JP7123801B2 - 新しい連鎖球菌プロテアーゼ - Google Patents
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Description
(a)配列番号1のアミノ酸配列;
(b)配列番号1のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号1の変異体;
(c)対象において、連鎖球菌、好ましくはS.スイス(S. suis)に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号1のフラグメント、配列番号1の変異体、もしくは配列番号1の変異体のフラグメント;
(d)配列番号3のアミノ酸配列;
(e)配列番号3のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3の変異体;
(f)対象において、連鎖球菌、好ましくは、S.アガラクチアエ(S. agalactiae)に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号3のフラグメント、配列番号3の変異体、もしくは配列番号3の変異体のフラグメント;
(g)配列番号5のアミノ酸配列;
(h)配列番号5のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号5の変異体;
(i)対象において、S.ポルシナス(S. porcinus)に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号5のフラグメント、配列番号5の変異体、もしくは配列番号5の変異体のフラグメント;
(j)配列番号7のアミノ酸配列;
(k)配列番号7のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号7の変異体;
(l)対象において、連鎖球菌、好ましくはS.エクイ(S. equi)に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号7のフラグメント、配列番号7の変異体、もしくは配列番号7の変異体のフラグメント;または
(m)配列番号9のアミノ酸配列;
(n)配列番号9のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号9の変異体;
(o)対象において、連鎖球菌、好ましくはS.シュードポルシナス(S. pseudoporcinus)に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号9のフラグメント、配列番号9の変異体、もしくは配列番号9の変異体のフラグメント
を含み;好ましくは、免疫応答は保護免疫応答である、IgdEポリペプチドを提供する。
(a)ポリペプチド配列番号1もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグメントをコードする配列;
(b)ポリペプチド配列番号3もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグメントをコードする配列;
(c)ポリペプチド配列番号5もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグメントをコードする配列;
(d)ポリペプチド配列番号7もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグメントをコードする配列;または
(e)ポリペプチド配列番号9もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグメントをコードする配列
を含む、IgdEポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
(a)配列番号2もしくはそれに相補的な配列;
(b)(a)で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列;
(c)(a)もしくは(b)で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列;
(d)(a)もしくは(b)で定義された配列との少なくとも70%の同一性を有する配列;
(e)IgdEシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ/もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはS.スイス(S. suis)に対する免疫応答を生じさせることができる配列(a)、(b)、(c)もしくは(d)のいずれかのフラグメント;
(f)配列番号4もしくはそれに相補的な配列;
(g)(f)で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列;
(h)(f)もしくは(g)で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列;
(i)(f)もしくは(g)で定義された配列との少なくとも70%の同一性を有する配列;
(j)配列(f)、(g)、(h)もしくは(i)のいずれかの、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ/もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはS.アガラクチアエ(S. agalactiae)に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント;
(k)配列番号6もしくはそれに相補的な配列;
(l)(k)で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列;
(m)(k)もしくは(l)で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列;
(n)(k)もしくは(l)で定義された配列との少なくとも70%の同一性を有する配列;
(o)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ/もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはS.ポルシナス(S. porcinus)に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードする、配列(k)、(l)、(m)もしくは(n)のいずれかのフラグメント;
(p)配列番号8もしくはそれに相補的な配列;
(q)(p)で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列;
(r)(p)もしくは(q)で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列;
(s)(p)もしくは(q)で定義された配列との少なくとも70%の同一性を有する配列;または
(t)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ/もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはS.エクイ(S. equi)に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードする配列(p)、(q)、(r)もしくは(s)のいずれかのフラグメント;
(u)配列番号10もしくはそれに相補的な配列;
(v)(u)で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列;
(w)(u)もしくは(v)で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列;
(x)(u)もしくは(v)で定義された配列との少なくとも70%の同一性を有する配列;または
(y)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ/もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはS.シュードポルシナス(S. pseudoporcinus)に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードする、配列(u)、(v)、(w)もしくは(x)のいずれかのフラグメント
