KR20180124857A - 신규한 스트렙토코커스 프로테아제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 나타내는 IgdE로 명명된 신규한 스트렙토코커스 프로테아제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 추가적으로 상술한 스트렙토코커스 프로테아제를 사용, Fc 및 Fab 단편을 생성하는 방법을 사용, 및 IgG를 검출하는 방법을 사용하여 IgG를 절단하는 시험관 내 (in vitro) 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 스트렙토코커스 프로테아제
본 발명은 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 나타내는 신규한 스트렙토코커스 프로테아제(Streptococcal proteases)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 스트렙토코커스 감염에 대한 치료 및 예방 접종, 자가 면역 질환과 같은 병원성 IgG 항체에 의해 매개되는 증상의 치료, 및 생명 공학을 위한 새로운 도구의 개발에 관한 것이다.
병원성 박테리아는 그들의 숙주를 식민지화 및 침략하기 위한 다양한 전략을 발전시켰으며, 성장을 촉진하고 숙주 면역 반응으로부터 회피를 매개하기 위해 다양한 독성 인자를 사용한다. 멸종 위험을 피하기 위해 병원성 박테리아는 선천성(innate) 면역 반응뿐만 아니라, 가장 중요하게는 특정 면역글로불린 모두에 대응해야 한다. 특정 Ig는 보체(complement) 기반 및/또는 식세포(phagocyte) 기반 면역 반응을 개시함으로써 후천성(adaptive) 면역계의 중심이다. Ig는 Fc 효과기 부분과 가요성 힌지(flexible hinge) 영역을 통해 연결된 가변 항원-인식 Fab 영역으로 구성된다. Fc 영역은 식세포 세포상의 특정 수용체와의 접촉을 매개하거나 C1q와 결합함으로써 보체의 전형적인 경로를 유발한다. 따라서, 힌지 영역은 다양한 미생물 프로테아제의 표적이며, 예를 들면 S. 피오게네스(S. pyogenes)로부터의 IdeS (Ponel-Rammingen et al 2002, EMBO J. 21, 1607-161), 포르피모나스 기니발리스(Porphymonas ginivalis)로부터의 Gingipain K (Vincents et al. FASEB J. 10, 3741-3750) 및 스트렙토코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 SspA (Prokesov et al., 1992. Immunol. Lett., 31, 259-265)를 포함한다.
스트렙토코커스 감염은 돼지, 말, 소와 같은 가축뿐만 아니라 인간에게도 흔하다. 스트렙토코커스 감염은 비교적 가벼운 질환에서 생명을 위협하는 심각한 상태까지 다양하다. 스트렙토코커스 감염의 예방, 방지 및 치료를 위한 인간 및 수의학 백신에 사용할 수 있는 스트렙토코커스 항원의 공급이 매우 필요하다.
엄격한 서열 특이성을 가진 프로테아제는 생명 공학 도구로서 유용하다. 면역 글로불린을 분해하는 프로테아제는 의학적 용도, 예컨대, IgG를 특이적으로 분해하는 프로테아제는 IgG 항체가 매개하는 질환 또는 증상의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명자들은 스트렙토코커스(streptoccoci)로부터 신규한 계열의 IgG 분해 효소를 동정, 정제 및 특성을 규명하였다. 면역글로불린 G-분해 효소(Immunoglobulin G-degrading Enzyme)에 대해 IgdE로 명명된 이 계열의 효소들은 이전에 특성화된 IdeS 계열의 스트렙토코커스 면역글로불린 분해 프로테아제와는 상이한 시스테인 프로테아제이며 고도의 특이성을 지닌 IgG의 힌지 영역의 효율적인 절단을 매개한다.
이 효소는 S. 수이스(S. suis) 균주에서 확인되었으며 IgdEsuis로 명명되었고; S. 아갈락티애(S. agalactiae) 균주에서 IgdEagalactiae로 명명되었으며; S. 포르시너스(S. porcinus) 균주에서 IgdEporcinus로 명명되었고; S. 에쿠이(S. equi) 균주에서 IgdEequi로 명명되었으며; S. 슈도포르시너스(S. pseudoporcinus) 균주에서 IgdEpseudoporcinus로 명명되었다.
S.suis로부터의 IgdE는 돼지 IgG에 대해 매우 특이적임이 입증되었다. IgM 절단 프로테아제 IdeSsuis와 유사하게, 1121 아미노산의 큰 단백질은 단백질의 N-말단 부분에 단백질 분해 활성 도메인을 가지고 있다. N-말단 470 아미노산으로 구성되고 양말단이 제거된(truncated) S.sis IgdE 단백질은 IgG 절단 활성을 보유하기 때문에, 전체 크기의 단백질은 시험 관내에서 IgG 절단에 필수적이지는 않다.
S.suis IgdE에 의한 돼지 IgG의 절단은 두 개의 IgG 중쇄 사이에 공유 결합 인 디설파이드 결합을 형성할 가능성이 있는 힌지 영역 시스테인 잔기의 N 말단에서만 일어났다. 따라서, IgG 절단은 64 kDa Fc 단편 및 2 개의 Fab 단편의 형성을 초래한다. 이 절단 패턴은 하부 힌지 영역에서 IgG를 가수 분해하여 하나의 F(ab ')2 단편과 2 개의 동일한 1/2Fc 단편을 생성하는 S. pyogenes의 IgG 엔도펩티다아제 IdeS와는 상이하고(von Pawel-Rammingen ibid) 유리(free) ½Fc 단편을 생성하는 사슬 내 디설파이드 결합으로부터 IgM C-말단을 절단하는 Ide Ssuis 와도 상이하다 (Seele et al., 2015. J. Vet. Res. 46, 45).
S. suis는 예를 들어, 인간 및 돼지에서 수막염을 일으킬 수 있다. S. agalactiae는 예를 들어, 인간 및 소에서 수막염과 패혈증을 일으킬 수 있다. S. porcinus는 예를 들어, 돼지에서 호흡기 감염, 돼지 선역(porcine strangles)을 일으킬 수 있다. S. equi는 예를 들어, 말에서 호흡기 감염, 선역을 일으킬 수 있다.
IgdE 계열의 프로테아제는 스트렙토코커스 감염에 대한 면역화를 위한 백신과 같은 스트렙토코커스 감염의 예방 및 치료에 사용된다. IgdE 항체는 추가적으로 스트렙토코커스 감염과 관련된 증상의 수동 면역화 및 치료에 사용된다. 또한, IgdE 프로테아제는 신규한 생명 공학 도구를 개발하는 데 유용하고, 자가 면역 질환, 이식 거부, 수술 후 치료 및 후천성 혈우병과 같은 IgG 항체가 매개하는 질환 또는 증상을 치료 또는 예방하는 데 유용하다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 대상에서 면역 반응을 생성시키는데 사용하기 위한 분리된 IgdE 폴리펩타이드를 제공한다
분리된 IgdE 폴리펩타이드는 시스테인 프로테아제 활성을 보유하고/하거나 대상에서 스트렙토코커스에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 IgdEsuis, IgdEagalactiae, IgdEporcinus, IgdEequi 또는 IgdEpseudoporcinus 폴리펩타이드 또는 이의 임의의 변이체 또는 단편이다. 변이체는 다른 박테리아로부터의 IgdE 폴리펩타이드일 수 있다. 박테리아는 바람직하게는 스트렙토코커스이다.
제1 양태의 일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하며 대상에서 면역 반응을 생성시키는데 사용하기 위한 IgdE 폴리펩타이드를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열;
(b) 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 1의 변이체;
(c) 스트렙토코커스, 바람직하게는 S. suis에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열번호 1의 단편, 서열번호 1의 변이체, 또는 서열번호 1의 변이체의 단편;
(d) 서열번호 3의 아미노산 서열;
(e) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 변이체;
(f) 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　agalactiae에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열번호 3의 단편, 서열번호 3의 변이체, 또는 서열번호 3의 변이체의 단편;
(g) 서열번호 5의 아미노산 서열;
(h) 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 5의 변이체;
(i) 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　porcinus에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열번호 5의 단편, 서열번호 5의 변이체, 또는 서열번호 5의 변이체의 단편;
(j) 서열번호 7의 아미노산 서열;
(k) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 7의 변이체;
(l) 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　equi에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열번호 7의 단편, 서열번호 7의 변이체, 또는 서열번호 7의 변이체의 단편;
(m) 서열번호 9의 아미노산 서열;
(n) 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 9의 변이체;
(o) 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　pseudoporcinus에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열번호 9의 단편, 서열번호 9의 변이체, 또는 서열번호 9의 변이체의 단편.
