CN109311951B - 新型链球菌蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种名为IgdE的新型链球菌蛋白酶，其显示出IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性。本发明还涉及使用所述链球菌蛋白酶切割IgG的体外方法，使用所述方法产生Fc和Fab片段，以及使用所述方法检测IgG。

Description

新型链球菌蛋白酶
技术领域
本发明涉及一种新型链球菌蛋白酶，其显示出IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性。本发明还涉及针对链球菌感染的治疗和疫苗接种，由病原性IgG抗体介导的病症(例如自身免疫疾病)的治疗，以及开发用于生物技术的新工具。
背景技术
致病菌已经进化出定殖和入侵它们宿主的各种策略，并且使用多种致病因子来促进生长并介导对宿主免疫应答的逃避。为了避免明显的灭绝风险，致病菌必须处理先天免疫反应，但最重要的是还必须处理特异性免疫球蛋白。特异性Ig因启动基于补体的和/或基于吞噬细胞的免疫应答而成为适应性免疫系统的核心。Ig由可变抗原识别Fab区组成，该可变抗原识别Fab区通过柔性铰链区与Fc效应部分连接。Fc区介导与吞噬细胞上的特异性受体的接触或通过结合C1q触发补体的经典途径。因此，铰链区是几种微生物蛋白酶的靶标，其例子包括来自化脓性链球菌(S.pyogenes)的IdeS(von Pawel-Rammingen etal.2002.EMBO J.21,1607-161)、来自Porphymonas ginivalis的Gingipain K(Vincentset al.2011.FASEB J.10,3741-3750)和来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的SspA(Prokesováet al.1992.Immunol.Lett.31,259-265)。
链球菌感染常见于人类以及家畜(如猪、马和牛)。链球菌感染的严重程度从相对轻微的疾病到严重的危及生命的疾病。非常需要提供可用于人用和兽用疫苗中的链球菌抗原，用于预防、防治和治疗链球菌感染。
具有严格序列特异性的蛋白酶可用作生物技术工具。降解免疫球蛋白的蛋白酶可以具有医学用途，例如，可以使用特异性降解IgG的蛋白酶来治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症。
发明内容
本发明人已经鉴定、纯化和表征了来自链球菌的新型IgG降解酶家族。这个酶家族称为IgdE，即免疫球蛋白G降解酶，是与以前表征的IdeS家族的链球菌免疫球蛋白降解蛋白酶不同的半胱氨酸蛋白酶，并且以高度特异性介导IgG铰链区的有效切割。
该酶已在以下菌株中得到鉴定：猪链球菌(S.suis)，命名为IgdEsuis；无乳链球菌(S.agalactiae)，命名为IgdEagalactiae；菌株豕链球菌(S.porcinus)，命名为IgdEporcinus；马链球菌(S.equi)，命名为IgdEequi；假豕链球菌(S.pseudoporcinus)，命名为IgdEpseudoporcinus。
来自猪链球菌的IgdE被证明对猪IgG具有高度特异性。与IgM切割蛋白酶IdeSsuis类似，1121个氨基酸大蛋白在蛋白质的N端部分携带蛋白水解活性结构域。全长蛋白质对于体外IgG切割不是必需的，因为由N端470个氨基酸组成的截短的猪链球菌IgdE蛋白保留IgG切割活性。
猪链球菌IgdE对猪IgG的切割恰好发生在铰链区半胱氨酸残基的N端，该残基可能在两条IgG重链之间形成共价二硫键。因此，IgG切割导致形成一个64kDa Fc片段和两个Fab片段。这种切割模式不同于化脓性链球菌(S.pyogenes)的IgG内肽酶IdeS和IdeSsuis，该IdeS水解下铰链区中的IgG，从而产生一个F(ab')2片段和两个相同的1/2Fc片段(von Pawel-Rammingen，同上)，IdeSsuis则切割来自链内二硫键的IgMC端C端，产生游离的1/2Fc片段(Seele et al.2015.J.Vet.Res.46,45)。
猪链球菌可以例如引起人类和猪的脑膜炎。无乳链球菌可以例如引起人类和牛的脑膜炎和败血症。豕链球菌可以例如引起猪的呼吸道感染、猪窒息。马链球菌可以例如引起马的呼吸道感染、窒息。
IgdE家族的蛋白酶可用于预防和治疗链球菌感染，例如用于对链球菌感染免疫的疫苗。IgdE抗体进一步用于被动免疫和治疗与链球菌感染相关的病症。IgdE蛋白酶也可用于开发新型生物技术工具，以及用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症，例如自身免疫疾病、移植排斥、术后治疗和获得性血友病。
因此，在第一方面，本发明提供了分离的IgdE多肽，其用于在对象中产生免疫应答。
分离的IgdE多肽优选为IgdEsuis、IgdEagalactiae、IgdEporcinus、IgdEequi或IgdEpseudoporcinus多肽，或其任何变体或片段，其保留半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生对链球菌的免疫应答。该变体可以是来自另一种细菌的IgdE多肽。该细菌优选是链球菌。
在第一方面的一个实施例中，本发明提供了分离的IgdE多肽，其用于在对象中产生免疫应答，所述IgdE多肽包括：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：1的变体，所述变体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(c)SEQ ID NO：1的片段、SEQ ID NO：1的变体或SEQ ID NO：1的变体的片段，其能够在对象中产生对链球菌(优选猪链球菌)的免疫应答；
(d)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：3的变体，所述变体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(f)SEQ ID NO：3的片段、SEQ ID NO：3的变体或SEQ ID NO：3的变体的片段，其能够在对象中产生对链球菌(优选无乳链球菌)的免疫应答；
(g)SEQ ID NO：5的氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO：5的变体，所述变体与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(i)SEQ ID NO：5的片段、SEQ ID NO：5的变体或SEQ ID NO：5的变体的片段，其能够在对象中产生对豕链球菌的免疫应答；
(i)SEQ ID NO：7的氨基酸序列；
(k)SEQ ID NO：7的变体，所述变体与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(l)SEQ ID NO：7的片段、SEQ ID NO：7的变体或SEQ ID NO：7的变体的片段，其能够在对象中产生对链球菌(优选马链球菌)的免疫应答；或
(m)SEQ ID NO：9的氨基酸序列；
(n)SEQ ID NO：9的变体，所述变体与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(o)SEQ ID NO：9的片段、SEQ ID NO：9的变体、或SEQ ID NO：9的变体的片段，其能够在对象中产生对链球菌(优选假豕链球菌)的免疫应答；
优选地，免疫应答是保护性免疫应答。
优选地，免疫应答产生能够中和免疫对象中感染性链球菌的IgdE的IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性的抗体。
在第一方面的另一个实施例中，本发明提供了在对象中产生免疫应答的方法，其包括向所述对象以IgdE多肽给药。
在第二方面，本发明提供了分离的编码IgdE多肽的多核苷酸，用于在对象中产生免疫应答。
IgdE多肽优选为IgdEsuis、IgdEagalactiae、IgdEporcinus、IgdEequi或IgdEpseudoporcinus多肽，或其变体或片段，其保留半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生对链球菌的免疫应答。所述变体可以是来自另一种细菌的IgdE多肽。所述细菌优选是链球菌。
在第二方面的一个实施例中，本发明提供了编码IgdE多肽的多核苷酸，用于在对象中产生免疫应答，所述多核苷酸包括：
(a)编码如上定义的多肽SEQ ID NO：1或其变体或片段的序列；
(b)编码如上定义的多肽SEQ ID NO：3或其变体或片段的序列；
(c)编码如上定义的多肽SEQ ID NO：5或其变体或片段的序列；
(d)编码如上定义的多肽SEQ ID NO：7或其变体或片段的序列；
(e)编码如上定义的多肽SEQ ID NO：9或其变体或片段的序列。
在第二方面的另一个实施例中，本发明提供了编码IgdE多肽的多核苷酸，用于在对象中产生免疫应答，所述多核苷酸包括：
(a)SEQ ID NO：2或其互补序列；
(b)因(a)中定义的序列的遗传密码所产生的简并序列；
(c)在严格条件下与(a)或(b)中定义的序列杂交的序列；
(d)与(a)或(b)中定义的序列具有至少70％一致性的序列；
(e)(a)、(b)、(c)或(d)中任一序列的片段，所述片段编码具有IgdE半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生针对链球菌，优选猪链球菌的免疫应答的多肽。
(f)SEQ ID NO：4或其互补序列；
(g)因(f)中定义的序列的遗传密码而产生的简并序列；
(h)在严格条件下与(f)或(g)中定义的序列杂交的序列；
(i)与(f)或(g)中定义的序列具有至少70％一致性的序列；
(j)(f)、(g)、(h)或(i)中任一序列的片段，所述片段编码具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生针对链球菌(优选无乳链球菌)的免疫应答的多肽。
(k)SEQ ID NO：6或其互补序列；
(l)因(k)中定义的序列的遗传密码而产生的简并序列；
(m)在严格条件下与(k)或(l)中定义的序列杂交的序列；
(n)与(k)或(l)中定义的序列具有至少70％一致性的序列；
(o)(k)、(l)、(m)或(n)中任一序列的片段，所述片段编码具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生针对链球菌(优选豕链球菌)的免疫应答的多肽。
(p)SEQ ID NO：8或其互补序列；
(q)因(p)中定义的序列的遗传密码而产生的简并序列；
(r)在严格条件下与(p)或(q)中定义的序列杂交的序列；
(s)与(p)或(q)中定义的序列具有至少70％一致性的序列；或
(t)(p)、(q)、(r)或(s)中任一序列的片段，所述片段编码具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生针对链球菌(优选马链球菌)的免疫应答的多肽；
(u)SEQ ID NO：10或其互补序列；
(v)因(u)中定义的序列的遗传密码而产生的简并序列；
(w)在严格条件下与(u)或(v)中定义的序列杂交的序列；
(x)与(u)或(v)中定义的序列具有至少70％一致性的序列；
(y)(u)、(v)、(w)或(x)中任一序列的片段，所述片段编码具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生针对链球菌(优选假豕链球菌)的免疫应答的多肽。
优选地，免疫应答是保护性免疫应答。
优选地，免疫应答产生能够中和免疫对象中感染性链球菌的IgdE的IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性的抗体。
在第二方面的另一个实施例中，本发明提供了在对象中产生免疫应答的方法，其包括向所述对象以编码IgdE多肽的多核苷酸给药。
在第三方面，本发明提供分离的IgdE多肽，其用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症。
IgdE多肽优选为IgdEsuis、IgdEagalactiae、IgdEporcinus、IgdEequi或IgdEpseudoporcinus多肽，或其任何变体或片段，其保留半胱氨酸蛋白酶活性。所述变体可以是来自另一种细菌的IgdE多肽。所述细菌优选是链球菌。
在第三方面的一个实施例中，本发明提供IgdE多肽，其用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症，所述IgdE多肽包括：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：1的变体，所述变体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(c)SEQ ID NO：1的片段或SEQ ID NO：1的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(d)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：3的变体，所述变体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(f)SEQ ID NO：3的片段或SEQ ID NO：3的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(g)SEQ ID NO：5的氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO：5的变体，所述变体与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(i)SEQ ID NO：5的片段或SEQ ID NO：5的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(j)SEQ ID NO：7的氨基酸序列；
(k)SEQ ID NO：7的变体，所述变体与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(l)SEQ ID NO：7的片段或SEQ ID NO：7的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(m)SEQ ID NO：9的氨基酸序列；
(n)SEQ ID NO：9的变体，所述变体与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(o)EQ ID NO：9的片段或SEQ ID NO：9的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(p)SEQ ID NO：11的氨基酸序列；
(q)SEQ ID NO：11的变体，所述变体与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；或
(r)SEQ ID NO：11的片段或SEQ ID NO：11的变体的片段，所述片段具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性。
优选地，IgdE多肽可以是IgdEagalactiae多肽，所述多肽包括：
(d)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：3的变体，所述变体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(f)SEQ ID NO：3的片段或SEQ ID NO：3的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性。
在第三方面的另一个实施例中，本发明提供了治疗、预防或防治由IgG抗体介导的疾病或病症的方法，所述方法包括以治疗有效量的IgdE多肽向对象给药。
由IgG抗体介导的疾病或病症可以是自身免疫疾病、移植排斥、手术后治疗和获得性血友病。
在第四方面，本发明提供了用于切割IgG的体外方法，所述方法包括使IgG与具有半胱氨酸蛋白酶活性的IgdE多肽接触。
IgdE多肽优选为IgdEsuis、IgdEagalactiae、IgdEporcinus、IgdEequi或IgdEpseudoporcinus多肽，或其任何变体或片段，其保留半胱氨酸蛋白酶活性。所述变体可以是来自另一种细菌的IgdE多肽。所述细菌优选是链球菌。
在第四方面的一个实施例中，本发明提供了用于切割IgG的体外方法，所述方法包括使IgG与IgdE多肽接触，所述IgdE多肽包括：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：1的变体，所述变体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(c)SEQ ID NO：1的片段或SEQ ID NO：1的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(d)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：3的变体，所述变体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(f)SEQ ID NO：3的片段或SEQ ID NO：3的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(g)SEQ ID NO：5的氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO：5的变体，所述变体与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(i)SEQ ID NO：5的片段或SEQ ID NO：5的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(j)SEQ ID NO：7的氨基酸序列；
(k)SEQ ID NO：7的变体，所述变体与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(l)SEQ ID NO：7的片段或SEQ ID NO：7的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(m)SEQ ID NO：9的氨基酸序列；
(n)SEQ ID NO：9的变体，所述变体与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(o)SEQ ID NO：9的片段或SEQ ID NO：9的变体的片段，所述片段具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(p)SEQ ID NO：11的氨基酸序列；
(q)SEQ ID NO：11的变体，所述变体与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；或
(r)SEQ ID NO：11的片段或SEQ ID NO：11的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性。
优选地，IgdE多肽可以是IgdEagalac多肽，其包括：
(d)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：3的变体，所述变体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；或
(f)SEQ ID NO：3的片段或SEQ ID NO：3的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性。
在第四方面的另一个实施例中，本发明提供了用于产生IgG的Fc或Fab片段的体外方法，所述方法包括使IgG与具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性的IgdE多肽接触。
在第五方面，本发明提供了用于鉴定激活或抑制IgdE多肽的IgG半胱氨酸活性的物质的方法。所述方法可以包括：
a)在不存在候选物质亦允许IgG半胱氨酸活性的条件下，使IgdE多肽和IgG与该物质接触，
b)与不存在候选物质的情况相比，确定在所述物质存在下消化的IgG的量，
c)由此确定该物质是否激活或抑制IgdE多肽的IgG半胱氨酸活性。
可以如实施例1中所述进行IgG降解的定量分析。