を含むIgdEポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
(a)配列番号1のアミノ酸配列;
(b)配列番号1のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号1の変異体;
(c)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号1のフラグメントもしくは配列番号1の変異体のフラグメント;
(d)配列番号3のアミノ酸配列;
(e)配列番号3のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3の変異体;
(f)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3のフラグメントもしくは配列番号3の変異体のフラグメント;
(g)配列番号5のアミノ酸配列;
(h)配列番号5のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号5の変異体;
(i)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号5のフラグメントもしくは配列番号5の変異体のフラグメント;
(j)配列番号7のアミノ酸配列;
(k)配列番号7のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号7の変異体;
(l)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号7のフラグメントもしくは配列番号7の変異体のフラグメント;
(m)配列番号9のアミノ酸配列;
(n)配列番号9のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号9の変異体;
(o)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号9のフラグメントもしくは配列番号9の変異体のフラグメント;
(p)配列番号11のアミノ酸配列;
(q)配列番号11のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号11の変異体;または
(r)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号11のフラグメントもしくは配列番号11の変異体のフラグメント
を含むIgdEポリペプチドを提供する。
(d)配列番号3のアミノ酸配列;
(e)配列番号3のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3の変異体;
(f)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3のフラグメントまたは配列番号3の変異体のフラグメント;
を含む、IgdEagalactiaeポリペプチドであり得る。
(a)配列番号1のアミノ酸配列;
(b)配列番号1のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号1の変異体;
(c)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号1のフラグメントもしくは配列番号1の変異体のフラグメント。
(d)配列番号3のアミノ酸配列;
(e)配列番号3のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3の変異体;
(f)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3のフラグメントもしくは配列番号3の変異体のフラグメント;
(g)配列番号5のアミノ酸配列;
(h)配列番号5のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号5の変異体;
(i)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号5のフラグメントもしくは配列番号5の変異体のフラグメント;
(j)配列番号7のアミノ酸配列;
(k)配列番号7のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号7の変異体;
(l)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号7のフラグメントもしくは配列番号7の変異体のフラグメント;
(m)配列番号9のアミノ酸配列;
(n)配列番号9のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号9の変異体;
(o)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号9のフラグメントもしくは配列番号9の変異体のフラグメント;
(p)配列番号11のアミノ酸配列;
(q)配列番号11のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号11
の変異体;または
(r)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号11のフラグメントもしくは配列番号11の変異体のフラグメント
を含む方法を提供する。
(d)配列番号3のアミノ酸配列;
(e)配列番号3のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3の変異体;または
(f)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3のフラグメントもしくは配列番号3の変異体のフラグメント
を含むIgdEagalacポリペプチドであり得る。
a)IgdEポリペプチドおよびIgGを、候補物質と、該物質の不在下におけるIgGのシステイン活性を可能にする条件下で接触させること、
b)候補物質の存在下で消化されたIgGの量を、前記物質の不在下における場合と比較して決定すること、
c)それにより、該物質が、IgdEポリペプチドのIgGシステイン活性を活性化するかまたは阻害するかを決定すること
を含むことができる。
配列番号1は、S.スイス(S. suis)の株10から単離されたIgdEのアミノ酸配列である。S.スイス(S. suis)からのIgdEの追加のアミノ酸配列は、例えばGenBankで、アクセッション番号WP_012027720.1、WP_044687717.1、WP_045002893.1、WP_044981166.1、WP_044770432.1、WP_043041527.1、WP_014917307.1、WP_044981141.1、WP_044766031.1、WP_044780628.1、WP_044980481.1、WP_044768304.1、WP_043033176.1、WP_044772573.1、ABQ42883.1、ABQ42882.1、ABQ42884.1、ABQ42885.1、WP_024402604.1、WP_044671803.1、WP_014639000.1、WP_014636499.1、WP_044475270.1、WP_044683049.1、WP_044682603.1、WP_044982674.1、WP_024406212.1、WP_024402376.1、WP_024382860.1、WP_044684005.1、WP_044688055.1、WP_044754153.1、WP_024412941.1、WP_029172805.1、AER15932.1、WP_024414493.1、WP_044762560.1、WP_024417771.1、WP_044675281.1、WP_044666819.1、WP_043032980.1、WP_044671755.1、WP_024416363.1、ABL84354.1、ABL84413.1、WP_044758899.1、WP_024393919.1、WP_014736321.1、WP_024383620.1、WP_044475488.1、WP_024386700.1、WP_024381951.1、WP_024390579.1、WP_023371419.1、WP_044772576.1、WP_044766774.1、WP_044672596.1、WP_043028752.1、WP_044771508.1、WP_024383851.1、WP_024388957.1、WP_024394959.1、WP_029174632.1、WP_044752120.1、WP_044678077.1、WP_002938262.1、WP_044769991.1、WP_044770681.1、WP_044749736.1、およびWP_044771392.1として見出すことができる。
