

[00151] Assim, o passo (a) do método acima compreende, de preferência, adicionalmente, o contato da amostra com uma população de nanopartículas magnéticas capazes de se ligarem a Ides e o polipeptídeo EndoS49, e em que o passo (b) compreender a realização de separação de campo magnético sobre a amostra.

[00152] O polipeptídeo EndoS49 é preferivelmente um polipeptídeo EndoS49 modificado deficiente atividade endoglicosidase.

[00153] Na forma de realização acima da presente invenção, a amostra contendo IgG compreende tipicamente IgG purificada ou isolada. Por "IgG purificada ou isolada" entende-se uma fracção de IgG com uma pureza de grau comercial normal.IgG é tipicamente isolado a partir de uma amostra tal como soro ou, no caso de IgG recombinante, a partir de lisados de células. O isolamento pode ser realizado de acordo com qualquer método adequado, de preferência, de acordo com o método descrito acima para o isolamento de IgG usando um polipeptídeo EndoS49 modificado deficiente atividade endoglicosidase. Assim, uma forma de realização da invenção inclui o método descrito acima, compreendendo, antes do passo (a): (i) contatar a referida amostra contendo IgG com um polipeptídeo que não possui atividade de EndoS49 endoglicosidase IgG, para permitir assim a formação de um complexo polipeptídeo IgG-EndoS49; (ii) separação do referido complexo polipeptídeo IgG- EndoS49 da amostra contatada; (iii) IgG de eluição a partir do complexo polipeptídeo IgG- EndoS49 obtendo-se assim uma amostra contendo IgG, e em que os passos (a) e (b) são realizados a amostra contendo IgG obtida no passo (iii). A separação do complexo polipeptídeo IgG-EndoS49 partir de uma amostra é efectuada de preferência de acordo com os métodos descritos na secção anterior relacionada com os métodos para a determinação da presença ou ausência de IgG numa amostra, ou para isolar IgG a partir de uma amostra contendo IgG.

[00154] Numa forma de realização alternativa da invenção, os métodos são adaptados para isolar fragmentos Fab a partir de amostras de IgG-contidos, sem a necessidade de purificar o IgG antes de realizar o método. Estes métodos podem ser realizados em uma amostra contendo IgG não purificado, por exemplo, soro total, lisado celular ou meio de cultura de células. Nesta forma de realização da invenção, o método compreende: (a) contatar a referida amostra contendo IgG com um polipeptídeo EndoS49 para permitir assim a formação de um complexo polipeptídeo IgG-EndoS49; (b) separação do referido complexo polipeptídeo IgG- EndoS49 da amostra contatada; (c) adição aos complexos de IgG-EndoS49 polipeptídicos, obtidos no passo (b) Ides, e (d) separar a referida Ides e disse polipeptídeo EndoS49 a partir da mistura obtida em (c); e isolando fragmentos Fab.

[00155] Os métodos para a separação do Ides e / ou polipeptídeo EndoS49 a partir das amostras / misturas acima compreendem, de preferência usando um Ides e / ou polipeptídeo EndoS49 que é derivatizada ou modificados tal como descrito acima. A modificação do mesmo ou um diferente pode ser usado em cada um dos Ides e o polipeptídeo EndoS49. Reagentes preferidos ou meios de separação são as populações de partículas magnéticas capazes de se ligar aos IDEs e / ou polipeptídeo EndoS49. Por exemplo, onde o Ides e / ou polipeptídeo EndoS49 polipeptídeo é derivatizada com um marcador de histidina, as partículas magnéticas conter nos seus grupos superfície quelantes que transportam um níquel, cobre ou iões de zinco. Alternativamente, onde o Ides e / ou polipeptídeo EndoS49 polipeptídeo é derivatizado com uma marca de biotina, as partículas magnéticas conter na sua superfície de estreptavidina.

[00156] Assim, o passo (a) do método acima compreende, de preferência, adicionalmente, o contato da amostra com uma população de nanopartículas magnéticas capazes de se ligar ao polipeptídeo EndoS49, passo (c) compreende, adicionalmente, o contato dos complexos de polipeptídeo IgG-EndoS49 obtidos no passo (b) com uma população de nanopartículas magnéticas capazes de se ligarem a Ides e o polipeptídeo

EndoS49, e em que os passos (b) e (d) compreender a realização de separação de campo magnético sobre a amostra de (a) e da mistura obtida em (c), respectivamente.