바람직하게는 상기 면역 반응은 방어(protective) 면역 반응이다.
바람직하게는 상기 면역 반응은 면역화된 대상에서 감염성 스트렙토코커스 의 IgdE의 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 중화시킬 수 있는 항체를 생성한다.
제1 양태의 또 다른 구현예에서, 본 발명은 IgdE 폴리펩타이드를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 면역 반응을 생성시키는 방법을 제공한다.
제2 양태에서, 본 발명은 대상에서 면역 반응을 생성시키는 데 사용하기 위한, IgdE 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
IgdE 폴리펩타이드는 바람직하게는 시스테인 프로테아제 활성을 보유하고/하거나 대상에서 스트렙토코커스에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 IgdEsuis, IgdEagalactiae, IgdEporcinus, IgdEequi 또는 IgdEpseudoporcinus 폴리펩타이드 또는 이의 임의의 변이체 또는 단편이다. 변이체는 다른 박테리아로부터의 IgdE 폴리펩타이드일 수 있다. 박테리아는 바람직하게는 스트렙토코커스이다.
제2 양태의 일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하며 대상에서 면역 반응을 생성시키는 데 사용하기 위한, IgdE 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다:
(a) 상기 정의된 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 단편을 코딩하는 서열;
(b) 상기 정의된 서열번호 3의 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 단편을 코딩하는 서열;
(c) 상기 정의된 서열번호 5의 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 단편을 코딩하는 서열;
(d) 상기 정의된 서열번호 7의 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 단편을 코딩하는 서열; 또는
(e) 상기 정의된 서열번호 9의 폴리펩타이드 또는 이의 변이체 또는 단편을 코딩하는 서열.
제2 양태의 다른 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하며 대상에서 면역 반응을 생성시키는데 사용하기 위한 IgdE 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다:
(a) 서열번호 2 또는 이의 상보적인 서열;
(b) (a)에 정의된 서열에 대한 유전 암호의 결과로서 디제너레이트(degenerate)된 서열;
(c) 엄격한 조건 하에서 (a) 또는 (b)에 정의된 서열과 혼성화하는 서열;
(d) (a) 또는 (b)에 정의된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열;
(e) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하고/하거나 스트렙토코커스, 바람직하게는 S. suis에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열 (a), (b), (c) 또는 (d) 중 어느 하나의 단편;
(f) 서열번호 4 또는 이의 상보적인 서열;
(g) (f)에 정의된 서열에 대한 유전 암호의 결과로서 디제너레이트(degenerate)된 서열;
(h) 엄격한 조건 하에서 (f) 또는 (g)에 정의된 서열과 혼성화하는 서열;
(i) (f) 또는 (g)에 정의된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열;
(j) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하고/하거나 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　agalactiae에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열 (f), (g), (h) 또는 (i)의 중 어느 하나의 단편;
(k) 서열번호 6 또는 이의 상보적인 서열;
(l) (k)에 정의된 서열에 대한 유전 암호의 결과로서 디제너레이트(degenerate)된 서열;
(m) 엄격한 조건 하에서 (k) 또는 (l)에 정의된 서열과 혼성화하는 서열;
(n) (k) 또는 (l)에 정의된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열;
(o) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하고/하거나 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　porcinus에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열 (k), (l), (m) 또는 (n) 중 어느 하나의 단편;
(p) 서열번호 8 또는 이의 상보적인 서열;
(q) (p)에 정의된 서열에 대한 유전 암호의 결과로서 디제너레이트(degenerate)된 서열;
(r) 엄격한 조건 하에서 (p) 또는 (q)에 정의된 서열과 혼성화하는 서열;
(s) (p) 또는 (q)에 정의된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열;
(t) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하고/하거나 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　equi에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열 (p), (q), (r) 또는 (s) 중 어느 하나의 단편;
(u) 서열번호 10 또는 이의 상보적인 서열;
(v) (u)에 정의된 서열에 대한 유전 암호의 결과로서 디제너레이트(degenerate)된 서열;
(w) 엄격한 조건 하에서 (u) 또는 (v)에 정의된 서열과 혼성화하는 서열;
(x) (u) 또는 (v)에 정의된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열; 또는
(y) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하고/하거나 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　pseudoporcinus에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열 (u), (v), (w) 또는 (x) 중 어느 하나의 단편.
바람직하게는 상기 면역 반응은 방어(protective) 면역 반응이다.
바람직하게는 상기 면역 반응은 면역화된 대상에서 감염성 스트렙토코커스 의 IgdE의 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 중화시킬 수 있는 항체를 생성한다.
제2 양태의 또 다른 구현예에서, 본 발명은 IgdE 폴리펩타이드를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 면역 반응을 생성시키는 방법을 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명은 IgG 항체에 의해 매개되는 질환 또는 증상의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 분리된 IgdE 폴리펩타이드를 제공한다.
IgdE 폴리펩타이드는 바람직하게는 시스테인 프로테아제 활성을 보유하는 IgdEsuis, IgdEagalactiae, IgdEporcinus, IgdEequi 또는 IgdEpseudoporcinus 폴리펩타이드 또는 이의 임의의 변이체 또는 단편이다. 변이체는 다른 박테리아로부터의 IgdE 폴리펩타이드일 수 있다. 박테리아는 바람직하게는 스트렙토코커스이다.
제3 양태의 일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하며 IgG 항체에 의해 매개되는 질환 또는 증상의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 폴리펩타이드를 제공한다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열;
(b) 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 1의 변이체;
(c) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 1의 단편 또는 서열번호 1의 변이체의 단편;
(d) 서열번호 3의 아미노산 서열;
(e) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 변이체;
(f) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 단편 또는 서열번호 3의 변이체의 단편;
(g) 서열번호 5의 아미노산 서열;
(h) 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 5의 변이체;
(i) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 5의 단편 또는 서열번호 5의 변이체의 단편;
(j) 서열번호 7의 아미노산 서열;
(k) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 7의 변이체; 또는
(l) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 7의 단편 또는 서열번호 7의 변이체의 단편; 또는
(m) 서열번호 9의 아미노산 서열;
(n) 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 9의 변이체;
(o) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 9의 단편 또는 서열번호 9의 변이체의 단편;
(p) 서열번호 11의 아미노산 서열;
(q) 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 11의 변이체;
(r) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 11의 단편 또는 서열번호 11의 변이체의 단편.
바람직하게는 IgdE 폴리펩타이드는 다음을 포함하는 IgdEagalactiae 폴리펩타이드일 수 있다:
(d) 서열번호 3의 아미노산 서열;
(e) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 변이체;
(f) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 단편 또는 서열번호 3의 변이체의 단편;
제3 양태의 다른 구현예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 IgdE 폴리펩타이드를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, IgG 항체에 의해 매개되는 질환 또는 증상의 치료, 예방 또는 방지 방법을 제공한다.
IgG 항체에 의해 매개되는 질환 또는 증상은 자가 면역 질환, 이식 거부, 수술 후 치료 및 후천성 혈우병일 수 있다.
제4 양태에서, 본 발명은 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 IgdE 폴리펩타이드와 IgG를 접촉시키는 단계를 포함하는, IgG의 절단을 위한 시험관 내(in vitro) 방법을 제공한다.
IgdE 폴리펩타이드는 바람직하게는 시스테인 프로테아제 활성을 보유하는 IgdEsuis, IgdEagalactiae, IgdEporcinus, IgdEequi 또는 IgdEpseudoporcinus 폴리펩타이드 또는 이의 임의의 변이체 또는 단편이다. 변이체는 다른 박테리아로부터의 IgdE 폴리펩타이드일 수 있다. 박테리아는 바람직하게는 스트렙토코커스이다.