本発明によるIgdEポリペプチドは、好ましくは、IgdEsuis、IgdEagalactiae、IgdEporcinus、IgdEequi、またはIgdEpseudoporcinusポリペプチド、またはシステインプロテアーゼ活性を保持するそれらの任意の変異体もしくはフラグメントであり、かつ/または対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができる。変異体は、別の細菌からのIgdEポリペプチドであってもよい。細菌は、好ましくは連鎖球菌である。
本発明によるポリヌクレオチドは:(a)配列番号4、5、6、8、もしくは10のコード配列;(b)(a)で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列;(c)(a)もしくは(b)で定義された配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ/もしくは対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができる配列;または(d)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ/もしくは対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができるポリペプチドをコードする、(a)、(b)もしくは(c)で定義された配列のいずれか1つのフラグメントを含むかまたはそれらからなることができる。
IgdEポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、病原性IgG抗体により媒介される疾患または状態を治療または予防するために使用することもできる。病原性のIgG抗体が、多くの異なる疾患および状態の病原性に関与していることは、当技術分野において周知である。その結果として、そのような疾患における病原性のIgG抗体の効果は、IgdEポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用して阻害することができる。
本発明は、IgGを:
(a)配列番号1、3、5、7、9もしくは11のアミノ酸配列;
(b)配列番号1、3、5、7、9もしくは11のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGシステインプロテアーゼ活性を有するそれらの変異体;または
(c)IgGシステインプロテアーゼ活性を有する(a)もしくは(b)のいずれかのそれらのフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む、IgGの切断のためのインビトロの方法を包含する。
(a)配列番号3のアミノ酸配列;
(b)配列番号3のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3の変異体;
(c)IgGシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3のフラグメントまたは配列番号3の変異体のフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む。
S.スイス(S. suis)からのIgdEの同定
細菌株および成長条件
S.スイス(S. suis)の株10は、突然変異生成およびブタの実験的感染のために幾つかの研究で使用されたことのある毒性の血清型2の株である(Smith et al. 1999. Infect. Immun. 67, 1750-1756)。株10M7はHilde Smith(AWG、Lelystad、オランダ)の好意により提供された(Smith et al. 1996. Infect. Immun. 64, 4409-4412)。連鎖球菌は、コロンビア寒天プレート上で6%のヒツジ血液を添加して、またはBactoTodd-Hewittブロス(THB)中、嫌気性条件下にて37℃で成長させた。大腸菌(Eschrichia coli)株は、Luriaブロス(LB)中で培養した。適当な場合に、抗生物質を、カナマイシンについては50μg/mlおよびゲンタマイシンについては20μg/ml添加した。
実験的に感染させたコブタからの試料を先行する研究中に取り出した。この動物実験のためのプロトコルは、ドイツのニーダーザクセン州動物実験委員会消費者保護および食物安全局(Committee on Animal Experiments of the Lower Saxonian State Office for Consumer Protection and Food Safety)により承認された(承認番号33.9-42502-04-07/1243)。殺菌アッセイのために従来のコブタからの血液のコレクションを、ドイツのザクセン州地方事務所(regional office in Saxonia)でN19/14として登録した。動物試験は、実験および他の科学的目的のために使用される脊椎動物保護のためのヨーロッパ協定(the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes)(ヨーロッパ条約シリーズno.123(European Treaty Series, no.123):http://www.conventions.coe.int/Treaty/en/Treaties/Html/123.htm)およびドイツの動物保護法(German Animal Protection Law)で概説された原則および勧告に厳密に従って実施した。
S.スイス(S. suis)の株10M7の培養物を、OD600約0.6で収穫して、培養上清を0.22μMのExpress PLUS膜フィルター(ミリポア)を通して滅菌濾過した後、培養上清を硫酸アンモニウムを用いて30%飽和まで分画した。生じた沈殿を廃棄して、硫酸アンモニウムを残存上清に添加し、最終の濃度を50%飽和にした。第2の沈殿を、20mMのBis-Tris(pH6.8)を添加して出発時の体積の1/100に再懸濁して、同じ緩衝液に対する緩衝液交換を、HiPrep26/10脱塩カラム(GE Healthcare)により実施した。この材料を、FPLCによりHiTrap Q HPカラム(GE Healthcare)でさらに分画した。タンパク質を直線的NaClグラジエントにより溶出させて、約0.2M NaClで溶出した分画が、IgGを分解する活性を含有することが見出された。活性分画をサイズ排除クロマトグラフィー(HiPrep 16/60 Sephacryl S-100HR、GE Healthcare)にかけて、そこでIgGを分解する活性は、約37mlの溶出体積で溶出した。活性分画をSDS-PAGEにより分析して、タンパク質バンドを質量分析法の分析にかけた。
MALDI-TOF質量分析法は、Umeaタンパク質分析施設(Umea University)によって実施された。MS分析のためのペプチドは、トリプシンを使用してゲル内消化により調製して(改変された配列決定規格、Promega)、Easy nano LCシステム(Proxeon)に連結された、HCT ultra ETD II イオン捕捉装置(Bruker)ESIを使用するLC-MS/MSにより分析した。LC-MS/MSのデータセットについての処理、デコンヴォルーションおよび化合物検出は、DataAnalysisソフトウェア(4.0 SP4、Bruker)を使用して実施した。処理されたデータセットのピークリストファイルを使用するデータベース検索は、Mascot検索エンジン(Matrixscience)を使用して、NCBInrデータベースの細菌配列で実施した。検索パラメーターは、MSおよびMS/MS両方の様式について、ならびに酸化によるメチオニンの、プロピオンアミド誘導およびN末端アセチル化によるシステインの可変改変について、0.3Daの質量誤差を許容した。