[00157] Deve entender-se que podem ser utilizados quaisquer meios de separação adequados. Por exemplo, os meios alternativos descritos na secção relacionada com métodos para o isolamento de uma população de células, que são substancialmente livre de moléculas de IgG ligadas a FcyRs poderia ser adaptado para a separação de Ides e / ou polipeptídeo EndoS49.

[00158] O polipeptídeo EndoS49 na forma de realização acima é preferencialmente um polipeptídeo EndoS49 modificado deficiente atividade endoglicosidase.

[00159] Os métodos anteriores da invenção também pode ser usado para isolar os fragmentos Fc de amostras contendo IgG.Numa tal forma de realização da invenção, o método compreende: (a) fazer contatar a referida amostra contendo IgG com Ides; (b) separação de Ides a mistura obtida na etapa (a), isolando, assim, os fragmentos Fab e Fc; (c) fazer contatar os referidos fragmentos Fab e Fc com um polipeptídeo EndoS49 para permitir assim a formação de um complexo polipeptídeo fragmento Fc-EndoS49; (d) separar os fragmentos de Fc-EndoS49 complexos polipeptídeo a partir da mistura obtida no passo (c); e (e) isolamento de fragmentos de Fc do fragmento de EndoS49 complexos de polipeptídeos Fc obtidos no passo (d).

[00160] Deve ser entendido que qualquer meio de separação apropriados podem ser utilizados, conforme descrito acima, no entanto, os métodos para a separação do Ides e / ou polipeptídeo EndoS49 a partir das amostras / misturas acima compreendem, de preferência usando um

Ides e / ou polipeptídeo EndoS49 que é derivatizada ou modificados conforme descrito acima.

[00161] De preferência, o passo (a) do método acima, adicionalmente, compreende o contato da amostra com uma população de nanopartículas magnéticas capazes de se ligarem a Ides, passo (c) compreende, adicionalmente, o contato dos fragmentos Fab e Fc, obtidos no passo (b) com uma população de magnético nanopartículas capazes de se ligarem ao polipeptídeo EndoS49, e em que os passos (b) e (d) compreender a realização de separação de campo magnético sobre a amostra de (a) e da mistura obtida em (c), respectivamente. O polipeptídeo EndoS49 é preferivelmente um polipeptídeo EndoS49 modificado deficiente atividade endoglicosidase.

[00162] Numa forma de realização alternativa, os fragmentos de Fc podem ser isolados a partir de uma amostra contendo IgG por um método compreendendo: (a) contatar a referida amostra contendo IgG com Ides e um polipeptídeo EndoS49 (b) separação do polipeptídeo EndoS49 a partir da mistura obtida em (a); isolando fragmentos Fc.

[00163] Deve ser entendido que qualquer meio de separação apropriados podem ser utilizados, conforme descrito acima. No entanto, de preferência, o passo (a) do método acima compreende, adicionalmente, o contato da amostra com uma população de nanopartículas magnéticas capazes de se ligarem ao polipeptídeo EndoS49 mas não Ides, e em que o passo (b) compreender a realização de separação de campo magnético sobre a mistura obtida em (a). De preferência, o Ides e / ou o polipeptídeo são EndoS49 derivatizado ou modificado, como descrito acima, com a condição de que uma modificação diferente é aplicada a cada um. Por exemplo, onde o Ides é modificado pela adição de um marcador de histidina, tais que ele se liga a uma população de partículas magnéticas, contendo na sua superfície grupos quelantes que transportam um níquel, cobre ou iões de zinco, o polipeptídeo EndoS49 pode ser modificada pela adição de um bio tag estanho de tal modo que ele se liga a uma população de partículas magnéticas, contendo na sua superfície de estreptavidina. O polipeptídeo EndoS49 é preferivelmente um polipeptídeo EndoS49 modificado deficiente atividade endoglicosidase.