제4 양태의 일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 폴리펩타이드와 IgG를 접촉시키는 단계를 포함하는, IgG의 절단을 위한 시험관 내(in vitro) 방법을 제공한다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열;
(b) 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 1의 변이체;
(c) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 1의 단편 또는 서열번호 1의 변이체의 단편;
(d) 서열번호 3의 아미노산 서열;
(e) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 변이체;
(f) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 단편 또는 서열번호 3의 변이체의 단편;
(g) 서열번호 5의 아미노산 서열;
(h) 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 5의 변이체;
(i) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 5의 단편 또는 서열번호 5의 변이체의 단편;
(j) 서열번호 7의 아미노산 서열;
(k) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 7의 변이체;
(l) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 7의 단편 또는 서열번호 7의 변이체의 단편;
(m) 서열번호 9의 아미노산 서열;
(n) 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 9의 변이체;
(o) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 9의 단편 또는 서열번호 9의 변이체의 단편;
(p) 서열번호 11의 아미노산 서열;
(q) 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 11의 변이체;
(r) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 11의 단편 또는 서열번호 11의 변이체의 단편.
바람직하게는 IgdE 폴리펩타이드는 다음을 포함하는 IgdEagalac 폴리펩타이드일 수 있다:
(d) 서열번호 3의 아미노산 서열;
(e) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 변이체; 또는
(f) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 단편 또는 서열번호 3의 변이체의 단편.
제4 양태의 또 다른 구현예에서, 본 발명은 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 IgdE 폴리펩타이드와 IgG를 접촉시키는 단계를 포함하는, IgG의 Fc 또는 Fab 단편의 생성을 위한 시험관내 방법을 제공한다.
제5 양태에서, 본 발명은 IgdE 폴리펩타이드의 IgG 시스테인 활성을 활성화 또는 저해하는 물질을 동정하는 방법을 제공한며, 상기 방법은 다음을 포함할 수 있다:
a) 물질의 부재하에 IgG 시스테인 활성을 허용하는 조건 하에서 IgdE 폴리펩타이드 및 IgG를 후보 물질과 접촉시키는 단계;
b) 상기 물질의 부재하에서와 비교하여 후보 물질의 존재하에 분해된 IgG의 양을 결정하는 단계,
c) b) 단계에서 얻은 결과를 기반으로 상기 물질이 IgdE 폴리펩타이드의 IgG 시스테인 활성을 활성화 또는 저해하는지 여부를 결정하는 단계.
IgG 분해의 정량 분석은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 방법으로 시험할 수 있는 후보 화합물은 일반적으로 "저분자(small molecules)"로서 공지된 단순 유기 분자, 예를 들어 2000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것들을 포함한다. 또한, 이 방법은 합성 펩타이드 라이브러리 및 펩타이드 파지 라이브러리를 포함하는 펩타이드 라이브러리와 같은 화합물 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 다른 적합한 분자는 IgdE의 IgG 분해 활성을 조절하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 임의의 다른 분자를 포함한다.
도 1. S. suis의 배양 상등액에서의 IgG 분해 활성.
(A) S. suis 균주 10 및 10△ide Ssuis 의 농축(20x) 배양 상등액을 2% 돼지 혈장과 함께 37℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하고, 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 약 32 kDa의 분해 산물(*)이 관찰되었다. (B) 암모늄 설페이트 침전에 의해 분획된 S. suis 균주 10의 배양 상등액의 항-IgG 웨스턴 블롯 분석. 1% 돼지 혈장을 20-40% 및 40-60% 암모늄 설페이트 포화 분획과 함께 37℃에서 16 시간 동안 인큐베이션한 후 IgG 분해 산물(*)을 획득하였다. 단백질 크기 기준을 보여주는 레인 1은 화학발광 신호를 검출하기 전의 막의 사진 이미지이다. (C) 시험한 모든 혈청형의 S. suis 균주의 배양 상등액은 IgG를 절단하였다. 농축 (10x) 배양 상등액을 1% 돼지 혈장과 함께 37℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하고 항-IgG 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 모든 래인에서 약 32 kDa의 다양한 강도의 IgG 절단 산물 (*)이 관찰되었다. 다른 웨스턴 블롯의 이미지를 하나의 도면으로 조립하였다.
도 2. S. suis IgdE의 활성 부위의 동정.
(A) IgdE 및 잠재적 활성 부위 잔기 치환과 C-말단 제거(truncation) 변이체를 갖는 다양한 rIgdE 컨스트럭트들의 개략도. 분비 시그널 펩타이드 (잔기 1-37)는 밝은 회색으로 표시하였고, 트랜스글루타미나제 도메인은 상자로 표시하였으며, 잠재적인 활성 부위 잔기 및 치환을 표시하였다. (B) 3.3 μM 돼지 IgG를 다양한 rIgdE 컨스트럭트들을 발현하는 대장균 세포의 가용성 분획으로 37℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 반응물을 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분석하였다. IgG 절단(*)은 rIgdE, rIgdED348A 및 rIgdE△C와의 배양시 발생했으나, rIgdEC302S 또는 rIgdEH333A와의 배양시에서는 발생하지 않았다. 37 kDa의 약한 단백질 밴드는 용해물 제제에 존재하는 오염 물질이며 IgdE 활성과 관련이 없다.
도 3. 재조합 S. suis IgdE의 시간 경과 및 저해제 프로파일.
절단 (A)의 시간 경과는 절단 산물의 농도 측정 정량에 이어 환원 조건 하에서 쿠마시 플루오르 오렌지 염색 SDS-PAGE 전에 연속적인 샘플링에 의해 모니터링하였다. 1.67 μM 돼지 IgG를 0.2 μM 정제된 rIgdE△C와 함께 배양하였다. 밤새 절단(16 시간)을 100% 상대 절단으로 설정하였다. 억제제 프로파일 (B)의 경우 250 μM 및 2.5 μM의 각 억제제 존재하에 초기 절단을 모니터링하였다. 억제되지 않은 대조군의 초기 절단 활성을 100% 상대 활성으로 설정하였다. DMSO 대조군은 250 μM Z-LVG-CHN2와 상관 관계가 있다. 데이터는 3 회 실험의 평균 ± SEM으로 나타내었다. 억제되지 않은 대조군(*) 또는 DMSO 대조군(¤)과의 차이는 P <0.05(*), <0.01(**) 및 <0.001(*** 또는 ¤¤¤)의 P 값으로 유의성을 설정하여 Dunnett의 Multiple Comparison Test로 분석하였다.
도 4. S. suis IgdE는 힌지 영역에 있는 돼지 IgG의 중쇄를 절단한다.
비-환원성 (A) 및 환원성 (B) 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE로 반응을 분석하였다. 3.3 μM IgG를 37℃에서 16 시간 동안 10 nM 정제된 rIgdE와 함께(+) 또는 없이(-) 배양하였다. (C) 관찰된 절단 패턴 및 절단 부위는 하나의 IgG 중쇄가 IgdE에 의해 먼저 가수분해되어 하나의 유리 Fab 단편 (Fab) 및 단일 절단 IgG (scIgG)가 생성되고, 두 번째 단계로 다른 하나의 중쇄가 가수분해되어 하나의 Fc 단편(Fc) 및 두 개의 Fab 단편이 생성되는 모델을 제시한다.
도 5. IgdE는 돼지 IgG에 매우 특이적이다.
(A) 2% 돼지 혈장을 10 nM 정제된 rIgdE와 함께(+) 또는 없이(-) 배양하였다. 환원 조건 하에서 항-돼지 IgG, IgM 및 IgA 웨스턴 블롯으로 반응을 분석하였다. IgG의 절단만이 관찰되었다(*). (B) 다른 종의 0.5 mg/ml IgG를 10 nM 정제된 rIgdE와 함께(+) 또는 없이(-) 배양하고, 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 돼지(*) 이외의 다른 종에서 유래된 IgG의 절단은 관찰되지 않았다. 37kDa의 약한 단백질 밴드는 용해물 제제에 존재하는 오염 물질이며(레인 2 참조) IgdE 활성과 관련이 없다. 다른 젤의 이미지를 하나의 도면으로 조립하였다.
도 6. 내인성 IgG의 S. suis IgdE 분해
S. suis IgdE는 건강한 돼지 및 각 병변을 갖는 돼지의 모든 체액에서 내인성 IgG를 분해한다. (크기는 화살표로 표시). 다른 분해 산물은 관찰할 수 없었다. 체액을 37℃에서 16 시간 동안 10 nM 정제된 rIgdE와 함께(+) 또는 없이(-) 배양하였다. 환원 조건 하에서 SDS-PAGE (A) 및 항-IgG 웨스턴 블롯 (B)으로 반응을 분석하였다. 단백질 크기 기준을 보여주는 레인은 화학발광 신호를 검출하기 전의 막의 사진 이미지이다. 다른 젤의 이미지를 하나의 도면으로 조립하였다.