15種の異なるS.スイス(S. suis)株(表2)の培養上清を、OD600約0.6で単離して、飽和した硫酸アンモニウム溶液の添加により50%の最終の飽和に濃縮した。Zeba Spin脱塩カラム7K MWCO(Thermo Scientific)によるPBSに対する緩衝液交換に続いて、沈殿をPBS中で出発時の1/20の体積に再懸濁した。S.スイス(S. suis)の培養上清の50%硫酸アンモニウム沈殿分画を、IgG分解を分析するために使用した。
igdEのインフレーム欠失は、原理的にSeele et al., 2013(J. Bacteriol. 195, 930-940)におけるように、S.スイス(S. suis)の株10を用いて実行した。感熱性のベクターpSET5_ΔigdEを構築するために、618bpの5’-igdEアンプリコンを、プライマーpreProIgdEPstI(TCACTGCAGTTTTGGGGAGTAGG、配列番号12)およびpostSSIgdEBamHI(ATGGATCCCAGTTCAGAACCTC、配列番号13)を用いて生じさせ、612bpの3’-igdEアンプリコンをプライマーpreEndIgdEBamHI(CGGGATCCAGAGAAAAAAGAGATCC、配列番号14)およびpostEndIgdEEcoRI(AGGAATTCACCGTTATTGTAGCG、配列番号15)を用いて生じさせた。これらのアンプリコンを、プライマーの名で指示された制限酵素を用いてpSET5(18)中にクローニングしてpSET5_ΔigdEを生じさせた。欠失クローンを、選択的PCR分析ならびにプライマーIgdE-seq_frw(ATTGTATTTGGTGGAGGAG、配列番号16)およびIgdE-seq_rev(TTTAGCAGCTAAGTTGATACC、配列番号17)を使用して、ゲノムのアンプリコンの配列決定により確認した。
配列の分析を、SIB Bioinformatics Resource Portal Expasy(www.expasy.ch)を使用して実施した。SignalP 4.0を走らせて、推定上のシグナルペプチドおよびそれぞれの切断部位を同定した(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。潜在的な活性部位の残基を同定するために、S.スイス(S. suis)IgdEのインシリコモデル化を、SWISS-モデル(http://swissmodel.expasy.org/)を使用して実施した。推定上の膜貫通領域を、コンセンサス予測ウェブサーバーTOPCONS(http://topcons.cbr.su.se/)の最終アクセッション2015-11-06を使用して同定した。
プライマーをゲノムS.スイス(S. suis)P1/7中の遺伝子SSU_RS08150に基づいて設計した。全てのPCRを、Phusion Master Mix HF(Thermo Scientific)を用いて実行した。全ての得られたプラスミドを制限分析、PCRおよび配列決定により確認した。
シグナルペプチドのコード配列(アミノ酸38~1121をコードする)を欠くS.スイス(S. suis)igdE遺伝子を、S.スイス(S. suis)の株10の染色体DNAから、プライマーIgdE-frw_NcoI(GTTTCCATGGATGAAAACTCACATTTACAATCG、配列番号18)およびIgdE-rev_NotI(ACGTGCGGCCGCATAAGCTTCGTAC、配列番号19)を使用するテンプレートとして増幅して、NcoIおよびNotI(Thermo Scientific)で消化した後、pET_ZZ_1a中にクローニングした。挿入された全体を配列決定して、S.スイス(S. suis)igdEのクローニングおよび配列を検証した。得られたS.スイス(S. suis)の株10igdEの配列は、S.スイス(S. suis)の05ZYH33の配列のうちの1つと同じであり、32個のアミノ酸の挿入を含有しており、S.スイス(S. suis)P1/7のSSU_RS08150と比較した。
pET_ZZ_1a igdE、igdEC302S、igdEH302A、igdED302AまたはigdEΔCを保有する大腸菌(E. coli)ArcticExpress(DE3)_RIL(Agilent Technologies)単離物を、OD6000.6まで30℃で成長させた。タンパク質の発現は、1mM IPTGを用いて12℃で誘発し、インキュベーションをさらに22時間継続した。
濃縮されて分画された培養上清中におけるIgG切断活性をモニターするために、試料を1%ブタ血漿とPBS中で37℃で16時間インキュベートした後、ウェスタンブロット分析した。
時間経過分析および阻害剤プロファイルのために、IgG分解反応を、0.25mg/mlのブタIgGおよび2μMの精製IgdEΔCを用いてPBS中37℃で、阻害せずに、または2.5μMまたは250μMのAEBSF(Sigma)、EDTA、E-64(Sigma)、ヨードアセトアミド(Sigma)、またはZ-LVG-CHN2(Bachem)の存在下で実施した。250μMのZ-LVG-CHN2中のDMSO含有率に対応する0.275%のDMSO(Sigma)を溶媒対照として使用した。反応液を連続的に試料として採取して、還元条件下でSDS-PAGEにかけた。タンパク質のバンドは、Coomassie Fluor(商標) Orange Protein Gel Stain(Invitrogen)を用いる染色により検出した。IgG分解産物を、LAS4000撮像システム(冨士フィルム)を用いる撮像により濃度計で定量化し、Image Studio Version3.1(LI-COR Biosciences)ソフトウェアを用いて分析した。時間経過実験のために、阻害されない終夜の切断を100%相対切断として設定した。阻害剤プロファイルのために、初期切断速度を切断産物の初期増大(0~25%の相対切断)から計算して、阻害されない反応の初期切断速度を100%相対活性として設定した。実験は、少なくとも3連で実施した。統計分析は、GraphPad Prism Version 5.0を使用して実施した。
SDS-PAGEのための試料は、還元または非還元いずれかの試料緩衝液を用いて調製し、95℃に5分間加熱した。12%のSDS-PAGEをクーマシーブルー(Sigma)、Coomassie Fluor(商標) Orange Protein Gel Stain(Invitrogen)のいずれかで染色して、またはウェスタンブロット分析のためにHybond-P PVDF膜(GE Healthcare)にブロットした。0.1%PBS-ツイーン中で、膜を5%乾燥粉乳でブロッキングし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体とインキュベートした。ヤギ抗ブタIgG-HRP(Thermo Scientific)およびヤギ抗ブタIgM-HRP(Thermo Scientific)を1:25,000に希釈して、ヤギ抗ブタIgA-HRP(Thermo Scientific)を1:12,500に希釈した。膜を0.1%PBS-ツイーンで徹底的に洗浄した後、Amersham ECL選択ウェスタンブロット検出試薬(GE Healthcare)を用いてメーカーの使用説明に従って現像し、LAS4000撮像システム(冨士フィルム)により写真撮影した。
S.スイス(S. suis)IgdEで処理されたブタIgGを、前に説明したようにSDS-PAGEにより分離して、50mMのホウ酸ナトリウム/20%MetOHをブロット緩衝液として用いて、半乾燥ブロットによりHybond-P PVDF膜(GE Healthcare)上に移した。該膜をPonceau S(Sigma)で染色して、乾燥後、約32kDaの分解産物を正確に切り出した。分解産物のN末端のエドマン配列決定を、Proteome Factory(ベルリン、ドイツ)により実施して、配列W/C PICPACEを得た。最初の位置配列決定は、強いトリプトファンピークおよびシステイン位置に弱いピークのみを生ずる汚染に多分基づいて複雑であった。しかしながら、BLAST相同性の検索で、配列を疑う余地のないスコアのブタIgGヒンジ領域配列が、システイン残基を対応する位置に含有した。システインは、プロピオンアミド改変されたシステインのシグナルにより同定されたが、それにも拘わらずシステインは較正標準の部分ではない。
