JP6076349B2

JP6076349B2 - ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のエンドグリコシダーゼ及びその使用方法

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Publication number: JP6076349B2
Application number: JP2014530196A
Authority: JP
Inventors: コリン、マティアス; オールホーン、マリア; シェーグレン、ヨナタン
Original assignee: ジェノビスエービー
Priority date: 2011-09-13
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2017-02-08
Anticipated expiration: 2032-09-12
Also published as: IN2014CN02163A; KR20140081813A; US9493752B2; MX347727B; SG11201400505YA; EP2756077B1; US20140302519A1; PL2756077T3; DK2756077T3; ZA201401840B; EA028490B8; MX2014002906A; GB201406321D0; JP2014531205A; ES2627334T3; CN103946377B; WO2013037824A1; AU2012307461B2; PT2756077T; EP2756077A1

Description

発明の分野
本発明は、新規エンドグリコシダーゼ、グリカン加水分解活性を欠如したその変異体（mutant）、及び糖タンパク質のグリカンを加水分解する方法におけるその使用に関する。

発明の背景
エンドグリコシダーゼS（EndoS）は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）の多数の血清型によって分泌され、IgG重鎖上の297番目のアスパラギン残基と結合した保存グリカンを加水分解することによって、天然IgGに対して特異的なエンドグリコシダーゼ活性を有する（Collin and Olsen, The EMBO Journal, 2001, 20 3046-3055）。EndoSは、天然IgGに対してユニークな特異性を有する、初めて知られた細菌酵素である。対照的に、他の公知のエンドグリコシダーゼの活性は、糖タンパク質基質の変性を必要とするか、又はそれにより強化される。

IgGなどの抗体は、基礎研究、並びに診断及び薬剤の開発において多くの適用を有する。これらの適用のいくつか、例えば、免疫組織化学、免疫測定法、腫瘍検出、放射線療法、抗体結合部位の結晶学的研究、免疫標的化などにおいては、IgG分子全体よりもFab断片を使用した方が便利である。Fab断片を使用する利点のいくつかは、Fab断片は細胞のFc受容体による影響を受けず又は抗原を沈殿させないこと、免疫原性の低下を示し食作用の影響を受けにくいこと、及び放射性標識Fab断片はIgG分子全体よりも組織から迅速に排除されることである。他の適用については、IgGのFc断片を使用することが望ましい。さらなる適用では、抗体又は他の糖タンパク質の脱グリコシル化体（version）を使用することが望ましい場合がある。

Fab断片及びFc断片へのIgGの切断は、ほとんどの場合、ペプシン又はパパインなどのタンパク質分解酵素を用いて実施される。これらの酵素は、多くの場合、他のタンパク質も切断するため、切断反応は一般に、精製したIgG画分に対して実施されなければならない。さらに、ペプシン及びパパインは、通常、2以上の部位でIgGを切断する。これは、得られた断片が、多くの場合、完全なFab断片又はFc断片に対応せず、たとえ切断によってFab断片及びFc断片がもたらされたとしても、通常、より小さな断片へとさらに切断されやすいことを意味する。Fab断片からのFc断片の単離は、ほとんどの場合、細菌のプロテインA及びGのFc結合特性を利用するプロテインA又はGアフィニティー分離カラムを用いて実施される。

多くの異なる糖タンパク質は、治療への適用に有用性がある。このようなタンパク質のグリコシル化を分析するための方法は、治療学としてタンパク質を研究・開発するのに有用性がある。また、これらのタンパク質の脱グリコシル化体を提供することが望ましい場合もある。

発明の要旨
本発明者らは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）の血清型M49から新規エンドグリコシダーゼ（本明細書において、EndoS49と称する）を同定した。EndoS49は、NZ131株（腎炎原性で形質転換性が高い血清型M49株）から単離した。NZ131株は、ニュージーランドにおける溶連菌感染後急性糸球体腎炎（acute post-streptococcal glomerulonephritis）症例からの臨床分離株である。タンパク質レベルでは、EndoS49はEndoSと40％未満の同一性を有し、EndoSが108 kDaであるのに対して、EndoS49は90 kDaのタンパク質である。EndoS49は、EndoSよりも広範囲のタンパク質に対して脱グリコシル化活性を有する。

該酵素は90 kDaの酵素であり、ファミリー18 グリコシドヒドロラーゼ触媒ドメインを有する。EndoS49は、ヒト糖タンパク質、特にIgG1〜4及びα-1-ミクログロブリン上のグリカンを加水分解する。EndoS49は、IgG及びα-1-ミクログロブリンを含むヒト糖タンパク質上のグリカンの加水分解に使用できる。従って、EndoS49は、該酵素を糖タンパク質と接触させ、生じた産物をグリカン及びタンパク質の分析のために分離するグリコプロファイリング（glycoprofiling）分析に使用できる。EndoS49はまた、脱グリコシル化タンパク質を調製するためにも使用できる。該酵素は、エンドグリコシダーゼ活性を低下又は除去するために改変（modified）できる。

エンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変EndoS49ポリペプチドは、グリコシル化され及び／又は機能的に活性なIgGを単離するための方法で使用できる。本発明者らは、このような改変EndoS49ポリペプチドを、変性及び／又は脱グリコシル化IgGに結合できる追加のIgG結合試薬と組み合わせて使用することにより、IgG含有サンプルのグリコシル化状態又は機能的品質を評価する方法も特定した。

従って、本発明によれば、
（a）配列番号1のアミノ酸配列、
（b）配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有し、エンドグリコシダーゼ活性を有する、そのバリアント（variant）、又は
（c）エンドグリコシダーゼ活性を有する、そのいずれかの断片
を含むポリペプチドを提供する。

本発明はまた、
（a）配列番号2のアミノ酸配列、
（b）配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有し、186位のグルタミン酸に相当するアミノ酸が置換されている、そのバリアント、又は
（c）そのいずれかの断片
を含む、IgGに結合でき、かつエンドグリコシダーゼ活性を有さないポリペプチドも提供する。

本発明はまた、本発明のポリペプチドをコード又は発現する、ポリヌクレオチド、発現ベクター及び宿主細胞も提供する。本発明はまた、タンパク質、特に抗体、特にIgG抗体のグリコシル化状態を決定又は分析する方法における本発明のポリペプチドの使用にも関する。

本発明はまた、IgG含有サンプルからIgGを単離する方法であって、
（a）前記IgG含有サンプルを、IgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変EndoS49ポリペプチドと接触させる工程、
（b）接触させたサンプルから前記EndoS49を分離する工程
を含み、それにより単離されたIgGを得る方法を提供する。

さらに、IgG含有サンプルのグリコシル化状態又は機能的品質を評価する方法であって、IgG含有サンプルから第1及び第2のサブサンプルを得ることを含み、ここで、該第1のサブサンプルに、上記方法の工程（a）及び（b）を適用し、かつ該第2のサブサンプルに、EndoS49ポリペプチドを、変性及び／又は脱グリコシル化IgGに結合できる代替IgG結合試薬に置き換えることを除いて上記方法の工程（a）及び（b）を適用し、さらに
（c）該第1のサブサンプルにおけるEndoS49ポリペプチドに結合したIgGの量及び該第2のサブサンプルにおける代替IgG結合試薬に結合したIgGの量を定量する工程、及び
（d）（c）で測定した両方の結合IgG量を比較する工程
を含み、それによりIgG含有サンプルのグリコシル化状態又は機能的品質を評価する方法を提供する。

本発明の改変酵素はまた、IgGのFab断片又はFc断片を単離するための方法にも使用されてよい。本発明の方法は、S. ピオゲネス（S. pyogenes）由来の高特異的IgG切断酵素、IdeS（S. ピオゲネスの免疫グロブリンG分解酵素、Immunoglobulin G-degrading enzymes of S. pyogenes）及びEndoS49ポリペプチドを利用する。

本発明の一方法では、IgG含有サンプルをIdeS及びEndoS49ポリペプチド（上述のエンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変EndoS49ポリペプチドである）と接触させる。

本発明の方法では、通常、IdeSがIgGをFab断片及びFc断片へと切断し、EndoS49ポリペプチドがFc断片に結合する。次いで、Fc断片をFab断片から分離する。

この方法は、精製IgGを含むサンプルからFab断片又はFc断片を単離するのに特に有用である。より具体的には、本発明の改変EndoS49ポリペプチドを用いて精製されたIgGを含むサンプルからFab断片又はFc断片を単離するのに有用である。しかし、この方法はまた、未精製IgGを含有するサンプル、例えば、血清、細胞溶解物又は細胞培養培地に使用するために適合させることもできる。

本発明の方法を実施するためのキットも提供する。

EndoS49とEndoSとのClustalWアライメントにより、2つの異なるタンパク質を明らかにする。MacVectorソフトウェアのClustalWを用いて、EndoS49とEndoSとをアライメントした。触媒残基としてGlu186を有する179〜186位にGH18触媒モチーフ（D**D*D*E）が存在する。 EndoS49は糖タンパク質に対して活性を有する。図2A. 1 μgのEndoS49、その触媒変異体及び切断型をPBS中、3 μgのヒトIgGとともに、37℃で一晩インキュベートし、SDS-PAGEゲル及びLCAレクチンブロットで分析した。図2B. 1 μgのEndoS49及びEndoS49（E186L）を、3 μgのヒトIgGサブクラス1〜4とともにインキュベートし、上記のように分析した。図2C. 1 μgのEndoS49及びその変異体を、3 μgのα-1-ミクログロブリンとともにインキュベートし、10％ SDS-PAGEゲルで分析した。 EndoS49はIgGと結合する。4、2及び1 μgのEndoS49及びその変異体をPVDFメンブレン上に固定し、ヒトIgGとともにインキュベートした後、HRP結合プロテインGとともにインキュベートした。 ndoS49及びndoSのゲノムコンテキスト（genomic context）。GAS株NZ131（M49）及び5005（M1）におけるndoS49及びndoSの周辺遺伝子の比較をMacVectorで実施した。 EndoS49及び他の細菌エンドグリコシダーゼの系統発生分析。 EndoS又はEndoS49で消化し、それに続いてIdeSで消化した後のアバスチン（Avastin）及びアービタックス（Erbitux）のSDS-PAGEゲル。

配列の簡単な説明
配列番号1は、S. ピオゲネス血清型M49のNZ131から単離されたEndoS49ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号2は、配列番号1の配列に由来する改変EndoS49ポリペプチド（E186L）のアミノ酸配列である。
配列番号3は、EndoS49ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号4は、S. ピオゲネスAP1から単離されたIdeSのアミノ酸配列である。

発明の詳細な説明
［一般的なポリペプチド特性］
本発明は、新規ポリペプチドEndoS49に関する。本発明はまた、細菌タンパク質EndoS49及びIdeS、並びに他のタンパク質を利用する様々な方法を提供する。タンパク質、ペプチド及びポリペプチドという用語は、本明細書では交換可能に使用する。本発明の特定のポリペプチド及び方法が、エンドグリコシダーゼ活性を有するEndoS49ポリペプチドを必要とする一方、本発明の他のポリペプチド及び方法は、前記活性を欠如した改変EndoS49ポリペプチドを必要とすることが理解されよう。

以下のセクションは、本発明のすべてのポリペプチドの一般的な特性に関し、特に、本発明のポリペプチド内に含まれるアミノ酸配列の変化、改変（alteration）、修飾（modification）又は誘導体化に関する。本明細書に記載するようなポリペプチドの変化、改変、修飾又は誘導体化は、ポリペプチドが、本開示の以下のセクションで詳述され得る、任意のさらに必要な活性又は特性を保持するという要件を受けることが理解されよう。