도 7. IgdE는 S. suis에 의한 IgG 절단에 필요하며 IgG 절단은 Ide Ssuis 와 무관하다.
S. suis 균주 10, 10△igdE, 10△ide Ssuis 및 10△ide Ssuis △igdE의 농축된 (10x) 상등액을 1% 돼지 혈장과 함께 37℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 환원 조건 하에서 항-IgG 웨스턴 블롯 (A) 또는 항-IgM 웨스턴 블롯 (B)으로 반응을 분석하였다. IgG 분해(*)는 균주 10 및 10△ide Ssuis 의 상등액과 함께 배양한 경우에만 관찰된 반면, 균주 10 및 10△igdE의 상등액과 함께 배양한 경우에는 IgM 분해(*) 만 관찰되었다.
도 8. S. suis의 배양 상등액에서 검출된 IgG 분해 활성의 억제제 프로파일.
S. suis 균주 10의 농축 (10x) 배양 상등액을 계열 특이 프로테아제 억제제 존재하에 돼지 혈장과 함께 배양하였다. 환원 조건 하에서 항-IgG 웨스턴 블롯으로 반응을 분석하였다. 0.1-1 mM AEBSF, 0.1-5 mM EDTA, 50 μM E-64와 함께, 임의의 억제제 및 1/200 희석 완전 억제제 칵테일없이(별표로 표시) 배양하였을 때 IgG의 절단 산물을 관찰할 수 있었던 반면, 5 mM AEBSF, 250 μM E-64와 함께, 농축 상등액(-C), 0.1-5 mM Z-LVG-CHN2, 0.1-5 mM 아이오도아세트아미드 및 1/50 희석 완전 억제제 칵테일없이 배양하였을 때 산물을 관찰할 수 없었다.
도 9. rIgdE △C 정제를 모니터링하는 대표적인 쿠마시 블루 염색 SDS-PAGE 겔.
발현 플라스미드를 갖는 IPTG 유도 대장균의 용해물로부터 rIgdE△C를 정제하였다. His-ZZ-태깅된 rIgdE△C를 함유하는 Ni2+-친화성 크로마토그래피 정제의 용출 물을 Tev-프로테아제와 함께 배양하여 Ni2+-친화성 크로마토그래피 정제의 두 번째 라운드 전에 His-ZZ-태그를 제거하였다. 태깅되지 않은 rIgdE△C를 함유하는 정제 단계의 통과액(flow through) 분획 2 및 3을 모으고, 완충액을 PBS로 교환하고 추가 실험에 사용하였다. rIgdE△C의 부분적 분해로 인해 이러한 분획에서 약 50 kDa의 두 가지 주요 밴드가 관찰될 수 있다.
도 10. rIgdEagalactiae는 인간 IgG1을 특이적으로 절단한다.
(A) rIgdEagalactiae를 6 가지 다른 종의 폴리클로날 IgG와 함께 37℃에서 18 시간 동안 배양하고, 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 분해 산물은 별표(*)로 표시된다. 다른 젤의 이미지들을 이용하여 도면을 만들었다. (B) rIgdEagalactiae를 인간 또는 소 혈청과 함께 37℃에서 18 시간 동안 배양하고, 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 분해 산물은 별표(*)로 표시된다. (C) 37℃에서 18 시간 동안 인간 및 돼지 혈청과 함께 배양한 rIgdEagalactiae의 조 추출물을 이용한 웨스턴 블롯팅. 막은 인간 및 돼지 폴리클로날 IgG에 대한 항체로 각각 처리하였다. 분해 산물은 별표(*)로 표시된다. (D) rIgdEagalactiae를 인간 IgA와 IgM뿐만 아니라 인간 IgG의 서브 클래스와 함께 37℃에서 18 시간 동안 배양하고, 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 분해 산물은 별표(*)로 표시된다. 다른 젤의 이미지들을 이용하여 도면을 만들었다.
도 11. rIgdEagalactiae는 인간 혈청 IgG1을 단일 절단 IgG1로 완전히 분해한다.
인간 혈청 및 모노클로날 인간 IgG1을 rIgdEagalactiae의 존재 (+) 또는 부재 (-)하에서 37℃에서 18 시간 동안 배양하고 인간 IgG1 특이 항체로 비-환원 조건하에서 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
도 12. rIgdEequi는 말 IgG7만을 절단한다.
rIgdEequi를 발현하는 대장균 세포의 가용성 분획물과 함께(+) 또는 없이(-) 37℃에서 16 시간 동안 0.6 μM 재조합 말 IgG 아형 또는 혈청 IgG를 배양하였다. 환원 조건 하에서 SDS-PAGE로 반응을 분석하였다. IgG 절단(*)은 IgG7 및 혈청 IgG와의 배양시 발생하였다. SDS-PAGE는 쿠마시 플루오르 오렌지 단백질 겔 염색 (A)으로 염색되거나 토끼 항-말 IgG H & L (HRP) ab6921로 웨스턴 블롯 (B) 분석을 실시하였다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 S. suis 균주 10으로부터 분리된 IgdE의 아미노산 서열이다. S. suis로부터의 IgdE의 추가 아미노산 서열은, 예를 들어, GenBank 등록 번호 WP_012027720.1, WP_044687717.1, WP_045002893.1, WP_044981166.1, WP_044770432.1, WP_043041527.1, WP_014917307.1, WP_044981141.1, WP_044766031.1, WP_044780628.1, WP_044980481.1, WP_044768304.1, WP_043033176.1, WP_044772573.1, ABQ42883.1, ABQ42882.1, ABQ42884.1, ABQ42885.1, WP_024402604.1, WP_044671803.1, WP_014639000.1, WP_014636499.1, WP_044475270.1, WP_044683049.1, WP_044682603.1, WP_044982674.1, WP_024406212.1, WP_024402376.1, WP_024382860.1, WP_044684005.1, WP_044688055.1, WP_044754153.1, WP_024412941.1, WP_029172805.1, AER15932.1, WP_024414493.1, WP_044762560.1, WP_024417771.1, WP_044675281.1, WP_044666819.1, WP_043032980.1, WP_044671755.1, WP_024416363.1, ABL84354.1, ABL84413.1, WP_044758899.1, WP_024393919.1, WP_014736321.1, WP_024383620.1, WP_044475488.1, WP_024386700.1, WP_024381951.1, WP_024390579.1, WP_023371419.1, WP_044772576.1, WP_044766774.1, WP_044672596.1, WP_043028752.1, WP_044771508.1, WP_024383851.1, WP_024388957.1, WP_024394959.1, WP_029174632.1, WP_044752120.1, WP_044678077.1, WP_002938262.1, WP_044769991.1, WP_044770681.1, WP_044749736.1, 및 WP_044771392.1에서 찾을 수 있다.
서열번호 2는 is S.　suis 균주 10부터 분리된 IgdE를 코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 3은 S.　agalactiae 균주 CCUG4208로부터 분리된 IgdE의 아미노산 서열이다. S.　agalactiae로부터의 IgdE의 추가 아미노산 서열은, 예를 들어, GenBank 등록 번호 EPU21342.1, EFV98161.1, CAD47554.1, EPU23939.1, EPW71972.1, EPT99261.1, EPV90329.1, EGS26825.1, EPV84888.1, CFQ52811.1, EPT84780.1, EPT99074.1, CCW42936.1, CCW40848.1, EAO70450.1, EPU74838.1, EPT51236.1, EPU77761.1, EPT36280.1, WP_011058381.1, EPT59860.1, EPT39170.1, EPT38734.1, CFQ25568.1, EPU40877.1, WP_025193619.1, WP_000440329.1, WP_000440333.1, WP_000440330.1, WP_000440331.1, WP_047199154.1, WP_001901206.1, WP_025193273.1, WP_025194923.1, WP_000440334.1, WP_025195559.1, WP_047200043.1, WP_041165773.1, EPU33307.1, CFW66620.1, WP_041981191.1, WP_000440332.1, WP_047200261.1, WP_029692083.1, WP_017770870.1, WP_025197885.1, EAO75153.1, WP_001884472.1, EAO62452.1, WP_025195776.1, WP_047200280.1, CFW66618.1, 및 EAO75155.1에서 찾을 수 있다.