S.スイス(S. suis)IgdEに対するIgG力価を検出するために、Maxisorb(登録商標)プレート(Nunc)を、炭酸塩緩衝液を使用して0.6μgのrIgdEタンパク質でコートした。コーティング後、プレートを0.1%ツイーン20(PBST)を加えたPBSで3回洗浄して、PBS中5%の粉乳で37℃で2時間ブロッキングした。全ての試料および対照を、1:100の希釈で出発して、PBST中における4回の2倍希釈の(陽性参照血清:6個)2連シリーズで測定した。S.スイス(S. suis)IgdEに特異的なIgG抗体を検出するために、プレートを、ヤギ抗ブタIgG-HRP(1mg/ml、Bethyl、A100-105P)と、1:10000の希釈で37℃で1時間インキュベートした。全てのインキュベーションステップは、37℃で振盪機上で実施して、各インキュベーションステップ後、プレートをPBSTで洗浄した。プレートを、2,2-アジノ-ジ-[3-エチルベンジチアゾリンスルホネート](ABTS)および0.003%H2O2を基質として用いて現像した。吸光度は、405nmでマイクロプレートリーダー(Synergy H1、BioTek Instruments GmbH)で測定した。光学密度を、バックグラウンドを差し引いた後対数の直線的回帰分析により抗体濃度に変換した。各試料についてのELISAユニットは、2つのシリーズの4回希釈の各々について計算されたユニットの平均として定義された。S.スイス(S. suis)の株10を用いた実験的感染後20日に採取された血清試料から得られたELISA値を、任意に100ELISAユニットに設定して、一方、初乳を奪われたコブタから誘導された血清試料からのELISA値を陰性対照として使用した。
S.スイス(S. suis)はIgG切断酵素を分泌する。
S.スイス(S. suis)の細胞外酵素のタンパク質分解活性を、S.スイス(S. suis)の株10の濃縮された上清および同系遺伝子型のIgMプロテアーゼ突然変異体10ΔideSsuisと、推定上の基質としての2%ブタ血漿とをインキュベートすることにより分析した。3時間のインキュベーションの後、反応混合物を還元SDS-PAGEにより分析した。興味深いことに、野生株10および同系遺伝子型のIgMプロテアーゼ突然変異体10ΔIdeSsuisの両方の細菌培養上清から得られた血漿タンパク質のバンドのパターンは、ブタ血漿対照にはなかった約32kDaの追加のタンパク質バンドを含有した(図1A)。32kDaバンドを切り出して、MALDI-TOF質量分析法にかけ、S.スイス(S. suis)におけるIgGタンパク質分解活性の存在を示すIgG分解産物と同定した。この発見を確認して、タンパク質分解活性はS.スイス(S. suis)の分泌された酵素に基づくことを立証するために、細菌培養物の成長上清を、硫酸アンモニウムの量を増大させて(0から80%の飽和まで)添加することにより分画した。分画は、ブタ血漿を用いてIgG切断活性について試験して、IgGの分解フラグメントを、特異的ポリクローナル抗ブタIgG抗体を使用してウェスタンブロットにより検出した。20から60%硫酸アンモニウムで飽和した沈殿は、IgG切断活性を明確に示して、観察されたIgGタンパク質分解活性は、最近記載されたIgMプロテアーゼIdeSsuis(Seele、前出)と別物であり、S.スイス(S. suis)の培養上清中の分泌されたタンパク質に基づくことを示した(図1B)。
精製の試行に先立って、硫酸アンモニウムによるプロテアーゼが富化された沈殿を、クラス特異的プロテアーゼ阻害剤の存在下でIgG切断活性について試験して、推定上のIgGプロテアーゼを予備的に分類した。メタロプロテアーゼ阻害剤EDTAはIgG切断に影響しなかったが、それに対してセリンプロテアーゼ阻害剤AEBSFはIgG切断に中程度に干渉した。しかしながら、システインプロテアーゼ阻害剤E-64、Z-LVG-CHN2およびヨードアセトアミドは、全てIgG分解活性を阻害するように思われた(図8)。したがって、活性部位のシステイン残基は、AEBSF(24、25)により阻害され得るので、阻害剤全体のプロファイルは、IgG切断プロテアーゼはシステインプロテアーゼのクラスに属するという仮定と最も一致する。精製するために、株10の同系遺伝子型の突然変異体である株S.スイス(S. suis)10M7を、培養上清中の高度に豊富なムラミニダーゼ放出タンパク質(MRP)による低発現タンパク質の遮蔽を回避するために、使用した。細菌培養上清を、硫酸アンモニウム沈殿により分画して、沈殿をアニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)にかけた。IgG切断活性を示す試料を、還元SDS-PAGEにより分離した。タンパク質のバンドをMALDI-TOF質量分析法およびpBLASTアルゴリズムを使用するNCBIデータベースに対する類似性検索により同定した。IgGタンパク質分解酵素の最初の特徴付けが、該プロテアーゼが最も分泌されるシステインプロテアーゼらしいことを示したので、同定されたタンパク質の配列を、i)該タンパク質のコア内におけるシステイン残基の存在、およびii)分泌シグナルペプチドの存在についてスクリーニングした。IgMに特異的であることが以前に示されたIdeSsuisの他に、2つの(10のうちの)同定されたタンパク質が推定上の触媒的システイン残基を含有したが、唯1つだけがSignalPアルゴリズムにより予測されたシグナルペプチド配列およびコアシステイン残基の両方を含有した。このタンパク質は、S.スイス(S. suis)の血清型2株のゲノムの配列データベースにおける推定上のエクスポートされたタンパク質と注釈を付けられ(www.sanger.ac.uk)、株P1/7中のSSU_RS08150と命名される。SSU_RS08150は、該タンパク質内のアミノ酸188から265内のN末端半分に位置する推定上のトランスグルタミナーゼのコア配列モチーフを有する1121アミノ酸のタンパク質(GenBankアクセッション番号WP_012027720)をコードする。膜タンパク質形態のTOPCONSconsensus予測は、アミノ酸1059~1080の間付近のC末端で推定上の膜貫通ヘリックスを同定した。予測されたサイズの118kDa(シグナル配列なし)は、SDS-PAGEの後の最初に精製されたタンパク質のバンドの推定されたサイズより若干小さく(データ掲載せず)、それはSDS-PAGE上における低pI(pI 4.66)のタンパク質の僅かに遅い移動に基づく。全長の推定上のタンパク質配列を、NCBIデータベースに対するpBLASTアルゴリズムを使用する類似性検索で使用した。この検索により、全長タンパク質は、MEROPSペプチダーゼデータベース(Rawlings et al. 2014. Nucleic Acids Res. 42, 503-509)のいかなる知られたプロテアーゼに対しても類似性がなく;いかなる真核生物のタンパク質に対しても類似性がないが、トランスグルタミナーゼコアモチーフを含有する該プロテアーゼのN端部の半分は、ストレプトコッカス・ポルシナス(Streptococcus porcinus)およびストレプトコッカス・シュードポルシナス(Streptococcus pseudoporcinus)の仮定上のタンパク質に対する若干の類似性(480~492アミノ酸残基の領域において54%の同一性)およびストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)の仮定上のタンパク質に対する若干の類似性(264から406アミノ酸残基の領域における40%までの同一性)があることが明らかになった。プロテアーゼのN末端部分は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)およびストレプトコッカス・メリオニス(Streptococcus merionis)(約32%同一性)の仮定上のタンパク質に対しても若干の類似性を示す。該推定上のタンパク質は、幾つかのデータベースでリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼGおよびEとして表示されているが、実験的に確認された機能の不在に基づいて、およびブタIgGに対する酵素活性に基づいて、該タンパク質は、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)の免疫グロブリンGを分解する酵素に対するIgdEと表示した。