[00164] Similar aos métodos de isolamento de fragmentos de Fab, será apreciado que em métodos para a separação de fragmentos de Fc da amostra contendo IgG compreende tipicamente IgG purificada ou isolada. Um método preferido de isolar IgG é descrito em etapas (i) a (iii) conforme estabelecido acima. Kits

[00165] A presente invenção proporciona - Um kit para isolar IgG a partir de uma amostra contendo IgG, compreendendo: (a) um polipeptídeo EndoS49 de acordo com a invenção, que não tem atividade endoglicosidase, e opcionalmente (b) meios para separar o referido polipeptídeo EndoS49 a partir de uma amostra. um kit para determinar a presença ou ausência de IgG numa amostra, compreendendo: (a) um polipeptídeo EndoS49 de acordo com a invenção, que não tem atividade endoglicosidase, e opcionalmente (b) meios para separar o referido polipeptídeo EndoS49 a partir de uma amostra. - Um kit para avaliar o estado de glicosilação e / ou a qualidade funcional de uma IgG contendo a amostra, que compreende: (a) um polipeptídeo EndoS49 de acordo com a invenção, que não tem atividade endoglicosidase, e opcionalmente; (b) um reagente de ligação Igg alternativa que é capaz de se ligar desnaturado e / ou desglicosilada IgG;

(c) meios para separar o referido polipeptídeo EndoS49 a partir de uma amostra, e (d) meios para separar o referido reagente de ligação de IgG a partir de uma amostra de alternativa.

[00166] O reagente de ligação Igg alternativa compreende proteína G e / ou da Proteína A e / ou Proteína A / G.

[00167] A presente invenção também fornece: - Um estojo para isolamento de fragmentos de Fab ou Fc de IgG compreendendo: (a) IDEs; (b) um polipeptídeo EndoS49; e (c) Os meios para separar disse IDEs e disse polipeptídeo EndoS49 a partir de uma amostra.

[00168] Numa forma de realização preferida, o kit compreende, adicionalmente, um polipeptídeo EndoS49 de acordo com a invenção, que não tem atividade endoglicosidase e um meio para separar a referida polipeptídeo EndoS49 a partir de uma amostra. O polipeptídeo é preferencialmente uma EndoS49 polipeptídeo EndoS49 de acordo com a invenção, que não tem atividade endoglicosidase.

[00169] Formas de realização preferidas dos estojos acima compreender ainda instruções para utilização do kit de um método da invenção. Outras formas de realização preferidas incluem aquelas em que os meios para separar um polipeptídeo EndoS49, um reagente de ligação Igg alternativa, um polipeptídeo Ides, ou um polipeptídeo a partir de uma amostra EndoS49 são populações de nanopartículas magnéticas, em que cada população é capaz de se ligar a pelo menos um de os indicados polipeptídeos / reagentes / proteínas. Nesta concretização, o kit compreende tipicamente adicionalmente instruções para realizar a separação de campo magnético sobre a amostra.

[00170] Em concretizações preferidas dos métodos e kits acima, o

[00171] polipeptídeos / proteínas / reagentes utilizados são derivatizados com uma etiqueta de afinidade, de preferência, um marcador de histidina, para auxiliar a separação dos referidos polipeptídeos. Os exemplos seguintes ilustram a invenção: Exemplo 1 MATERIAIS E MÉTODOS Cepas bacterianas e crescimento

[00172] O genoma da estirpe NZ131 GÁS de serotipo M49, foi sequenciada e desta estirpe foi por conseguinte seleccionada, como estirpe de referência no presente trabalho (McShan et al. De 2008) (Chaussee et al., 1999). NZ131 tensão GAS foi propagada em ágar sangue andEscherichia coli Top 10 (Invitrogen) e BL21 pLysS (Invitrogen) foram propagadas em caldo lisogenia ágar (LB).Para a selecção em E. coli Top 10 células, a carbenicilina foi utilizada a 100 ug / mL e para a E. coli BL21 pLysS, foram utilizados 100 ug / ml de carbenicilina e 34 ug / ml de cloranfenicol. Culturas durante a noite de E. coli foram realizadas em meio LB a 37 ° C com arejamento. Preparação de DNA genômico de NZ131 tensão GAS foi realizada utilizando DNA Puregene Purification Kit (Qiagen).