本発明のポリペプチドのバリアントは、本開示の以下のセクションでより詳細に記載する特定レベルのアミノ酸同一性により定義されてよい。アミノ酸同一性は、任意の適切なアルゴリズムを使用して計算されてよい。例えば、PILEUP及びBLASTアルゴリズムを使用して、例えば、Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されるように、相同性又は整列配列（line up sequences）を計算することができる（例えば、（通常、初期設定において）同等又は対応する配列を同定するなど）。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、あるポジティブに評価された閾値スコアTと合致するか、又はそれを満たす問合わせ配列中の長さWの短いワードを同定することによって、ハイスコアリングシーケンスペア（high scoring sequence pair）（HSP）を最初に同定することを伴う。Tは、近傍ワードスコア閾値（neighbourhood word score threshold）と称される（Altschul et al、前述）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含有するHSPを見出すために検索を開始するための種（seed）として働く。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。各方向におけるワードヒットの延長は、以下の場合に停止される：累積アライメントスコアがその最大限に達成された値から量Xだけ低下する場合、1以上のネガティブのスコアリング残基アライメントの累積によって累積スコアが0以下になる場合、又はいずれかの配列の末端に達する場合。BLASTアルゴリズムのパラメーターW、T及びXはアライメントの感度及び速度を決定する。BLASTプログラムは、初期設定として、ワード長（W）11、BLOSUM62スコアリングマトリクス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919を参照）アライメント（B）50、期待値（E）10、M＝5、N＝4及び両鎖の比較を用いる。

BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計学的分析を実施する；例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787参照。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の一つは、2つのポリヌクレオチド配列間又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標となる最小合計確率（smallest sum probability）（P（N））である。例えば、第1の配列を第2の配列と比較して、最小合計確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満の場合、その配列はもう1つの配列と類似であると考えられる。あるいは、UWGCGパッケージは、相同性を計算するために使用できるBESTFITプログラムを提供する（例えば、初期設定で使用する）（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395）。

本発明のポリペプチドのバリアントには、置換バリアントも含まれることが理解されよう。置換バリアントは、好ましくは、1以上のアミノ酸を同数のアミノ酸と交換すること、及び保存的アミノ酸置換を行うことを伴う。例えば、アミノ酸は、類似の特性を有する別のアミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸又は別の脂肪族アミノ酸で置換されてよい。適切な置換基を選択するために使用できる20個の主要なアミノ酸のいくつかの特性は以下の通りである。

本発明のポリペプチド及び本発明で使用するためのポリペプチドは、実質的に単離された形態であってよい。ポリペプチドは、ポリペプチドの企図する目的を妨害しない担体又は希釈剤と混合されてよいことが理解され、それでも実質的に単離されていると考えられよう。本発明で使用するためのポリペプチドは、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、一般的にポリペプチドは調製物中に含まれ、調製物中のポリペプチドの50重量％超、例えば、80重量％超、90重量％超、95重量％超又は99重量％超が本発明のポリペプチドである。

本発明のポリペプチドのアミノ酸配列及び本発明で使用するためのポリペプチドのアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むように、又は化合物の安定性を増大させるように改変されてよい。ポリペプチドが合成手段によって製造される場合、かかるアミノ酸は製造の間に導入されてよい。ポリペプチドはまた、合成的又は組換えによる製造のいずれかの後に改変されてよい。

本発明のポリペプチド又は本発明で使用するポリペプチドはまた、D-アミノ酸を使用して製造されてよい。このような場合、アミノ酸はCからN方向の逆配列に結合される。これは、このようなポリペプチドを製造するために当分野で一般的である。

多くの側鎖の改変は、当分野で公知であり、該ポリペプチドの側鎖に行われてよく、本明細書で詳述され得るような任意のさらに必要な活性又は特性を保持するポリペプチドに行われてよい。

本発明のポリペプチド及び本発明で使用するポリペプチドは、化学的に改変されてよく、例えば、翻訳後に改変されてよいことが理解されよう。例えば、該ポリペプチドは、グリコシル化、リン酸化されてよく、あるいは改変したアミノ酸残基を含んでよい。該ポリペプチドは、細胞膜への挿入を促進するためのシグナル配列の添加によって改変されてよい。

本発明のポリペプチドはまた、単離又は精製を助けるために誘導体化又は改変されてよい。従って、本発明の一実施態様において、本発明で使用するためのポリペプチドは、分離手段に直接的かつ特異的に結合できるリガンドを添加することによって、誘導体化又は改変される。あるいは、該ポリペプチドは、結合対の1つの構成要素を添加することによって誘導体化又は改変され、分離手段は結合対の他方の構成要素を添加することによって誘導体化又は改変された試薬を含む。任意の適切な結合対を使用できる。本発明で使用するためのポリペプチドが結合対の1つの構成要素を添加することによって誘導体化又は改変される好ましい実施態様では、該ポリペプチドはヒスチジンタグ又はビオチンタグを付けられることが好ましい。通常、ヒスチジンタグ又はビオチンタグのアミノ酸コード配列は、遺伝子レベルで含まれ、タンパク質はE. coliにおいて組換えによって発現される。ヒスチジンタグ又はビオチンタグは、通常、ポリペプチドの1つの末端、N末端又はC末端のいずれかに存在する。ヒスチジンタグは、通常、6個のヒスチジン残基からなるが、それよりも長く、通常、7、8、9、10又は20個までのアミノ酸であり得、又はそれよりも短く、例えば、5、4、3、2又は1個のアミノ酸でもあり得る。さらに、ヒスチジンタグは、1個以上のアミノ酸置換、好ましくは上記で定義したような保存的置換を含有してよい。

［エンドグリコシダーゼ活性を有するEndoS49ポリペプチド］
この場合のEndoS49ポリペプチドは、好ましくは、S. ピオゲネス（S. pyogenes） EndoS49、又はS. ピオゲネス EndoS49のバリアント若しくは断片であってエンドグリコシダーゼ活性を保持するものである。バリアントは、別のストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）、又は好ましくはストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のEndoS49ポリペプチドであってよい。

EndoS49ポリペプチドは、
（a）配列番号1のアミノ酸配列、
（b）配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有し、エンドグリコシダーゼ活性を有する、そのバリアント、又は
（c）エンドグリコシダーゼ活性を有する、そのいずれかの断片
を含んでよい。

好ましくは、ポリペプチドは、配列番号1の配列を含むか、又はそれからなる。配列番号1は、S. ピオゲネス由来のEndoS49の配列である。本発明のEndoS49ポリペプチドは、さらにシグナル配列を含まなくてよい。

このセクションに記載するようなバリアントポリペプチドは、そのアミノ酸配列は配列番号1のものとは異なるものの、EndoS49のエンドグリコシダーゼ活性を保持するものである。このようなバリアントは、ペプチドがIgGエンドグリコシダーゼ活性を維持する限り、アレルバリアント、及びタンパク質配列内に単一アミノ酸又はアミノ酸群の欠失、修飾（modification）又は付加を含んでよい。

バリアント配列は、通常、少なくとも1、2、3、5、10、20、30、50、100個又はそれ以上の変異（アミノ酸の置換、欠失又は挿入であってよい）によって異なる。例えば、改変したポリペプチドがIgG特異的エンドグリコシダーゼとしての活性を保持するならば、1〜100個、2〜50個、3〜30個又は5〜20個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を行ってよい。

配列番号1のアミノ酸配列のバリアントは、好ましくは、配列番号1の残基179〜186を含有し、特にモチーフD**D*D*Eを含む。これらのアミノ酸は、ファミリー18 グリコシドヒドロラーゼ触媒ドメインを構成する。186位のグルタミン酸は、酵素活性に不可欠である。従って、最も好ましくは、配列番号1のバリアントは、配列番号1の186位と同等の位置にグルタミン酸を含有する。配列番号1のバリアントが、配列番号1の186位と同等の位置にグルタミン酸を含有するならば、該バリアントは、1個以上の保存的置換を有する、配列番号1の残基179〜186を含有してよい。

通常、EndoS49のエンドグリコシダーゼ活性を示し、配列番号1のアミノ酸配列と約50％超、55％超又は65％超の同一性、好ましくは少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、少なくとも97％又は少なくとも99％の同一性を有するポリペプチドは、そのタンパク質のバリアントと考えられる。配列番号1のバリアントの同一性は、配列番号1で示された配列の少なくとも100個、少なくとも250個、少なくとも500個、少なくとも750個、少なくとも800個、少なくとも810個、少なくとも820個、少なくとも930個、少なくとも940個又はそれ以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、より好ましくは配列番号1の全長にわたって測定されてよい。

本発明で使用するEndoS49ポリペプチドの断片は、通常、EndoSのIgGエンドグリコシダーゼ活性を保持する限り、少なくとも400、500、600、700、750、800又は825個のアミノ酸長である。好ましくは、本発明で使用するEndoS49ポリペプチドの断片は、配列番号1の残基179〜186を包含する。

本発明で使用するためのポリペプチドは、EndoS49ポリペプチド又はEndoS49ポリペプチドのバリアントを発現する任意の適切な生物から単離されてよい。通常、EndoS49ポリペプチドは、ストレプトコッカス（Streptococcus）の適切なEndoS49発現株、好ましくはS. ピオゲネス株、特に血清型M49のものから単離される。

発現しているS. ピオゲネス培養物、又はEndoS49を発現している他の細胞の培養物からのEndoS49の単離及び精製は、通常、エンドグリコシダーゼ活性に基づいている。好ましくは、精製方法は、硫酸アンモニウム沈殿工程及びイオン交換クロマトグラフィー工程を伴う。一方法によれば、培養培地を、増加量の硫酸アンモニウムを添加することにより分画する。硫酸アンモニウムの量は、10〜80％であってよい。好ましくは、培養培地を50％硫酸アンモニウムで分画し、得られた上清を70％硫酸アンモニウムでさらに沈殿させる。次いで、ペレット化したポリペプチドをイオン交換クロマトグラフィー、例えば、Mono QカラムでのFPLCに供してよい。溶出した画分について、エンドグリコシダーゼ活性の測定を行ってよく、ピーク活性画分を収集してよい。画分は、SDS-PAGEによって分析してよい。画分は-80℃で保存してよい。

本発明で使用するためのポリペプチドは、このように単離したポリペプチドの断片として調製されてもよい。さらに、EndoS49ポリペプチドは、合成的に、又は組換え手段によって製造されてもよい。例えば、組換えEndoS49ポリペプチドは、適切なコントロール配列に作動可能に連結された、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで培養哺乳動物細胞をトランスフェクトし、細胞を培養し、細胞によって産生されたEndoS49ポリペプチドを抽出し、精製することによって製造されてよい。

このセクションに記載した本発明のEndoS49ポリペプチドは、エンドグリコシダーゼ活性を示す。好ましくは、ポリペプチドは、完全長IgG重鎖ポリペプチドの結合グリカンを加水分解することによって、IgG又はIgG Fc断片を加水分解する。好ましくは、本発明のEndoS49ポリペプチドはまた、エンドグリコシダーゼ活性を有し、α-1-ミクログロブリンのグリカン加水分解が可能である。

エンドグリコシダーゼ活性は、適切なアッセイによって測定されてよい。例えば、試験ポリペプチドをIgGやα-1-ミクログロブリンなどの糖タンパク質とともに適切な温度、例えば37℃でインキュベートしてよい。次いで、開始物質（starting material）及び反応産物をSDS-PAGEによって分析してよい。通常、試験ポリペプチドがIgGエンドグリコシダーゼ活性を有するならば、IgG重鎖の分子量はおよそ3 kDa〜4 kDa減少する。試験ポリペプチドがIgGエンドグリコシダーゼ活性を有するかどうかを測定するための別のアッセイは、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ基質を任意選択で用いてよい、レンズマメアグルチニンレクチン（Lens culinaris agglutinin lectin：LCA）を使用したグリコシル化IgGの検出による。通常、試験ポリペプドがIgGエンドグリコシダーゼ活性を有するならば、炭水化物シグナルが減少する。試験ポリペプチドがIgGエンドグリコシダーゼ活性を有するかどうかを測定するための別のアッセイは、試験ポリペプチドを精製IgG Fc断片とともにインキュベートし、それに続いて、10 mMのジチオトレイトール（dithiotreitol）でサンプルを還元し、質量分析（MALDI-TOF）で解析することによる。エンドグリコシダーゼ活性は、上記アッセイのIgGの代わりにα-1-ミクログロブリンを用いることにより、EndoS49ポリペプチドについて測定し得る。