서열번호 4는 S.　agalactiae 균주 CCUG4208로부터 분리된 IgdE를 코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 5는 S.　porcinus 균주 DSM20725로부터 분리된 IgdE의 아미노산 서열이다. S.　porcinus로부터의 IgdE의 아미노산 서열은, 예를 들어, GenBank 등록 번호 WP_003085269.1에서 찾을 수 있다.
서열번호 6은 S.　porcinus 균주 DSM20725로부터 분리된 IgdE를 코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 7은 S.　equi 균주 ssp zooepidemicus #1로부터 분리된 IgdE의 아미노산 서열이다. S.　equi로부터의 IgdE의 추가 아미노산 서열은, 예를 들어, GenBank 등록 번호 KDE01980.1, KIS07668.1, KIS08707.1, KIS19971.1, WP_043038795.1, WP_043036602.1, WP_037584076.1, KIS20896.1, AIA68804.1, WP_043029522.1, WP_012678259.1, WP_042670323.1, WP_043040324.1, 및 WP_014622546.1에서 찾을 수 있다.
서열번호 8은 S.　equi 균주 ssp zooepidemicus #1로부터 분리된 IgdE를 코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 9는 S.　pseudoporcinus 균주 ATCC® BAA-1381로부터 분리된 IgdE의 아미노산 서열이다. S.　pseudoporcinus로부터의 IgdE의 아미노산 서열은, 예를 들어, GenBank 등록 번호 WP_007895676.1에서 확인할 수 있다.
서열번호 10은 S.　pseudoporcinus 균주 ATCC BAA-1381로부터 분리된 IgdE를 코딩하는 핵산 서열이다.
서열번호 11은 S.　suis로부터 분리된 IgdE의 C-말단 제거된(truncated) 변이체의 아미노산 서열이다.
IgdE 폴리펩타이드
본 발명에 따른 IgdE 폴리펩타이드는 시스테인 프로테아제 활성을 보유하고/하거나 대상에서 스트렙토코커스에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 IgdEsuis, IgdEagalactiae, IgdEporcinus, IgdEequi 또는 IgdEpseudoporcinus 폴리펩타이드 또는 이의 임의의 변이체 또는 단편이다. 변이체는 다른 박테리아로부터의 IgdE 폴리펩타이드일 수 있다. 박테리아는 바람직하게는 스트렙토코커스이다.
IgdE 폴리펩타이드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11의 아미노산 서열; 또는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 이들의 임의의 변이체; 또는 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11의 단편; 또는 이들의 임의의 변이체를 포함할 수 있다.
IgdE 폴리펩타이드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11의 아미노산 서열; 또는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 대상에서 스트렙토코커스에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 이들의 임의의 변이체; 또는 대상에서 스트렙토코커스에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11의 단편; 또는 이들의 임의의 변이체를 포함할 수 있다.
스트렙토코커스는 S.　suis, S.　agalactiae, S.　porcinus, S.　equi, 또는 S.　pseudoporcinus일 수 있다.
바람직하게는, 폴리펩타이드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 임의의 서열을 포함하거나 이로부터 이루어진다.
폴리펩타이드는 추가로 시그널 서열 또는 N-말단 메티오닌을 포함할 수 있다.
변이체 폴리펩타이드는 아미노산 서열이 각각 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 아미노산 서열과 다르나, IgdE와 동일한 필수 특성 또는 기본 기능성을 보유한다. 따라서, 변이체 폴리펩타이드는 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 나타내고/내거나 대상에서 스트렙토코커스에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있다. 바람직하게는 면역 반응은 방어 면역 반응이다. 바람직하게는, 면역 반응은 면역화된 대상에서 감염성 스트렙토코커스의 IgdE의 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 중화시킬 수 있는 항체를 생성한다. 특히, IgG 시스테인 프로테아제 활성이 결여된 IgdE 변이체는 면역화된 대상에서 감염성 스트렙토코커스의 IgdE의 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 중화시킬 수 있는 항체를 생성하는 면역 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 IgdE 변이체는 본 발명에 따른 IgdE 변이체에 포함된다.
전형적으로, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 아미노산 서열과 약 70% 이상의 동일성, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 90% 및 특히 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩타이드는 상기 단백질의 변이체로 간주된다. 이러한 변이체는 펩타이드가 기본 IgdE 기능을 유지하는 한, 대립 형질 변이체 및 단백질 서열 내 단일 아미노산 또는 아미노산 기의 결실, 변형 또는 부가를 포함할 수 있다. 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 변이체의 동일성은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11에 나타낸 서열의 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 275, 적어도 300 이상의 인접 아미노산 부위 전체, 또는 보다 바람직하게는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 전장 전체에서 측정될 수 있다. 상기 열거된 하한 중 임의의 것을 상기 열거된 상한 중 임의의 것과 조합하여 본 발명의 폴리펩타이드의 길이에 대한 범위를 제공할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 길이가 50 내지 250 개의 아미노산, 또는 길이가 100 내지 300 개의 아미노산일 수 있다. 폴리펩타이드는 길이가 100 내지 586 개의 아미노산, 길이가 150 내지 500 개의 아미노산 또는 길이가 100 내지 400 개의 아미노산 일 수 있다.
아미노산 동일성은 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 계산할 수 있다. 예를 들어, UWGCG Package는 상동성을 계산하는 데 사용할 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다(예를 들어, 디폴트 설정에 이용)(Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395). PILEUP 및 BLAST 알고리즘은 예를 들어 Altschul S. F. (1993) J MoI Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al. (1990) J MoI Biol 215:403-10에 기술된 바와 같은, 동등하거나 대응하는 서열을 동정하는 것과 같은 상동성 또는 정렬 서열(전형적으로 디폴트 설정)을 계산하는데 사용될 수 있다.
BLAST 분석 수행을 위한 소프트웨어는 생물학 정보 국립센터 (National Center for Biotechnology Information (http://wwwncbinlmnihgov/)를 통해 누구나 이용가능하다. 이 알고리즘은 요청한 서열의 길이 W에서 짧은 단어들을 식별함으로써 일치 또는 일부 양성수치 임계점수 T를 만족하는 고득점 서열일치 (High scoring sequence pair; HSPs)를 일차적으로 식별하는 것을 수반한다. T는 이웃 단어 점수 임계점 (heighbourhood word score threshold)을 말한다 (Altschul et al, supra) 이들 시작 이웃 단어의 발단은 이들을 포함하는 HSPs를 찾기 위한 초기 조사의 시발점으로 작용한다. 상기 단어의 발단은 누적 얼라인먼트 점수가 증가될 수 있을때까지 멀리 각 서열을 따라 양방향으로 확장된다. 각 방향으로 단어의 발단을 확장하는 것은 하기와 같은 때에 중단된다; 누적 얼라인먼트 점수가 양 X에 의해 최고 달성치로부터 떨어졌을 때; 하나 또는 그이상의 음성-점수 잔류물 얼라인먼트가 축적으로 인한 누적 얼라인먼트 점수가 0 또는 그이하로 내려갈 때; 또는 어느 서열의 끝이라도 닿았을때. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 얼라인먼트의 민감도와 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트값으로 단어길이(W)는 11, BLOSUM62 스코어링 메트릭스 (Henikoff and Henikoff (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:10915-10919 참조) 얼라인먼트 (B)는 50, 익스펙테이션(E)은 10, M=5, N=4 를 사용하였고, 양쪽 스트랜드를 비교하였다.
BLAST 알고리즘은 두 서열 간의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 참조. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 측정은 최소 합계 확률(probability (P(N))이고, 이는 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 매치에 의한 확률이 우연히 일어날 수 있음을 제공한다. 예를 들면, 제1 서열과 제2 서열을 비교한 최소 합계 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 0.1 미만, 더욱 바람직하게는 0.01 미만, 가장 바람직하게는 0.001 미만인 경우, 한 서열은 다른 서열과 유사한 것으로 간주된다.