[00173] A transformação foi levada a cabo usando a choque de calor a 42 ° C durante 30 s. Plasmídeo preparações a partir de E. coli foram realizadas usando o plasmídeo miniprep Kit I (EZNA). Todos os iniciadores utilizados neste trabalho estão listados na Tabela 2. A expressão recombinante de EndoS49.

[00174] A expressão recombinante de EndoS49 em E. coli foi criada por amplificação por PCR do gene ndoS49 de estreptococos do grupo A estirpe NZ131, serotipo M49 com os iniciadores ndoS49-F-Bamffl, CTGTAAGGATCCAGGAGAAGACTG, e ndoS49-R-XhoI, GAAACCTCGAGTCTTTGTAATCGTAGGACTT. O fragmento do gene ndoS49 foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e XhoI e ligado ao vector de expressão pGEX-5X-3 (Amersham Biosciences) usando DNA ligase de T4 (Fermentas) criando o plasmídeo pGEX-ndoS49. O vector de expressão foi usado para transformar E. coli Top 10 células quimicamente competentes e células recombinantes foram cultivadas em placas de carbenicilina a 100 ug / mL e rastreados por PCR utilizando os iniciadores ndoS49-F-BamHI e ndoS49- R-XhoI. Os clones positivos foram isolados e o plasmídeo pGEX-ndoS49 foi purificado e transformado em E. coli estirpe BL21 pLysS expressão como descrito acima.

[00175] Um clone recombinante foi crescido durante a noite a 37 ° C com os antibióticos e diluído 1: 20 em meio LB com antibióticos e cultivadas durante 3 h. A expressão da proteína EndoS49 foi induzida com IPTG 0,1 mM durante 3 h. As células foram colhidas e lisadas com Reagente de extracção BugBuster Proteína (Novagen). Recombinante GST-EndoS49 foi purificado em coluna com glutationa-Sepharose 4B (GE Healthcare) e eluída com glutationa reduzida. A mutagénese de EndoS49.

[00176] A mutagénese dirigida ao local do ácido glutâmico 186 (Glu-186) para a leucina (E186L) foi realizada utilizando II QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. O iniciador de mutagénese utilizado foi CTAGATATTGATATTCTTCACGAATTTACGAAC em combinação com o anti- sentido da sequência de cima e o plasmídeo pGEX-ndoS49 (mutação sublinhado). Isto gerou os plasmídeos pGEX-ndoS49 (El% 6V) e, após a sequenciação, EndoS49 recombinante (E186L) foi expressa e purificada como descrito por EndoS49.The versões truncadas de EndoS49 foram construídos por amplificação de partes do gene ndoS49 de NZ131 GÁS com primersndoS49 (truncl-5) que contém restrições locais BamHI e XhoI (Tabela 2). Os fragmentos foram digeridos e ligados no vector pGEX como descrito acima, e transformados em E. coli Top 10 e, subsequentemente, a BL21 pLysS e cultivadas com antibióticos. As proteínas foram produzidas como acima e as proteínas EndoS49 (truncl) de 80 kDa, EndoS49 (trunc2) de 70 kDa, EndoS49

(trunc3) de 60 kDa, EndoS49 (trunc4) de 50 kDa, EndoS49 (trunc5) de 42 kDa foram purificados. Glicoproteína ensaio hidrólise glicanos

[00177] 1 ug recombinante EndoS49and seus mutantes foram incubados com 3 ug de cada glicoproteína em 20 de PBS durante a noite a 37 ° C. Hidrólise glicano foi analisado num gel de 10% SDS- PAGE e depois analisadas com LCAlectin blot como descrito anteriormente (Collin e Olsen, 2001). Análise slot-blot

[00178] EndoS49 e seus mutantes foram imobilizadas sobre uma membrana de PVDF ativado metanol a 4, 2, 1 mg em PBS por slot utilizando Millipore equipamento ranhura blot. A membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado (Disco) durante 1 h à temperatura ambiente.