ポリペプチドのエンドグリコシダーゼ活性は、阻害研究（inhibition studies）によってさらに特徴付けることができる。

EndoS49ポリペプチドは、対象から採取したサンプル中に存在する糖タンパク質分子を加水分解することができる。従って、対象がヒトである場合、EndoS49ポリペプチドは、ヒトIgG重鎖やα-1-ミクログロブリンなどの対象の糖タンパク質におけるグリカンを加水分解することができる。EndoS49は、ヒトIgGの4種のサブクラス（IgG_1〜4）すべてを加水分解することができる。好ましい実施態様において、EndoS49ポリペプチドは、ヒトIgG及びα-1-ミクログロブリンを加水分解する能力を有する。

［エンドグリコシダーゼ活性を欠如したEndoS49ポリペプチド］
この場合のEndoS49ポリペプチドは、エンドグリコシダーゼ活性を欠如するように操作されているがIgG結合活性を有する、改変S. ピオゲネス EndoS49であってよい。このような改変EndoS49は、本明細書に記載の方法において特に有用である。IgG結合活性によって、改変EndoS49は、IgG又はそのバリアント若しくは断片、特にそのFc断片（正常にグリコシル化されている）に結合することが理解されよう。「正常にグリコシル化される（normally glycosylated）」により、IgG分子又はその断片のバリアントが、天然に存在するIgG分子への結合で見られるように、少なくとも1つの炭水化物基が結合したIgGポリペプチド重鎖（又はその断片のバリアント）を少なくとも含む糖タンパク質であることが理解されよう。特に、少なくとも1つの炭水化物基は、全長IgG重鎖ポリペプチドの残基297に対応するアスパラギン残基に結合するグリカンである。

EndoS49ポリペプチドは、好ましくは、部位特異的変異誘発によって操作される。IgG結合活性により、このセクションに記載のEndoS49ポリペプチドは、IgGサブクラスIgG_1〜4の少なくとも1種、好ましくは2種、3種又は4種すべてに結合することが理解されよう。好ましくは、少なくとも1種のIgGサブクラスに、高い親和性及び／又は高い特異性で結合する。

高い親和性とは、改変EndoS49とIgGサブクラスとの相互作用についての結合親和定数（binding affinity constant）（K_D）が、0.05 μM超、好ましくは0.06 μM超、0.07 μM超又は0.08 μM超であることを意味する。結合活性は測定されてよく、結合親和性は、任意の適切な手段によって評価されてよい。例えば、表面プラズモン共鳴相互作用解析、平衡透析分析、又は、例えば、スキャッチャード分析と併用した任意の標準的生化学的方法による。

この場合のバリアントは、エンドグリコシダーゼ活性を欠如しているがIgG結合活性を有することを除いて、先のセクションで記載されるように、別の生物、例えば、別の細菌などのEndoS49ポリペプチドに由来してよい。改変EndoS49ポリペプチドは、
（a）配列番号2のアミノ酸配列、
（b）配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有し、エンドグリコシダーゼ活性を欠如したそのバリアント、又は
（c）エンドグリコシダーゼ活性を欠如したそのいずれかの断片
を含んでよい。

好ましくは、ポリペプチドは、配列番号2の配列を含むか、又はそれからなる。配列番号2は、配列番号1の配列に由来するが、配列番号1の186位のグルタミン酸（E）をロイシン（L）に置換することによってエンドグリコシダーゼ活性を欠如するように操作されている。このようなポリペプチドは、通常、上記のようにIgG結合活性を有する。

このセクションに記載するようなバリアントポリペプチドは、そのアミノ酸配列は配列番号2のものとは異なるものの、エンドグリコシダーゼ活性を欠如しIgG結合活性を保持するものである。このようなバリアントは、ペプチドが上記の特性を維持する限り、アレルバリアント、及びタンパク質配列内の単一アミノ酸又はアミノ酸群の欠失、修飾又は付加を含んでよい。

バリアント配列は、通常、少なくとも1、2、3、5、10、20、30、50、100個又はそれ以上の変異（アミノ酸の置換、欠失又は挿入であってよい）によって異なる。例えば、改変したポリペプチドがエンドグリコシダーゼ活性を欠如し、IgG結合活性を保持するならば、1〜100個、2〜50個、3〜30個又は5個〜20個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を行ってよい。

通常、エンドグリコシダーゼ活性を欠如し、IgG結合活性を保持し、配列番号2のアミノ酸配列と約50％超、55％超又は65％超の同一性、好ましくは少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、少なくとも97％又は少なくとも99％の同一性を有するポリペプチドは、そのタンパク質のバリアントと考えられる。配列番号2のバリアントの同一性は、配列番号2で示された配列の少なくとも100個、少なくとも250個、少なくとも500個、少なくとも750個、少なくとも800個、少なくとも820個、少なくとも830個又はそれ以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、より好ましくは配列番号2の全長にわたって測定されてよい。

本発明で使用するEndoS49ポリペプチドの断片は、通常、エンドグリコシダーゼ活性を欠如しIgG結合活性を保持する限り、少なくとも300、400、500、600、700、750、800又は830個のアミノ酸長である。

別法において、所望の特性を有するEndoS49タンパク質は、EndoS49タンパク質をコードするヌクレオチドを改変（alter）し、次いで適切な系で該ヌクレオチドを発現させることにより製造することができる。適切な方法には、タンパク質をコードするヌクレオチドの部位特異的変異誘発が含まれる。この技術は、タンパク質機能の研究で広く使用されている。この技術は、通常、オリゴヌクレオチドに基づいており、以下の工程を伴う：
（1）対象タンパク質をコードするDNAをプラスミドベクターにクローニングする工程、
（2）プラスミドDNAを変性させて、1本鎖を生成する工程、
（3）合成オリゴヌクレオチドが標的領域にアニールするように、標的配列に相補的であるが所望の変異（1以上）（点突然変異、欠失又は挿入）を組み込んだ合成オリゴヌクレオチド（単数又は複数）を変性DNAと接触させる工程、
（4）鋳型としてプラスミドDNA鎖を使用して、DNAポリメラーゼにより変異鎖を伸長する工程、
（5）E. coliにおける形質転換によりヘテロ2本鎖（変異／非変異鎖）を増殖させる工程。

増殖後、生成したヘテロ2本鎖のうち約50％は変異型であり、その他の50％は「野生型」（変異なし）である。変異型の生成に都合の良いように、選択及び濃縮方法を使用する。例えば、未変異の親鎖は、メチル化DNAのみを消化する制限酵素（DpnI）で消化することができる。新たに合成された鎖はメチル化されていない一方、親鎖は（正しいE. coliバックグラウンドから精製されたならば）メチル化されているので、これにより、E. coliの形質転換前に反応から親鎖を除去することが可能である。

部位特異的変異誘発の代替法には、
（1）特異的変異プライマー（specific mutagenic primer）を使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づく方法、又はエラープローンPCRと、その後、所望の変異又はタンパク質機能の欠如／獲得についてスクリーニングする方法、
（2）対象遺伝子を有するプラスミドをE. coliミューテーター株（DNA校正系を欠如している）に導入し、その後、所望の変異又はタンパク質機能の欠如／獲得についてスクリーニングする方法、
（3）所望の変異を含有する部分的遺伝子又は完全な遺伝子を化学的に合成し、その後、適切なタンパク質発現系へ導入する方法
が含まれる。

あるいは、所望の特性を有するEndoS49タンパク質は、所望の変異を有するポリペプチドの一部を化学的に合成することを含む、DNAに依存しない方法によって製造することができる。

EndoS49ポリペプチドは、対象から採取したサンプル中に存在するIgG分子に結合できる。従って、対象がヒトである場合、EndoS49ポリペプチドは、ヒトIgGに結合できる。EndoS49は、ヒトIgGの4種のサブクラス（IgG_1〜4）すべてに結合できる。

［ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞］
本発明はまた、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び医薬におけるその使用にも関する。特に、本発明は、
（a）配列番号3のコード配列又はその相補的配列、
（b）（a）で定義する配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列、
（c）（a）又は（b）で定義する配列に対する遺伝暗号の結果として縮重する配列、
（d）（a）、（b）又は（c）で定義する配列と少なくとも60％の同一性を有する配列、及び
（e）上記配列の断片
を含むか、又はそれからなるポリヌクレオチドに関する。

通常、ポリヌクレオチドはDNAである。しかし、本発明は、RNAポリヌクレオチドを含んでよい。ポリヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖であってよく、それらの中に合成又は修飾ヌクレオチド（modified nucleotide）を含んでよい。

本発明のポリヌクレオチドは、バックグラウンドを有意に超えるレベルで、配列番号3のコード配列又は該コード配列の相補体にハイブリダイズし得る。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、DNAライブラリー中に存在する他のDNAに起因して、生じ得る。本発明のポリヌクレオチドと、配列番号3のコード配列又は該コード配列の相補体との相互作用により生じたシグナルレベルは、通常、他のポリヌクレオチドと配列番号3のコード配列との相互作用の少なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍強いものである。相互作用の強度は、プローブを例えば³²Pで放射性標識することにより測定されてよい。選択的ハイブリダイゼーションは、通常、中等度ないしは高いストリンジェンシーの条件を用いることにより達成されてよい。しかし、そのようなハイブリダイゼーションは、当分野で公知の任意の適切な条件下で行われてよい（Sambrookら, 1989を参照）。例えば、高いストリンジェンシーが要求される場合には、適切な条件は、60℃〜最大65℃で0.1〜0.2×SSCを含む。低いストリンジェンシーが要求される場合には、適切な条件は60℃で2×SSCを含む。

配列番号3のコード配列は、ヌクレオチドの置換、例えば、1、2又は3個〜10、25、50又は100個の置換により改変されてよい。その代わりに又はそれに加えて、配列番号3のポリヌクレオチドは、1以上の挿入及び／若しくは欠失により、並びに／又は一方若しくは両方の末端での伸長により改変されてよい。シグナル配列などの追加の配列を含んでもよい。該改変ポリヌクレオチドは、通常、エンドグリコシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。あるいは、ポリヌクレオチドは、EndoS49ポリペプチドのエピトープ部分をコードする。縮重置換を施してよく、かつ／又は該改変配列が翻訳された場合に保存的アミノ酸置換（例えば上記表に示されるように）が生じる置換を施してよい。

配列番号3のDNAコード配列の相補体に選択的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列は、通常、配列番号3の少なくとも20、好ましくは少なくとも30、例えば少なくとも40、少なくとも60、より好ましくは少なくとも100個の連続したヌクレオチドの領域にわたり、又は最も好ましくは配列番号3の全長にわたり、配列番号3のコード配列と少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は少なくとも99％の配列同一性を有する。配列同一性又は類似性を計算するための方法は、本発明のポリペプチドに関連して上記でより詳細に記載する。

上記の配列同一性の程度と最小サイズとの任意の組み合わせを用いて、本発明のポリヌクレオチドを定義してよく、より厳密な組合せ（すなわち、より長い長さにわたる、より高い配列同一性）が好ましい。従って、例えば、25ヌクレオチド、好ましくは30ヌクレオチドにわたって少なくとも90％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが本発明の一側面を構成し、40ヌクレオチドにわたって少なくとも95％の配列同一性を有するポリヌクレオチドについても同様である。