可以根据本发明所述的方法测试的候选化合物包括简单的有机分子，通常称为“小分子”，例如分子量小于2000道尔顿的有机分子。该方法还可用于筛选化合物库，例如肽库，包括合成肽库和肽噬菌体库。其他合适的分子包括多核苷酸序列和任何调节IgdE的IgG降解活性的其他分子。
附图说明
图1.猪链球菌培养物上清液中的IgG降解活性。
(A)将猪链球菌菌株10和10Δide Ssuis的浓缩(20x)培养物上清液与2％猪血浆在37℃培养16小时，并在还原条件下通过SDS-PAGE分析。观察到约32kDa的降解产物(*)。(B)通过硫酸铵沉淀分级的猪链球菌菌株10的培养物上清液的抗IgG蛋白质印迹分析。1％猪血浆与20-40％和40-60％硫酸铵饱和级分在37℃培养16小时后获得IgG降解产物(*)。显示蛋白质大小标准的泳道1是在检测化学发光信号之前的膜的照片图。(C)所有测试血清型的猪链球菌菌株的培养物上清液切割IgG。将浓缩的(10x)培养物上清液与1％猪血浆在37℃培养16小时，并通过抗IgG蛋白质印迹分析。在所有泳道中观察到不同强度的约32kDa的IgG裂解产物(*)。不同的蛋白质印迹的图像已组合成一个图。
图2.猪链球菌IgdE的活性位点的鉴定。
(A)IgdE和具有潜在活性位点残基取代和C端截短变体的不同rIgdE构建体示意图。分泌信号肽(残基1-37)以浅灰色标记，转谷氨酰胺酶结构域以加框显示并指示潜在的活性位点残基和取代。(B)将3.3μM猪IgG在37℃下与表达不同rIgdE构建体的大肠杆菌细胞的可溶性级分一起培养16小时。在还原条件下分析反应的SDS-PAGE。与rIgdE、rIgdED348A和rIgdEΔC培养后发生IgG切割(*)，但与rIgdEC302S或rIgdEH333A培养后不发生。37kDa的弱蛋白质条带是裂解物制备中存在的污染物，与IgdE活性无关。图3.重组猪链球菌IgdE的时程和抑制剂方面。
通过连续取样，继而在还原条件下用考马斯福陆橙染色SDS-PAGE，然后对裂解产物进行光密度定量，来监测切割的时间过程(A)。将1.67μM猪IgG与0.2μM纯化的rIgdEΔC一起培养。过夜切割(16h)设定为100％相对切割。对于抑制剂方面(B)，监测在250μM和2.5μM的每种抑制剂存在下的初始切割。无抑制对照的初始切割活性设定为100％相对活性。DMSO对照与250μM Z-LVG-CHN2有相关性。数据表示为三次实验的平均值±SEM。通过Dunnett多重比较测试，分析无抑制对照(*)或DMSO对照(¤)的差异，其显著性设定为P值<0.05(*)，<0.01(**)和<0.001(***或¤¤¤)。
图4.猪链球菌IgdE切割铰链区中的猪IgG重链。
通过非还原(A)和还原(B)考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析反应。将3.3μM IgG与(+)或不与(-)10nM纯化rIgdE在37℃培养16小时。(C)观察到的切割模式和切割位点可假设一种模型，其中一条IgG重链首先被IgdE水解，产生一个游离的Fab片段(Fab)和单个切割IgG(scIgG)，并且在第二步中，另一条重链被水解，产生一个Fc片段(Fc)和两个Fab片段。
图5.IgdE对猪IgG具有高度特异性。
(A)将2％猪血浆与(+)或不与(-)10nM纯化rIdgE一起培养。在还原条件下通过抗猪IgG、IgM和IgA蛋白质印迹分析反应。仅观察到IgG的切割(*)。(B)将0.5mg/ml不同物种的IgG与(+)或不与(-)10nM纯化rIgdE一起培养，并在还原条件下通过SDS-PAGE分析。没有观察到来自猪(*)之外的任何其他物种的IgG的切割。37kDa的弱蛋白质条带是裂解物制备中存在的污染物(参见泳道2)，与IgdE活性无关。不同的蛋白质印迹的图像已组合成一个图。
图6.猪链球菌IgdE的内源性IgG的降解
在健康猪和具有各自损伤的猪的所有测试体液中以猪链球菌IgdE降解内源IgG。(尺寸用箭头表示)。没有观察到其他降解产物。将体液与(+)或不与(-)10nM纯化rIgdE在37℃培养16小时。在还原条件下通过SDS-PAGE(A)和抗IgG蛋白质印迹(B)分析反应。显示蛋白质大小标准的泳道是在检测化学发光信号之前膜的照片图像。不同的胶的图像已组合成一个图。
图7.IgdE对于猪链球菌切割IgG是必需的，IgG切割与IdeSsuis无关。
将猪链球菌菌株10、10ΔigdE、10ΔideSsuis和10ΔideSsuisΔigdE的浓缩(10x)上清液与1％猪血浆在37℃培养16小时。在还原条件下通过抗IgG蛋白质印迹(A)或抗IgM蛋白质印迹(B)分析反应。仅当与菌株10和10ΔideSsuis的上清液一起培养时才观察到IgG降解(*)，同时仅在与菌株10和10ΔigdE的上清液培养时观察到IgM降解(*)。
图8.在猪链球菌培养物上清液中检测到的IgG降解活性抑制剂方面。
在类别特异性蛋白酶抑制剂存在下，将猪链球菌菌株10的浓缩(10x)培养物上清液与猪血浆一起培养。在还原条件下通过抗IgG蛋白质印迹分析反应。当与0.1-1mM AEBSF、0.1-5mM EDTA、50μM E-64一起培养，且没有任何抑制剂和1/200稀释的完全抑制剂混合物(用星号标记)时，可以观察到IgG的切割产物，而当与5mM AEBSF、250μM E-64一起培养，且没有浓缩上清液(-C)、0.1-5mM Z-LVG-CHN2、0.1-5mM碘乙酰胺和1/50稀释的完全抑制剂混合物时，观察不到降解产物。
图9.代表性的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶监测rIgdEΔC纯化。
从携带表达质粒的IPTG诱导的大肠杆菌的裂解物中纯化rIgdEΔC。将含有His-ZZ标记的rIgdEΔC的Ni2+-亲和层析纯化的洗脱液与Tev-蛋白酶一起培养以除去His-ZZ-标签，然后进行第二轮Ni2+-亲和层析纯化。合并该纯化步骤中的含有未标记的rIgdEΔC的级分2和3的液流，将缓冲液换成PBS并用于进一步的实验。由于rIgdEΔC的部分降解，在这些级分中可以观察到两个约50kDa的主要条带。
图10.rIgdEagalactiae特异性切割人IgG1。
(A)将rIgdEagalactiae与六种不同物种的多克隆IgG在37℃下培养18小时，并在还原条件下通过SDS-PAGE分析。降解产物用星号(*)表示。已经使用不同胶的图像来创建该图。(B)将rIgdEagalactiae与人或牛血清在37℃下培养18小时，并在还原条件下通过SDS-PAGE分析。降解产物用星号(*)表示。(C)rIgdEagalactiae的粗提取物在37℃下与人和猪血清一起培养18小时并进行蛋白质印迹。分别用针对人和猪多克隆IgG的抗体处理膜。降解产物用星号(*)表示。(D)将rIgdEagalactiae与人IgG的亚类以及人IgA和IgM在37℃下培养18小时，并在还原条件下通过SDS-PAGE分析。降解产物用星号(*)表示。使用不同胶的图像来创建该图。
图11.rIgdEagalactiae将人血清IgG1完全降解为单个切割IgG1。
将人血清和单克隆人IgG1在存在(+)或不存在(-)rIgdEagalactiae的情况下于37℃培养18小时，并在非还原条件下用人IgG1特异性抗体通过蛋白质印迹分析。
图12.rIgdEequi仅切割马IgG7。
将0.6μM重组马IgG亚型或血清IgG在37℃下与(+)或不与(-)表达rIgdEequi的大肠杆菌细胞的可溶性级分一起培养16小时。在还原条件下分析反应的SDS-PAGE。与IgG7和血清IgG一起培养时发生IgG切割(*)。SDS-PAGE用考马斯福陆橙蛋白凝胶染色剂(A)染色或用兔抗马IgG H&L(HRP)ab6921进行蛋白质印迹(B)分析。
具体实施方式
序列简要说明
SEQ ID NO：1是从猪链球菌菌株10分离的IgdE的氨基酸序列。来自猪链球菌的IgdE的其他氨基酸序列可以是例如在GenBank中找到的如下登记号：WP_012027720.1、WP_044687717.1、WP_045002893.1、WP_044981166.1、WP_044770432.1、WP_043041527.1、WP_014917307.1、WP_044981141.1、WP_044766031.1、WP_044780628.1、WP_044980481.1、WP_044768304.1、WP_043033176.1、WP_044772573.1、ABQ42883.1、ABQ42882.1、ABQ42884.1、ABQ42885.1、WP_024402604.1、WP_044671803.1、WP_014639000.1、WP_014636499.1、WP_044475270.1、WP_044683049.1、WP_044682603.1、WP_044982674.1、WP_024406212.1、WP_024402376.1、WP_024382860.1、WP_044684005.1、WP_044688055.1、WP_044754153.1、WP_024412941.1、WP_029172805.1、AER15932.1、WP_024414493.1、WP_044762560.1、WP_024417771.1、WP_044675281.1、WP_044666819.1、WP_043032980.1、WP_044671755.1、WP_024416363.1、ABL84354.1、ABL84413.1、WP_044758899.1、WP_024393919.1、WP_014736321.1、WP_024383620.1、WP_044475488.1、WP_024386700.1、WP_024381951.1、WP_024390579.1、WP_023371419.1、WP_044772576.1、WP_044766774.1、WP_044672596.1、WP_043028752.1、WP_044771508.1、WP_024383851.1、WP_024388957.1、WP_024394959.1、WP_029174632.1、WP_044752120.1、WP_044678077.1、WP_002938262.1、WP_044769991.1、WP_044770681.1、WP_044749736.1和WP_044771392.1。
SEQ ID NO：2是编码从猪链球菌菌株10分离的IgdE的核酸序列。
SEQ ID NO：3是从无乳链球菌菌株CCUG4208分离的IgdE的氨基酸序列。来自无乳链球菌的IgdE的其他氨基酸序列可以是例如在GenBank中找到的如下登记号：EPU21342.1、EFV98161.1、CAD47554.1、EPU23939.1、EPW71972.1、EPT99261.1、EPV90329.1、EGS26825.1、EPV84888.1、CFQ52811.1、EPT84780.1、EPT99074.1、CCW42936.1、CCW40848.1、EAO70450.1、EPU74838.1、EPT51236.1、EPU77761.1、EPT36280.1、WP_011058381.1、EPT59860.1、EPT39170.1、EPT38734.1、CFQ25568.1、EPU40877.1、WP_025193619.1、WP_000440329.1、WP_000440333.1、WP_000440330.1、WP_000440331.1、WP_047199154.1、WP_001901206.1、WP_025193273.1、WP_025194923.1、WP_000440334.1、WP_025195559.1、WP_047200043.1、WP_041165773.1、EPU33307.1、CFW66620.1、WP_041981191.1、WP_000440332.1、WP_047200261.1、WP_029692083.1、WP_017770870.1、WP_025197885.1、EAO75153.1、WP_001884472.1、EAO62452.1、WP_025195776.1、WP_047200280.1、CFW66618.1和EAO75155.1。
SEQ ID NO：4是编码从无乳链球菌菌株CCUG4208分离的IgdE的核酸序列。
SEQ ID NO：5是从豕链球菌菌株DSM20725分离的IgdE的氨基酸序列。来自豕链球菌的IgdE的其他氨基酸序列可以是例如在GenBank中找到的如下登记号：WP_003085269.1。
SEQ ID NO：6是编码从豕链球菌菌株DSM20725分离的IgdE的核酸序列。
SEQ ID NO：7是从马链球菌菌株ssp zooepidemicus#1分离的IgdE的氨基酸序列。来自马链球菌的IgdE的其他氨基酸序列可以是例如在GenBank中找到的如下登记号：KDE01980.1、KIS07668.1、KIS08707.1、KIS19971.1、WP_043038795.1、WP_043036602.1、WP_037584076.1、KIS20896.1、AIA68804.1、WP_043029522.1、WP_012678259.1、WP_042670323.1、WP_043040324.1和WP_014622546.1。
SEQ ID NO：8是编码从马链球菌菌株ssp zooepidemicus#1分离的IgdE的核酸序列。
SEQ ID NO：9是从假豕链球菌菌株
Figure BDA0001821883650000121
BAA-1381分离的IgdE的氨基酸序列。来自假豕链球菌的IgdE的氨基酸序列可以是例如在GenBank中找到的如下登记号：WP_007895676.1。
SEQ ID NO：10是编码从假豕链球菌菌株ATCC BAA-1381分离的IgdE的核酸序列。
SEQ ID NO：11是从猪链球菌中分离的IgdE的C端截短变体的氨基酸序列。
IgdE多肽
根据本发明所述的IgdE多肽优选为IgdEsuis,、IgdEagalactiae、IgdEporcinus、IgdEequi或IgdEpseudoporcinus多肽，或其任何变体或片段，其保留半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中引起对链球菌的免疫应答。所述变体可以是来自另一种细菌的IgdE多肽。所述细菌优选是链球菌。
IgdE多肽可包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11的氨基酸序列；或其任何一种变体，所述变体与SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11中的任一个氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；或SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11的片段；或其任何一种变体，所述变体具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性。
IgdE多肽可包含SEQ ID NO：1、3、5,、7、9、11的氨基酸序列；或其任一变体，所述变体与SEQ ID NO：1、3、5,、7、9或11中的任一氨基酸序列具有至少70％的一致性并且能够在对象者中引起对链球菌的免疫应答；或SEQ ID NO：1、3、5,、7、9、11的片段；或其任一变体，所述变体能够引起对象对链球菌的免疫应答。
所述链球菌可以是猪链球菌、无乳链球菌、豕链球菌、马链球菌或假豕链球菌。
优选地，所述多肽包含SEQ ID NO：1、3、5,、7、9或11中任一序列或由其组成。
多肽可另外包含信号序列或N端甲硫氨酸。
变体多肽是氨基酸序列与SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11分别不同，但保留与IgdE相同的本质特征或基本功能的多肽。因此，变体多肽可以显示IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性，和/或在对象中引起对链球菌的免疫应答。优选地，免疫应答是保护性免疫应答。优选地，免疫应答产生能够中和免疫对象中感染性链球菌的IgdE的IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性的抗体。显著可见地，缺乏IgG半胱氨酸蛋白酶活性的IgdE变体仍然能够引起免疫应答，产生能够中和免疫对象中感染性链球菌的IgdE的IgG半胱氨酸蛋白酶活性的抗体。这种IgdE变体包括在根据本发明所述的IgdE变体中。
通常，与SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的氨基酸序列具有超过约70％一致性，优选至少80％、至少90％、特别优选至少95％、至少97％或至少99％一致性的多肽，被认为是蛋白质的变体。这种变体可以包括等位基因变体和蛋白质序列内单个氨基酸或氨基酸组的缺失、修饰或添加，只要该肽保持基本的IgdE功能。可以在如SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11所示序列上的至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少275个、至少300个或更多个连续氨基酸的区域上，或更优选为在SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的全长区域上测量SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的变体的一致性。应当理解，如上所列的任何上限均可与如上所列的任何下限组合，以提供本发明多肽长度的范围。例如，多肽可以是50至250个氨基酸的长度，或可以是100至300个氨基酸其长度。多肽可以是100至586个氨基酸的长度，可以是150至500个氨基酸长度或可以是100至400个氨基酸长度。
可以使用任何合适的算法计算氨基酸一致性。例如，UWGCG包提供BESTFIT程序，该程序可用于计算同源性(例如，在其默认设置下使用)(Devereux et al.(1984)NucleicAcids Research 12,387-395)。PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或排列序列(例如识别等效序列或相应序列(通常在其默认设置下)，例如Altschul S.F.(1993)J MoI Evol36:290-300；Altschul,S,F et al.(1990)J MoI Biol 215:403-10中所述。
用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。这种算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字组来识别高评分序列对(HSP)，所述短字组在与数据库序列中的相同长度的字对齐时匹配或满足某个正值阈值得分T。T被称为邻域字组得分阈值(Altschul et al.，同上)。这种初始邻域字组的命中作为种子用于启动搜索，以找到包含它们的HSP。字组命中沿着每个序列双扩大，直至累积比对得分可增加的最大点。在以下情况下，各方向上的字组命中的扩大停止：累积比对得分从其最大实现值的下降量达X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积评分变为零或以下；或达到任一序列的结尾。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序默认使用字长(W)为11，BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.ScL USA 89:10915-10919)比对(B)为50，期望(E)为10，M＝5，N＝4，以及两段的比较。
BLAST算法对两个序列之间的相似性进行统计分析；参见，例如Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小和概率(P(N))，其指示了两个多核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率。例如，如果第一序列与第二序列的比对中的最小和概率小于约1，优选地小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为序列与另一序列相似。
变体序列的差异通常存在于至少1、2、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸位置(其可能是氨基酸的取代、删除或插入)。例如，可以进行1至50、2至30、3至20或5至10个氨基酸取代、删除或插入。取代优选为保守取代，例如根据下表1。第二列中相同嵌段中的氨基酸，优选在第三列中的相同行中的氨基酸，可以彼此取代：
表1.