변이체 서열은 전형적으로 적어도 1, 2, 5, 10, 20, 30, 50 또는 그 이상의 아미노산 위치(아미노산의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있음)만큼 상이하다. 예를 들어, 1 내지 50, 2 내지 30, 3 내지 20 또는 5 내지 10 개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이 이루어질 수 있다. 치환은 바람직하게는 보존적 치환, 예를 들어 하기 표 1에 따른 치환일 수 있다. 제2 칼럼의 동일한 블록 및 바람직하게는 제3 칼럼의 동일 라인의 아미노산은 서로 치환될 수 있다 :
지방족 비-극성 Gly Ala Pro
Ile Leu Val
극성-비전하 Cys Ser Thr Met
Asn Gln
극성-전하 Asp Glu
Lys Arg
방향족 His Phe Trp Tyr
달리 명시하지 않는 한, 변형은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 치환은 아미노산을 유사한 화학 구조, 유사한 화학적 성질 또는 유사한 사슬 부피의 다른 아미노산으로 대체한다. 도입된 아미노산은 이들이 대체된 아미노산과 유사한 극성, 친유성, 소수성, 염기성, 산성, 중성 또는 전하를 가질 수 있다. 대안적으로, 보존적 치환은 이미 존재하는 방향족 또는 지방족 아미노산 대신에 방향족 또는 지방족인 또 다른 아미노산을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 변화는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며 하기 표 A1에 정의된 바와 같은 20 가지 주요 아미노산의 특성에 따라 선택될 수 있다. 아미노산이 유사한 극성을 갖는 경우, 이는 표 A2의 아미노산 측쇄에 대한 소수성 정도(hydropathy) 규모를 참조하여 결정할 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
바람직하게는, 폴리펩타이드는 전형적으로 시스테인 프로테아제에서 발견되는 간격으로 시스테인 잔기 및 히스티딘 잔기를 포함한다. 예를 들어, 서열번호 1에서, 이들 잔기는 위치 302 및 위치 333에서 발견된다. 촉매 트리아드를 완성시키는 아스파르트 산 잔기는 위치 348에서 발견된다.
본 발명에서 사용되는 IgdE 폴리펩타이드의 단편은 IgdE의 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 보유하고/하거나 대상의 스트렙토코커스에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 한, 전형적으로 길이가 적어도 10, 예를 들어 적어도 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 아미노산 길이, 100, 150, 200, 250 또는 300 아미노산이다.
본 발명에서 사용되는 폴리펩타이드는 화학적으로 변형, 예컨대, 번역 후 변경될 수 있다. 예를 들어, 이들은 글리코실화, 인산화되거나 또는 변형된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이들은 정제를 돕기 위한 히스티딘 잔기의 첨가 또는 세포막 내로의 삽입을 촉진하기 위한 신호 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형된 폴리펩타이드는 본원에서 사용된 "폴리펩타이드"라는 용어의 범위 내에 있다
전형적으로, 본 발명에 따라 사용하기 위한 폴리펩타이드는 면역글로불린 시스테인 프로테아제 활성, 특히 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 나타낸다. 바람직하게는, 폴리펩타이드는 힌지 영역, 보다 특히 중쇄의 힌지 영역에서 IgG를 절단한다. 바람직하게는, 절단은 IgG의 Fc 및 Fab 단편의 생성을 초래한다. 바람직하게는 활성은 IgG에 특이적이다. IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성은 적합한 분석 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 시험 폴리펩타이드는 적절한 온도, 예를 들어 37℃에서 IgG로 인큐베이션될 수 있다. 이어서, 출발 물질 및 반응 산물을 SDS PAGE로 분석하여 목적의 IgG 절단 산물이 존재하는지를 결정할 수 있다. 일반적으로 이 절단 산물은 32kDa 단편이다. 전형적으로, 이 첫 번째 절단 후에 IgG의 더 이상의 분해는 없다. 절단 산물은 N-말단 시퀀싱을 실시하여 절단이 IgG의 힌지 영역에서 발생했는지를 검증할 수 있다.
폴리펩타이드의 시스테인 프로테아제 활성은 억제 연구에 의해 추가로 특성화될 수 있다. 바람직하게는, 활성은 펩타이드 유도체 Z-LVG-CHN2 및/또는 프로테아제 억제제인 아이오도아세트산에 의해 저해된다.
폴리펩타이드의 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성은 일반적으로 IgG의 절단을 허용하는 조건하에서 이들 면역글로불린과 함께 인큐베이션할 때 폴리펩타이드가 Ig의 다른 부류, 즉 IgM 및 IgA를 분해하지 않을 수 있다는 점에서 IgG-특이 적이다. S.　suis, S.　porcinus, 및 S.　pseudoporcinus로부터의 IgdE는 돼지 IgG에 특이적인 것으로 밝혀졌다. S.　agalactiae로부터의 IgdE는 인간 IgG, 및 특히 인간 IgG1에 특이적인 것으로 밝혀졌다. S.　equi으로부터의 IgdE는 말 IgG, 및 특히 말 IgG7에 특이적인 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 사용하기 위한 폴리펩타이드는 실질적으로 분리된 형태일 수 있다. 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 의도된 목적을 방해하지 않고 여전히 실질적으로 분리된 것으로 간주되는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명에서 사용하기 위한 폴리펩타이드는 또한 실질적으로 정제된 형태일 수 있으며, 이 경우 일반적으로 제제 내 본 발명의 폴리펩타이드가 50% 이상, 예를 들어, 80 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량%로 포함된다.
본 발명에서 사용하기 위한 폴리펩타이드는 IgdE 폴리펩타이드를 발현하는 임의의 적합한 유기체로부터 분리될 수 있다. 전형적으로, IgdE 폴리펩타이드는 적합한 IgdE 발현 스트렙토코커스 균주로부터 분리된다. 적합한 유기체 및 균주는 다수의 기술에 의해 동정될 수 있다. 예를 들어 스트렙토코커스 균주는 초기에 igdE 유전자의 존재를 시험할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브는 예를 들어, 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10에 기초하여 디자인될 수 있다. 적합한 프라이머의 예는 서열번호 12 내지 22에 제시되어있다. igdE 유전자의 존재는 프라이머를 사용하는 PCR 또는 균주의 게놈 DNA에 대한 프로브의 혼성화에 의해 확인될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드
본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 (a) 서열번호 4, 5, 6, 8, 또는 10의 코딩 서열; (b) (a)에 정의된 서열에 대한 유전 암호의 결과로서 디제너레이트된 서열; (c) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하고/하거나 스트렙토코커스에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 (a) 또는 (b)에 정의된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열; 또는 (d) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하고/하거나 스트렙토코커스에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 (a), (b) 또는 (c)에 정의된 서열 중 어느 하나의 단편.
전형적으로 폴리뉴클레오타이드는 DNA이다. 그러나, 폴리뉴클레오타이드는 RNA 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 또는 이중 가닥일 수 있으며, 합성 또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 백그라운드보다 유의하게 높은 수준으로 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 코딩 서열 또는 이의 상보적인 서열에 전형적으로 혼성화할 수 있다. 백그라운드 혼성화는 예컨대, DNA 라이브러리에 있는 다른 DNA 때문에 일어날 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 코딩 서열또는 이의 상보적인 서열 간의 상호작용에 의해 발생된 시그널 수준은, 다른 폴리뉴클레오타이드 및 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 코딩서열 간의 상호작용보다 일반적으로 적어도 10 배, 바람직하게는 적어도 100 배만큼 강하다. 상호작용의 강도는 예를 들어 32P와 같은 프로브를 방사선표지하여 측정할 수 있다. 선택적 혼성화(hybridisation)는 일반적으로 고엄격성(high stringency)에 대한 배지 조건으로 달성될 수 있다. 그러나, 이러한 혼성화는 당업계에 알려진 임의의 적합한 조건하에서 실시될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989 참고). 예를 들어, 고엄격성(high stringency)이 요구된다면 60℃ 내지 65℃에서 0.1 내지 0.2×SSC를 포함하는 조건이 적당하다. 저엄격성(lower stringency)이 요구된다면 60℃에서 2×SSC를 포함하는 조건이 적당하다.