[00179] Lavar sempre foi realizado para 3x10 minutos em PBST. A membrana foi incubada com 10 ug de IgG humana (Sigma) em 0,5% de leite desnatado durante 1 hora a 37 ° C e depois lavou-se. 5 ug de peroxidase de rábano conjugado com proteína G (Invitrogen) foi adicionada à membrana e incubada durante 1 h a 37° C. Depois de lavar a membrana foi desenvolvida com Supersignal West Pico quimioluminescência do substrato (Thermo Scientific). Análise bioinformática

[00180] Os genes ndoS49 e NDOS foram traduzidas para EndoS49 e EndoS e comparados pelo algorithmin ClustalW dentro do MacVector software (MacVector Inc.). A árvore filogenética foi construída com MacVector usando sequências de proteínas do NCBI PubMed com os seguintes números de acesso: EndoS (AF296340), EndoE (AAR20477), EndoH (NP 631673), Endoc (ADC53484), EndoF2 (P36912), EndoF3 (P36913) ( Collin e Olsen, 200 lb) (Collin e Fischetti, 2004) (Tarentino e Plummer, 1974) (Tarentino et al., 1993). PCR de triagem para ndoS49

[00181] Primers amplificando o gene ndoS49 de GAS foram projetados e denotado ndoS49-F (AAAACGCGGACCACTATATGC) e ndoS49-R (AAACGTTGTCCGAGGATTTG). 42 amostras de gás foram propagadas em agar de sangue e cultivados durante a noite a 37 ° C com 5% de C0 2 . As colónias únicas foram colhidas e lisadas em 20 H estéril 2 0 a 99 ° C durante 10 minutos. Estes lisados foram utilizados como molde para uma reação de PCR para detectar rigorosa ndoS49 nas estirpes GÁS 42. Como um controlo positivo, os iniciadores para a amplificação do gene recA foram concebidos, recA-F (AGCCCTTGATGATGCTTTG) e recA-R (AACAATTCTGGGTGATCGG). Controles como positivo, tanto reações de PCR utilizado o DNA genômico de NZ131 tensão GAS (M49) e API (Ml) como modelo.

RESULTADOS Análise ClustalW revela duas enzimas diferentes: EndoS49 e EndoS

[00182] Os genes ndoS49 e NDOS estavam em silico traduzido em proteínas e comparados pelo ClustalWalgorithm. Ao nível do gene a identidade é de 50% e 37% em relação ao nível da proteína. A análise ClustalW revelou uma sequência de peptídeo de sinal (quase) idênticas e uma família conservada 18 glicosídeo hidro domínio lasecatalytic (DGLDIDIE) (Figura 1). Análise Experimental de EndoS demonstrou que triptofanos são essenciais para a atividade de hidrólise-glicano (Allhorn et al., 2008). Estes triptofanos também são conservados em EndoS49.EndoS49. Recombinantes mostram atividade hidrolisante glicano em glicoproteínas humanas

[00183] A 90 kDa EndoS49 foi com sucesso por via recombinante expressa em E. coli BL21 e purificada a partir da fracção solúvel utilizando o marcador GST. EndoS49 (E186L), um mutante catalítico com o ácido glutâmico do motivo GH18 (El 86) substituído por uma leucina (L), foi construída e purificada da mesma maneira. Para mapear a atividade da proteína, 5 versões truncadas carboxi-terminais das enzimas foram construídos e denotado EndoS49 (truncl) de 80 kDa, EndoS49 (trunc2) de 70 kDa, EndoS49 (trunc3) de 60 kDa, EndoS49 (trunc4) de 50 kDa e EndoS49 (trunc5) de 42 kDa. Esta colecção de enzimas foi utilizado para analisar a atividade de hidrólise de glicano EndoS49 em glicoproteínas humanas. Em primeiro lugar, as enzimas foram incubadas com IgG humana durante a noite e analisados num gel de SDS-PAGE e com ACV lectina blot, a detecção das estruturas de manose nos glicanos de IgG.O gel revelou um desvio de 4 kDa a cadeia pesada de IgG tratada com EndoS49 e o blot LCA lectina confirmou este deslocamento como uma falta de glicanos ligados a N (Figura 2A). EndoS49 (E186L) não mostrou nenhuma mudança e nenhuma mudança na composição glicanos sugerindo que E186 tem um papel crucial na atividade catalítica de EndoS49. No que diz respeito as enzimas truncadas, EndoS49 (truncl-4) mostrou uma atividade sobre os glicanos de IgG mas EndoS49 (trunc5), a mais pequena das enzimas (42 kDa), não revelou nenhuma atividade glicano Hidrólise (Figura 2A).