Figure BDA0001821883650000141
除非另有说明，否则所述修饰优选为保守氨基酸取代。保守取代用具有相似化学结构、相似化学性质或类似侧链体积的其他氨基酸取代氨基酸。引入的氨基酸可以具有与它们取代的氨基酸相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。可选地，保守取代可以引入另一种芳族或脂族氨基酸取代预先存在的芳族或脂族氨基酸。保守氨基酸变化在本领域中是公知的，并且可以根据下表A1中定义的20种主要氨基酸的性质进行选择。当氨基酸具有相似的极性时，这可以通过参考表A2中氨基酸侧链的亲水性尺度来确定。
表A1-氨基酸化学性质
Figure BDA0001821883650000142
Figure BDA0001821883650000151
表A2亲水性尺度
Figure BDA0001821883650000152
优选地，多肽包含通常在半胱氨酸蛋白酶中间隔存在的半胱氨酸残基和组氨酸残基。例如，在SEQ ID NO：1中，这些残基位于302位和333位。在348位发现完成催化三联体的天冬氨酸残基。
用于本发明的IgdE多肽片段通常长度为至少10个，例如至少15、20、25、30、40、50个或更多个氨基酸，长度为最多100、150、200、250或300个氨基酸，只要该片段保留IgdE的IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中引起对链球菌的免疫应答。
用于本发明的多肽可以经过化学修饰，例如，翻译后修饰。例如，它们可以被糖基化、磷酸化或包含修饰的氨基酸残基。它们可以通过添加组氨酸残基来修饰，以帮助纯化或通过添加信号序列来促进插入细胞膜内。这种修饰的多肽落入本文使用的术语“多肽”的范围内。
通常，根据本发明使用的多肽显示免疫球蛋白半胱氨酸蛋白酶活性，特别是IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性。优选地，多肽在铰链区切割IgG，更特别地，在重链的铰链区切割IgG。优选地，切割导致IgG的Fc和Fab片段的产生。优选地，该活性对IgG具有特异性。可以通过合适的测定法来确定IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性。例如，可以在合适的温度(例如37℃)下将测试多肽与IgG一起培养。然后可以通过SDS PAGE分析起始材料和反应产物，以确定是否存在所需的IgG切割产物。通常，该切割产物是32kDa片段。通常，在此第一次切割后没有IgG的进一步降解。可以对切割产物进行N端测序以验证IgG的铰链区中发生了切割。
多肽的半胱氨酸蛋白酶活性可以通过抑制研究进一步表征。优选地，其活性被肽衍生物Z-LVG-CHN2和/或被蛋白酶抑制剂碘乙酸抑制。
多肽的IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性通常是对IgG有特异性的，因为当在允许IgG切割的条件下与这些免疫球蛋白一起培养时，多肽不会降解其他类别的Ig，即IgM和IgA。发现来自猪链球菌、豕链球菌和假豕链球菌的IgdE对猪IgG具有特异性。发现来自无乳链球菌的IgdE对人IgG，特别是人IgG1具有特异性。发现来自马链球菌的IgdE对马IgG，特别是马IgG7具有特异性。
用于本发明的多肽可以是基本上分离的形式。应当理解，多肽可以与载体或稀释剂混合，该载体或稀释剂不会干扰多肽的预期目的，并且多肽仍然被认为是基本上分离的。用于本发明的多肽也可以是基本上纯化的形式，在这种情况下，它通常在制剂中包含所述多肽，其中该制剂中超过50％，例如超过80％、90％、95％或99％重量的多肽是本发明的多肽。
用于本发明的多肽可以从任何表达IgdE多肽的合适生物中分离。通常，IgdE多肽从合适的表达链球菌的IgdE菌株中分离。可通过许多技术鉴定合适的生物和菌株。例如，最初可以测试链球菌菌株是否存在igdE基因。可以基于例如SEQ ID NO：2、4、6、8或10设计多核苷酸引物或探针。合适的引物的例子列于SEQ ID NO：12-22。然后可以通过PCR使用引物或通过探针与菌株的基因组DNA杂交来验证igdE基因的存在。
多核苷酸
根据本发明所述的多核苷酸可以包含以下或由以下组成：(a)SEQ ID NO：4、5、6、8或10的编码序列；(b)因(a)中定义的序列的遗传密码而产生的简并序列；(c)与(a)或(b)中定义的序列具有至少70％一致性的序列，所述序列编码具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中引起对链球菌的免疫应答的多肽；或(d)(a)、(b)或(c)中定义的任一序列的片段，所述片段编码具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中引起对链球菌的免疫应答的多肽。
通常，所述多核苷酸是DNA。然而，所述多核苷酸可以是RNA多核苷酸。所述多核苷酸可以是单链或双链的，并且可以在其中包括合成或修饰的核苷酸。本发明的多核苷酸通常可以以显著高于背景的水平与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的编码序列或编码序列的互补序列杂交。背景杂交可能在例如DNA库中存在其他DNA的情形下发生。由本发明的多核苷酸与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的编码序列或编码序列的互补序列之间的相互作用产生的信号水平通常为至少10倍，优选至少100倍强于其他多核苷酸与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的编码序列之间的相互作用。例如，可以通过放射性标记探针例如32P测量相互作用的强度。通常可以使用中度至高度严格的条件实现选择性杂交。然而，这种杂交可以在任何本领域已知的合适条件下进行(参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1989)。例如，如果要求高严格度，合适的条件包括在60℃至65℃下0.1至0.2×SSC。如果严格性要求较低，合适的条件包括在60℃下2×SSC。
SEQ ID NO：2、4、6、8或10的编码序列可以通过核苷酸取代来修饰，例如1、2或3至10、25、50或100个取代。可选地或另外地，SEQ ID NO：2、4、6、8、10的多核苷酸可以通过一个或多个插入和/或删除和/或通过任一端或两端的延伸进行修饰。还可以包括诸如信号序列的附加序列。修饰的多核苷酸通常编码具有IgdE特异性半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中引起对链球菌的免疫应答的多肽。可以进行简并取代和/或可以进行在修饰序列翻译后产生保守氨基酸取代的取代，例如如上表1中所示。
能够与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的DNA编码序列的互补序列选择性杂交的核苷酸序列，通常分别在SEQ ID NO：2、4、6、8或10的至少20个，优选至少30个，例如至少40个、至少60个，更优选至少100个连续核苷酸的区域上，或最优选地，在SEQ ID NO：2、4、6、8或10的全长的区域上，与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的编码序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性。序列一致性可以通过任何合适的方法，例如如上所述方法确定。
上述序列一致性程度和最小大小的任何组合均可用于定义本发明的多核苷酸，优选更严格的组合(即在较长序列上的较高序列一致性)。因此，在构成本发明的一个方面中，例如，为在超过20个，优选超过30个核苷酸上具有至少90％序列一致性的多核苷酸，还有在40个核苷酸上具有至少95％序列一致性的多核苷酸。多核苷酸片段的长度优选为至少10个，优选至少15个或至少20个，例如至少25个，至少30个或至少40个核苷酸。它们的长度通常多至40、50、60、70、100或150个核苷酸。片段长度可以超过150个核苷酸，例如其长度可以高达200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸，或甚至分别比SEQ ID NO：2、4、6、8或10的编码序列短几个核苷酸，例如5、10或15个核苷酸。
用于本发明的多核苷酸可以重组、合成或任何通过本领域技术人员可获得的方法生产。它们也可以通过标准技术克隆。多核苷酸通常以分离的和/或纯化的形式提供。
通常，短多核苷酸通过合成方法产生，包括一次一个核苷酸地逐步制备所需的核酸序列。使用自动化技术实现此目的的技术在本领域中是容易获得的。
通常使用重组方法生产更长的多核苷酸，例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。这将涉及制备需要克隆的igdE基因区域的一对引物(例如约15-30个核苷酸)到，使所述引物与从细菌细胞获得的DNA接触，在允许所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离已扩增片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。可以将引物设计成含有合适的限制酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到合适的克隆载体中。合适的引物是例如SEQ ID NO：12-22中的引物。
此类技术可用于获得本文所述的全部或部分igdE基因序列。虽然通常本文提到的技术在本领域中是公知的，但是可以特别参考Sambrook et al.(1989)。如本文所述的IgdE多核苷酸可用于生产用于本发明的多肽，其可以在体外、体内或离体生产。多核苷酸本身可以用作治疗剂，或者可以参与重组蛋白质合成。
通常将用于本发明的多核苷酸掺入重组可复制载体中。该载体可用于在相容的宿主细胞中复制核酸。因此，可以通过将IgdE多核苷酸引入可复制载体，将载体引入相容的宿主细胞中，并在允许载体复制的条件下培养宿主细胞来制备用于本发明的多核苷酸。
优选地，所述载体是包含编码IgdE多肽的核酸序列的表达载体。这种表达载体在分子生物学领域中为常规构建，并且可以例如涉及使用质粒DNA和适当的引发剂、启动子、增强子和其他元件，例如聚腺苷酸化信号，该信号可能是必需的并且位于正确的方向，以允许蛋白质表达。其他合适的载体对于本领域技术人员而言是显而易见的。作为这方面的进一步示例，我们参考Sambrook et al..(1989)。
优选地，载体中用于本发明的多核苷酸与控制序列可操作地连接，所述控制序列能够提供编码序列在宿主细胞中表达，即载体是表达载体。术语“可操作地连接”是指并置，其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。与编码序列“可操作地连接”的调节序列，例如启动子，以这样的方式定位：在与调节序列相容的条件下实现编码序列的表达。
所述载体可以是例如具有复制起点的质粒、病毒或噬菌体载体，可选地用于表达所述多核苷酸的启动子，和可选地启动子调节子。所述载体通常适于在体内使用。
可以选择启动子和其他表达调节信号以与设计表达的宿主细胞相容。可以使用哺乳动物启动子，例如β-肌动蛋白启动子。组织特异性启动子是特别优选的。也可以使用病毒启动子，例如Moloney小鼠白血病病毒长末端重复序列(MMLV LTR)、rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、人巨细胞病毒(CMV)IE启动子、腺病毒、HSV启动子(例如HSV IE启动子)或HPV启动子，特别是HPV上游调节区(URR)。病毒启动子在本领域中是容易获得的。所述载体可以进一步包括多核苷酸侧翼上的序列，从而产生包含与真核基因组序列同源的序列的多核苷酸，优选哺乳动物基因组序列。这允许通过同源重组将本发明的多核苷酸引入真核细胞的基因组中。特别地，包含侧翼为病毒序列的表达盒的质粒载体，可用于制备适于将本发明的多核苷酸递送至哺乳动物细胞的病毒载体。合适的病毒载体的其他例子包括单纯疱疹病毒载体和逆转录酶病毒，包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和HPV病毒。使用这些病毒的基因转移技术是本领域技术人员已知的。例如，逆转录病毒载体可用于将产生多核苷酸的多核苷酸稳定整合到宿主基因组中。相反，复制缺陷型腺病毒载体保持游离基因，因此允许瞬时表达。
疾病和病症
IgdE多肽或多核苷酸可用于治疗或预防由致病性IgG抗体介导的疾病或病症。本领域众所周知，致病性IgG抗体参与许多不同疾病和病症的发病机理。因此，可以使用IgdE多肽或多核苷酸抑制病原性IgG抗体在这些疾病中的作用。
所述疾病或病症可以是自身免疫疾病。这样的疾病包括艾迪生氏病(Addison'sdisease)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性胃炎、自身免疫性听力丧失、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状旁腺机能减退、自身免疫性垂体炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性多内分泌腺病、白塞氏病(Bechet'sdisease)、大疱性类天疱疮、心肌病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、许尔-斯特劳斯(Churg-Strauss)综合征、乳糜泻、克罗恩氏病(Crohn's disease)、CREST综合征、恶性萎缩性丘疹病(Degos disease)、获得性大疱性表皮松解、原发性混合型冷球蛋白血症、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征(Goodpasture's syndrome)、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、格林-巴利综合征(Guillan-Barre syndrome)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、特发性血小板减少性紫癜、炎性肠病、川崎氏病(Kawasaki'sdisease)、美尼尔氏综合症(Meniere's syndrome)、混合性结缔组织病、蚕蚀性角膜溃疡、多发性硬化、重症肌无力、落叶型天疱疮、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、1型多腺体自身免疫综合征(PAS-I)、2型多腺自身免疫综合征的(PAS-2)、3型多腺体自身免疫综合征(PAS-3)、多发性肌炎/皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、银屑病关节炎、雷诺氏综合征(Raynaud's syndrome)、瑞特尔氏综合征(Reiter's syndrome)、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、亚急性甲状腺炎、交感性眼病、系统性红斑狼疮、大动脉炎、1型糖尿病、白癜风、小柳原田病(Vogt-Koyanagi-Harada disease)或韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)。优选地，所述自身免疫疾病是类风湿性关节炎(RA)。
所述疾病或病症可以是哮喘。所述哮喘可以是急性或慢性哮喘。
IgG激活补体系统的经典途径。因此，IgdE多肽和多核苷酸可用于治疗补体激活对患者有害的疾病和病症。例如，IgdE多肽和多核苷酸可用于治疗移植衍生的病症，例如移植排斥(例如同种异体移植排斥和异种移植排斥)和移植物抗宿主病。由于组织或器官在患者体内移植，可能发生移植衍生疾病。
IgdE多肽和多核苷酸也可用于术后治疗，例如用于治疗已经历心脏旁路手术的患者。
此外，IgdE多肽和多核苷酸可用于治疗获得性血友病，即去除已形成针对凝血因子的自身抗体的血友病患者中的IgG。
本文所用的术语“对象”包括任何哺乳动物对象，例如人、猪、马和任何牛。
体外方法
本发明包括用于切割IgG的体外方法，其包括使IgG与多肽接触，所述多肽包含：
(a)SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的氨基酸序列；
(b)其变体，所述变体与SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的氨基酸序列具有至少70％一致性且具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性；或
(c)(a)或(b)的片段，所述片段具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性。
在优选的实施例中，氨基酸序列是SEQ ID NO：3。用于切割IgG的体外方法包括使IgG与包含以下的多肽接触：
(a)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：3的变体，其与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性；
(c)SEQ ID NO：3的片段或SEQ ID NO：3的变体的片段，其具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性。
在优选的实施例中，所述多肽对人IgG，特别是人IgG1具有特异性。此外，无论轻链是κ还是λ型，如图4所示，所述多肽切割IgG1。
所述多肽是IgG半胱氨酸蛋白酶，其通常可以包含催化位点，该催化位点包括半胱氨酸残基、组氨酸残基和天冬氨酸残基，其位置对应于SEQ ID NO：1的265、296和311位置。例如，在SEQ ID NO：3中，在262、293和308位置发现半胱氨酸残基、组氨酸残基和天冬氨酸残基。所述多肽的变体和片段通常保留这些残基。
本发明的方法包括在允许发生特异性半胱氨酸蛋白酶活性的条件下将所述多肽与含有IgG的样品一起培养。该方法还包括鉴定和/或分离切割产物。可以通过本领域已知的任何合适的方法进行分析。在某些情况下，通过凝胶电泳(例如SDS-PAGE)或质谱法进行分析。
在本发明的另一个实施例中，用体外方法产生IgG的Fc或Fab片段。该方法包括使IgG与本发明的多肽接触。
在本发明的另一个实施例中，本发明的方法用于检测IgG。这可以包括(i)在允许多肽的IgG特异性半胱氨酸蛋白酶活性的条件下使样品与所述多肽接触；和(ii)监测IgG特异性切割片段的存在；其中特异性切割片段的存在指示样品中的IgG。
实施例
实施例1.鉴定来自猪链球菌的IgdE
细菌菌株和生长条件
猪链球菌菌株10是毒性血清型2菌株，其已用于猪的诱变和实验感染的若干研究中(Smith et al.1999.Infect.Immun.67,1750-1756)。菌株10M7由Hilde Smith(AWG，Lelystad，荷兰)友情提供(Smith et al.1996.Infect.Immun.64,4409-4412)。链球菌在有6％羊血的Columbia琼脂平板上或在Bacto Todd-Hewitt液体培养基(THB)中在厌氧条件下于37℃生长。在Luria液体培养基(LB)中培养大肠杆菌菌株。适当时，加入抗生素：50μg/ml的卡那霉素和20μg/ml的庆大霉素。
来自动物的材料
在先前的研究中获取来自实验感染仔猪的样品。这个动物实验的方案经德国下萨克森州消费者保护和食品安全办公室的动物实验委员会(Committee on AnimalExperiments of the Lower Saxonian State Office for Consumer Protection andFood Safety)批准(许可号33.9-42502-04-07/1243)。用于杀菌试验的常规仔猪的血液收集依N19/14在德国萨克森区域办事处登记。动物研究严格按照“用于实验和其他科学目的的脊椎动物保护的欧洲公约(European Convention for the Protection of VertebrateAnimals Used for Experimental and Other Scientific Purposes)”(欧洲条约系列，第123号：http://www.conventions.coe.int/Treaty/en/Treaties/Html/123.htm)和德国动物保护法(German Animal Protection Law)中概述的原则和建议进行。
鉴定IgG降解活性
在约OD 600为约0.6时收获猪链球菌菌株10M7培养物，并将培养物上清液通过0.22μM Express PLUS膜过滤器(Millipore)无菌过滤，然后用硫酸铵将培养物上清液分级至30％饱和度。弃去所得沉淀物，并将硫酸铵加入剩余的上清液中至终浓度为50％饱和度。将第二沉淀物用20mM Bis-Tris pH 6.8以起始体积的1/100重悬，并通过HiPrep 26/10脱盐柱(GE Healthcare)对相同缓冲液进行缓冲液交换。在HiTrap Q HP柱(GE Healthcare)上通过FPLC进一步对该物质分级。通过线性NaCl梯度洗脱蛋白质，发现在～0.2M NaCl洗脱的级分含有IgG降解活性。将活性级分进行尺寸排阻色谱(HiPrep 16/60Sephacryl S-100HR，GE Healthcare)，并以约37ml洗脱体积洗脱IgG降解活性。通过SDS-PAGE分析活性级分，并对蛋白质条带进行质谱分析。
质谱
由
Figure BDA0001821883650000211
蛋白质分析团队(
Figure BDA0001821883650000212
Protein Analysis Facility)(
Figure BDA0001821883650000213