서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 코딩 서열은 뉴클레오티드 치환, 예를 들어 1, 2 또는 3 내지 10, 25, 50 또는 100개의 치환에 의해 변형될 수 있다. 서열번호 2, 4, 6, 8, 10의 폴리뉴클레오타이드는 택일적으로 또는 부가적으로 하나 이상의 삽입 및/또는 결실 및/또는 한쪽 또는 양 말단에서의 연장에 의해 변형될 수 있다. 또한, 시그널 서열과 같은 추가 서열이 포함될 수 있다. 변형된 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 IgdE 특이 시스테인 프로테아제 활성을 가지고/가지거나 대상에서 스트렙토코커스에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 폴리펩타이드를 코딩한다. 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 변형된 서열이 번역될 때 보존적 아미노산 치환을 초래할 수 있는 디제너레이트 치환이 이루어질 수 있고/또는 치환이 이루어질 수 있다.
서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 DNA 코딩 서열의 상보적인 서열에 선택적으로 혼성화될 수 있는 뉴클레오타이드 서열은, 일반적으로 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 영역의 적어도 20, 바람직하게는 적어도 30, 예를 들어 적어도 적어도 40, 적어도 60, 보다 바람직하게는 적어도 100 개의 인접 뉴클레오티드 또는 가장 바람직하게는 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 전체 길이에서 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 코딩 서열과 각각 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 서열 동일성은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 상술한 바와 같이 결정될 수 있다.
상술한 서열 동일성 정도 및 최소 크기의 임의의 조합은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 정의하는데 사용될 수 있으며, 보다 엄격한 조합(즉, 보다 긴 길이에 대한 더 높은 서열 동일성)이 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 20 개 이상, 바람직하게는 30 개 이상 뉴클레오타이드와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 40 개 이상 뉴클레오타이드와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드와 마찬가지로 본 발명의 일 양태를 형성한다. 폴리뉴클레오타이드 단편은 바람직하게는 길이가 적어도 10 개, 바람직하게는 적어도 15 개 또는 적어도 20 개, 예를 들어 적어도 25 개, 적어도 30 개 또는 적어도 40 개일 것이다. 이들은 전형적으로 길이가 40, 50, 60, 70, 100 또는 150 뉴클레오타이드일 것이다. 단편은 길이가 예컨대, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 뉴클레오티드처럼 150 뉴클레오타이드 길이보다 더욱 길 수 있고, 또는 서열번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 코딩 서열보다 5, 10 또는 15 뉴클레오타이드와 같이 최대 몇개의 뉴클레오타이드가 짧은 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드는 재조합, 합성, 또는 당업자가 이용할 수 있는 임의의 수단에 의해 제조될 수 있다. 표준 기술로도 복제할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 분리 및/또는 정제된 형태로 제공된다.
일반적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드는 한 번에 한 뉴클레오타이드의 원하는 핵산 서열을 단계적으로 제조하는 합성 수단에 의해 생산될 것이다. 자동화 기술을 이용하여 이를 달성하는 기술은 당업계에서 용이하게 이용가능하다.
길이가 더 긴 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 재조합 방법, 예를 들어 PCR (polymerase chain reaction) 클로닝 기술을 사용하여 생산될 것이다. 이것은 클론닝하고자하는 igdE 유전자의 영역에 대한 프라이머 쌍(예, 약 15-30 뉴클레오타이드)을 제작하고, 상기 프라이머를 세균 세포로부터 수득된 DNA에 접촉시키고, 원하는 영역의 증폭을 일으키는 조건 하에서 PCR을 수행하고, 증폭된 단편을 분리하고(예를 들어, 아가로스 젤 상에서 반응 혼합물을 정제), 증폭된 DNA를 복구시키는 것과 관련있다. 상기 프라이머는 적합한 제한효소 인식위치를 포함하여 증폭된 DNA가 적합한 클로닝 벡터안으로 복제될 수 있게 설계할 수 있다. 적합한 프라이머는 예를 들어 서열번호 12 내지 22의 프라이머이다.
이러한 기술은 본원에 개시된 igdE 유전자 서열의 전부 또는 일부를 수득하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 본원에 언급된 기술은 당업계에 잘 알려져 있으나, 특히 Sambrook et al. (1989)을 참고할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 IgdE 폴리뉴클레오타이드는 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 발생할 수 있는 본 발명에서 사용하기 위한 폴리펩타이드의 생산에 유용하다. 폴리뉴클레오타이드는 그 자체로 치료제로서 사용될 수 있거나 재조합 단백질 합성에 관여할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 재조합 복제가능한 벡터에 통합된다. 상기 벡터는 양립가능한 숙주세포에서 핵산을 복제하는데 사용될 수 있다. 따라서, IgdE 폴리뉴클레오타이드를 복제가능한 벡터 안으로 도입하고, 상기 벡터를 숙주 세포 안으로 도입하고, 벡터의 복제를 야기하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 성장시킴으로써 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 제조될 수 있다.
바람직하게는 상기 벡터는 IgdE 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현벡터이다. 상기 발현벡터는 분자생물학계에서 일상적으로 구성되고 예를 들어 플라스미드 DNA 및 적절한 개시제, 프로모터, 인헨서 및 폴리아데닐화 시그널과 같은 다른 요소들의 이용과 관련이 있고, 이는 단백질 발현을 위해 요구될 수 있고 정확한 방향으로 배치될 수 있다. 다른 적합한 벡터는 당업자에게 명백할 것이다. 이와 관련하여 추가 예로서 Sambrook et al, 1989를 참조한다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 숙주세포에 서 코딩서열을 발현할 수 있는 제어서열(control sequence)에 작동가능하게 연결되며, 즉, 상기 벡터는 발현 벡터이다. 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 구성요소가 정해진 방법으로 기능하도록 허용하는 관계에 놓인 병렬을 나타낸다. 코딩서열에 "작동가능하게 연결된" 프로모터 등 조절서열은 코딩서열의 발현이 조절서열과 공존하는 조건 하에 일어나는 방법으로 배치된다.
예를 들어 벡터는 복제개시점, 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 선택적으로 그 프로모터의 조절자를 가지는 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 전형적으로 생체 내에서 사용되도록 적응된다.
프로모터 및 다른 발현 조절 신호는 발현이 설계된 숙주 세포와 양립할 수 있도록 선택될 수 있다. β-액틴 프로모터와 같은 포유 동물 프로모터가 사용될 수 있다. 조직-특이적 프로모터가 특히 바람직하다. 또한, 예를 들어, 바이러스 프로모터로는 Moloney 쥐백혈병바이러스 긴말단반복순서(MMLV LTR), 라우스 육종바이러스(RSV) LTR 프로모터, SV40 프로모터, 인간 거대세포바이러스(CMV) IE 프로모터, 아데노바이러스, HSV 프로모터(HSV IE 프로모터) 또는 HPV 프로모터, 특히 HPV 업스트림 조절영역(URR)을 이용할 수 있다. 바이러스 프로모터는 당업계에서 손쉽게 이용가능하다. 벡터는 진핵 생물 게놈 서열, 바람직하게는 포유류 게놈 서열에 상동성인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 폴리뉴클레오타이드를 플랭킹하는 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이는 상동성 재조합에 의해 진핵 세포의 게놈에 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 도입할 수 있게 한다. 특히, 바이러스 서열이 측면에 위치한 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 벡터를 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포유 동물 세포에 전달하기에 적합한 바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 적합한 바이러스 벡터의 다른 예는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 HPV 바이러스를 포함하는 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터 및 레트로바이러스를 포함한다. 이들 바이러스를 이용한 유전자 전이 기술은 당업자에게 공지되어있다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터는 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주 게놈에 안정하게 통합시키는데 사용될 수 있다. 대조적으로 복제-결핍 아데노 바이러스 벡터는 에피솜(episomal)으로 남아 있으므로 일시적인 발현이 가능하다.
질환 및 증상
IgdE 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 병원성 IgG 항체에 의해 매개되는 질환 또는 증상을 치료 또는 예방하는데 사용할 수 있다. 병원성 IgG 항체가 다수의 상이한 질환 및 증상의 발병 기전에 관여한다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 결과적으로, IgdE 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 이러한 질환에서 병원성 IgG 항체의 효과를 억제할 수 있다.