ポリヌクレオチド断片、例えば、プローブ又はプライマーとしての使用に適したものなどは、好ましくは、少なくとも10、好ましくは少なくとも15又は少なくとも20、例えば、少なくとも25、少なくとも30又は少なくとも40ヌクレオチド長であろう。それらは、通常、最大で40、50、60、70、100又は150ヌクレオチド長であろう。プローブ及び断片は、150ヌクレオチド長よりも長いものでもあり得、例えば、最大で200、300、400、500、600、700ヌクレオチド長、又はさらには配列番号3のコード配列よりも最大で数個のヌクレオチド（例えば、5又は10ヌクレオチド）短いものであり得る。

本発明のポリヌクレオチドは、組換えにより、合成により、又は当業者に利用可能な任意の手段により製造されてよい。それらは、標準的な技術によりクローニングされてよい。ポリヌクレオチドは、通常、単離及び／又は精製された形態で提供される。

一般に、プライマーは、所望の核酸配列を1ヌクレオチドずつ段階的に製造することを伴う、合成手段によって製造される。自動化技術を用いてこれを達成するための技術は、当分野で容易に利用可能である。

より長いポリヌクレオチドは、通常、組換え手段を用いて、例えば、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて製造される。これは、クローン化を所望するndoS49遺伝子領域に対するプライマー対（例えば、約15〜30ヌクレオチドのもの）を作製し、細菌細胞から得られたDNAとプライマーを接触させ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅された断片を単離し（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することにより）、増幅されたDNAを回収することを伴う。プライマーは、増幅されたDNAを適切なクローニングベクター中にクローニングできるように、適切な制限酵素認識部位を含むよう設計してよい。

一般に、本明細書に記載の技術は、当分野で周知であるものの、特にSambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989に言及してよい。

本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの製造に有用性があり、これはin vitroで行われてよい。本発明のポリヌクレオチドは、プライマーとして、例えば、PCRプライマー、代替の増幅反応のプライマーなど、プローブとして、例えば、放射性又は非放射性標識を用いて常法により提示標識（revealing label）で標識されたものなどとして使用されてよく、あるいは該ポリヌクレオチドはベクターにクローニングされてよい。

本発明のポリヌクレオチド又はプライマーは、提示標識を有してよい。適切な標識には、³²P若しくは³⁵Sのようなラジオアイソトープ、酵素標識、又はビオチンなどの他のタンパク質標識が含まれる。このような標識は、本発明のポリヌクレオチド又はプライマーに付加されてよく、自体公知の技術を用いて検出されてよい。

標識又は非標識の、本発明のポリヌクレオチド若しくはプライマー、又はその断片は、サンプル中のndoS49を検出又はシーケンシングするための核酸に基づく試験において、当業者により使用されてよい。

検出のためのこのような試験は、通常、DNA又はRNAを含むサンプルを、本発明のポリヌクレオチド又はプライマーを含むプローブとハイブリダイズ条件下で接触させ、サンプル中、プローブと核酸との間で形成されたいずれかの二本鎖を検出することを含む。このような検出は、PCRなどの技術を用いて達成されてよく、又は固体支持体上にプローブを固定し、プローブにハイブリダイズしていないサンプル中の核酸を除去し、次いでプローブにハイブリダイズしている核酸を検出することにより達成されてよい。あるいは、サンプル核酸を固体支持体上に固定してよく、かかる支持体に結合したプローブの量を検出することができる。

本発明のプローブは、適切な容器中、テストキットの形態で都合よく包装されてよい。このようなキット中、キットが設計されるアッセイフォーマットが、プローブと固体支持体との結合を必要とする場合には、プローブは固体支持体と結合されてよい。キットはまた、プローブされるサンプルを処理し、サンプル中、プローブと核酸をハイブリダイズするために適切な試薬、コントロール試薬、指示書などを含有してよい。

本発明のポリヌクレオチドは、組換え複製可能なベクター中に組み込まれてよい。該ベクターを用いて、適合する宿主細胞中で核酸を複製してよい。従って、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入し、該ベクターを適合する宿主細胞に導入し、ベクターの複製がもたらされる条件下、宿主細胞を増殖させることにより製造されてよい。

好ましくは、ベクターは、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターである。このような発現ベクターは、分子生物学の分野でルーチンに構築されており、例えば、プラスミドDNA、並びに適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー及び他の要素（タンパク質発現を可能にするために、必要に応じて、正しい方向で配置される）の使用を伴ってよい。他の適切なベクターは、当業者に理解される。これに関する更なる例示の目的で、Sambrook et al. 1989を引用する。

本発明のポリヌクレオチドは、アンチセンスRNAの作製を提供するために、アンチセンスの方向で上記ベクターに挿入されてよい。アンチセンスRNA若しくは他のアンチセンスポリヌクレオチド、又は干渉RNA（iRNA）は、合成手段により作製されてもよい。このようなアンチセンスポリヌクレオチド又はiRNAは、本発明のアッセイにおいて試験化合物として使用されてよく、あるいは治療によるヒト又は動物の体の治療方法に有用であってよい。

好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチド又は本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を提供可能なコントロール配列と作動可能に連結されており、すなわち該ベクターは発現ベクターである。用語「作動可能に連結（operably linked）」するとは、記載の構成要素が、その意図する様式で機能することができるような関係で並置されることを意味する。コード配列に「作動可能に連結」された制御配列（例えば、プロモーター）は、コード配列の発現が、制御配列に適合する条件下で達成されるように配置される。

ベクターは、例えば、複製起点を備え、任意選択で前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター及び任意選択で該プロモーターのレギュレーターを備えた、プラスミド、ウイルス、又はファージベクターであってよい。ベクターは、1以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子、又は真菌ベクター用の耐性遺伝子を含有してよい。

プロモーター及び他の発現制御シグナルは、発現が企図される宿主細胞に適合するように選択されてよい。例えば、酵母プロモーターには、S. セレビシエ（S. cerevisiae）GAL4及びADHプロモーター、S. ポンベ（S. pombe）nmt1及びadhプロモーターが含まれる。哺乳動物プロモーターには、カドミウムなどの重金属に応答して誘導され得るメタロチオネインプロモーターが含まれる。SV40ラージT抗原プロモーターやアデノウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターも使用してよい。これらすべてのプロモーターは当分野で容易に入手可能である

βアクチンプロモーターなどの哺乳動物プロモーターを使用してよい。組織特異的プロモーターが特に好ましい。ウイルスプロモーターを使用してもよく、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（MMLV LTR）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）IEプロモーター、アデノウイルス、HSVプロモーター（例えば、HSV IEプロモーター）又はHPVプロモーター、特にHPV上流調節領域（URR）などである。ウイルスプロモーターは当分野で容易に入手可能である。

本発明のポリペプチド又はポリペプチド断片の発現を提供するために、発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換してよい。上記のように、発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を、ポリペプチド又は断片の発現が可能な条件下で培養し、発現したポリペプチド又は断片を回収する。単離及び精製は、上記のように実施してよい。宿主細胞はベクターに適合するように選択され、好ましくは細菌性である。宿主細胞は、非ヒト動物の細胞、又は本発明のポリヌクレオチドで形質転換される植物の細胞であってもよい。

IdeS
IdeSは、ヒト病原体S. ピオゲネスによって産生される細胞外システインプロテアーゼであり、WO 03／051914に記載される。IdeSは元々血清型M1のA群ストレプトコッカス株（group A streptococcal strain）から単離されたが、現在では、ides遺伝子は、試験されたA群ストレプトコッカス株のすべてで同定されている。IdeSは、極めて高度の基質特異性を有し、その唯一同定された基質はIgGである。IdeSは、ヒトIgGのヒンジ領域下部において、単一のタンパク質分解切断を触媒する。このタンパク質分解は、オプソニン化貪食作用の阻害を促進し、A群ストレプトコッカスの殺滅を妨害する。IdeSはまた、様々な動物において、IgGの複数のサブクラスを切断し、IgGをFc断片及びFab断片へと効率よく転換する。ides遺伝子は、GST融合タンパク質として、E. coli中でクローン化され、発現された。

本発明の方法で使用するためのIdeSポリペプチドは、好ましくは、S. ピオゲネス IdeS、又はシステインプロテアーゼ活性を保持するS. ピオゲネス IdeSのバリアント若しくは断片である。バリアントは、別の生物、例えば、別の細菌などのIdeSポリペプチドであってよい。細菌は、好ましくはストレプトコッカスである。ストレプトコッカスは、好ましくは、A群ストレプトコッカス、C群ストレプトコッカス又はG群ストレプトコッカスである。特に、バリアントは、C群ストレプトコッカス、例えば、S. エクイ又はS. ズーエピデミカスなどのIdeSポリペプチドであってよい。あるいは、バリアントは、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来であってよい。

IdeSポリペプチドは、
（a）配列番号4のアミノ酸配列、
（b）配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有し、IgGシステインプロテアーゼ活性を有する、そのバリアント、又は
（c）IgGシステインプロテアーゼ活性を有する、そのいずれかの断片
を含んでよい。

好ましくは、IdeSポリペプチドは、配列番号4の配列を含むか、又はそれからなる。配列番号4は、シグナル配列を有さない、IdeSの成熟型の配列である。

バリアントIdeSポリペプチドは、そのアミノ酸配列は配列番号4のものとは異なるものの、IdeSと同様のIgGシステインプロテアーゼ活性を示すものである。通常、配列番号4のアミノ酸配列と約50％超、55％超又は65％超の同一性、好ましくは少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、少なくとも97％又は少なくとも99％の同一性を有するポリペプチドは、そのタンパク質のバリアントと考えられる。このようなバリアントは、ペプチドがIdeSの基本的機能を維持する限り、アレルバリアント、及びタンパク質配列内の単一アミノ酸又はアミノ酸群の欠失、修飾又は付加を含んでよい。配列番号4のバリアントの同一性は、配列番号4で示された配列の少なくとも50個、少なくとも75個、少なくとも100個、少なくとも150個、少なくとも200個、少なくとも250個、少なくとも275個、少なくとも300個又はそれ以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、より好ましくは配列番号4の全長にわたって測定されてよい。

配列番号4のアミノ酸配列のバリアントは、好ましくは、配列番号4の残基Lys-55及び／又はCys-65及び／又はHis-233及び／又はAsp-255及び／又はAsp-257を含有する。最も好ましくは、配列番号4のバリアントは、配列番号4の残基Lys-55、Cys-65、His-233、Asp-255及びAsp-257のそれぞれを含有する。

バリアント配列は、通常、少なくとも1、2、5、10、20、30、50個又はそれ以上の変異（アミノ酸の置換、欠失又は挿入であってよい）によって異なる。例えば、1〜50個、2〜30個、3〜20個又は5〜10個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入がなされてよい。改変ポリペプチドは、IgG特異的システインプロテアーゼとしての活性を保持する。好ましくは、バリアントポリペプチドは、システインプロテアーゼで典型的に見られる間隔でシステイン残基とヒスチジン残基を含む。例えば、配列番号4において、これらの残基は、システインプロテアーゼで典型的に見られるように、アミノ酸約130個の間隔で見られる。

本発明で使用するIdeSポリペプチドの断片は、通常、それがIdeSのIgGシステインプロテアーゼ活性を保持する限り、少なくとも10個、例えば、少なくとも15、20、25、30、40、50個又はそれ以上のアミノ酸長であって、最大で100、150、200、250又は300個のアミノ酸長である。好ましくは、本発明で使用するIdeSポリペプチドの断片は、配列番号4の残基Lys-55及び／又はCys-65及び／又はHis-233及び／又はAsp-255及び／又はAsp-257を包含する。最も好ましくは、断片は配列番号4の残基Lys-55、Cys-65、His-233、Asp-255及びAsp-257のそれぞれを包含することが最も好ましい。