大学)进行MALDI-TOF质谱。使用胰蛋白酶(测序级修饰，Promega)通过凝胶内消化来制备用于MS分析的肽，并使用与Easy nano LC系统(Proxeon)连接的HCT ultra ETD II离子阱仪器(Bruker)通过ESI LC-MS/MS分析该肽。使用DataAnalysis软件(4.0SP4，Bruker)进行LC-MS/MS数据集的处理、去卷积和化合物检测。使用NCBInr数据库的细菌序列中的Mascot搜索引擎(Matrixscience)，使用处理的数据集的峰列表文件进行数据库搜索。搜索参数允许MS和MS/MS模式的质量误差为0.3Da，并且允许通过氧化对甲硫氨酸以及通过丙酰胺衍生和N端乙酰化对半胱氨酸进行可变修饰。
筛选猪链球菌菌株的IgG降解能力
在OD600为约0.6时分离15种不同猪链球菌菌株(表2)的培养物上清液，并通过加入饱和硫酸铵溶液浓缩至最终饱和度为50％。通过Zeba旋转脱盐柱7K MWCO(ThermoScientific)对PBS进行缓冲液交换，然后将沉淀物以起始体积的1/20重悬于PBS中。将猪链球菌培养物上清液的50％硫酸铵沉淀级分用于IgG降解分析。
表2.本研究使用的猪链球菌菌株
Figure BDA0001821883650000221
ΔigdE删除菌株的产生
igdE的框内删除主要如Seele et al.,2013(J.Bacteriol.195,930-940)以猪链球菌菌株10进行的一样。为了构建热敏载体pSET5_ΔigdE，用引物preProIgdEPstI(TCACTGCAGTTTTGGGGAGTAGG，SEQ ID NO：12)和postSSIgdEBamHI(ATGGATCCCAGTTCAGAACCTC，SEQ ID No：13)产生618bp 5'-igdE扩增子，以及用引物preEndIgdEBamHI(CGGGATCCAGAGAAAAAAGAGATCC，SEQ ID NO：14)和postEndIgdEEcoRI(AGGAATTCACCGTTATTGTAGCG，SEQ ID No：15)产生612bp 3'-igdE扩增子。将这些扩增子克隆到pSET5(18)中，用引物名称中所示的限制酶产生pSET5_ΔigdE。通过选择性PCR分析以及使用引物IgdE-seq_frw(ATTGTATTTGGTGGAGGAG，SEQ ID NO：16)和IgdE-seq_rev(TTTAGCAGCTAAGTTGATACC，SEQ ID NO：17)对基因组扩增子进行测序来确认删除克隆。
测序分析
使用SIB Bioinformatics Resource Portal Expasy(www.expasy.ch)进行序列分析。运行SignalP 4.0以鉴定推定的信号肽和各自的切割位点(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。使用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)进行猪链球菌IgdE的计算机模拟以鉴定潜在的活性位点残基。使用共识预测网络服务器TOPCONS(http://topcons.cbr.su.se/)最后一次登记2015-11-06鉴定推定的跨膜区域。
DNA技术和引物序列
基于基因组猪链球菌P1/7中的基因SSU_RS08150设计引物。所有PCR均用PhusionMaster Mix HF(Thermo Scientific)进行。通过限制性分析、PCR和测序检查所有获得的质粒。
猪链球菌igdE的克隆和IgdE突变体的产生
使用引物IgdE-frw_NcoI(GTTTCCATGGATGAAAACTCACATTTACAATCG，SEQ ID NO：18)和IgdE-rev_NotI(ACGTGCGGCCGCATAAGCTTCGTAC，SEQ ID NO：19)从作为模板的猪链球菌菌株10的染色体DNA扩增缺少信号肽编码序列(编码氨基酸38-1121)的猪链球菌igdE基因，并在NcoI和NotI(Thermo Scientific)消化后克隆到pET_ZZ_1a中。对整个插入物进行测序以验证猪链球菌igdE的克隆和序列。获得的猪链球菌菌株10igdE的序列与猪链球菌05ZYH33的序列相同，并且其与猪链球菌P1/7的SSU_RS08150相比含有32个氨基酸的插入。
用QuickChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(AgilentTechnologies)和引物IgdE-C302S(AACGTCAGAAAGCGATGAGTGTAGGTTTCAGCACT，SEQ ID NO：20)、IgdE-H333A(CAGAAGGTGTCCCGGCTGCTACAGCGCGTG，SEQ ID NO：21)和IgdE-D348A(TAAAAAGTGGCACACCATTGCCGGTACAGGTTTTATTACAG，SEQ ID NO：22)，根据制造商的说明书进行推定的活性位点残基C302至S、H333至A和D348至A的定向诱变。
通过用限制性内切核酸酶XhoI(Thermo Scientific)消化pZZ1a中的全长igdE，产生IgdEΔC，该IgdEΔC由猪链球菌IgdE的N端470个氨基酸组成。对消化后的质粒进行纯化，重新连接并转化到大肠杆菌中。重组猪链球菌IgdE的表达和纯化
携带pET_ZZ_1a igdE、igdEC302S、igdEH302A、igdED302A或igdEΔC的大肠杆菌ArcticExpress(DE3)_RIL(Agilent Technologies)分离株在30℃下生长至OD600 0.6。用1mM IPTG在12℃诱导蛋白质表达，并继续培养22小时。
裂解细胞，通过BugBuster HT蛋白质提取试剂(Novagen)得到粗提物，或通过Stansted高压细胞破碎剂(Stansted Fluid Power)在50mM Bis-Tris pH 7,0.5M NaCl、5％甘油、40μM咪唑中纯化。使用标准流程在HisTrap FF(GE healthcare)上纯化His-ZZ标记的蛋白质。通过Tev-蛋白酶在5℃下酶促切割20小时除去标记，然后在HisTrap FT上进行第二轮纯化。收集含有未标记的rIgdE的液流。如上所述纯化重组IgdEΔC，其与全长rIgdE相比具有更高的产率和纯度。
定性IgG降解分析
为了监测浓缩分级培养物上清液中的IgG切割活性，将样品与1％猪血浆在PBS中在37℃培养16小时，然后进行蛋白质印迹分析。
为了鉴定IgG蛋白酶的催化类型，在0.1-5mM AEBSF(Sigma)、0.1-5mM EDTA、50-250μME-64(Sigma)、0.1-5mM Z-LVG-CHN2(Bachem)、0.1-5mM碘乙酰胺(Sigma)或以1/200至1/50稀释的完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的存在下，进行IgG降解反应。
将PBS中的0.5mg/ml猪IgG(Sigma)或其他物种(人、山羊、牛、马和小鼠；所有都来自Sigma)与携带上述猪链球菌IgdE构建体的诱导性大肠杆菌的粗提取物一起培养或与10nM纯化的rIgdE在37℃下培养16小时，然后在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE。
使用以下稀释液来分析稀释后的猪体液中内源性IgG的降解：心囊液、腹腔液和关节液的1/10稀释液；血清的1/50稀释液；未稀释的脑脊液。脑脊液和关节液来自患有由猪链球菌感染引起的纤维蛋白-化脓性脑膜炎和滑膜炎的仔猪或来自没有病变的仔猪。另外，如上所述用纯化的rIgdE进行IgG降解分析，并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析进行分析。实验重复至少三次，并显示代表性分析。
定量IgG降解分析
对于时程分析和抑制剂方面，用0.25mg/ml猪IgG和2μM纯化的IgdEΔC在37℃下在PBS中无抑制进行IgG降解反应，或在2.5μM或250μM AEBSF(Sigma)、EDTA、E-64(Sigma)、碘乙酰胺(Sigma)或Z-LVG-CHN2(Bachem)存在下进行IgG降解反应。使用0.275％的DMSO(Sigma)(对应于250μM Z-LVG-CHN2中的DMSO含量)作为溶剂对照。连续向反应取样并在还原条件下进行SDS-PAGE。通过用考马斯福陆TM橙蛋白凝胶染色剂(Invitrogen)染色检测蛋白质条带。通过用LAS4000成像系统(Fujifilm)成像对IgG降解产物进行密度计量，并用Image Studio 3.1版(LI-COR Biosciences)软件分析。对于时程实验，无抑制的过夜切割设定为100％相对切割。对于抑制剂方面，初始切割速率由切割产物的初始增加(0-25％相对切割)计算，无抑制反应的初始切割速率设定为100％相对活性。实验至少一式三份地进行。使用GraphPad Prism 5.0版本进行统计学分析。
SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
用还原或非还原样品缓冲液制备用于SDS-PAGE的样品，并将该用于SDS-PAGE的样品加热至95℃5分钟。12％SDS-PAGE用考马斯亮蓝(Sigma)、考马斯福陆TM橙蛋白凝胶染色剂(Invitrogen)染色，或印迹到Hybond-P PVDF膜(GE Healthcare)进行蛋白质印迹分析。用含5％干奶粉的0.1％PBS-吐温封闭膜，然后与辣根过氧化物酶缀合的抗体一起培养。将山羊抗猪IgG-HRP(Thermo Scientific)和山羊抗猪IgM-HRP以1：25000稀释，并将山羊抗猪IgA-HRP(Thermo Scientific)以1：12500稀释。在根据制造商说明用Amersham ECL Select蛋白质印迹检测试剂(GE Healthcare)显影之前，用0.1％PBS-吐温彻底洗涤膜，然后用LAS4000成像系统(Fujifilm)描绘。
N端Edman测序
如前所述地将猪链球菌IgdE处理的猪IgG通过SDS-PAGE分离，并通过在Hybond-PPVDF膜(GE Healthcare)上的半干印迹法，用50mM硼酸钠/20％MetOH作为印迹缓冲液转移。用丽春红S(Sigma)对膜进行染色，干燥后，将约32kDa降解产物紧密切出。通过ProteomeFactory(柏林，德国)进行降解产物的N端Edman测序，并获得序列W/C PICPACE。由于疑似污染产生强色氨酸峰而在半胱氨酸位置仅有微小峰，因此第一个位置序列测定复杂难辨。然而，在BLAST同源性检索中，该序列明确地得分为在相应位置含有半胱氨酸残基的猪IgG铰链区序列。通过丙酰胺修饰的半胱氨酸的信号鉴定半胱氨酸，但是，半胱氨酸并不是校准标准的一部分。
ELISA
为了检测对猪链球菌IgdE的IgG滴度，使用碳酸盐缓冲液用0.6μg的rIgdE蛋白涂覆
Figure BDA0001821883650000251
板(Nunc)。涂覆后，用PBS加0.1％吐温20(PBST)洗涤板三次，并用含5％奶粉的PBS在37℃下封闭2小时。对于每个样品及对照，测量含4个(阳性参照血清：6个)PBST双倍稀释液(始于1:100稀释液)的稀释系列，一式两份。为了检测猪链球菌IgdE特异性IgG抗体，将板与山羊抗猪IgG-HRP(1mg/ml，Bethyl，A100-105P)以1：10000的稀释度在37℃培养1小时。所有培养步骤均在摇床上37℃进行，并在每个培养步骤后，用PBST洗涤板。用2,2-联氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)和0.003％H2O2作为底物使板显色。用酶标仪(Synergy H1，BioTek Instruments GmbH)在405nm处测量吸光度。扣除背景后，通过对数线性回归分析将光密度转换为抗体浓度。每个样品的ELISA单位定义为两个系列的四个稀释液中每一个的计算单位的平均值。从猪链球菌菌株10实验感染20天后抽取的血清样品获得的ELISA值任意设定为100个ELISA单位，而来自初乳剥夺仔猪的血清样品的ELISA值用作阴性对照。
结果
猪链球菌分泌IgG切割酶
通过将猪链球菌菌株10和同基因型IgM蛋白酶突变体10ΔideSsuis的浓缩上清液与作为推定底物的2％猪血浆一起培养，从而分析猪链球菌细胞外酶的蛋白水解活性。培养3小时后，通过还原SDS-PAGE分析反应。有趣的是，从野生型菌株10和同基因型IgM蛋白酶突变体10ΔideSsuis的细菌培养物上清液获得的血浆蛋白条带模式，含有约32kDa的额外蛋白质条带，该条带在猪血浆对照中不存在(图1A)。切下32kDa条带，进行MALDI-TOF质谱分析，并鉴定为IgG降解产物，该产物显示猪链球菌中存在IgG蛋白水解活性。为了证实这一发现并支持蛋白水解活性归因于猪链球菌的分泌酶，通过添加逐步增加的硫酸铵(0至80％饱和度)来对细菌培养物的生长上清液进行分级。用猪血浆测试级分的IgG切割活性，并使用特异性多克隆抗猪IgG抗体通过蛋白质印迹检测IgG降解片段。20至60％硫酸铵饱和度的沉淀物清楚地表现出IgG切割活性，表明观察到的IgG蛋白水解活性不同于最近描述的IgM蛋白酶IdeSsuis(Seele，同上)且这是由于猪链球菌培养物上清液中的分泌蛋白(图1B)所导致。
15种不同猪链球菌菌株的培养物上清液，包括临床相关血清型2的几种菌株，血清型2的两个人类的分离物，和一组代表另外血清型的菌株(表2)，如上所述通过蛋白质印迹分析。对于所有菌株，可通过蛋白质印迹分析检测到约32kDa的IgG切割产物(图1C)，表明IgG降解活性在不同猪链球菌菌株中是保守的。
新型猪链球菌蛋白酶IgdE的纯化和序列特征
在纯化试验之前，在类别特异性蛋白酶抑制剂存在下，测试富含蛋白酶的硫酸铵沉淀物的IgG切割活性，以对推定的IgG蛋白酶进行初步分类。金属蛋白酶抑制剂EDTA不影响IgG切割，而丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF中度干扰IgG切割。然而，半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64、Z-LVG-CHN2和碘乙酰胺似乎都抑制IgG降解活性(图8)。因此，由于活性位点半胱氨酸残基可被AEBSF抑制(24，25)，所以整体抑制剂特征与IgG切割蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶类的假设最为一致。为了纯化，使用猪链球菌菌株10M7(菌株10的同基因突变体)，以避免培养物上清液高度丰富的溶菌酶释放蛋白(MRP)掩蔽低表达的蛋白质。通过硫酸铵沉淀对细菌培养物上清液分级，并对沉淀物进行阴离子交换色谱和尺寸排阻色谱(SEC)。通过还原SDS-PAGE分离显示IgG切割活性的样品。通过MALDI-TOF质谱法鉴定蛋白质条带，并使用pBLAST算法对NCBI数据库进行相似性搜索。由于IgG蛋白水解酶的初始表征表明蛋白酶很可能是分泌的半胱氨酸蛋白酶，所以在鉴定的蛋白质的序列中筛选：i)蛋白质核心内的半胱氨酸残基的存在，和ii)分泌信号肽的存在。除了此前已经证实IdeSsuis是IgM特异性，(10种之中的)2种蛋白质鉴定为含有推定的催化半胱氨酸残基，但只有一种同时含有SignalP算法预测的信号肽序列和核心半胱氨酸残基。该蛋白质在猪链球菌血清型2菌株的基因组序列数据库中注释为推定的输出蛋白质(www.sanger.ac.uk)，在菌株P1/7中命名为SSU_RS08150。SSU_RS08150编码一个1121个氨基酸的蛋白质(GenBank登录号WP_012027720)，其具有推定的转谷氨酰胺酶核心序列基序(位于所述蛋白质的N端侧的氨基酸188至265内)。膜蛋白拓扑结构的TOPCONS共识预测在C端约氨基酸1059-1080之间鉴定出推定的跨膜螺旋。预测大小118kDa(无信号序列)略低于SDS-PAGE后初始纯化的蛋白质条带的估计大小(数据未显示)，这是由于pI低(pI 4.66)的蛋白质在SDS-PAGE上迁移稍慢。使用pBLAST算法将全长推定的蛋白质序列用于针对NCBI数据库的相似性搜索。该搜索揭示了全长蛋白质与MEROPS肽酶数据库中任何已知的蛋白酶没有相似性(Rawlings et al.2014.NucleicAcids Res.42,503-509)；与任何真核蛋白没有相似性，但含有转谷氨酰胺酶核心基序的蛋白酶的N端半部与豕链球菌和假豕链球菌的假定蛋白有一些相似性(在480-492个氨基酸残基的区域中有54％一致性)，且与马链球菌的假定蛋白质有一些相似性(在264至406个氨基酸残基的区域中有高达40％的一致性)。蛋白酶的N端部分也显示出与无乳链球菌和Streptococcus merionis的假定蛋白质有一些相似性(约32％一致性)。该推定的蛋白质在一些数据库中表示为核糖核酸酶或核糖核酸酶G和E，但由于缺乏实验证实的功能并且基于对猪IgG的酶活性，该蛋白质被表示为猪链球菌的免疫球蛋白G降解酶IgdE。
IgdE是一种新型的半胱氨酸蛋白酶
猪链球菌IgdE序列显示在302位存在单一半胱氨酸残基，由于抑制剂特征，假定其代表催化位点半胱氨酸。猪链球菌IgdE的计算机三维建模(http://swissmodel.expasy.org)，使用已知的转谷氨酰胺酶结构域结构作为模板，揭示了含有潜在催化三联体的蛋白质N端部分存在推定的活性位点裂口，该三联体由半胱氨酸302、组氨酸333和天冬氨酸348组成。
为了鉴定猪链球菌IgdE的推定蛋白酶结构域和催化位点残基，创建了几种重组IgdE构建体(图2A)。通过定点诱变分别产生突变蛋白IgdEC302S、IgdEH333A和IgdED348A，其取代所有三个推定的催化位点残基。此外，通过XhoI限制酶切割产生缺少猪链球菌IgdE的C端部分的构建体。将表达这些构建体的大肠杆菌的粗可溶性级分与猪IgG一起培养，并通过SDS-PAGE分析。在重组猪链球菌IgdE的存在下，出现32kDa IgG衍生条带，证明重组蛋白含有IgG蛋白水解活性(图2B，泳道3)。IgG切割活性可以认定在蛋白质的N端部分，因为缺少氨基酸471至1121的重组蛋白质足以具有IgG切割活性(图2B，泳道7)。突变蛋白与猪IgG共培养的SDS-PAGE分析(图2B，泳道4-6)显示，rIgdEC302S和rIgdEH333A均未表现出IgG切割活性，而rIgdED348A显示出一定程度地降低的IgG切割活性。总之，这些数据强烈表明这三个残基是猪链球菌IgdE的催化位点的一部分。
用纯化的重组IgdEΔC和类别特异性蛋白酶抑制剂重复进行抑制剂筛选。与经典转谷氨酰胺酶相反，IgdE不依赖于钙，因为蛋白酶在EDTA存在下具有完全活性，而半胱氨酸类特异性抑制剂碘乙酰胺和Z-LVG-CHN2有效干扰IgG蛋白水解活性，因为在125倍摩尔过量的抑制剂培养18小时后根本没有检测到切割产物(图3)。丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF在125倍摩尔过量时适度地抑制IgdEΔC。有趣的是，在这个实验环境中，E-64没有抑制纯化的IgdEΔC，这可能是由于与其他链球菌Ig蛋白酶(如IdeS和Ide猪链球菌)所描述的相似窄活性位点。然而，在非常高的浓度下，E-64干扰猪链球菌培养物上清液的IgG切割活性(图8)。Z-LVG-CHN2半胱氨酸蛋白酶特异性抑制剂在结构上基于胱抑素C的抑制性反应位点(Greenand Shaw.1981.J.Biol.Chem.256,1923-1928)，在125倍摩尔过量时完全抑制IgdEΔC。碘乙酰胺和Z-LVG-CHN2抑制酶活性，以及IgdEC302S和IgdEH333A突变体的酶活性缺乏，表明IgdE是新型的和迄今为止独特的半胱氨酸蛋白酶家族成员。
猪链球菌IgdE在铰链区中以高特异性切割猪IgG
通过还原和非还原SDS-PAGE分析猪IgG降解产物。在非还原条件下观察到的条带图案与位于互连二硫键的N端的重链铰链区中的切割位点一致(图4A)。将在还原条件下获得的IgG降解产物(图4B)进行N端Edman测序，并在猪IgG2ab、IgG4ab和IgG6ab亚型的铰链区序列中发现所得序列C*PICPACE。具有作为共同基序的CPICPGCE的相似序列存在于IgG1ab和IgG5ab亚型的铰链区中，而IgG3在铰链区中存在CPxxxxC序列(表3)。
表3.猪IgG降解产物的N端Edman测序
Figure BDA0001821883650000281
Figure BDA0001821883650000291
所有猪IgG亚型的铰链区序列。在表中标出了认为参与S-S共价键的半胱氨酸残基
(下划线)和潜在的切割位点(↓)。
除了鉴定的切割位点之外，在还原和非还原SDS-PAGE上观察到的切割模式还与如下切割反应一致，在该切割反应中，一条IgG重链仅在同二聚体二硫键的N端水解，然后进行第二步水解切割第二条重链(图4C)。有趣的是，在猪IgA和IgM的重链序列中未发现与IgG铰链区相似的序列。因此，使用针对猪IgG、IgM和IgA的特异性抗体进一步研究猪链球菌IgdE特异性。通过蛋白质印迹分析与重组猪链球菌IgdE培养的猪血浆，证明该蛋白酶靶向猪血浆中的IgG，但不切割IgA或IgM(图5A)。
通过将纯化的猪链球菌IgdE与人、山羊、牛、马和小鼠的IgG制剂一起培养来研究蛋白酶的宿主特异性(图5B)。有趣的是，仅发现猪IgG是这种新型IgG蛋白酶的底物。因此，IgdE显示出明显的物种特异性并且仅靶向猪IgG。
为了进一步离体评估猪链球菌IgdE的特异性，使用健康或患病仔猪的体液。用重组猪链球菌IgdE处理来自心囊、腹腔和关节的液体以及脑脊液和血清，并通过SDS-PAGE(图6A)和使用猪IgG特异性抗体的蛋白质印迹进行分析(图6B)。除了在心囊、腹腔和血清样品中的rIgdE存在下可观察到诊断性IgG切割产物的出现外，蛋白质条带模式没有明显变化。在健康猪的关节液和脑脊液中也没有IgG，即没有切割产物。相反，从具有临床症状(例如，患有脑膜炎和滑膜炎)的仔猪获得的所有体液，由于炎症反应而含有IgG，并且在用rIgdE处理的所有样品中均可观察到单个特征性32kDa条带(图6)。由于观察到猪体液与蛋白酶培养后在SDS-PAGE上不能鉴定出额外的降解产物，强调了猪链球菌IgdE的特异性。因此，尽管不能排除存在额外的底物，但这些结果表明猪链球菌IgdE是高度特异性的IgG蛋白酶，补充了之前描述的猪链球菌IgA和IgM降解蛋白酶(Seele同上；Zhang etal.2010.Vet.Microbiol.140,171-175)。