S.スイス(S. suis)IgdEの配列は、阻害剤プロファイルに基づいて、触媒部位のシステインを表すと仮定される位置302における単一のシステイン残基の存在を明らかにする。知られたトランスグルタミナーゼドメイン構造をテンプレートとして使用した、S.スイス(S. suis)IgdEのインシリコの3Dモデル化(http://swissmodel.expasy.org)は、システイン302、ヒスチジン333およびアスパラギン酸348からなる潜在的な触媒的三連構造を含有するタンパク質のN末端部分における推定上の活性部位の裂溝を示した。
ブタIgGの分解産物を、還元および非還元SDS-PAGEで分析した。非還元条件下で観察されたバンドのパターンは、相互に接続するジスルフィド結合のちょうどN末端で、重鎖のヒンジ領域に位置する切断部位と一致する(図4A)。還元条件下で得られたIgG分解産物(図4B)をN末端のエドマン配列決定にかけて、得られた配列C*PICPACEは、ブタIgG2ab、IgG4ab、およびIgG6abサブタイプのヒンジ領域配列で見出された。共通のモチーフとしてCPICPGCEを有する同様な配列が、IgG1abおよびIgG5abサブタイプのヒンジ領域に存在するが、それに対してIgG3はヒンジ領域中にCPxxxxC配列を示した(表3)。
株10および株10ΔideSsuisは、後者はIgM切断活性を欠くが、S.スイス(S. suis)igdEのインフレーム欠失突然変異体を生じさせるために使用された。野生株10からの成長上清におけるIgGおよびIgM切断活性を、特異的ポリクローナル抗ブタIgGまたはIgM抗体を使用して、ウェスタンブロットにより決定した(図7)。予想されたように、野生株10は、IgGおよびIgM切断活性を示したが(図7Aおよび図7B、レーン3)、それに対して、同系遺伝子型の突然変異体株10ΔigdEの上清のみが、IgM切断活性を含有して、IgGまたはIgMのいずれの分解も二重突然変異体株10ΔideSsuisΔigdEの上清で検出可能でなかった(図7Aおよび図7B、レーン5)。したがって、S.スイス(S. suis)IgdEは、ブタIgGを切断するために必要かつ十分であり、他のIgG切断活性はこれらの実験条件下では放出されないと思われる。
離乳期のコブタは、初期には、初乳に由来する母の抗体により細菌感染から保護される。母の抗体のレベルは経時的に減少して、活性IgGに媒介される免疫が2週間後の初めに出現する。したがって、初乳由来のコブタの血清中のIgG抗体(SCDP)のレベルは、ELISA測定におけるバックグラウンド値を超えない。ELISAを、rIgdEを抗原として用いて実施し、コブタからの異なる血清試料を、このIgGプロテアーゼに向けられた抗体の存在について研究した。S.スイス(S. suis)の株10を用いる実験感染後20日に採取された血清試料は、rIgdEに対して非常に高い力価を含有した(100 ELISAユニットと定義した;材料および方法を参照されたい)。陰性対照として使用されたSCDPと対照的に、S.スイス(S. suis)IgdEに対する特異的抗体の有意の量が、9匹の5~6週齢の従来の離乳期コブタのうち7匹で検出可能であった(36から92の範囲のELISAユニット)。これらの結果は、S.スイス(S. suis)IgdEが、S.スイス(S. suis)によりインビボで発現された免疫原性抗原であることを示した。
他の連鎖球菌種からのIgdEの同定
全ての入手可能な連鎖球菌のゲノムのコード配列を、NCBI[ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Bacteria/on Aug-21-2015]およびPATRIC[ftp://ftp.patricbrc.org/patric2/on Aug-25-2015]からダウンロードした。
S.ポルシナス(S. porcinus)から単離されたIgdEの性質
・組換えIgdEporcinusは、精製されたポリクローナルブタIgGを切断して、還元SDS-PAGEにより検出される32kDaの分解産物を生じた。
・組換えIgdEporcinusをウシ、ウマ、ヒト、ヤギまたはマウスからの精製ポリクローナルIgGとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった。
・組換えIgdEporcinusはブタ血清中のIgGを切断したが、抗IgG、IgMおよびIgAウェスタンブロット分析によりIgMまたはIgAは検出されなかった。
・ブタIgGの32kDa分解産物のN末端配列は、CPICPACEであることがN末端のエドマン配列決定により示されて、このタンパク質が、ブタIgG内のS.スイス(S. suis)からのIgdEと同じ切断部位を有することが示された。
・組換えIgdEporcinusは、容易に過剰発現されて高純度に精製された。
・全ての試験したS.ポルシナス(S. porcinus)の株は、それらの成長培養上清で、組換えタンパク質と同じブタIgG切断表現型を示した。
S.アガラクチアエ(S. agalactiae)から単離されたIgdEの性質
・組換えIgdEagalactiaeは、精製ポリクローナルヒトIgGを切断して、還元SDS-PAGEにより検出される32kDaの分解産物を生じさせた(図10)。
・組換えIgdEagalactiaeは、精製モノクローナルヒトIgG1カッパおよびIgG1ラムダを切断して、還元SDS-PAGEにより検出される32kDaの分解産物を生じさせた(図10D)。
・組換えIgdEagalactiaeをモノクローナルヒトIgG2、IgG3またはIgG4とインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった(図10D)。
・組換えIgdEagalactiaeをウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびマウスからの精製ポリクローナルIgGとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった(図10A)。
・組換えIgdEagalactiaeは、ヒト血清中のIgGを切断したが、IgMまたはIgAは、抗IgG、IgMおよびIgAウェスタンブロット分析により検出されなかった。
・組換えIgdEagalactiaeは、ヒト血清IgG1を完全に分解して単一の切断されたIgG1にする(図11)。
・ヒトIgGの32kDaの分解産物のN末端配列は、H(またはGまたはS)TCPPCPAPEであることがN末端のエドマン配列決定により示されて、このタンパク質はIgG1でヒンジ領域にパパインと同じ切断部位を有することを示し、システイン残基のN末端が重鎖間のH-H共有結合に関与すると考えられる。
・組換えIgdEagalactiaeは容易に過剰発現されて精製される。
S.エクイ(S. equi)から単離されたIgdEの性質
・組換えIgdEequiを発現する大腸菌(E. coli)の溶解物は、精製ポリクローナルウマIgGを切断して、還元SDS-PAGEにより検出された、32kDaの分解産物を生じさせる。
・組換えIgdEequiをウシ、ヒト、ブタ、ヤギ、ラット、ウサギおよびマウスからの精製ポリクローナルIgGとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった。
・組換えIgdEequiはウマ血清中のIgGを切断したが、IgMまたはIgAは、抗IgG、IgMおよびIgAウェスタンブロット分析により検出されなかった。
・組換えIgdEequiは、精製モノクローナル組換えウマIgG7を切断して、32kDaの分解産物を生じさせ、還元SDS-PAGEにより検出された(図12)。
・組換えIgdEequiを、組換えモノクローナルウマIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5またはIgG6とインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった。
・ウマIgGの32kDaの分解産物のN末端のエドマン配列決定により示されたN末端配列は、(G)PTCPECXGVである。この配列はウマIgG7のヒンジ領域に見出される。
S.シュードポルシナス(S. pseudoporcinus)から単離されたIgdEの性質