本発明で使用するためのIdeSポリペプチドは、免疫グロブリンシステインプロテアーゼ活性、特にIgGシステインプロテアーゼ活性を示す。好ましくは、該ポリペプチドは、IgGをヒンジ領域で、とりわけ重鎖のヒンジ領域で切断する。切断により、IgGのFc断片及びFab断片の生成がもたらされる。好ましくは、活性はIgGに特異的である。システインプロテアーゼ活性は、適切なアッセイにより測定されてよい。例えば、試験ポリペプチドをIgGとともに適切な温度、例えば37℃でインキュベートしてよい。次いで、所望のIgG切断産物が存在するかどうかを決定するために、開始物質及び反応産物をSDS-PAGEによって分析してよい。通常、この切断産物は31 kDaの断片である。通常、この最初の切断の後には、さらなるIgGの分解は生じない。切断産物をN末端配列決定に供して、切断がIgGのヒンジ領域で生じているかを確認してよい。好ましくは、N末端配列は配列GPSVFLFPを含む。

ポリペプチドのシステインプロテアーゼ活性は、阻害研究によってさらに特徴付けることができる。好ましくは、活性は、ペプチド誘導体Z-LVG-CHN₂及び／又はヨード酢酸（いずれもプロテアーゼ阻害剤である）によって阻害される。しかし、活性は通常、E64によっては阻害されない。

ポリペプチドのシステインプロテアーゼ活性が通常IgG特異的であるのは、該ポリペプチドを他のIgGクラス、すなわちIgM、IgA、IgD及びIgEとともに、IgGの切断が可能な条件下でインキュベートした場合に、該ポリペプチドがこれらの免疫グロブリンを分解し得ないという点にある。IdeSポリペプチドは、ヒトIgGを切断することができる。好ましい実施態様において、該ポリペプチドは、ヒト、ウサギ、マウス又はヤギIgGを切断する能力を有する。

本発明で使用するためのIdeSポリペプチドは、IdeSポリペプチドを発現する任意の適切な生物から単離されてよい。通常、IdeSポリペプチドは、S. ピオゲネスの適切なIdeS発現株から単離される。適切な生物及び株は、多くの技術によって同定されてよい。例えば、S. ピオゲネス株は、ides遺伝子の存在について初めに試験されてよい。次いで、プライマーを使用したPCR、又はS. ピオゲネス株のゲノムDNAに対するプローブのハイブリダイゼーションによってides遺伝子の存在を確認することができる。

活性型IdeSを発現するS. ピオゲネス株は、培養上清中のIgGシステインプロテアーゼ活性をアッセイすることによって同定することができる。好ましくは、阻害剤E64を上清に添加して、いずれのSpeBシステインプロテアーゼ活性も阻害する。少なくとも5種の株、AP1、AP12、AP55、KTL3及びSF370株は活性型IdeSを発現する。好ましくは、発現株は、AP1、AP12及びAP55から選択される。

発現しているS. ピオゲネス培養物又はIdeSを発現している他の細胞培養物からのIdeSの単離及び精製は、通常、IgGシステインプロテアーゼ活性に基づいている。好ましくは、精製方法は、硫酸アンモニウム沈殿工程及びイオン交換クロマトグラフィー工程を伴う。一方法によれば、培養培地を、増加量の硫酸アンモニウムを添加することにより分画する。硫酸アンモニウムの量は、10〜80％であってよい。好ましくは、培養培地を50％硫酸アンモニウムで分画し、得られた上清を70％硫酸アンモニウムでさらに沈殿させる。次いで、ペレット化したポリペプチドをイオン交換クロマトグラフィー、例えば、Mono QカラムでのFPLCに供してよい。溶出した画分について、IgGシステインプロテアーゼ活性の測定を行ってよく、ピーク活性画分を収集してよい。画分は、SDS-PAGEによって分析してよい。例えば、SDS-PAGEタンパク質バンドからN末端配列を得ることができる。画分は、-20℃で保存してよい。

［EndoS49のエンドグリコシダーゼ活性を用いる方法］
本明細書に記載するように、EndoS49はエンドグリコシダーゼ活性を有し、IgG及びα-1-ミクログロブリンを含む糖タンパク質のグリカンを加水分解できる。従って、本発明は、糖タンパク質を脱グリコシル化する方法、特に、糖タンパク質（特に、IgG及びα-1-ミクログロブリン）由来のグリカンを加水分解する方法を提供する。通常、このような方法は、糖タンパク質を含むサンプルを、糖タンパク質とともにEndoS49と一緒に、エンドグリコシダーゼ活性が可能な条件下でインキュベートすることを含む。適切な条件には、少なくとも1 μg／ml、2 μg／ml、4 μg／ml、6 μg／ml、8 μg／ml、10 μg／ml、12 μg／ml、15 μg／ml又は20 μg／ml、好ましくは少なくとも10 μg／mlの濃度でEndoS49を使用することが含まれる。適切な条件には、サンプルをEndoS49とともに少なくとも20分間、30分間、40分間、50分間、60分間、70分間、80分間、90分間又は120分間、好ましくは少なくとも60分間インキュベートすることも含まれる。インキュベーションは、好ましくは、室温で、より好ましくはおよそ20℃、25℃、30℃、35℃、40℃又は45℃、最も好ましくはおよそ37℃で行う。

これらの方法を用いて脱グリコシル化タンパク質を提供してよく、それら自身は、研究又は治療に有用であってよい。これらの方法を用いて、例えば、グリコマッピング（glycomapping）又はグリコプロファイリングにおいて、糖タンパク質上のグリカンを特徴付けてもよい。このようなグリコマッピング及びグリコプロファイリングは、IgG分子などの抗体分子に対して、例えば、モノクローナルIgG分子の分析において特に有用である。通常、該方法は、タンパク質をEndoS49とともにインキュベートして、タンパク質のグリカンを加水分解することを伴った。その後、グリカン、及びタンパク質又はポリペプチドを、HPLCやゲルクロマトグラフィーなどの任意の適切な技術を用いて分離する。次いで、分離した部分を任意の適切な分析方法、例えば、質量分析、HPLC、ゲルクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、分光分析、キャピラリー電気泳動、並びにグリカン及び／又はタンパク質を分析するためのその他の標準的実験技術などを用いて分析し得る。

本発明のさらなる方法によれば、該方法は、抗体のFc部分のグリカンを本明細書に記載の方法及び技術を用いてより詳細に分析できるように、IdeSなどの追加の酵素を利用することを含んでよい。

一例は、免疫グロブリンのフコシル化を分析することである。IgG分子上のFcグリカンのフコシル化の程度は、IgG薬物候補の治療可能性に重要である。アフコシル化（Afucosylated）IgG分子は、治療用IgG分子のADCC（nn）作用を高める。従って、本発明では、EndoS49を用いて、IgGのFcグリカンにおけるフコース量を分析するための方法を提供する。

通常、このような方法は、糖タンパク質、この場合には免疫グロブリンを、EndoS49とともに、EndoS49のエンドグリコシダーゼ活性が可能な条件下でインキュベートすることを含む。適切な条件には、少なくとも1 μg／ml、2 μg／ml、4 μg／ml、6 μg／ml、8 μg／ml、10 μg／ml、12 μg／ml、15 μg／ml又は20 μg／ml、好ましくは少なくとも10 μg／mlの濃度でEndoS49を使用することが含まれる。適切な条件には、サンプルをEndoS49とともに少なくとも20分間、30分間、40分間、50分間、60分間、70分間、80分間、90分間又は120分間、好ましくは少なくとも60分間インキュベートすることも含まれる。インキュベーションは、好ましくは、室温で、より好ましくはおよそ20℃、25℃、30℃、35℃、40℃又は45℃、最も好ましくはおよそ37℃で行う。IdeSをEndoS49での反応後、又は同一反応混合物中に添加して、タンパク質分解を誘導し、免疫グロブリン分子をF(ab')2とFcとに分けてよい。2つの断片は、分離方法を用いて分離した後、質量分析計に投入する。グリカンの切断後、GlcNAc及びコアFuc残基は、コンセンサスFc/2グリコシル化部位にてAsnと結合したままである。アフコシル化免疫グロブリンは、コアフコシル化されないので、いくつかのFc/2は、消化後にGlcNAcのみを含む。フコースがないことによりもたらされる特徴的な質量の差（-146 Da）は、デコンボリューションマススペクトル（deconvoluted mass spectrum）において容易に発見できる。従って、EndoS49の使用は、IgGのコアアフコシル化程度の直接的な評価を容易にする。

［サンプル中のIgGの有無を決定する方法又はIgG含有サンプルからIgGを単離する方法］
IgGの単離及び／又は検出は、プロテインG又はプロテインAのような薬剤を使用して当分野で典型的に実施される。これらの細菌タンパク質はIgGと十分に相互作用する。しかし、プロテインAは、IgGサブクラスの4種類すべて（IgG_1〜4）と結合するわけではなく、プロテインA及びプロテインGはいずれも、非グリコシル化及び／又は変性した不活性なIgGと、グリコシル化され及び／又は天然の機能的に活性なIgGとを区別することができない。それに反して、本発明者らは、IgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如したEndoS49ポリペプチドが、通常、IgGサブクラスの4種類すべてと高い親和性で結合し、正常にグリコシル化されたIgG、すなわち、天然の機能的に活性な形態のIgGに選択的であることを特定した。

従って、本発明は、サンプル中のIgGの有無を決定するための改善された方法であって、前記サンプルを、IgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如したEndoS49ポリペプチドと接触させる工程、接触させたサンプルから前記EndoS49を分離する工程、及びそれによりIgGの有無を決定する工程を含み、任意選択で、IgGが存在する場合に単離されたIgGを得る工程を含んでよい方法を提供する。従って、本発明は、IgG含有サンプルからIgGを単離する方法であって、前記サンプルを、IgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如したEndoS49ポリペプチドと接触させる工程、接触させたサンプルから前記EndoS49を分離する工程、及びそれにより単離されたIgGを得る工程を含む方法も提供する。

上記サンプルは、EndoS49ポリペプチドとサンプルとの間に相互作用が生じ、IgG結合活性が生じる、すなわち、IgG-EndoS49ポリペプチド複合体を形成させるのに適切な条件下にて、EndoS49ポリペプチドと接触させる。適切な条件には、少なくとも1 μg／ml、2 μg／ml、4 μg／ml、6 μg／ml、8 μg／ml、10 μg／ml、12 μg／ml、15 μg／ml又は20 μg／ml、好ましくは少なくとも10 μg／mlの濃度でEndoS49を使用することが含まれる。適切な条件には、サンプルをEndoS49とともに少なくとも20分間、30分間、40分間、50分間、60分間、70分間、80分間、90分間又は120分間、好ましくは少なくとも60分間インキュベートすることも含まれる。インキュベーションは、好ましくは、室温で、より好ましくはおよそ20℃、25℃、30℃、35℃、40℃又は45℃、最も好ましくはおよそ37℃で行う。

これらの方法におけるEndoS49の特別な利点は、EndoS49が正常なグリコシル化IgGに特異的に結合することである。他のIgG結合剤のIgG結合活性は、通常、IgG糖タンパク質の変性を必要とするか、又はそれにより強化される。これは、通常、IgG含有サンプルを酸で処理することによって達成される。このような処理は、いくつかの抗体（酸感受性（acid-sensitive）抗体）に損傷を与え、又は変性させる可能性がある。本発明の方法はこのような処理を必要としないので、該方法は、サンプルから天然型（native form）の酸感受性IgGを単離するのに特に適している。

EndoS49は、接触させたサンプルから任意の適切な方法により分離してよい。サンプルからEndoS49を取り除くための好ましい方法には、上記のように誘導体化又は改変したEndoS49を使用することが含まれる。