IgdE是猪链球菌表达的唯一IgG切割酶.
使用菌株10和菌株10ΔideSsuis(后者缺乏IgM切割活性)产生猪链球菌igdE框内删除突变体。使用特异性多克隆抗猪IgG或IgM抗体，通过蛋白质印迹测定来自野生型菌株10的生长上清液中的IgG和IgM切割活性(图7)。如所预期，野生型菌株10表现出IgG和IgM切割活性(图7A和B，泳道3)，而同基因突变菌株10ΔigdE的上清液仅含有IgM切割活性，并且在双突变菌株10ΔideSsuisΔigdE的上清液中均未检测到IgG或IgM降解(图7A和B，泳道5)。因此，似乎猪链球菌IgdE对于切割猪IgG是必需的，并且足以切割猪IgG，并且在这些实验条件下没有释放其他IgG切割活性。
猪链球菌IgdE的体内表达
最初通过初乳衍生的母体抗体保护断奶仔猪免受细菌感染。母体抗体水平随时间降低，并且最早在两周后发展活性IgG介导的免疫。因此，初乳剥夺仔猪血清中的IgG抗体水平(SCDP)在ELISA测量中不超过背景值。用rIgdE作为抗原进行ELISA以研究来自仔猪的不同血清样品中是否存在针对IgG蛋白酶的抗体。在用猪链球菌菌株10实验感染20天后抽取的血清样品，具有针对rIgdE的非常高的滴度(定义为100个ELISA单位，参见材料和方法)。与用作阴性对照的SCDP相比，9只5-6周龄的常规断奶仔猪中有7只检测到显著量的针对猪链球菌IgdE的特异性抗体(ELISA单位范围为36至92)。这些结果证明猪链球菌IgdE是猪链球菌在体内表达的免疫原性抗原。
实施例2.鉴定来自其他链球菌物种的IgdE
所有可用的链球菌基因组的编码序列从NCBI[ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Bacteria/on Aug-21-2015]和PATRIC[ftp://ftp.patricbrc.org/patric2/onAug-25-2015]下载。
作为IgdE的参考序列，我们使用了RefSeq序列WP_014636499.1。仅去除来自猪链球菌的序列中的N端信号肽和C端区域，留下氨基酸38-520(此后称为“IgdE_域”)。
将IgdE_域用作针对NCBI序列以及PATRIC序列的blastp搜索(E值截止值为1，以保留所有可能的蛋白酶)中的查询序列。使用相同的参数，将获得的命中数反过来用作针对相同数据库的查询序列。从匹配序列列表中，当使用IgdE作为查询时，我们选择那些在第二轮中具有与第一轮中匹配的区域重叠的匹配序列。从进一步的考虑中除去催化位点中不含‘C’的序列，并且在相同序列的情况下仅保留一个拷贝。
发现的许多序列注释为S层蛋白或含有S层同源结构域W。它们通常在同一基因组中以两个或更多个拷贝存在，并且在催化位点具有SxC或GxC基序，而不是在原始IgdE序列中发现的AxC基序。当针对Pfam搜索所有序列时，这些序列非常适合Pfam模型‘Transglut_core’。为了除去不是IgdE家族成员的这些序列，除去了与E值为至多1e-6的Transglut_core模型匹配的所有序列，以及缺少AxC基序的序列。剩余的序列切去两端，以仅包含与IgdE_域序列匹配的部分。如果由此得到相同的“域”序列，则仅保留一个拷贝。
在豕链球菌、无乳链球菌、马链球菌和假豕链球菌中鉴定出属于IgdE家族的蛋白酶。克隆、表达和表征所述蛋白酶。
实施例3.从豕链球菌中分离的IgdE的性质
·重组IgdEporcinus切割纯化的多克隆猪IgG，通过还原SDS-PAGE检测到32kDa降解产物。
·当重组IgdEporcinus与来自牛、马、人、山羊或小鼠的纯化多克隆IgG一起培养时，未观察到降解产物。
·重组IgdEporcinus切割猪血清中的IgG，但通过抗IgG、IgM和IgA蛋白质印迹分析未检测到IgM或IgA。
·猪IgG的32kDa降解产物的N端序列是CPICPACE，如N端Edman测序所示，表明该蛋白质具有与来自猪IgG内的猪链球菌的IgdE相同的切割位点。
·重组IgdE豕易于过表达及纯化至高纯度。
·所有测试的猪链球菌菌株在其生长培养物上清液中显示与重组蛋白质相同的猪IgG切割表型。
实施例4.从无乳链球菌中分离的IgdE的性质
·重组IgdE agalactiae 切割纯化的多克隆人IgG，通过还原SDS-PAGE检测到32kDa降解产物(图10)。
·重组IgdE agalactiae 切割纯化的单克隆人IgG1κ和IgG1λ，通过还原SDS-PAGE检测到32kDa降解产物(图10D)。
·当重组IgdE agalactiae 与单克隆人IgG2、IgG3或IgG4一起培养时，未观察到降解产物(图10D)。
·当重组IgdE agalactiae 与来自牛、马、猪、山羊或小鼠的纯化多克隆IgG一起培养时，未观察到降解产物(图10A)。
·重组IgdE agalactiae 切割人血清中的IgG，但未通过抗IgG、IgM和IgA蛋白质印迹分析检测到IgM或IgA。
·重组IgdE agalactiae 将人血清IgG1完全降解为单个切割IgG1(图11)。
·人IgG的32kDa降解产物的N端序列是H(或G或S)TCPPCPAPE，如N端Edman测序所示，表明该蛋白质在半胱氨酸残基的铰链区N端中具有与IgG1中的木瓜蛋白酶相同的切割位点，该半胱氨酸残基被认为参与了重链之间的H-H共价键。
·重组IgdE agalactiae 易于过表达并纯化。
实施例5.从马链球菌中分离的IgdE的性质
·表达重组IgdEequi的大肠杆菌裂解物切割纯化的多克隆马IgG，通过还原SDS-PAGE检测到32kDa降解产物。
·当重组IgdEequi与来自牛、马、猪、山羊、大鼠、兔和小鼠的纯化多克隆IgG一起培养时，未观察到降解产物。
·重组IgdEequi切割马血清中的IgG，但未通过抗IgG、IgM和IgA蛋白质印迹分析检测到IgM或IgA。
·重组IgdEequi切割纯化的单克隆重组马IgG7，通过还原SDS-PAGE检测到32kDa降解产物(图12)。
·当重组IgdEequi与重组单克隆马IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5或IgG6一起培养时，未观察到降解产物。
·如N端Edman测序所示，马IgG的32kDa降解产物的N端序列是(G)PTCPECXGV。这个序列存在于马IgG7的铰链区。
实施例6.从假豕链球菌中分离的IgdE的性质
·假豕链球菌培养物上清液具有猪IgG切割表型，但不具有人IgG切割表型。
·重组IgdEpseudoporcinus切割纯化的多克隆人和猪IgG，通过还原SDS-PAGE检测到32kDa降解产物。
·当重组IgdEpseudoporcinus与来自牛、马、山羊、小鼠或大鼠的纯化多克隆IgG一起培养时，
未观察到降解产物。
·重组IgdEpseudoporcinus切割人和猪血清中的IgG，但未通过抗IgG、IgM和IgA蛋白质印迹分析检测到IgM或IgA。
·猪IgG的32kDa降解产物的N端序列是CPICPACE，如N端Edman测序所示，表明该蛋白质与来自猪IgG内的IgdE具有相同的切割位点。
·重组IgdEpseudoporcinus在大肠杆菌BL21pLysS中容易过表达。
本申请所述的发明还涉及以下方面：
1、一种用于在对象中产生免疫应答的多肽，所述多肽包括：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：1的变体，所述变体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(c)SEQ ID NO：1的片段、SEQ ID NO：1的变体或SEQ ID NO：1的变体的片段，其能够在对象中产生对链球菌，优选猪链球菌的免疫应答；
(d)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：3的变体，所述变体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(f)SEQ ID NO：3的片段、SEQ ID NO：3的变体或SEQ ID NO：3的变体的片段，其能够在对象中产生对链球菌，优选无乳链球菌的免疫应答；
(g)SEQ ID NO：5的氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO：5的变体，所述变体与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(i)SEQ ID NO：5的片段、SEQ ID NO：5的变体或SEQ ID NO：5的变体的片段，其能够在对象中产生对链球菌，优选豕链球菌的免疫应答；
(j)SEQ ID NO：7的氨基酸序列；
(k)SEQ ID NO：7的变体，所述变体与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(l)SEQ ID NO：7的片段、SEQ ID NO：7的变体或SEQ ID NO：7的变体的片段，其能够在对象中产生对链球菌，优选马链球菌的免疫应答；
(m)SEQ ID NO：9的氨基酸序列；
(n)SEQ ID NO：9的变体，所述变体与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(o)SEQ ID NO：9的片段、SEQ ID NO：9的变体或SEQ ID NO：9的变体的片段，其能够在对象中产生对链球菌，优选假豕链球菌的免疫应答；
2、编码根据方面1所述的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸用于在对象中产生免疫应答。
3、一种用于在对象中产生免疫应答的多核苷酸，所述多核苷酸包括：
(a)SEQ ID NO：2或其互补序列；
(b)因(a)中定义的序列的遗传密码而产生的简并序列；
(c)在严格条件下与(a)或(b)中定义的序列杂交的序列；
(d)与(a)或(b)中定义的序列具有至少70％一致性的序列；
(e)(a)、(b)、(c)或(d)中任一序列的片段，所述片段编码具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生针对链球菌(优选猪链球菌)的免疫应答的多肽。
(f)SEQ ID NO：4或其互补序列；
(g)因(f)中定义的序列的遗传密码而产生的简并序列；
(h)在严格条件下与(f)或(g)中定义的序列杂交的序列；
(i)与(f)或(g)中定义的序列具有至少70％一致性的序列；
(j)(f)、(g)、(h)或(i)中任一序列的片段，所述片段编码具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生针对链球菌(优选无乳链球菌)的免疫应答的多肽。
(k)SEQ ID NO：6或其互补序列；
(l)因(k)中定义的序列的遗传密码而产生的简并序列；
(m)在严格条件下与(k)或(l)中定义的序列杂交的序列；
(n)与(k)或(l)中定义的序列具有至少70％一致性的序列；
(o)(k)、(l)、(m)或(n)中任一序列的片段，所述片段编码具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生针对链球菌(优选豕链球菌)的免疫应答的多肽。
(p)SEQ ID NO：8或其互补序列；
(q)因(p)中定义的序列的遗传密码而产生的简并序列；
(r)在严格条件下与(p)或(q)中定义的序列杂交的序列；
(s)与(p)或(q)中定义的序列具有至少70％一致性的序列；
(t)(p)、(q)、(r)或(s)中任一序列的片段，所述片段编码具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生针对链球菌(优选马链球菌)的免疫应答的多肽。
(u)SEQ ID NO：10或其互补序列；
(v)因(u)中定义的序列的遗传密码而产生的简并序列；
(w)在严格条件下与(u)或(v)中定义的序列杂交的序列；
(x)与(u)或(v)中定义的序列具有至少70％一致性的序列；
(y)(u)、(v)、(w)或(x)中任一序列的片段，所述片段编码具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性和/或能够在对象中产生针对链球菌，优选假豕链球菌的免疫应答的多肽。
4、一种用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症的多肽，所述多肽包括：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：1的变体，所述变体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(c)SEQ ID NO：1的片段或SEQ ID NO：1的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(d)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：3的变体，所述变体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(f)SEQ ID NO：3的片段或SEQ ID NO：3的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(g)SEQ ID NO：5的氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO：5的变体，所述变体与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(i)SEQ ID NO：5的片段或SEQ ID NO：5的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(j)SEQ ID NO：7的氨基酸序列；
(k)SEQ ID NO：7的变体，所述变体与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；或
(l)SEQ ID NO：7的片段或SEQ ID NO：7的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；或
(m)SEQ ID NO：9的氨基酸序列；
(n)SEQ ID NO：9的变体，所述变体与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(o)SEQ ID NO：9的片段或SEQ ID NO：9的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(p)SEQ ID NO：11的氨基酸序列；
(q)SEQ ID NO：11的变体，所述变体与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；或
(r)SEQ ID NO：11的片段或SEQ ID NO：11的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
5、编码根据方面4所述的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症。
6、用于切割IgG的体外方法，所述方法包括使IgG与包含以下的多肽接触：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：1的变体，所述变体与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(c)SEQ ID NO：1的片段或SEQ ID NO：1的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(d)SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(e)SEQ ID NO：3的变体，所述变体与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(f)SEQ ID NO：3的片段或SEQ ID NO：3的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(g)SEQ ID NO：5的氨基酸序列；
(h)SEQ ID NO：5的变体，所述变体与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(i)SEQ ID NO：5的片段或SEQ ID NO：5的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(j)SEQ ID NO：7的氨基酸序列；
(k)SEQ ID NO：7的变体，所述变体与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(l)SEQ ID NO：7的片段或SEQ ID NO：7的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(m)SEQ ID NO：9的氨基酸序列；
(n)SEQ ID NO：9的变体，所述变体与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(o)SEQ ID NO：9的片段或SEQ ID NO：9的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
(p)SEQ ID NO：11的氨基酸序列；
(q)SEQ ID NO：11的变体，所述变体与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少70％的一致性并具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；或
(r)SEQ ID NO：11的片段或SEQ ID NO：11的变体的片段，所述片段具有IgG降解半胱氨酸蛋白酶活性；
7、一种用于鉴定激活或抑制IgdE多肽的IgG半胱氨酸活性的物质的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在不存在候选物质且允许IgG半胱氨酸活性的条件下，使IgdE多肽和IgG与该物质接触，
b)与不存在候选物质的情况相比，确定在所述物质存在下消化的IgG的量，
c)根据b)获得的结果，由此确定该物质是否激活或抑制IgdE多肽的IgG半胱氨酸活性。
序列表
<110> 乌尔里克·冯·帕维尔·拉明根
克里斯蒂安·施珀里
<120> 新型链球菌蛋白酶
<130> N410149WO
<150> SE1630021-2
<151> 2016-02-04
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1084
<212> PRT
<213> Streptococcus suis
<400> 1
Asp Glu Asn Ser His Leu Gln Ser Pro Lys Asn Thr Asn Lys Ile Glu
1 5 10 15
Val Leu Asn Trp Glu Ala Phe Ser Lys Lys Leu Lys Asp Tyr Ser Ser
20 25 30
Asp Gln Arg Gln Phe His Val Leu Lys Leu Gly Phe Glu Asn Arg Leu
35 40 45
Gly Thr Leu Ser Thr Arg Glu Glu Leu Glu Glu Phe Gly Lys Asn Asn
50 55 60
Asn Phe Leu Val Ile Asn Gly Lys Val Thr Gln Asn Ile His Asp Phe
65 70 75 80
Pro His Ile Leu Val Met Asn Lys Gly Asp Val Ile Ala His Asn Glu
85 90 95
Glu Asp Tyr His Asn Gln Met Arg Glu Leu Arg Phe Ser Gly Asn Gly
100 105 110
Asp Leu His Asn Ser Met Glu Pro Lys Arg Ile His Ala Leu Phe Lys
115 120 125
Ile Glu Leu Asp Ser Asn Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ala Ala Gly Leu
130 135 140
Gly Thr Ala Glu Asn Ser Leu Lys Asn Ile Asn Gly Met Thr Ile Tyr
145 150 155 160
Ser His Gly Leu Thr Val Asp Asn Lys Tyr Tyr Glu Asp Tyr Ser Lys
165 170 175
Tyr Thr His Asn Ser Val Lys Asn Ile Asn Val Thr Lys Glu Arg Phe
180 185 190
Ile Ala Asn Asp Asp Leu Ile His Lys Leu Ile Glu Ser Ser Glu Ala
195 200 205
Met Lys Gln Ser Ser Glu Arg Asp Lys Val Lys Ala Phe Val Gln Tyr
210 215 220
Val Ala Asn His Thr Thr Tyr Asp Trp Glu Ala Ala Asn Lys Ala Val
225 230 235 240
Gln Asn Tyr Ala Asp Ile Asn Tyr Tyr Leu Gly Ser Asp Leu Phe Ala
245 250 255
Val Thr Glu Arg Gln Lys Ala Met Cys Val Gly Phe Ser Thr Thr Ala
260 265 270