[00184] A análise adicional da desglicosilação IgG por EndoS49 foi realizado através da incubação de IgGi_ 4 com EndoS49 e EndoS49 (E 186L), durante a noite. As subclasses de IgG foram analisados como descrito acima e mostrou que EndoS49 tem atividade em todos os quatro subclasses de IgG, e em linha com os resultados anteriores, o mutante catalítico não revelou nenhuma atividade (Figura 2B). A incubação de recolha de enzimas com alfa-1-microglobulina, a proteína de soro humano glicosilada pesado, e a análise em SDS-PAGE mostrou a atividade de hidrólise de glicano EndoS49on desta glicoproteína (Figura 2C). Para elucidar ainda mais a especificidade da EndoS49, um substrato modelo consistindo de um N-acetil- beta-D-glucosaminida acoplado aos fluorescentes 4-methylumbelliferylwas incubadas com EndoS49 para 1, 2, 3, 4 e 16 horas e a fluorescência medidos. A fluorescência irá aumentar se o açúcar é clivada, mas foi observado nenhum aumento na intensidade (dados não mostrados), sugerindo que EndoS49 tem atividade apenas em substratos da glicoproteína. EndoS49 ligação à IgG

[00185] A constatação de que EndoS49 tem atividade hidrólise glicanos em IgG nos levou a acreditar que a enzima se liga IgG. Esta foi avaliada por meio de análise de mancha ranhura onde EndoS49 e seu mutante catalítico e versões truncadas foram imobilizadas sobre uma membrana de PVDF e incubadas com IgG e a ligação detectada com proteína G acoplada a peroxidase de rábano (HRP). A mancha de ranhura apresentam uma ligação aumentada a IgG pela EndoS49 mutante catalítico (E186L) (Figura 3). O ndoS49 gene está presente em sorotipo GAS M49

[00186] Para elucidar se ndoS49 está presente em todos os outros sorotipos do que M49 um rigoroso PCR foi implantado para analisar a presença do gene ndoS49 em uma seleção de cepas GÁS. Os iniciadores ndoS49-F e ndoS49-R foi utilizado numa PCR sobre os lisados das colónias GÁS juntamente com o controlo positivo de amplificar o gene recA, presente em todas as estirpes de GAS. O gene foi amplificado ndoS49 em todos os serotipos M49 gás selecionado e também de serotipo M60, enquanto nenhum outro serótipo deu um produto de PCR (Tabela 1).

[00187] Nos genomas sequenciados de estirpes GÁS NZ131 (M49) e MGAS5005 (Ml) dos genes circundantes ndoS49 e NDOS foram comparados revelando que os genes estão localizados no mesmo contexto genómico e que os genes circundantes são altamente conservados (Figura 4). O EndoS49 comprimento total foi comparado a uma seleção de endoglicosidases descritos anteriormente, EndoS, Endoc, EndoH, EndoE, EndoF2, EndoF3) e uma árvore filogenética foi reconstruída (Figura 5). Este revelou que a EndoS e Endoc são mais estreitamente relacionados do que EndoS e EndoS49 e que endoglicosidases de Streptococcus estão perto relacionado comparação com enzimas de outras bactérias.

Tabela 1. A presença de ndoS49 em uma seleção dos serotipos GAS Estirpe Serotipo ndoS49 recA 5448 M1 - + SF370 M1 - + ACN1 M1 - + ACN2 M2 - + ANC3 M3 - + 20224 M3 - + ACN4 M4 - + ACN5 M5 - + Manfredo M5 - + ACN6 M6 - + AP6 M6 - + ACN9 M9 - + ACN11 M11 - + ACN12 M12 - + ACN18 M18 - + ACN19 M19 - + ACN22 M22 - + ACN24 M24 - + ACN28 M28 - + NZ131 M49 + + 3487-05 M49 + + AW1 M49 + + AW2 M49 + + AW3 M49 + + AW4 M49 + + AW6 M49 + + AW7 M49 + +