好ましい改変には、ヒスチジンタグの付加が含まれる。ヒスチジンタグの存在は、該ポリペプチドが、表面上にニッケル、銅又は亜鉛イオンを有するキレート基を含有する試薬又は分離手段に高い親和性で結合することを意味する。ヒスチジンタグは、これらの金属イオンに強力に結合する。従って、このような試薬を用いて、EndoS49をサンプルから分離することができる。

別の好ましい改変には、ビオチンタグの付加が含まれる。ビオチンタグの存在は、該ポリペプチドが、ストレプトアビジンを含む試薬又は分離手段に高い親和性で結合することを意味する。ビオチンタグは、ストレプトアビジンに強力に結合する。従って、このような試薬を用いて、EndoS49をサンプルから分離することができる。

好ましい試薬及び分離手段は、EndoS49ポリペプチドに結合できる磁性粒子の集団である。例えば、EndoS49ポリペプチドがヒスチジンタグで誘導体化される場合、磁性粒子は、その表面上にニッケル、銅又は亜鉛イオンを有するキレート基を含有する。あるいは、EndoS49ポリペプチドがビオチンタグで誘導体化される場合、磁性粒子は、その表面上にストレプトアビジンを含有する。

従って、EndoS49をサンプルから取り除く好ましい方法は、上記のような磁性粒子の集団を使用する工程と、サンプルに磁場分離（magnetic field separation）を実施する工程とを含む。磁性粒子は好ましくは磁性ナノ粒子であり、磁場分離は好ましくは高勾配磁場分離である。

任意の適切な分離手段を使用してよいことが理解されよう。例えば、代替手段は、前記セクションに記載されている。

接触させたサンプルのEndoS49は、任意の適切な手段により、結合したIgGの有無について評価してよい。

例えば、EndoS49の分子量を分析してよい。IgGに結合したEndoS49は、IgGに結合していないEndoS49よりも高い分子量を有する。従って、適切な方法には、重量によってタンパク質種を区別できる任意の方法、例えば、SDS-PAGE及びウェスタンブロット、質量分析などが含まれる。あるいは、上記ウェスタンブロットは、IgG特異的抗体又は特定のIgGサブクラスに特異的な抗体を用いて、IgGの存在を直接分析してよい。この様式でブロットにおけるタンパク質を検出することは当分野で広く使用される技術である。

EndoS49に結合したIgGの有無を検出するための他の適切な手段には、EndoS49をIgGに対する抗体又はIgG結合タンパク質であって酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）が結合したものとともにインキュベートし、その後、蛍光発生／発色性基質を添加することが含まれる。この場合、色シグナルの発生はIgGの存在を示し、IgG量はシグナル強度に比例する。この様式でタンパク質を検出することは当分野で広く使用される技術である。

EndoS49に結合したIgGの有無を検出するためのさらなる適切な手段には、上記方法のいずれか又は任意の適切な方法によってEndoS49とは独立して分析／検出できるように、結合したIgGをEndoS49から最初に分離することが含まれる。IgGは、任意の適切な手段によってEndoS49から分離してよい。適切な手段には、接触させたサンプルのEndoS49と適切な溶出緩衝液とを接触させることによって、EndoS49からIgGを溶出することが含まれる。溶出緩衝液の選択は、通常、EndoS49に結合したIgGが、酸感受性であることが公知である又は疑われるかどうか、すなわち、酸との接触によって変性／不活性化されるかどうかによって決まる。

抗体が酸感受性ではない場合、低pHの溶出緩衝液を使用した溶出プロトコールが典型的には使用されてよい。このタイプの溶出プロトコールは当分野で周知である。このような溶出緩衝液は、通常、約pH＝3未満、最も好ましくは約pH＝2未満のpHを有する。好ましい例として、pH＝2のグリシン0.1 Mが挙げられる。さらに又は任意選択で、このような溶出緩衝液は、通常、以下：
- ナトリウム塩若しくはカリウム塩であって、好ましくは約0.5 M〜約1 Mの濃度のもの、
- 天然IgGのAsn-297と関連するグリカンと類似した構造を有する単糖類、二糖類、若しくは多糖類、
又はその任意の組み合わせ
の少なくとも1つを含んでよい。

しかし、上記で概説したように、本発明の方法は、酸感受性抗体の検出／単離に特に適している。従って、EndoS49に結合したIgGが、酸感受性であることが公知である又は疑われる場合には、低pHを必要としない溶出緩衝液及びプロトコールを使用することが好ましい。このようなプロトコールも当分野で公知であり、これは、EndoS49への結合をめぐって結合IgGと競合し、それにより結合IgGの解放を導く分子を含む緩衝液を提供するという原理に基づいている。従って、適切な競合溶出緩衝液には、通常、天然IgGのAsn-297と関連するグリカンに類似した構造を有する単糖類、二糖類、又は多糖類の1つ以上が含まれる。特に好ましい溶出緩衝液には、約0.25 M〜約0.5 Mのスクロースであって、好ましくはpHが約5.3〜約8.3のものが含まれる。特定の好ましい溶出緩衝液の例としては、例えば、スクロース0.25 M（PBS pH＝7.4）；スクロース0.5 M（PBS pH＝7.4）；スクロース0.25 M（PBS pH＝5.3）；スクロース0.25 M（PBS pH＝8.5）、及びスクロース0.25 M、マルトース0.25 M（PBS pH＝7.4）が挙げられる。

さらに又は任意選択で、このような競合溶出緩衝液は、通常、ナトリウム塩又はカリウム塩を、好ましくは約0.5 M〜約1 Mの濃度で含んでよい。

上記のようなEndoS49から結合IgGを分離するための手段を用いて、単離したIgGを得てもよい。

［IgG含有サンプルのグリコシル化状態及び／又は機能的品質（functional quality）を評価する方法］
非改変型の本発明のEndoS49ポリペプチドは、IgGのグリカンを加水分解する能力を有する。また、上述のとおり、IgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如し、かつIgG結合活性を有する本発明のEndoS49ポリペプチドは、グリコシル化され及び／又は天然の機能的に活性なIgGに特異的である。従って、EndoS49ポリペプチドは、糖タンパク質、特にIgG抗体のグリコシル化状態を分析するために使用することができる。

本発明の一側面によれば、IgG抗体を、エンドグリコシダーゼ活性を有する本発明のEndoS49ポリペプチドとともにインキュベートする。得られた産物は、HPLC、質量分析（mass spec）、ゲルクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、分光光度計、キャピラリー電気泳動を含む任意の適切な技術により分析できる。このような分析方法は、タンパク質の調製における任意の段階、例えば、薬剤候補物質のスクリーニングの間、生物学的薬剤の製造プロセスの開発及び放出アッセイのクオリティコントロールの間、並びに製造の間などにて実施できる。

エンドグリコシダーゼ活性を除去又は低下させるように改変したEndoS49ポリペプチド、又はその天然型でIgGと結合する能力を保持するEndoS49ポリペプチドは、グリコマッピング、特に糖タンパク質の分析、特にIgG構造の分析に有用であり得る。

例えば、本発明は、前記EndoS49ポリペプチドを、任意選択で代替IgG結合試薬とともに使用することによって、IgG含有サンプルのグリコシル化状態又は機能的品質を評価する方法であって、IgG含有サンプルから第1及び第2のサブサンプルを得て、第1のサブサンプルを前記セクションに記載したようなEndoS49ポリペプチドと接触させ、かつ第2のサブサンプルを、非グリコシル化及び／又は変性した不活性なIgGに結合できる代替IgG結合試薬と接触させ、次いで、第1のサブサンプルにおけるEndoSポリペプチドに結合したIgGの量及び第2のサブサンプルにおける代替IgG結合試薬に結合したIgGの量を定量することを含む方法を提供する。最終的に、第1のサブサンプル及び第2のサブサンプルで測定された両方の結合IgG量を比較することによって、IgG含有サンプルのグリコシル化状態又は機能的品質を評価することができる。

代替IgG結合試薬は、通常、IgGの全形態（天然型又は変性型）に結合するプロテインA又はプロテインGである。従って、この場合、前記試薬に結合したIgGの量は、第2のサブサンプルに存在する全IgGを表す。EndoS49ポリペプチドは、グリコシル化され及び／又は天然の機能的に活性なIgGのみに結合するので、EndoS49に結合したIgGの量は、第1のサブサンプルに存在するグリコシル化され及び／又は天然の機能的に活性なIgGのみを表す。当業者ならば、第2のサブサンプルの全IgGの濃度を第1のサブサンプルの天然IgGの濃度と比較することによって、元のサンプルにおける、グリコシル化され及び／又は天然の機能的に活性な形態で存在するIgGの割合を反映する比が得られることを認識するだろう。

別の実施態様において、代替IgG結合試薬は、非グリコシル化及び／又は変性したIgGに特異的であり得る。このような試薬は、例えば、抗体であり得る。従って、この実施態様において、元のサンプルにおける、グリコシル化され及び／又は天然の機能的に活性な形態で存在するIgGの割合は、式：
第1のサブサンプルのIgGの量／（第1のサブサンプルのIgGの量＋第2のサブサンプルのIgGの量）
によって評価することができる。

上記方法におけるサンプルは、EndoS49ポリペプチド又は代替IgG結合試薬と、ポリペプチド又は試薬とサンプルとの間に相互作用が生じ、IgG結合活性が生じるのに適切な条件下で接触させる。適切な条件は、例えば、前記セクションに記載したものと同等である。

［IgG含有サンプルからIgG Fab断片又はFc断片を単離する方法］
本発明の方法は、IgG含有サンプルからFab断片を単離するために使用することができる。一実施態様において、本発明は、IgG含有サンプルからIgGのFab断片を単離する方法であって、
（a）前記IgG含有サンプルをIdeS及びEndoS49ポリペプチドと接触させる工程、及び
（b）接触させたサンプルから前記IdeS及び前記EndoS49ポリペプチドを分離する工程
を含み、それによりFab断片を単離する方法を提供する。

サンプルからIdeS及びEndoS49ポリペプチドを分離する好ましい方法には、上記のように誘導体化又は改変したIdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドを使用することが含まれる。同一又は異なる改変をIdeS及びEndoS49ポリペプチドのそれぞれに使用してよい。

好ましい改変には、ヒスチジンタグの付加が含まれる。ヒスチジンタグの存在は、該ポリペプチドが、表面上にニッケル、銅又は亜鉛イオンを有するキレート基を含有する試薬又は分離手段に高い親和性で結合することを意味する。ヒスチジンタグは、これらの金属イオンに強力に結合する。従って、このような試薬を用いて、IdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドをサンプルから分離することができる。

別の好ましい改変には、ビオチンタグの付加が含まれる。ビオチンタグの存在は、該ポリペプチドが、ストレプトアビジンを含む試薬又は分離手段に高い親和性で結合することを意味する。ビオチンタグは、ストレプトアビジンに強力に結合する。従って、このような試薬を用いて、IdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドをサンプルから分離することができる。

好ましい試薬又は分離手段は、EndoS49ポリペプチドに結合できる磁性粒子の集団である。例えば、IdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドポリペプチドがヒスチジンタグで誘導体化される場合、磁性粒子は、その表面上にニッケル、銅又は亜鉛イオンを有するキレート基を含有する。あるいは、IdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドポリペプチドがビオチンタグで誘導体化される場合、磁性粒子は、その表面上にストレプトアビジンを含有する。

従って、EndoS49をサンプルから取り除く好ましい方法は、上記のような磁性粒子の集団を使用する工程と、サンプルに磁場分離を実施する工程とを含む。磁性粒子は好ましくは磁性ナノ粒子であり、磁場分離は好ましくは高勾配磁場分離である。

従って、上記方法の工程（a）は、好ましくは、サンプルを、IdeS及びEndoS49ポリペプチドに結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることをさらに含み、ここで、工程（b）は、サンプルに磁場分離を実施することを含む。