Ala Arg Ala Phe Asn Met Leu Gly Leu Pro Ala Tyr Val Val Val Gly
275 280 285
Lys Asn Ala Glu Gly Val Pro His Ala Thr Ala Arg Val Tyr Tyr Asp
290 295 300
Lys Lys Trp His Thr Ile Asp Gly Thr Gly Phe Ile Thr Gly Asn Lys
305 310 315 320
His Gln Arg Ser Ala Lys Tyr Ser Glu Lys His Phe Ser Thr Ile Gly
325 330 335
Glu Asp Ser Tyr Asp Val Val Glu Ala Gly Gln Glu Pro Lys Ala Glu
340 345 350
Arg Asn Tyr Met Ile Ile Asp Ser Asn Tyr Glu Ser Trp Ala Met Lys
355 360 365
Gln Lys Thr Ala Asp Leu Leu Leu Phe Asn Lys Glu Lys Ser Leu Val
370 375 380
Gly Leu Asp Tyr Ile Ala Tyr Val Glu Pro Thr Tyr Ile Thr Glu Asn
385 390 395 400
Lys Lys Asn His Leu Leu Asp Ile Tyr Lys Ala Leu Lys Arg Lys Val
405 410 415
Glu Glu Thr Lys Ala Thr Asp Lys Asp Asp Lys Asp Asp Lys Gln Glu
420 425 430
Gly Tyr Asp Arg Val Leu Gln Phe Val Asn Ser Asp Ile Asp Lys Leu
435 440 445
Ser Ala Leu Ser Lys Ile Thr Glu Glu Glu Phe Lys Ala Leu Glu Asn
450 455 460
Ser Met Asp Leu Ala Arg Val Phe Leu Gly Gln Met Asn Ala Lys Ala
465 470 475 480
Gly Lys Glu Phe Ser Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Ser Tyr Leu Lys Asn
485 490 495
Arg Gln Lys Asn Asn Thr Asn Ser Asp Asp Asp Arg Asn Arg Asn Glu
500 505 510
Leu Gln Glu Asn Gln Ala Asn Ser Asp Glu Val Ser Gln Asn Ser Lys
515 520 525
Asp Ala Ser Ala Pro Ser Val Asn Ser Ala Gln Gln Ser Glu Glu Leu
530 535 540
Glu Gly Thr Pro Ser Thr Gln Glu Thr Ile Ser Ala Ala Pro Ser Gln
545 550 555 560
Gln Thr Pro Ala Ala Pro Lys Ala Leu Gln Ala Lys Thr Glu Leu Glu
565 570 575
Asp Lys Thr Glu Thr Ser Ser Leu Gly Asn Thr Glu Met Val Ser Pro
580 585 590
Ser Ser Glu Thr Ala Gln Asn Thr Val Asp Ser Lys Glu Glu Ser Asp
595 600 605
Ala Lys Leu Pro Tyr Val Glu Pro Ser Ser Lys Glu Ser Ser Glu Ala
610 615 620
Gln Val Asn Thr Val Ser Ser Pro Gln Val Ser Ser Ala Ser Pro Thr
625 630 635 640
Ser Ser Glu Thr Ile Ser Thr Asp Thr Val Thr Ala Ser Gln Glu Lys
645 650 655
Ala Glu Ser Arg Val Ser Ala Pro Gln Val Ile Ser Ala Ser Gln Thr
660 665 670
Ser Pro Glu Thr Asn Ser Ala Glu Val Val Thr Thr Ser Gln Glu Val
675 680 685
Ala Lys Ala Pro Val Ser Ala Pro Gln Val Ser Ser Glu Ile Gln Thr
690 695 700
Leu Ser Glu Thr Ala Pro Thr Glu Val Ala Thr Glu Ala Pro Glu Leu
705 710 715 720
Ser Ala Leu Glu Ser Asn Pro Ala Pro Gln Thr Ser Leu Glu Thr Thr
725 730 735
Pro Thr Glu Glu Val Thr Glu Thr Pro Glu Pro Ser Val Val Glu Ser
740 745 750
Asn Ser Ala Ser Pro Thr Ser Pro Glu Thr Asn Ser Ala Glu Ala Val
755 760 765
Thr Thr Ser Gln Glu Met Ala Glu Pro Ser Val Ser Val Pro Gln Val
770 775 780
Ser Ser Glu Ile Pro Thr Ser Ser Glu Thr Ala Pro Ala Glu Val Ala
785 790 795 800
Thr Glu Val Ser Glu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Gln Pro Ser Pro Glu
805 810 815
Thr Thr Pro Thr Glu Thr Val Thr Thr Ser Gln Glu Val Ala Glu Ala
820 825 830
Pro Val Ser Ala Pro Gln Val Ser Ser Glu Ile Pro Thr Ser Pro Glu
835 840 845
Thr Ala Ser Thr Glu Val Val Val Ala Lys Gln Glu Val Ala Asp Ser
850 855 860
Pro Val Ser Ala Pro Gln Val Ile Ser Glu Ile Pro Thr Ser Ser Glu
865 870 875 880
Thr Ala Pro Ala Glu Val Ala Thr Glu Val Thr Glu Pro Ser Val Val
885 890 895
Ala Ser Ser Ser Ala Ser Pro Thr Ser Pro Glu Ala Asn Ser Thr Glu
900 905 910
Val Val Val Ala Lys Gln Glu Val Ala Asp Pro Leu Val Ser Ala Pro
915 920 925
Gln Thr Ser Ser Ala Ser Leu Thr Leu Glu Val Pro Lys Asn Glu His
930 935 940
Leu Asp Glu Lys Ala Asp Ala Thr Thr Pro Asn Gly Val Glu Ala Asn
945 950 955 960
Thr His Glu Ala Val Ser Val Pro Thr Ser Asp Ile Arg Val Gln Asp
965 970 975
Ala Gly Ser Asp Thr Val Pro Gln Pro Tyr Ser Leu Ser Ala Thr Leu
980 985 990
Phe Glu Glu Ala Ile Ser Thr Val Glu Pro Val Gly Val Ala Thr Ser
995 1000 1005
Ser Gln Glu Arg Ser Ala Val Ala Gly Lys Val Lys Val Pro Thr Ser
1010 1015 1020
Leu Glu Arg Ser Asn Asn Ser Val Glu Glu Glu Lys Val Val Asp Ser
1025 1030 1035 1040
Asn Ala Thr Ile Glu Asn Arg Glu Pro Glu Lys Lys Glu Ile Leu Thr
1045 1050 1055
Ser Glu Asn Val Leu Asn Ser Leu Val Thr Ile Trp Val Ala Leu Ser
1060 1065 1070
Thr Ser Phe Phe Met Arg Tyr Phe Ser Arg Gly Lys
1075 1080
<210> 2
<211> 3255
<212> DNA
<213> Streptococcus suis
<400> 2
gatgaaaact cacatttaca atcgccaaaa aacaccaata aaatagaggt tctgaactgg 60
gaagcatttt ctaaaaaatt gaaagactac tcctcggacc aacgacaatt tcatgttttg 120
aaattaggat ttgaaaatcg actgggaaca ttatcaactc gggaagaatt ggaagaattt 180
ggtaaaaaca acaatttttt ggtaatcaat ggtaaagtta ctcaaaatat tcatgacttt 240
ccacatatcc ttgttatgaa caagggtgat gttattgctc ataatgagga agattatcat 300
aatcagatga gagagttgag gttttcggga aatggcgact tacataatag tatggagcca 360
aaacggattc atgcactatt taagattgag cttgactcca ataaacggca gttattaaat 420
gctgcgggtc taggaactgc tgagaatagt ttgaaaaata ttaatggaat gactatttac 480
tcgcatggtc ttacagttga taataagtac tatgaggatt atagtaaata tactcataat 540
tcagttaaaa atataaacgt taccaaagag cgttttatag caaatgatga cttgattcat 600
aagttgatag agtcctcaga agctatgaag caatcaagtg aacgcgataa agttaaggca 660
tttgttcagt atgttgccaa tcatacaaca tatgattggg aagctgctaa taaggctgtt 720
caaaattatg cagacatcaa ttactactta ggatcagatt tgttcgcggt tactgaacgt 780
cagaaagcga tgtgtgtagg tttcagcact actgcggccc gtgcatttaa tatgttaggg 840
cttcctgctt atgttgttgt tgggaaaaat gcagaaggtg tcccgcatgc tacagcgcgt 900
gtttattatg ataaaaagtg gcacaccatt gacggtacag gttttattac agggaataag 960
catcagcgct cagctaaata tagcgagaaa cacttttcta ctattggtga ggatagttat 1020
gatgttgttg aggcaggaca ggagcctaag gcggagcgta actacatgat tattgatagt 1080
aattatgaga gttgggctat gaaacaaaaa acagcagatt tactgttgtt caacaaagaa 1140
aagtccttgg ttggtttgga ttatattgca tatgttgagc caacttatat aacagaaaat 1200
aagaaaaatc atttgctaga catctataaa gctttgaaac gtaaagtaga agaaacgaaa 1260
gcaacggata aagacgataa agatgataaa caagaggggt atgatcgtgt tttacaattt 1320
gtcaattctg atattgataa attgagtgct ctctccaaga ttacagaaga agaatttaaa 1380
gcactcgaaa attcaatgga tttagctcga gtgttcttgg ggcaaatgaa tgcgaaggct 1440
ggaaaagaat tttcggaagg agaaacttat caaagttatc taaagaatcg tcagaaaaat 1500
aacacaaatt ctgatgatga tagaaaccga aatgaattgc aagaaaacca agctaattct 1560
gatgaagtca gccaaaattc caaggatgct tcggctccaa gtgttaattc tgcacagcaa 1620
tctgaggagc ttgaaggaac tccttcaaca caggaaacaa tctcagctgc tccttctcaa 1680
caaacaccag cagctcctaa agcactacaa gctaaaactg agttagagga taaaacagag 1740
acttcatctt taggaaatac agagatggtt tcaccgagtt cagaaacagc tcagaataca 1800
gttgattcta aggaagaaag tgatgctaaa ttaccatatg ttgagccttc atccaaagaa 1860
tcgagtgaag cgcaggttaa tacagtttcc tctccacaag taagttctgc atccccaact 1920
tcatcagaaa ctatttctac agatacggta acagctagtc aagaaaaagc tgaatcacgg 1980
gtttctgccc cacaagtaat ttcagcatct caaacttcac cggaaactaa ttctgccgag 2040
gtggtaacaa ctagtcaaga agtagctaaa gcaccggttt ctgctccaca agtaagttct 2100
gaaatccaaa ctttatcaga aacagctcct acagaggtgg caacagaagc accggaatta 2160
agtgcacttg agagtaatcc agcacctcaa acttcattgg aaacaactcc tacagaggag 2220
gtaacagaaa caccggaacc aagtgtagtt gagagtaatt cagcatcccc aacttcaccg 2280
gaaactaatt ctgcagaggc agtaacaact agtcaagaaa tggctgaacc ttcggtttct 2340
gttccacaag taagttctga aatcccaact tcatcagaaa cagctccagc agaagtggca 2400
acagaagtat cggaagagag tagttcagca tctcaacctt caccggaaac aactcctaca 2460
gagacggtaa caactagtca agaagtagct gaagcaccgg tttctgctcc acaagtaagt 2520
tctgaaatcc caacttcacc ggaaacagct tctacagagg tggtggtagc taaacaagaa 2580
gtagctgact caccggtttc agctccacaa gtaatttctg aaatcccaac ttcatcagaa 2640
acagctccag cagaagtggc aacagaagta acagaaccaa gtgtagttgc gagtagttca 2700
gcatccccaa cttcaccgga agctaattct acagaggtgg tggtagctaa acaagaagta 2760
gctgacccac tggtttctgc tccacaaaca agttctgctt cacttacttt agaggttcct 2820
aaaaatgaac atttagacga gaaagcagat gcaactacgc caaatggagt tgaagcaaat 2880
actcatgagg cagtttctgt tccgacatca gatattcgtg ttcaagatgc tggttcagac 2940
acggtgcctc aaccttactc tttatctgcg acattgtttg aagaagcaat ttcaacagtt 3000
gagcctgtag gtgttgcaac ttcttctcaa gagagaagtg cagtagctgg caaggtgaaa 3060
gtgcctacct ctcttgaacg tagtaacaat tctgttgagg aagaaaaagt ggtcgattca 3120
aatgcaacaa ttgagaatcg agagccagag aaaaaagaga tccttacttc ggaaaatgta 3180
cttaacagct tagtaacaat ttgggtagct ttatctacta gtttcttcat gagatatttt 3240
tctcgaggaa aataa 3255
<210> 3
<211> 586
<212> PRT
<213> Streptococcus agalactiae
<400> 3
Asn Gln Asn Asn Ile Gln Glu Thr Asn Leu Val Glu Lys Asn Ser Glu
1 5 10 15
Asp Lys Phe Ile Gln Glu Leu Asn Arg Tyr Lys Thr Glu Ile Pro Asn
20 25 30
Phe Lys Gly Phe Asn Val Trp Ile Leu Gly Asp Lys Gly Tyr Tyr Lys
35 40 45
Asn Leu Ile Asn Leu Glu Glu Ile Lys Asn Ile Gln Ala Thr Leu Lys
50 55 60
Lys Glu Arg Asn Glu Glu Tyr Val Phe Val Lys Leu Asn Gly Lys Ile
65 70 75 80
Ala His Asp Thr Thr Val Phe Leu Met Asn Lys Lys His Lys Leu Leu
85 90 95
Lys Asn Ile Glu Glu Phe Lys Thr Ile Thr Gln Lys Arg Leu Thr Glu
100 105 110
Arg Gly Lys Phe Pro Tyr Asp Thr Val His Ser Thr Phe Glu Ile Lys
115 120 125
Asp Glu Asn Phe Ile Met Glu Arg Leu Lys Ser Ser Gly Leu Ser Met
130 135 140
Gly Lys Pro Val Asp Tyr Met Gly Val Asn Gly Ile Pro Ile Tyr Thr
145 150 155 160
Lys Thr Leu Ser Ile Asp Asn Lys Phe Ala Phe Glu Asn Asn Ser Lys
165 170 175
Asp Ser Ser Tyr Ser Ser Asn Ile Asn Ile Ser Glu Asp Lys Ile Lys
180 185 190
Glu Asn Asp Gln Lys Ile Leu Asp Leu Ile Val Lys Ser Gly Ala Asn
195 200 205
Asn Gln Asn Leu Thr Asp Glu Glu Lys Val Ile Ala Phe Thr Lys Tyr
210 215 220
Ile Gly Glu Ile Thr Asn Tyr Asp Asn Glu Ala Tyr Arg Ala Arg Asn
225 230 235 240
Val Asp Thr Glu Tyr Tyr Arg Ala Ser Asp Leu Phe Ser Val Thr Glu
245 250 255
Arg Lys Leu Ala Met Cys Val Gly Tyr Ser Val Thr Ala Ala Arg Ala
260 265 270
Phe Asn Ile Met Gly Ile Pro Ser Tyr Val Val Ser Gly Lys Ser Pro
275 280 285
Gln Gly Ile Ser His Ala Ala Val Arg Ala Tyr Tyr Asn Arg Ser Trp
290 295 300
His Ile Ile Asp Ile Thr Ala Ser Thr Tyr Trp Lys Asn Gly Asn Tyr
305 310 315 320
Lys Thr Thr Tyr Ser Asp Phe Ile Lys Glu Tyr Cys Ile Asp Gly Tyr
325 330 335
Asp Val Tyr Asp Pro Ala Lys Thr Asn Asn Arg Phe Lys Val Lys Tyr
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Met Glu Ser Asn Glu Ala Phe Glu Asn Trp Ile His Asn Asn Gly Ser