・S.シュードポルシナス(S. pseudoporcinus)の培養上清は、ブタIgGの切断表現型を有したが、ヒトIgGの切断表現型は有しなかった。
・組換えIgdEpseudoporcinusは、精製ポリクローナルヒトおよびブタIgGを切断して、還元SDS-PAGEにより検出されるように、32kDaの分解産物を生じさせた。
・組換えIgdEpseudoporcinusを、ウシ、ウマ、ヤギ、マウス、またはラットからの精製ポリクローナルIgGとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった。
・組換えIgdEpseudoporcinusは、ヒトおよびブタ血清中のIgGを切断したが、ブタ血清中のIgMまたはIgAは切断しないことが、抗IgG、IgMおよびIgAウェスタンブロット分析によりわかった。
・ブタIgGの32kDaの分解産物のN末端配列は、N末端のエドマン配列決定により示されるようにCPICPACEであり、このタンパク質は、ブタIgG内のIgdEと同じ切断部位を有することが示される。
・組換えIgdEpseudoporcinusは、大腸菌(E. coli)BL21pLysSで容易に過剰発現された。
1. 対象において免疫応答を生じさせることに使用するためのポリペプチドであって:
(a)配列番号1のアミノ酸配列;
(b)配列番号1のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号1の変異体;
(c)対象において、連鎖球菌、好ましくはS.スイス(S. suis)に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号1のフラグメント、配列番号1の変異体、または配列番号1の変異体のフラグメント;
(d)配列番号3のアミノ酸配列;
(e)配列番号3のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3の変異体;
(f)対象において、連鎖球菌、好ましくはS.アガラクチアエ(S. agalactiae)に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号3のフラグメント、配列番号3の変異体、または配列番号3の変異体のフラグメント;
(g)配列番号5のアミノ酸配列;
(h)配列番号5のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号5の変異体;
(i)対象において、連鎖球菌、好ましくはS.ポルシナス(S. porcinus)に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号5のフラグメント、配列番号5の変異体、または配列番号5の変異体のフラグメント;
(j)配列番号7のアミノ酸配列;
(k)配列番号7のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号7の変異体;
(l)対象において、連鎖球菌、好ましくはS.エクイ(S. equi)に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号7のフラグメント、配列番号7の変異体、または配列番号7の変異体のフラグメント;
(m)配列番号9のアミノ酸配列;
(n)配列番号9のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号9の変異体;
(o)対象において、連鎖球菌、好ましくはS.シュードポルシナス(S. pseudoporcinus)に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号9のフラグメント、配列番号9の変異体、または配列番号9の変異体のフラグメント;
を含むポリペプチド。
(a)配列番号2もしくはそれに相補的な配列;
(b)(a)で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列;
(c)(a)もしくは(b)で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列;
(d)(a)もしくは(b)で定義された配列との少なくとも70%の同一性を有する配列;
(e)配列(a)、(b)、(c)もしくは(d)のいずれかのフラグメントであり、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ/もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはS.スイス(S. suis)に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント。
(f)配列番号4もしくはそれに相補的な配列;
(g)(f)で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列;
(h)(f)もしくは(g)で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列;
(i)(f)もしくは(g)で定義された配列との少なくとも70%の同一性を有する配列;
(j)配列(f)、(g)、(h)もしくは(i)のいずれかのフラグメントであり、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ/もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはS.アガラクチアエ(S. agalactiae)に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント;
(k)配列番号6もしくはそれに相補的な配列;
(l)(k)で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列;
(m)(k)もしくは(l)で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列;
(n)(k)もしくは(l)で定義された配列との少なくとも70%の同一性を有する配列;
(o)配列(k)、(l)、(m)もしくは(n)のいずれかのフラグメントであり、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ/もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはS.ポルシナス(S. porcinus)に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント;
(p)配列番号8もしくはそれに相補的な配列;
(q)(a)で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列;
(r)(p)もしくは(q)で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列;
(s)(p)もしくは(q)で定義された配列との少なくとも70%の同一性を有する配列;
(t)配列(p)、(q)、(r)もしくは(s)のいずれかのフラグメントであり、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ/もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはS.エクイ(S. equi)に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント;
(u)配列番号10もしくはそれに相補的な配列;
(v)(u)で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列;
(w)(u)もしくは(v)で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列;
(x)(u)もしくは(v)で定義された配列との少なくとも70%の同一性を有する配列;または
(y)配列(u)、(v)、(w)もしくは(x)のいずれかのフラグメントであり、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ/もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはS.シュードポルシナス(S. pseudoporcinus)に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント
を含むポリヌクレオチド。
(a)配列番号1のアミノ酸配列;
(b)配列番号1のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号1の変異体;
(c)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号1のフラグメントもしくは配列番号1の変異体のフラグメント。
(d)配列番号3のアミノ酸配列;
(e)配列番号3のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3の変異体;
(f)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3のフラグメントもしくは配列番号3の変異体のフラグメント;
(g)配列番号5のアミノ酸配列;
(h)配列番号5のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号5の変異体;
(i)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号5のフラグメントもしくは配列番号5の変異体のフラグメント;
(j)配列番号7のアミノ酸配列;
(k)配列番号7のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号7の変異体;または
(l)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号7のフラグメントもしくは配列番号7の変異体のフラグメント;または
(m)配列番号9のアミノ酸配列;
(n)配列番号9のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号9の変異体;
(o)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号9のフラグメントもしくは配列番号9の変異体のフラグメント;
(p)配列番号11のアミノ酸配列;
(q)配列番号11のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号11の変異体;または
(r)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号11のフラグメントもしくは配列番号11の変異体のフラグメント
を含むポリペプチド。
(a)配列番号1のアミノ酸配列;
(b)配列番号1のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号1の変異体;
(c)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号1のフラグメントもしくは配列番号1の変異体のフラグメント;
(d)配列番号3のアミノ酸配列;
(e)配列番号3のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3の変異体;
(f)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号3のフラグメントもしくは配列番号3の変異体のフラグメント;
(g)配列番号5のアミノ酸配列;
(h)配列番号5のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号5の変異体;
(i)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号5のフラグメントもしくは配列番号5の変異体のフラグメント;
(j)配列番号7のアミノ酸配列;
(k)配列番号7のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号7の変異体;
(l)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号7のフラグメントもしくは配列番号7の変異体のフラグメント;
(m)配列番号9のアミノ酸配列;
(n)配列番号9のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号9の変異体;
(o)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号9のフラグメントもしくは配列番号9の変異体のフラグメント;
(p)配列番号11のアミノ酸配列1;
(q)配列番号11のアミノ酸配列との少なくとも70%の同一性を有し、IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号11の変異体;または
(r)IgGを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号11のフラグメントもしくは配列番号11の変異体のフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む、IgGを切断するためのインビトロの方法。
a)IgdEポリペプチドおよびIgGを候補物質と、該物質の不在下でIgGシステイン活性を可能にする条件下で接触させるステップ、
b)該候補物質の存在下で消化されたIgGの量を、前記物質の不在下における場合と比較して決定するステップ、
c)b)で得られた結果に基づいて、該物質がIgdEポリペプチドのIgGシステイン活性を活性化するかまたは阻害するかを決定するステップ
を含む方法。
Claims (8)
- ヒトIgG1の切断のためのインビトロの方法であって、ヒトIgG1を:
(a)配列番号3のアミノ酸配列;または
(b)配列番号3のアミノ酸配列との少なくとも90%の同一性を有し(但し、配列番号3のアミノ酸配列における位置262、293および308のアミノ酸残基は保持されている。)、ヒトIgG1に対するIgGシステインプロテアーゼ活性を有するそれらの変異体
を含むポリペプチドと接触させることを含む方法。 - 前記アミノ酸配列が配列番号3である、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリペプチドを、ヒトIgG1を含有する試料と、特異的システインプロテアーゼ活性が生ずることを可能にする条件下でインキュベートすることを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記切断産物の同定および/または単離をさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記同定および/または単離が、ゲル電気泳動または質量分析法による分析を含む、請求項4に記載の方法。
- FcおよびFabフラグメントを生じさせるために使用される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトIgG1を検出するために使用される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- (i)試料を、請求項1に記載のポリペプチドと、前記ポリペプチドのヒトIgG1特異的システインプロテアーゼ活性を可能にする条件下で接触させること;および
(ii)ヒトIgG1特異的切断フラグメントの存在についてモニターすること
を含み、前記特異的切断フラグメントの存在が試料中のヒトIgG1を示す、請求項7に記載の方法。
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C11 | Written invitation by the commissioner to file amendments |
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A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
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C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
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