EndoS49ポリペプチドは、好ましくは、エンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変EndoS49ポリペプチドである。

本発明の上記実施態様において、IgG含有サンプルは、通常、精製又は単離されたIgGを含む。「精製又は単離されたIgG」とは、通常の商用等級の純度を有するIgG画分を意味する。IgGは、通常、血清などのサンプルから、又は組換えIgGの場合には細胞溶解物から単離される。単離は、任意の適切な方法に従って実施してよく、好ましくは、エンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変EndoS49ポリペプチドを使用するIgGの単離について上述した方法に従って実施してよい。従って、本発明の一実施態様は、上記方法が、工程（a）の前に、
（i）前記IgG含有サンプルを、IgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如したEndoS49ポリペプチドと接触させ、それによりIgG-EndoS49ポリペプチド複合体を形成させる工程、
（ii）接触させたサンプルから前記IgG-EndoS49ポリペプチド複合体を分離する工程、及び
（iii）IgG-EndoS49ポリペプチド複合体からIgGを溶出し、それによりIgG含有サンプルを得る工程
を含み、ここで、工程（a）及び（b）が、工程（iii）で得られたIgG含有サンプルに対して実施される方法を包含する。IgG-EndoS49ポリペプチド複合体のサンプルからの分離は、好ましくは、サンプル中のIgGの有無を決定する方法又はIgG含有サンプルからIgGを単離する方法に関して上記セクションに記載した方法に従って実施する。

本発明の別の実施態様において、該方法を、その実施の前にIgGを精製する必要なく、IgG含有サンプルからFab断片を単離するように適合させる。これらの方法は、未精製のIgGを含有するサンプル、例えば、全血清、細胞溶解物又は細胞培養培地に対して実施することができる。本発明のこの実施態様において、該方法は、
（a）前記IgG含有サンプルをEndoS49ポリペプチドと接触させ、それによりIgG-EndoS49ポリペプチド複合体を形成させる工程、
（b）接触させたサンプルから前記IgG-EndoS49ポリペプチド複合体を分離する工程、
（c）工程（b）で得られたIgG-EndoS49ポリペプチド複合体にIdeSを添加する工程、及び
（d）（c）で得られた混合物から前記IdeS及び前記EndoS49ポリペプチドを分離する工程
を含み、それによりFab断片を単離する。

上記サンプル／混合物からIdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドを分離するための方法には、好ましくは、上記のように誘導体化又は改変したIdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドを使用することが含まれる。同一又は異なる改変をIdeS及びEndoS49ポリペプチドのそれぞれに使用してよい。好ましい試薬又は分離手段は、IdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドに結合できる磁性粒子の集団である。例えば、IdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドポリペプチドがヒスチジンタグで誘導体化される場合、磁性粒子は、その表面上にニッケル、銅又は亜鉛イオンを有するキレート基を含有する。あるいは、IdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドポリペプチドがビオチンタグで誘導体化される場合、磁性粒子は、その表面上にストレプトアビジンを含有する。

従って、上記方法の工程（a）は、好ましくは、サンプルを、EndoS49ポリペプチドに結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることをさらに含み、工程（c）は、工程（b）で得られたIgG-EndoS49ポリペプチド複合体を、IdeS及びEndoS49ポリペプチドに結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることをさらに含み、ここで、工程（b）及び（d）は、それぞれ、（a）のサンプル及び（c）で得られた混合物に磁場分離を実施することを含む。

任意の適切な分離手段を使用してよいことが理解されよう。例えば、FcγRに結合したIgG分子を実質的に含まない細胞集団の単離方法に関するセクションに記載した代替手段を、IdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドの分離に適合させ得る。

上記実施態様におけるEndoS49ポリペプチドは、好ましくは、エンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変EndoS49ポリペプチドである。

本発明の上記方法は、IgG含有サンプルからFc断片を単離するために使用することもできる。本発明のこのような一実施態様において、該方法は、
（a）前記IgG含有サンプルをIdeSと接触させる工程、
（b）工程（a）で得られた混合物からIdeSを分離し、それによりFab断片及びFc断片を単離する工程、
（c）前記Fab断片及びFc断片をEndoS49ポリペプチドと接触させ、それによりFc断片-EndoS49ポリペプチド複合体を形成させる工程、
（d）工程（c）で得られた混合物からFc断片-EndoS49ポリペプチド複合体を分離する工程、及び
（e）工程（d）で得られたFc断片-EndoS49ポリペプチド複合体からFc断片を単離する工程
を含む。

上記のように、任意の適切な分離手段を使用してよいが、上記サンプル／混合物からIdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドを分離するための方法には、好ましくは、上記のように誘導体化又は改変したIdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドを使用することが含まれることが理解されよう。

好ましくは、上記方法の工程（a）は、サンプルを、IdeSに結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることをさらに含み、工程（c）は、工程（b）で得られたFab断片及びFc断片を、EndoS49ポリペプチドに結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることをさらに含み、ここで、工程（b）及び（d）は、それぞれ、（a）のサンプル及び（c）で得られた混合物に磁場分離を実施することを含む。EndoS49ポリペプチドは、好ましくは、エンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変EndoS49ポリペプチドである。

別の実施態様において、Fc断片は、
（a）前記IgG含有サンプルをIdeS及びEndoS49ポリペプチドと接触させる工程、及び
（b）（a）で得られた混合物からEndoS49ポリペプチドを分離する工程
を含み、それによりFc断片を単離する方法によって、IgG含有サンプルから単離されてよい。

上記のように、任意の適切な分離手段を使用してよいことが理解されよう。しかし、好ましくは、上記方法の工程（a）は、サンプルを、EndoS49ポリペプチドに結合することはできるがIdeSには結合できない磁性ナノ粒子の集団と接触させることをさらに含み、ここで、工程（b）は、（a）で得られた混合物に磁場分離を実施することを含む。好ましくは、IdeS及び／又はEndoS49ポリペプチドは、異なる改変がそれぞれに適用されるという条件の下、上記のように誘導体化又は改変される。例えば、IdeSが、表面上にニッケル、銅又は亜鉛イオンを有するキレート基を含有する磁性粒子の集団に結合するように、ヒスチジンタグの付加により改変される場合、EndoS49ポリペプチドは、表面上にストレプトアビジンを含有する磁性粒子の集団に結合するように、ビオチンタグの付加により改変されてよい。EndoS49ポリペプチドは、好ましくは、エンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変EndoS49ポリペプチドである。

Fab断片を単離するための方法と同様に、Fc断片を分離するための方法において、IgG含有サンプルは、通常、精製又は単離されたIgGを含むことが理解されよう。IgGを単離する好ましい方法は、上記のように工程（i）から（iii）に記載する。

キット
本発明は、
（a）エンドグリコシダーゼ活性を欠如した本発明のEndoS49ポリペプチド、及び任意選択で、
（b）サンプルから前記EndoS49ポリペプチドを分離するための手段
を含む、IgG含有サンプルからIgGを単離するためのキット、
（a）エンドグリコシダーゼ活性を欠如した本発明のEndoS49ポリペプチド、及び任意選択で、
（b）サンプルから前記EndoS49ポリペプチドを分離するための手段
を含む、サンプル中のIgGの有無を決定するためのキット、
（a）エンドグリコシダーゼ活性を欠如した本発明のEndoS49ポリペプチド、及び任意選択で、
（b）変性及び／又は脱グリコシル化IgGに結合できる代替IgG結合試薬、
（c）サンプルから前記EndoS49ポリペプチドを分離するための手段、及び
（d）サンプルから前記代替IgG結合試薬を分離するための手段
を含む、IgG含有サンプルのグリコシル化状態及び／又は機能的品質を評価するためのキットを提供する。

代替IgG結合試薬は、プロテインG及び／又はプロテインA及び／又はプロテインA／Gを含む。

本発明はまた、
（a）IdeS、
（b）EndoS49ポリペプチド、及び
（c）サンプルから前記IdeS及び前記EndoS49ポリペプチドを分離するための手段
を含む、IgGのFab断片又はFc断片を単離するためのキットも提供する。

好ましい実施態様において、キットはさらに、エンドグリコシダーゼ活性を欠如した本発明のEndoS49ポリペプチド、及びサンプルから前記EndoS49ポリペプチドを分離するための手段を含む。EndoS49ポリペプチドは、好ましくは、エンドグリコシダーゼ活性を欠如した本発明のEndoS49ポリペプチドである。

上記キットの好ましい実施態様は、本発明の方法でキットを使用する指示書をさらに含む。さらに好ましい実施態様には、EndoS49ポリペプチド、代替IgG結合試薬、IdeSポリペプチド又はEndoS49ポリペプチドをサンプルから分離するための手段が、磁性ナノ粒子の集団であり、各集団が、示されるポリペプチド／試薬／タンパク質の少なくとも1つに結合できるものが含まれる。この実施態様において、キットは、通常、サンプルに磁場分離を実施するための指示書をさらに含む。

上記方法及びキットの好ましい実施態様において、使用するポリペプチド／タンパク質／試薬は、前記ポリペプチドの分離を助けるために、アフィニティータグ、好ましくはヒスチジンタグで誘導体化する。

以下の実施例は本発明を例証する。

実施例1
材料及び方法
（細菌株及び増殖）
血清型M49のGAS株NZ131のゲノムは配列決定されているので、この株を本研究におけるリファレンス株として選択した（McShan et al., 2008）（Chaussee et al., 1999）。GAS株NZ131は血液寒天培地上で増殖させ、E. coli株Top10（Invitrogen）及びBL21 pLysS（Invitrogen）は溶原培養液（lysogeny broth：LB）寒天培地上で増殖させた。E. coli Top10細胞の選択のために、カルベニシリンを100 μg／mLで使用し、E. coli BL21 pLysSのために、100 μg／mLのカルベニシリンと34 μg／mLのクロラムフェニコールを使用した。LBにて、37℃、通気してE. coliを一晩培養した。GAS株NZ131のゲノムDNAの調製は、Puregene DNA Purification Kit（Qiagen）を用いて実施した。形質転換は、42℃、30秒間のヒートショックを用いて実施した。E. coliからのプラスミドの調製は、Plasmid Miniprep Kit I（E.Z.N.A）を用いて実施した。本研究で使用したすべてのプライマーを表2に記載する。

（EndoS49の組換え発現）
E. coliにおけるEndoS49の組換え発現は、A群ストレプトコッカス株NZ131（血清型M49）のndoS49遺伝子を、プライマー（ndoS49-F-BamHI：CTGTAAGGATCCAGGAGAAGACTG、及びndoS49-R-XhoI：GAAACCTCGAGTCTTTGTAATCGTAGGACTT）を用いてPCR増幅することにより確立した。ndoS49遺伝子断片を制限酵素BamHI及びXhoIで消化し、DNAリガーゼT4（Fermentas）を用いて、発現ベクターpGEX-5X-3（Amersham Biosciences）にライゲーションして、プラスミドpGEX-ndoS49を作製した。発現ベクターでE. coli Top10化学的コンピテントセルを形質転換し、組換え細胞を100 μg／mLのカルベニシリンプレート上で増殖させ、プライマーndoS49-F-BamHI及びndoS49-R-XhoIを用いたPCRでスクリーニングした。陽性クローンを単離し、pGEX-ndoS49プラスミドを精製し、上記のように、E. coli発現株BL21 pLysSを形質転換した。

組換えクローンの1つを抗生物質とともに37℃で一晩増殖させ、抗生物質を含むLB培地で1：20希釈し、3時間増殖させた。タンパク質EndoS49の発現を、0.1 mMのIPTGで3時間誘導した。細胞を採取し、BugBuster Protein Extraction Reagent（Novagen）で溶解した。組換えGST-EndoS49をGlutathione Sepharose 4B（GE Healthcare）を有するカラムで精製し、還元型グルタチオンで溶出した。