AW8 M49 + + AW9 M49 + + AW10 M49 + + AW11 M49 + + AW12 M49 + + AW13 M49 + + ACN49 M49 + + AP49 M49 + + CS101 M49 + + AP53 M53 - + ALAB49 M53 - + ACN55 M55 - + ACN57 M57 - + ACN60 M60 + + AP74 M74 - +

Tabela 2. Os iniciadores utilizados neste trabalho Nome Sequência (5’-3’) iniciadores ndoS49-F- CTGTAAGGATCCAGGAGAAGACTG BamHI ndoS49-R-XhoI GAAACCTCGAGTCTTTGTAATCGTAGGACTT ndoS49(E186L) CTAGATATTGATATTCTTCACGAATTTACGAAC -F ndoS49(E186L) GTTCGTAAATTCGTGAAGAATATCAATATCTAG -R ndoS49(trunc1) ATTTCTCGAGCTGAAGACGTCCTTTAGCCACG -R-XhoI ndoS49(trunc2) TAAACTCGAGCCCCATCAGAAACATCTACTAAG

-R-XhoI ndoS49(trunc3) ATTTTCTCGAGGCATTATCAACATCATAATGACC -R-XhoI ndoS49(trunc4) TAAACTCGAGCCAGTCATGCCTACCATAACAAGCTCAG -R-XhoI C ndoS49(trunc5) ATTTCTCGAGCTGTCCAACTTGTTGAATG -R-XhoI ndoS49-F AAAACGCGGACCACTATATGC ndoS49-R AAACGTTGTCCGAGGATTTG recA-F AGCCCTTGATGATGCTTTG recA-R AACAATTCTGGGTGATCGG A sequência da proteína de EndoS49 NCBI Sequência de referência. Genoma NZ131: NC_011375.1 Sequência de gene ndoS49: NC_011375.1 Sequência de proteína EndoS49: YP 002.286.383,1 EndoS49 sequência de proteína:

MDKHLLVKRTLGCVCAATLMGAALATHHDSLNTVKAEEKTVQTG KTDQQVGAKLVQEIREGKRGPLYAGYFRTWHDRASTGIDGKQQHPENTMAE VPKEVDI LFVFHDHTASDSPFWSELKDSYVHKLHQQGTALVQTIGVNELNGRTGLSKDY PDTPEG NKALAAAIVKAFVTDRGVDGLDIDIEHEFTNKRTPEEDARALNVFKEIAQLIGKN GSD KSKLLIMDTTLSVENNPIFKGIAEDLDYLLRQYYGSQGGEAEVDTINSDWNQY QNYID ASQFMIGFSFFEESASKGNLWFDVNEYDPNNPEKGKDIEGTRAKKYAEWQPS TGGLKA GIFSYAIDRDGVAHVPSTYKNRTSTNLQRHEVDNISHTDYTVSRKLKTLMTEDK RYDV IDQKDIPDPALREQIIQQVGQYKGDLERYNKTLVLTGDKIQNLKGLEKLSKLQKL ELR QLSNVKEITPELLPESMKKDAELVMVGMTGLEKLNLSGLNRQTLDGIDVNSITH LTSF DISHNSLDLSEKSEDRKLLMTLMEQVSNHQKITVKNTAFENQKPKGYYPQTYD TKEGH YDVDNAEHDILTDFVFGTVTKRNTFIGDEEAFAIYKEGAVDGRQYVSKDYTYE AFRKD YKGYKVHLTASNLGETVTSKVTATTDETYLVDVSDGEKWHHMKLNIGSGAIM MENLA KGAKVIGTSGDFEQAKKIFDGEKSDRFFTWGQTNWIAFDLGEILAKEWRLFAE TNT EIKTDSSLNVAKGRLQILKDTTIDLEKMDIKNRKEYLSNDENWTDVAQMDDAKA IFNS

KLSNVLSRYWRFCVDGGASSYYPQYTELQILGQRLSNDVANTLKD Exemplo 2

[00188] Moléculas Monoclonais de Ig podem mostrar pequenas variações nos glicanos Fc e como consequência os glicanos Fc podem aparecer como uma piscina não homogênea de glicanos Fc. A grande maioria dos glicanos são idênticos, mas uma minoria pode mostrar estrutura variável de hidratos de carbono ou de composição. A variedade surge tanto a partir da origem da parte Fe, que pode ser humano, humanizado ou de outra espécie, e da escolha de uma linha celular de cultura de células e as condições de produção. Neste exemplo duas drogas bem conhecidas IgG base, Avastin e Erbitux, foram desglicosiladas ambos com EndoS e com EndoS49. As amostras foram incubadas com EndoS ou EndoS49 conforme estabelecido na Tabela abaixo.