355 360 365
Lys Ser Met Leu Phe Ile Asn Glu Ser Ala Ala Leu Lys Asp Lys Lys
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Pro Lys Asp Asp Phe Val Pro Val Thr Glu Lys Glu Lys Asn Glu Leu
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Ile Asp Lys Tyr Lys Lys Leu Leu Ser Gln Ile Pro Glu Asn Thr Gln
405 410 415
Asn Pro Gly Glu Lys Asn Ile Arg Asp Tyr Leu Lys Asn Glu Tyr Glu
420 425 430
Glu Ile Leu Lys Lys Asp Asn Leu Phe Glu His Glu His Ala Glu Phe
435 440 445
Lys Glu Ser Leu Asn Leu Asn Glu Ser Phe Tyr Leu Gln Leu Lys Lys
450 455 460
Glu Glu Lys Lys Pro Ser Asp Asn Leu Lys Lys Glu Glu Lys Pro Arg
465 470 475 480
Glu Asn Ser Val Lys Glu Arg Glu Thr Pro Ala Glu Asn Asn Asp Phe
485 490 495
Val Ser Val Thr Glu Lys Asn Asn Leu Ile Asp Lys Tyr Lys Glu Leu
500 505 510
Leu Ser Lys Ile Pro Glu Asn Thr Gln Asn Pro Gly Glu Lys Asn Ile
515 520 525
Arg Asn Tyr Leu Glu Lys Glu Tyr Glu Glu Leu Leu Gln Lys Asp Lys
530 535 540
Leu Phe Lys His Glu Tyr Thr Glu Phe Thr Lys Ser Leu Asn Leu Asn
545 550 555 560
Glu Thr Phe Tyr Ser Gln Leu Lys Glu Gly Glu Met Lys Leu Ser Glu
565 570 575
Asn Pro Glu Lys Gly Glu Thr Asn Thr Asn
580 585
<210> 4
<211> 1761
<212> DNA
<213> Streptococcus agalactiae
<400> 4
aatcaaaata atattcaaga aactaatcta gttgaaaaaa acagtgaaga taagtttatt 60
caagagttaa ataggtataa aacagagata ccaaatttca aaggttttaa tgtttggatt 120
ttaggtgata aaggttatta caaaaacctt atcaatttag aagaaattaa aaatatccaa 180
gctacattaa aaaaagaaag aaatgaagaa tatgtctttg tcaaattaaa tgggaaaatc 240
gcacatgata caacagtatt cttgatgaat aaaaaacata aattacttaa aaatatagag 300
gaatttaaga cgataaccca aaaaaggcta actgagagag gaaagttccc atatgatacc 360
gttcattcta cgtttgaaat taaggatgaa aactttatca tggaaagatt gaaatcatca 420
gggttatcta tgggtaaacc agttgattat atgggcgtaa atggtatccc tatttacact 480
aaaacattat ctatagataa taagtttgcc tttgaaaata attcaaaaga ttcttcatat 540
tcttcaaaca ttaatattag tgaagataaa ataaaagaaa atgaccaaaa aattctagat 600
ttaatagtta aatctggagc taataatcaa aacttaacag atgaagaaaa agtaattgct 660
ttcactaaat atataggtga aataactaat tatgacaatg aagcttacag agctagaaat 720
gtcgacacag aatattacag agcttcagat ttattttctg taacagaaag aaaacttgct 780
atgtgcgttg gctatagtgt aacagccgct agggcattta atattatggg gatacctagt 840
tatgtcgttt ctggtaaaag tcctcaagga atatctcatg cagctgtgag agcgtattat 900
aatagaagtt ggcatatcat agatatcaca gccagtacat attggaaaaa tggtaattac 960
aaaacaacgt attccgattt tattaaagaa tactgtatag atggttatga cgtttatgat 1020
cccgcaaaaa caaataatag atttaaagtt aagtatatgg aatcaaatga agcgtttgaa 1080
aattggatac ataataatgg aagcaaatct atgttattta ttaatgaatc tgcagctcta 1140
aaagataaaa aaccaaaaga tgattttgta ccagtaacag aaaaagaaaa aaacgagctg 1200
atagataagt ataaaaaatt attgtcacag attcctgaaa acacacaaaa tccaggagaa 1260
aaaaacataa gagattattt gaaaaatgaa tatgaagaaa tattaaagaa agataattta 1320
tttgagcatg aacatgcaga atttaaagaa agtctaaatt taaatgaatc attctaccta 1380
caattaaaga aagaagaaaa gaaaccgagt gataatctca aaaaagaaga aaaaccaaga 1440
gaaaattcag taaaagagag ggagactcca gctgaaaaca atgattttgt ttcagtaaca 1500
gaaaaaaaca acttgattga taaatataaa gaattattat caaaaatccc agagaataca 1560
caaaatcctg gggaaaagaa tatacgaaat tatctagaga aagaatatga agaactacta 1620
caaaaagata aattattcaa gcatgagtac acagagttta caaaaagtct aaatttgaat 1680
gaaacattct attcacaatt aaaagaagga gaaatgaaac taagtgaaaa tcccgaaaaa 1740
ggagaaacga acacgaatta g 1761
<210> 5
<211> 493
<212> PRT
<213> Streptococcus porcinus
<400> 5
Ala Val Leu Ala Arg Glu Asn Ser Asn Ser Gly Gln Leu His Pro Glu
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Ala Arg Gln Ile Lys Ala Val Asp Phe Gln Glu Phe Ser Lys Lys Leu
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Lys Glu Glu Ile Ser Glu Asn Gln Gln Phe His Val Phe Lys Leu Gly
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Met Asn Asn Tyr Tyr Arg Ser Gly Ile Arg Ile Asn Glu Leu Asn Asn
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Leu Ala Thr Glu His Asp Phe Ile Leu Val Asn Asp His Ala Ser His
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Lys Lys Tyr Asp Val Pro His Ile Phe Ile Met Asn Lys Gly Asp Val
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Ile Val Pro Ser Lys Glu Lys Tyr Asp Glu Gln Met Arg Glu Val Lys
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Phe Ala Gly Asp Gln Pro Asn Ala Gln Arg Gln Arg Ile His Ala Leu
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Phe Glu Ile Gly Leu Asp Ser Asn Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ala Ala
130 135 140
Gly Leu Gly Thr Ala Glu Asn Thr Leu Ala Lys Val Asp Gly Phe Thr
145 150 155 160
Ile Tyr Ser His Gly Leu Thr Val Asp Asn Lys Tyr Tyr Glu Asp Tyr
165 170 175
Ile Arg Phe Asn Lys Asn Glu Asn Ile Asn Ile Thr Lys Glu Arg Phe
180 185 190
Thr Ala Asn Asp Asn Leu Ile His Asn Leu Ile Thr Glu Ser Thr Ala
195 200 205
Lys Val Gln Thr Asn Asp Arg Asp Lys Val Lys Ala Phe Val Met Tyr
210 215 220
Val Ala Asn His Thr Ile Tyr Asp Trp Ile Ala Ala Asn Asn Ala Val
225 230 235 240
Ser Asn Ile Ser Asp Val Asn Tyr Tyr Leu Gly Ser Asp Leu Phe Ser
245 250 255
Ile Thr Glu Arg Lys Lys Ala Met Cys Val Gly Phe Ser Thr Thr Ala
260 265 270
Ala Arg Ala Phe Asn Met Leu Gly Ile Pro Ala Tyr Val Val Val Gly
275 280 285
Lys Asn Ala Gln Gly Val Asp His Ala Thr Ala Arg Ala Tyr Tyr Asn
290 295 300
Gly Lys Trp His Thr Ile Asp Gly Thr Gly Phe Ile Asn Asp Lys Ala
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Ser Arg Ser Thr Ile Tyr Ser Glu Asn His Phe Tyr Ser Ile Gly Glu
325 330 335
Asp Ser Tyr Asn Ile Val Asp Val Asn Asp Glu Gln Ile Ala Phe Asp
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<211> 1482
<212> DNA
<213> Streptococcus porcinus
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aaagcagtgg attttcagga gttttcaaaa aaattaaagg aagaaatttc agaaaaccag 120
cagtttcacg ttttcaagct gggcatgaat aattattata ggtcaggcat ccgcataaat 180
gaactaaata atttagcaac tgagcatgac tttattcttg ttaatgacca tgctagccat 240
aagaaatatg atgttcctca tatctttatc atgaacaaag gagacgttat tgttcctagt 300
aaagaaaagt atgatgagca gatgagagag gtgaaattcg ccggtgatca acctaatgcg 360
caaagacaga gaattcatgc gctatttgaa atcggattgg attccaataa acgtcaatta 420
cttaacgctg cagggcttgg aaccgcagaa aatactttag caaaggttga tggctttaca 480
atctactctc atggcttgac ggttgataat aaatattatg aagactatat tcgttttaat 540
aaaaacgaaa acataaatat taccaaggaa cgctttactg ccaatgataa cttaatccat 600
aacttgataa ctgaatcaac agctaaagtt caaacaaatg accgagacaa agttaaagcg 660
tttgttatgt atgttgctaa ccacactatc tatgattgga tcgcagctaa caacgctgta 720
agtaatatat cagatgtcaa ctactatctt ggctctgatt tgttttcaat tactgaacgt 780
aagaaagcta tgtgtgttgg ttttagtact acagcagctc gtgcttttaa tatgttagga 840
attccagcct acgttgttgt tggaaaaaat gcacaaggtg tagaccatgc tacagctcgc 900
gcttactata acggtaaatg gcacactatt gacggtactg gttttattaa tgataaagct 960
tctcgctcta ctatttatag cgaaaatcac ttttactcta ttggcgaaga tagctataat 1020
atagttgatg ttaacgatga acaaatagct ttcgacaaaa actatatgaa aattgataag 1080
gtttttgaag aatgggctca aaaacaaccg acagcagact tattattgat taataaagat 1140
aaatcattag tcccttcaaa ttatgtagcc tacgtcgcac cagtaattgt cgataacaat 1200
cgtaaaggtt ctcttacaca aatttatcaa aatttaaaac aagtaatgga atcatcttct 1260
caaaaggcat ccctaacctc tctcttaaat actgcaacag cagacattgc aaaacttcaa 1320
actagttctc aacttaccca agaagactat aaccagattc agaattctat gaaatctgtt 1380
ctctcgtttt tctggcagtt agataaggat tctgctacga attttgaaaa tagcgaagat 1440
tataaaaaat atctaacaga aacaaagaat gcaggtaact aa 1482
<210> 7
<211> 517
<212> PRT
<213> Streptococcus equi
<400> 7
Met Glu Ala Trp Lys His Gly Ser Met Glu Ala Trp Lys His Gly Ser
1 5 10 15
Met Glu Ala Trp Lys His Gly Arg Thr Leu Cys Lys Gly Leu Leu Leu
20 25 30
Gly Leu Ala Cys Gly Ala Ile Ser Met Ser Leu Val Val Lys Ser Thr
35 40 45
Ile Val Val Ala Asp Asp Val Arg Leu Ser Glu Gln Ser Thr Val Ile
50 55 60
Leu Asp Asn Thr Val Ser Asn Leu Ile Ser Glu Val Lys Asp Glu Leu
65 70 75 80
Ala Lys Asn His Gln Asp Ala Leu Glu Ile Tyr Ile Leu Gly Glu Gly
85 90 95
Ser Pro Lys Tyr Ser Gly Val Ser Pro Asp Arg Leu Gly Asp Tyr Ile
100 105 110
Lys Asp Tyr Lys Pro Val Arg Leu Asn Gly Lys Val Ile His Gly Arg
115 120 125
Ala Phe Phe Met Met Lys Lys Glu Asp Gln Leu Ile Ser Thr Lys Glu
130 135 140
Glu Tyr Asp Arg Ile Ile Ala Glu Arg Phe Ser Asn Leu Glu Lys Phe
145 150 155 160
Asp Tyr Pro Thr Ile His Tyr Thr Phe Asn Ala Glu Leu Lys Asp Lys
165 170 175
Tyr Pro Tyr Leu Ser Leu Ile Leu Lys Ala Ser Gly Leu Ser Leu Ser
180 185 190
Asp Ser Ile Asn Leu Gly Ser Thr Leu Gly Ile Asn Gly Val Thr Ile
195 200 205
His Thr Gln His Leu Arg Ile Asp Asn Gln Phe Ala Tyr Arg Tyr Asn
210 215 220
Gly Glu Asp Tyr Lys Gln Asp Ser His Ile Thr Phe Asp Arg Phe Lys
225 230 235 240
Lys Asn Asp Asp Lys Leu Lys Glu Leu Ile Ala Thr Ser Gly Ala Asn
245 250 255
Gln Glu Gly Leu Thr Asp Ala Gln Arg Val Lys Ala Tyr Val Leu Tyr
260 265 270
Met Ala Asn His Val Asp Tyr Asp Trp Asp Ala Thr Arg Tyr Asn Pro
275 280 285
Asp Tyr Leu Ile Phe Cys Gln Ala Ser Asp Leu Phe Ala Leu Thr Glu
290 295 300
Arg Asn Lys Ala Met Cys Ile Gly Phe Ser Thr Ala Ala Ala Arg Gly
305 310 315 320
Leu Asn Leu Leu Gly Ile Pro Ser Tyr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Arg
325 330 335
Asp Gly Val Ala His Ala Thr Ile Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Lys Trp
340 345 350
Arg Thr Leu Asp Val Thr Gly Val Gly Arg Gly Lys Tyr Thr Glu Glu
355 360 365
His Tyr Asp Asn Leu Asn Thr His Asp Tyr Lys Ile Phe Asp Leu Thr
370 375 380
Lys Glu Thr Asn Val Asp Leu Asp Arg Gly Tyr Met Glu Ile Tyr Lys
385 390 395 400
Asp Phe Glu Asp Trp Ile Leu Ser His Asn Thr Lys Glu Leu Leu Phe
405 410 415
Ile Asn Gln Asp Ala Asn Ile Arg Asn Lys Val Ala Lys Asp Val Phe
420 425 430
Lys Tyr Ile Gln Glu Ala Glu Lys Gln Ser Leu Ile Asp Lys Tyr Asn
435 440 445
Glu Phe Ile Ile Arg Thr Ser Ala Leu Lys Ala Glu Phe Lys Thr Asp
450 455 460
Arg Leu Lys Glu Ile Val Gly Ser Leu Val Ser Gln Ala Gln Glu Glu
465 470 475 480
Leu Glu Asn Ile Lys His Ile Glu Val Met Thr Glu Asp Glu Lys Asp