（EndoS49の突然変異誘発）
グルタミン酸186（Glu-186）のロイシンへの部位特異的突然変異誘発（E186L）は、QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を用いて製造者の指示書に従って実施した。使用した突然変異誘発プライマーは、CTAGATATTGATATTCTTCACGAATTTACGAACであり、上記配列のアンチセンス及びプラスミドpGEX-ndoS49と組み合わせた（変異を下線で示す）。これにより、プラスミドpGEX-ndoS49（E186L）を作製し、配列決定後、EndoS49について記載したように、組換えEndoS49（E186L）を発現及び精製した。EndoS49の切断型（truncated version）は、制限酵素部位BamHI及びXhoIを含むプライマーndoS49（trunc1〜5）（表2）を用いて、GAS NZ131のndoS49遺伝子の一部を増幅することにより構築した。上記のように、断片を消化し、pGEXベクターにライゲーションし、E. coli Top10、及びそれに続いてBL21 pLysSを形質転換し、抗生物質とともに増殖させた。上記のようにタンパク質を産生し、タンパク質EndoS49（trunc1）（80 kDa）、EndoS49（trunc2）（70 kDa）、EndoS49（trunc3）（60 kDa）、EndoS49（trunc4）（50 kDa）、EndoS49（trunc5）（42 kDa）を精製した。

（糖タンパク質のグリカン加水分解アッセイ）
1 μgの組換えEndoS49及びその変異体を、20 μLのPBS中、3 μgの各糖タンパク質とともに37℃で一晩インキュベートした。グリカン加水分解は、10％SDS-PAGEゲルで分析し、それに続いて、以前に記載（Collin and Olsen, 2001a）されるように、LCAレクチンブロットで分析した。

（スロットブロット分析）
EndoS49及びその変異体を、Milliporeスロットブロット装置を用いて、スロットあたりPBS中4、2、1 μgにて、メタノール活性化PVDFメンブレン上に固定した。メンブレンを、5％スキムミルク（Difco）を用いて室温で1時間ブロッキングした。洗浄はPBST中、3×10分間、一貫して（consistently）実施した。メンブレンを、0.5％スキムミルク中、10 μgのヒトIgG（Sigma）とともに37℃で1時間インキュベートし、次いで洗浄した。5 μgの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合プロテインG（Invitrogen）をメンブレンに添加し、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、メンブレンをSupersignal West Pico Chemiluminiscent Substrate（Thermo Scientific）を用いて現像した。

（バイオインフォマティック解析）
遺伝子ndoS49及びndoSをEndoS49及びEndoSに翻訳し、ソフトウェアMacVector（MacVector Inc.）内のClustalWアルゴリズムを用いて比較した。系統樹は、以下のアクセッション番号を有するNCBI PubMedのタンパク質配列を用いて、MacVectorで構築した：EndoS（AF296340）、EndoE（AAR20477）、EndoH（NP_631673）、EndoC（ADC53484）、EndoF2（P36912）、EndoF3（P36913）（Collin and Olsen, 2001b）（Collin and Fischetti, 2004）（Tarentino and Plummer, 1974）（Tarentino et al., 1993）。

（ndoS49に対するPCRスクリーニング）
GAS由来のndoS49遺伝子を増幅するプライマーを設計し、ndoS49-F（AAAACGCGGACCACTATATGC）及びndoS49-R（AAACGTTGTCCGAGGATTTG）とした。42のGAS株を血液寒天培地上で増殖（propagated）させ、37℃、5％CO₂で一晩増殖（grown）させた。単一のコロニーをピックアップし、20 μLの滅菌H₂O中、99℃、10分間溶解した。これらの溶解物をストリンジェントなPCR反応のための鋳型として使用して、42GAS株中、ndoS49を検出した。ポジティブコントロールとして、遺伝子recAの増幅のためのプライマーrecA-F（AGCCCTTGATGATGCTTTG）及びrecA-R（AACAATTCTGGGTGATCGG）を設計した。ポジティブコントロールとして、両方のPCR反応は、鋳型としてGAS株NZ131（M49）及びAP1（M1）のゲノムDNAを使用した。

結果
（ClustalW分析は、2つの異なる酵素：EndoS49及びEndoSを明らかにする）
遺伝子ndoS49及びndoSをin silicoでタンパク質に翻訳し、ClustalWアルゴリズムを用いて比較した。遺伝子レベルでの同一性は50％であり、タンパク質レベルでは37％である。ClustalW分析により、（ほぼ）同一のシグナルペプチド配列、及び保存されたファミリー18 グリコシドヒドロラーゼ触媒ドメイン（DGLDIDIE）が明らかとなった（図1）。EndoSの実験解析により、トリプトファンが、グリカン加水分解活性に必須であることが示されている（Allhorn et al., 2008）。これらのトリプトファンは、EndoS49でも保存されている。

（組換えEndoS49は、ヒト糖タンパク質に対しグリカン加水分解活性を示す）
90 kDaのEndoS49をE. coli BL21にて首尾よく組換え発現させ、GSTタグを用いて可溶性画分から精製した。EndoS49（E186L）（GH18モチーフのグルタミン酸（E186）をロイシン（L）で置換した触媒変異体（catalytic mutant））を同様に構築し精製した。タンパク質の活性をマッピングするために、5種類のカルボキシ末端切断型酵素を構築し、EndoS49（trunc1）（80 kDa）、EndoS49（trunc2）（70 kDa）、EndoS49（trunc3）（60 kDa）、EndoS49（trunc4）（50 kDa）及びEndoS49（trunc5）（42 kDa）とした。この酵素の一群を利用して、ヒト糖タンパク質に対するEndoS49のグリカン加水分解活性を分析した。まず、該酵素をヒトIgGとともに一晩インキュベートし、SDS-PAGEゲル及びLCAレクチンブロット（IgGのグリカンのマンノース構造を検出する）で分析した。ゲルにより、EndoS49で処理したIgG重鎖の4 kDaの移動が明らかとなり、LCAレクチンブロットにより、これがN結合型グリカンの欠如による移動であることを確認した（図2A）。EndoS49（E186L）は、いずれの移動も示さず、グリカン組成に変化がなかったことから、E186が、EndoS49の触媒活性に重要な役割を担うことが示唆された。切断型酵素に関しては、EndoS49（trunc1〜4）はIgGのグリカンに対して活性を示したが、最も小さな酵素であるEndoS49（trunc5）（42 kDa）はいずれのグリカン加水分解活性も示さなかった（図2A)。

IgG_1〜4をEndoS49及びEndoS49（E186L）とともに一晩インキュベートすることにより、EndoS49によるIgG脱グリコシル化の更なる分析を実施した。IgGサブクラスを、上記のように分析し、EndoS49が、IgGサブクラスの4つすべてに対し活性を有することが示され、先の結果と一致して、触媒変異体は、いずれの活性も示さなかった（図2B）。酵素の一群をα-1-ミクログロブリン（高度にグリコシル化されたヒト血清タンパク質）とともにインキュベートし、SDS-PAGEで分析することにより、この糖タンパク質に対するEndoS49のグリカン加水分解活性が示された（図2C）。EndoS49の特異性をさらに解明するために、蛍光4-メチルウンベリフェリルを結合したN-アセチル-ベータ-D-グルコサミニドからなるモデル基質をEndoS49とともに1、2、3、4及び16時間インキュベートし、蛍光を測定した。糖が切断されれば蛍光は増大するが、このような強度の上昇は観察されず（データ示さず）、EndoS49が、糖タンパク質基質に対してのみ活性を有することが示唆された。

（IgGに結合するEndoS49）
EndoS49がIgGに対してグリカン加水分解活性を有するという発見により、該酵素がIgGに結合すると考えられた。スロットブロット分析を用いて、EndoS49並びにその触媒変異体及び切断型をPVDFメンブレンに固定し、IgGとともにインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合プロテインGで結合を検出して、これを評価した。スロットブロットは、触媒変異体EndoS49（E186L）によってIgGとの結合が増加することを示す（図3）。

（ndoS49遺伝子はGAS血清型M49に存在する）
ndoS49が、M49以外のいずれかの他の血清型に存在するかどうかを解明するために、ストリンジェントPCRを行い（deployed）、選択したGAS株におけるndoS49遺伝子の存在を分析した。GASコロニー由来の溶解物に対するPCRにおいて、プライマーndoS49-F及びndoS49-Rを、すべてのGAS株に存在するrecA遺伝子を増幅するポジティブコントロールとともに使用した。ndoS49遺伝子は、選択したすべてのGAS M49血清型で増幅され、血清型M60でも増幅されたが、他の血清型ではいずれもPCR産物を生じなかった（表1）。

GAS株NZ131（M49）及びMGAS5005（M1）の配列決定されたゲノムにおいて、ndoS49及びndoSの周囲の遺伝子を比較したところ、遺伝子は同じゲノムコンテキストに位置しており、周囲の遺伝子が高度に保存されていることが明らかとなった（図4）。全長EndoS49を、以前に記載されたエンドグリコシダーゼ（EndoS、EndoC、EndoH、EndoE、EndoF2、EndoF3）から選択したものと比較し、系統樹を再構築した（図5）。これにより、EndoSとEndoCとは、EndoSとEndoS49よりも近縁関係にあり、ストレプトコッカス由来のエンドグリコシダーゼは、他の細菌由来の酵素と比較して近縁関係にあることが明らかとなった。

（EndoS49のタンパク質配列）
NCBIリファレンス配列
NZ131ゲノム：NC_011375.1
ndoS49遺伝子配列：NC_011375.1
EndoS49タンパク質配列：YP_002286383.1
EndoS49タンパク質配列：

実施例2
モノクローナルIg分子は、Fcグリカンのわずかなバリエーションを示し得、結果として、Fcグリカンは、不均一なFcグリカンプールのように見え得る。グリカンの大部分は同一であるが、少数は可変性の炭水化物構造又は組成を示し得る。多様性は、Fc部分の起源（ヒト、ヒト化又は別の種に由来し得る）、並びに産生細胞株及び細胞培養条件の選択の両方に起因する。本実施例では、2つの周知なIgG系薬剤であるアバスチン（Avastin）及びアービタックス（Erbitux）を、EndoS及びEndoS49の両方で脱グリコシル化した。以下の表に記載するように、サンプルをEndoS又はEnodS49とともにインキュベートした。

結果を図6に示す。EndoS49は、EndoSよりも多種類のFcグリカンを切断する能力を有することが分かった。酵素活性の潜在的差異による影響を最小化するためにインキュベーションを一晩中行った場合であっても、EndoS酵素は、アービタックスのFcグリカンを完全には脱グリコシル化できなかった。しかしながら、EndoS49は、完全な脱グリコシル化プロファイルを示し、従って、免疫グロブリンのグリカンプロファイリングに関して言えば、これはより好都合な酵素である。

Claims

（a）配列番号１のアミノ酸配列、又は
（b）少なくとも810個の連続したアミノ酸の領域にわたって配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも95％の同一性を有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのエンドグリコシダーゼ活性を有する、そのバリアント
を含むポリペプチドとともに糖タンパク質をインキュベートすることを含む、糖タンパク質の完全な脱グリコシル化のための方法。
前記インキュベーションにより生成された産物を分析することにより、糖タンパク質のグリコシル化プロファイルを評価することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
（a）糖タンパク質を前記ポリペプチドと接触させて、該糖タンパク質のグリカンを加水分解する工程、
（b）脱グリコシル化タンパク質からグリカンを分離する工程、
（c）そうして生成されたグリカン及び／又は脱グリコシル化タンパク質を分析する工程
を含む、請求項２に記載の方法。
糖タンパク質が、IgG抗体又はモノクローナルIgG抗体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。