Raia Amostra Erbitux Avastin EndoS EndoS49 ideS 100 µg 100 µg 0.1 mg/ml 0.1 mg/ml 1 µg (µl) (µl) 1 MW - - - - - padrão 2 - + 5 - + 3 - + 50 - + 4 - + - 5 + 5 - + - 50 + 6 - + - - + 7 + - 5 - + 8 + - 50 - + 9 + - - 5 + 10 + - - 50 + 11 + - - - + 12 MW - - - - - padrão

[00189] Os resultados são apresentados na Figura

6. Verificou-se que EndoS49 tem o potencial para clivar uma grande variedade de glicanos Fc de EndoS. Mesmo que a incubação tenha sido deixada durante a noite, a fim de minimizar o efeito de possíveis diferenças nas atividades enzimáticas da enzima EndoS não poderia totalmente deglicosilato glicanos Erbtux Fc.

[00190] No entanto EndoS49 mostra um perfil completo de desglicosilação e é, por conseguinte, a enzima mais favorável quando se trata de glicana perfis das imunoglobulinas.

Claims (9)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo isolado caracterizado por compreender: (a) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1; (b) uma variante da mesma possuindo, pelo menos, 95% de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 mais de pelo menos 810 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO:1 e possuindo a atividade endoglicosidase de uma polipeptídeo que consiste na sequência de um aminoácido da SEQ ID NO: 1.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato que consiste da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

3. Polinucleotídeo caracterizado por compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou reivindicação 2.

4. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender: (i) SEQ ID NO: 3 ou uma sequência complementar a esta; (ii) uma sequência que hibridiza sob condições rigorosas com a sequência definida em (i); (iii) uma sequência que é degenerada como resultado do código genético para uma sequência, tal como definida em (i) ou (ii); (iv) uma sequência possuindo pelo menos 60% de identidade com uma sequência tal como definida em (i), (ii) ou (iii); ou (v) um fragmento de qualquer uma das sequências (i), (ii), (iii) ou (iv), e que codifica um polipeptídeo contendo a atividade endoglicosidase, ou do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1.

5. Vector de expressão caracterizado por compreender um polinucleotídeo tal como definido na reivindicação 3 ou 4.

6. Método para a hidrólise de glicano de uma glicoproteína caracterizado por compreender a incubação da glicoproteína com um polipeptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2.

7. Método para avaliar o estado de glicosilação de uma glicoproteína caracterizado por compreender a incubação de uma glicoproteína com um polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, e analisando os produtos produzidos.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender: (a) o contato da glicoproteína com o referido polipeptídeo para a hidrólise de glicano da glicoproteína; (b) separar o glicano da proteína desglicosilada; (c) analisar a proteína de glicano e / ou desglicosilada produzida.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pela glicoproteina incluir um anticorpo de IgG ou um anticorpo monoclonal IgG.

FIGURA 1. Alinhamento Clustal IW de Endo S49 (NZ131) e EndoS (5005)

1/4

FIGURA 2.

Atividade Endo S49 IgG Mancha azul Mancha LCA Atividade Endo S49 sobre subclasses de IgG Mancha azul Mancha LCA Atividade Endo S49 Alfa-1-microglobulina (A1m) Mancha azul

FIGURA 3.

Ligação de Endo S49 a IgG FIGURA 4.

Similaridade: Similaridade: Similaridade: 50% Similaridade: Similaridade: 99% 98% 94% 99%

FIGURA 5. Árvore fitogenética de endoglicosidases

Método: Neighbor Joining; Bootstrap (10000 reps); tie quebra = sistemática Distância: Não corretos (“p”) Intervalos distribuidos proporcionalmente

FIGURA 6.