485 490 495
Gln Phe Glu Tyr Thr Leu Arg Asn Leu Gly Val Tyr Tyr Ser Gln Cys
500 505 510
Glu Ser Ala Asn Gln
515
<210> 8
<211> 1554
<212> DNA
<213> Streptococcus equi
<400> 8
atggaagcat ggaagcatgg aagcatggaa gcatggaagc atggaagcat ggaagcatgg 60
aagcatggaa ggactttgtg taaaggatta ttattaggat tagcatgtgg tgctatatct 120
atgtctttag tcgtcaagag tacaattgta gttgcggacg atgtaaggct tagcgagcag 180
tcgacggtca ttttagataa cactgtgtca aatctgatta gtgaggttaa ggatgagtta 240
gccaaaaatc atcaggacgc attagaaatc tatatcttgg gggagggaag tccaaaatat 300
agtggagtgt ctcctgatcg tcttggtgac tacataaaag attataagcc tgtgcggttg 360
aatgggaagg tgatacatgg aagagcattt ttcatgatga aaaaggaaga tcagctgata 420
tcaactaaag aagaatatga ccgcataata gcagaaaggt tttcaaatct ggaaaaattt 480
gattacccta ctatacacta tacctttaat gcggagctaa aggataaata cccttatctt 540
agtttaatac taaaagcgag tggtctttcc ttgtctgact caataaattt aggctcaaca 600
ctgggtataa atggcgttac tatccataca cagcatttac gtatcgacaa tcagtttgct 660
tatagataca atggagagga ttataaacaa gatagtcata taacgtttga ccgttttaag 720
aagaatgatg acaagttaaa ggaattgatt gcaacatctg gagctaatca agaggggctg 780
acagatgctc aacgagtaaa agcctatgtc ttgtatatgg caaaccatgt tgattatgat 840
tgggatgcaa caagatataa tcctgattat ttaatatttt gtcaggcctc tgatttattt 900
gcacttacag agcgaaataa ggccatgtgt ataggcttta gtacagcagc tgcaagaggg 960
ttaaatctat tagggatacc atcttatgtg acctatggta aaaatagaga tggtgtagca 1020
catgcaacga tacgtgcttt ttacgataaa aagtggagaa cactagatgt tacaggagtt 1080
ggtagaggga aatacacaga agaacattat gacaatctca atacgcacga ttataagatt 1140
tttgatttaa ctaaggaaac aaacgttgat ttagatcgtg gctatatgga gatctataag 1200
gattttgaag attggatcct ctcacacaat acgaaagagc tattatttat taatcaagat 1260
gcgaatatac gtaataaggt tgcaaaagat gtttttaaat acatacaaga ggctgagaag 1320
caatcgttaa tagataagta taatgaattc atcataagaa cgagtgcttt aaaggctgag 1380
ttcaaaactg acaggttaaa agaaatagtc ggaagtctag ttagtcaggc acaggaagaa 1440
ttagaaaata tcaagcatat tgaagttatg acagaagatg aaaaagatca gtttgaatat 1500
acactgagga atttaggagt atattattca caatgtgaaa gcgctaatca ataa 1554
<210> 9
<211> 497
<212> PRT
<213> Streptococcus pseudoporcinus
<400> 9
Arg Glu Asn Glu Asn Val Arg Gln Leu Gln Ser Glu Asn Lys Gln Met
1 5 10 15
Lys Ala Val Asn Leu Gln Glu Phe Ser Glu Lys Leu Lys Gly Glu Ile
20 25 30
Ala Glu Asn Gln Gln Phe His Ile Phe Lys Leu Gly Leu Asn Asn Tyr
35 40 45
Tyr Ile Gly Gly Val Arg Ile Asn Glu Leu Ser Asp Leu Ala Lys Asn
50 55 60
His Asp Phe Ile Met Ile Asp Asn Arg Ala Thr His Asn Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Val Pro His Ile Ile Ile Met Asn Lys Asp Asp Val Ile Val His Asn
85 90 95
Gln Glu Asp Tyr Asn Lys Glu Met Ala Glu Leu Thr Phe Ala Gly Asp
100 105 110
Lys Pro Ile Gln Ser Asp Ser Tyr Leu Pro Gln Lys Lys Arg Ile His
115 120 125
Ala Leu Phe Glu Ile Gly Leu Asp Ser Asn Arg Arg Gln Leu Leu Asn
130 135 140
Ala Ala Gly Leu Lys Thr Pro Glu Asn Ser Val Ile Glu Leu Asp Thr
145 150 155 160
Phe Lys Ile Tyr Ser His Gly Leu Ala Val Asp Asn Lys Tyr Tyr Asp
165 170 175
Glu Tyr Ser His Phe Asn Asn Asn Thr Asn Val Asn Ile Thr Lys Gln
180 185 190
Arg Phe Thr Glu Asn Asp Asn Leu Ile His Asn Leu Ile Thr Thr Ser
195 200 205
Thr Ala Lys Asp Gln Pro Thr Asp Arg Asp Lys Val Lys Thr Phe Val
210 215 220
Met Tyr Val Ala Asn His Thr Ile Tyr Asp Trp Asn Ala Ala Asn Asn
225 230 235 240
Ala Val Ser Asn Ile Ser Asp Val Asn Tyr Tyr Leu Gly Ser Asp Leu
245 250 255
Phe Ser Ile Thr Glu Arg Lys Lys Ala Met Cys Val Gly Phe Ser Thr
260 265 270
Thr Ala Ala Arg Ala Phe Asn Met Leu Gly Ile Pro Ala Tyr Val Val
275 280 285
Glu Gly Lys Asn Ala Gln Gly Val Asp His Ala Thr Ala Arg Val Tyr
290 295 300
Tyr Asn Gly Lys Trp His Thr Ile Asp Gly Thr Gly Phe Ile Asn Gly
305 310 315 320
Asn Arg Thr Arg Ser Thr Leu Tyr Thr Glu Ser His Phe Arg Ser Val
325 330 335
Gly Glu Asp Ser Tyr Gln Leu Val Gly Leu Asn Glu Asp Ile Pro Phe
340 345 350
Asp Arg Asn Tyr Met Lys Ile Asp Lys Val Tyr Glu Glu Trp Ala Pro
355 360 365
Lys Gln Lys Thr Ala Asp Leu Leu Leu Val Asn Lys Asp Lys Ser Leu
370 375 380
Val Gly Leu Asp Arg Val Ala Tyr Val Glu Pro Val Tyr Val Asp Lys
385 390 395 400
Asn Arg Gln Asp Ala Leu Thr Gln Ile Tyr Lys Lys Leu Lys Glu Thr
405 410 415
Met Glu Ser Ser Ser Lys Lys Asn Pro Ser Ser Gly Gly Phe Ser Ser
420 425 430
Leu Leu Gly Ser Ala Ser Ser Asp Ile Ala Lys Leu Glu Gly Ser Ser
435 440 445
Gln Leu Thr Gln Glu Glu Tyr Asp Lys Ile His Arg Ser Met Thr Ser
450 455 460
Ile Leu Thr Phe Phe Ala Gln Leu Asp Lys Asp Ala Ala Glu Ala Phe
465 470 475 480
Glu Lys Gly Asn Asp Tyr Lys Asn Tyr Leu Ala Thr Thr Lys His Ala
485 490 495
Gln
<210> 10
<211> 1494
<212> DNA
<213> Streptococcus pseudoporcinus
<400> 10
agagaaaatg aaaacgtaag acaattacaa tcagaaaata aacaaatgaa agcagtaaac 60
ttgcaggaat tttcggagaa attaaaagga gaaattgctg aaaatcaaca atttcatatc 120
tttaaactag ggttgaataa ttattacata ggaggggtac gcataaatga actgagtgat 180
ttagcgaaaa accatgattt tatcatgatt gataatcgtg ctacccataa taaatatgga 240
gtccctcata taattattat gaacaaagat gatgttattg tgcataatca agaagactat 300
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caattactta acgctgcagg acttaaaaca ccagaaaata gtgtaataga acttgatacc 480
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gaacgcaaga aagctatgtg tgtaggcttt agcactacag cagctcgtgc ttttaatatg 840
ctgggtatcc cagcctatgt ggttgaaggt aaaaacgcgc aaggtgtgga ccatgctact 900
gctcgtgtct actataatgg aaaatggcat accattgacg ggactggctt tattaacggt 960
aaccgcactc gctccactct ctataccgaa agccacttta ggtctgttgg agaagatagc 1020
tatcaactgg ttggtcttaa tgaggacata ccttttgata gaaactatat gaagattgat 1080
aaagtttacg aagaatgggc tcccaaacaa aagacggcag acctactatt agttaacaaa 1140
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tctatgacat ctattctcac cttttttgca caactagata aagacgccgc cgaagccttt 1440
gaaaagggaa atgattataa gaattattta gcaacaacaa agcatgcaca gtaa 1494
<210> 11
<211> 432
<212> PRT
<213> Streptococcus suis
<400> 11
Asp Glu Asn Ser His Leu Gln Ser Pro Lys Asn Thr Asn Lys Ile Glu
1 5 10 15
Val Leu Asn Trp Glu Ala Phe Ser Lys Lys Leu Lys Asp Tyr Ser Ser
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Asp Gln Arg Gln Phe His Val Leu Lys Leu Gly Phe Glu Asn Arg Leu
35 40 45
Gly Thr Leu Ser Thr Arg Glu Glu Leu Glu Glu Phe Gly Lys Asn Asn
50 55 60
Asn Phe Leu Val Ile Asn Gly Lys Val Thr Gln Asn Ile His Asp Phe
65 70 75 80
Pro His Ile Leu Val Met Asn Lys Gly Asp Val Ile Ala His Asn Glu
85 90 95
Glu Asp Tyr His Asn Gln Met Arg Glu Leu Arg Phe Ser Gly Asn Gly
100 105 110
Asp Leu His Asn Ser Met Glu Pro Lys Arg Ile His Ala Leu Phe Lys
115 120 125
Ile Glu Leu Asp Ser Asn Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ala Ala Gly Leu
130 135 140
Gly Thr Ala Glu Asn Ser Leu Lys Asn Ile Asn Gly Met Thr Ile Tyr
145 150 155 160
Ser His Gly Leu Thr Val Asp Asn Lys Tyr Tyr Glu Asp Tyr Ser Lys
165 170 175
Tyr Thr His Asn Ser Val Lys Asn Ile Asn Val Thr Lys Glu Arg Phe
180 185 190
Ile Ala Asn Asp Asp Leu Ile His Lys Leu Ile Glu Ser Ser Glu Ala
195 200 205
Met Lys Gln Ser Ser Glu Arg Asp Lys Val Lys Ala Phe Val Gln Tyr
210 215 220
Val Ala Asn His Thr Thr Tyr Asp Trp Glu Ala Ala Asn Lys Ala Val
225 230 235 240
Gln Asn Tyr Ala Asp Ile Asn Tyr Tyr Leu Gly Ser Asp Leu Phe Ala
245 250 255
Val Thr Glu Arg Gln Lys Ala Met Cys Val Gly Phe Ser Thr Thr Ala
260 265 270
Ala Arg Ala Phe Asn Met Leu Gly Leu Pro Ala Tyr Val Val Val Gly
275 280 285
Lys Asn Ala Glu Gly Val Pro His Ala Thr Ala Arg Val Tyr Tyr Asp
290 295 300
Lys Lys Trp His Thr Ile Asp Gly Thr Gly Phe Ile Thr Gly Asn Lys
305 310 315 320
His Gln Arg Ser Ala Lys Tyr Ser Glu Lys His Phe Ser Thr Ile Gly
325 330 335
Glu Asp Ser Tyr Asp Val Val Glu Ala Gly Gln Glu Pro Lys Ala Glu
340 345 350
Arg Asn Tyr Met Ile Ile Asp Ser Asn Tyr Glu Ser Trp Ala Met Lys
355 360 365
Gln Lys Thr Ala Asp Leu Leu Leu Phe Asn Lys Glu Lys Ser Leu Val
370 375 380
Gly Leu Asp Tyr Ile Ala Tyr Val Glu Pro Thr Tyr Ile Thr Glu Asn
385 390 395 400
Lys Lys Asn His Leu Leu Asp Ile Tyr Lys Ala Leu Lys Arg Lys Val
405 410 415
Glu Glu Thr Lys Ala Thr Asp Lys Asp Asp Lys Asp Asp Lys Gln Glu
420 425 430
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer/probe
<400> 12
tcactgcagt tttggggagt agg 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer/probe
<400> 13
atggatccca gttcagaacc tc 22
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer/probe
<400> 14
cgggatccag agaaaaaaga gatcc 25
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<220>
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attgtatttg gtggaggag 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer/probe
<400> 17
tttagcagct aagttgatac c 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer/probe
<400> 18
gtttccatgg atgaaaactc acatttacaa tcg 33
<210> 19
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 19
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<220>
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<210> 21
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<212> DNA
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<220>
<223> Primer/probe
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<210> 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer/probe
<400> 22
taaaaagtgg cacaccattg ccggtacagg ttttattaca g 41

Claims (7)

1.一种非诊断治疗目的的用于切割人IgG1的体外方法，所述方法包括使人IgG1与多肽接触，所述多肽为SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括在允许发生特异性半胱氨酸蛋白酶活性的条件下，将所述多肽与含有人IgG1的样品一起培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括鉴定和/或分离切割产物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述鉴定和/或分离包括通过凝胶电泳或质谱进行分析。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于产生Fc和Fab片段。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用于非诊断治疗目的的人IgG1检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其进一步包括：
(i)在允许多肽的人IgG1特异性半胱氨酸蛋白酶活性的条件下，使样品与权利要求1所定义的多肽接触；和
(ii)监测人IgG1特异性切割片段的存在；
其中，特异性切割片段的存在指示样品中的人IgG1。
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