질환 또는 증상은 자가 면역 질환일 수 있다. 이러한 질환은 애디슨 병, 원형탈모, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 재생 불량성 빈혈, 자가면역 위염, 자가면역 청력상실, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 부갑상선 기능 저하, 자가면역 뇌하수체염, 자가면역 내이질환, 자가면역 림프세포증식증후군, 자가면역 심근염, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 다발성 내분비병증, 베체트병, 수포성류천포창, 심근증, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 처그-스트라우스증후군, 소화 장애증, 크론 병, CREST 증후군, Degos 질환, 표피성 불사증, 필수혼합혈전증, 거대세포동맥염, 사구체 신염, 굿패셔 증후군, 그레이브스 병, 기옌-버러지 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 혈전증, 염증성 장 질환, 가와사키 병, 메니에르 증후군, 혼합된 연결 조직 질환, 무어의 궤양, 다발성 경화증, 미아스테니아 그라티스, 펨피구스, 펨피구스, 악성아니아몰수증, 다당염수막증, 다선성 자가면역 증후군 1형(PAS-I), 다선성 자기면역 증후군 2형(PAS-2), 다선성 자기면역 증후군 3형(PAS-3), 다발성 근염/피부근염, 원발쓸개관간경화증, 건선, 건선성관절염, 레이나우드 증후군, 라이터 증후군, 류마티스성 관절염, 유육종증, 경피증, 스조그렌 증후군, 아급성 갑상선염, 교감성 안염, 전신 홍반성 루프스, 타카야스 동맥염, 1형 당뇨, 백반증, 보그트-코야나기-하라다 병 또는 베게너 육아종증을 포함한다. 바람직하게는 상기 자가면역 질환은 류마티스성 관절염(RA)이다.
질환 또는 증상은 천식이 될 수 있다. 천식은 급성 또는 만성 천식일 수 있다.
IgG는 보체 시스템의 전형적인 경로를 활성화시킨다. 따라서, IgdE 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 보체 활성화가 환자에게 해로운 경우 질환 및 증상를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, IgdE 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 이식-유래 장애, 예를 들어 이식 거부(예를 들어 동종 이식 및 이종 이식 거부) 및 이식편-대-숙주 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 장기 이식 장애는 환자의 조직 또는 장기 이식으로 인해 발생할 수 있다.
또한, IgdE 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 수술 후 치료, 예를 들어 심장 바이 패스 (by-pass) 조작을 받은 환자의 치료에 사용된다.
또한, IgdE 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 후천성 혈우병의 치료, 즉, 응고 인자에 대한 자가 항체를 생성하는 혈우병 환자에서 IgG를 제거하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상"은 인간, 돼지, 말 및 임의의 소와 같은 임의의 포유 동물 대상을 포함한다.
시험관내 시험 법
본 발명은 다음을 포함하는 폴리펩타이드와 IgG를 접촉시키는 단계를 포함하는, IgG의 절단을 위한 시험관 내 방법을 포함한다:
(a) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 아미노산 서열;
(b) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 이의 변이체; 또는
(c) IgG 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 단편.
바람직한 구현예에서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 3이다. IgG의 절단을위한 시험관 내 방법은 다음을 포함하는 폴리펩타이드와 IgG를 접촉시키는 단계를 포함한다:
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열;
(b) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 변이체;
(c) IgG 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 단편 또는 서열번호 3의 변이체의 단편.
바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 인간 IgG, 및 특히 인간 IgG1에 특이적이다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 경쇄가 카파 또는 람다 유형인지 여부에 관계없이 도 4에 나타낸 바와 같이 IgG1을 절단한다.
폴리펩타이드는 IgG 시스테인 프로테아제이고, 일반적으로 서열번호 1의 265, 296 및 311 위치에 상응하는 위치의 시스테인 잔기, 히스티딘 잔기 및 아스파르트산 잔기를 포함하는 촉매 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 3에서, 시스테인 잔기, 히스티딘 잔기 및 아스파르트산 잔기는 위치 262, 293 및 308에서 발견된다. 폴리펩타이드의 변이체 및 단편은 일반적으로 이들 잔기를 보유한다.
본 발명의 방법은 특정 시스테인 프로테아제 활성이 발생하는 조건 하에서 IgG를 함유하는 샘플과 폴리펩타이드를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 절단 산물의 동정 및/또는 분리를 추가적으로 포함한다. 상기 분석은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의한 것일 수 있다. 일부의 경우, 겔 전기 영동(예를 들어, SDS-PAGE) 또는 질량 분광법에 의해 분석된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 시험관 내 방법은 IgG의 Fc 또는 Fab 단편을 생성시키는 데 사용된다. 상기 방법은 본 발명의 폴리펩타이드와 IgG를 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 구현예에서, 본 발명의 방법은 IgG를 검출하는데 사용된다. 이는 (i) 폴리펩타이드의 IgG 특이 시스테인 프로테아제 활성을 허용하는 조건하에서, 샘플을 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; 및 (ii) IgG 특이 절단 단편의 존재에 대해 모니터링하는 단계를 포함하며; 여기서 상기 특이 절단 단편의 존재는 샘플에서 IgG를 나타낸다.
실시예
실시예 1. S. suis 로부터의 IgdE의 동정
박테리아 균주 및 성장 조건
S. suis 균주 10은 돼지의 돌연변이 유발 및 실험 감염에 대한 여러 연구에사용된 독성 혈청형 2 균주이다(Smith et al., 1999. Infect. Immun. 67, 1750-1756). 10M7 균주는 Hilde Smith (AWG, Lelystad, Netherlands) (Smith et al., 1996. Infect. Immun. 64, 4409-4412)에 의해 제공되었다. 스트렙토코커스 (Streptococci)는 37℃의 혐기성 조건 하에서 6% 양 혈액 또는 THB(Bacto Todd-Hewitt broth)로 컬럼비아 한천 플레이트에서 배양되었다. 대장균 균주는 LB(Luria Broth)에서 배양하였다. 적절하게 항생제로 카나마이신 50 ㎍/㎖ 및 겐타마이신 20 ㎍/㎖를 첨가하였다.
동물 재료
실험적으로 감염된 새끼 돼지의 시료는 이전 연구에 기초하였다. 이 동물 실험을 위한 프로토콜은 독일의 소비자 보호 및 식품 안전국 동물 실험위원회 (허가 번호 33.9-42502-04-07/1243)의 승인을 받았다. 살균 분석을 위한 종래 새끼 돼지의 혈액 수집은 독일 Saxonia의 지역 사무소에서 N19/14로 등록되었다. 동물 실험은 실험적 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물 보호에 관한 유럽 협약 (European Treaty Series, no. 123: http://www.conventions.coe.int/Treaty/en/Treaties/Html/123.htm) 및 독일 동물 보호법에 명시된 원칙과 권장 사항을 엄격히 준수하여 수행되었다.
IgG 분해 활성의 동정
S.suis 균주 10M7 배양물을 약 0.6의 OD600에서 수확하고, 30% 포화까지 배양 상층액을 암모늄 설페이트로 분획하기 전에 배양 상층액을 0.22 μM Express PLUS 멤브레인 필터 (Millipore)를 통해 멸균-여과하였다. 생성된 침전물을 버리고 암모늄 설페이트를 나머지 상층액에 첨가하여 50%의 최종 포화 농도로 농축시켰다. 두 번째 침전물을 20 mM Bis-Tris pH 6.8로 시작 부피의 1/100에 재현탁하고 동일한 완충액에 대한 완충액 교환을 HiPrep 26/10 탈염 칼럼(GE Healthcare)으로 실시하였다. 상기 물질을 HiTrap Q HP 칼럼 (GE Healthcare)상의 FPLC로 추가적으로 분획하였다. 단백질은 선형 NaCl 구배에 의해 용출되었고, ~ 0.2 M NaCl에서 용출된 분획이 IgG 분해 활성을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 활성 분획을 크기 배제 크로마토 그래피 (HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR, GE Healthcare)에 적용하여 ~ 37 ml 용출 부피에서 IgG 분해 활성을 용출시켰다. 활성 분획을 SDS-PAGE로 분석하고 단백질 밴드를 질량 분광 분석에 적용하였다.
질량 분광학
MALDI-TOF 질량 분석은 Umea Protein Analysis Facility (Umea University)에 의해 수행되었다. MS 분석을 위한 펩타이드는 트립신(sequencing grade modified, Promega)을 이용하여 인-겔 분해(in-gel digestion)로 준비하였고, Easy nano LC 시스템 (Proxeon)에 연결된 HCT ultra ETD II 이온 트랩 기기(Bruker)를 사용하여 ESI LC-MS/MS로 분석하였다. LC-MS/MS 데이터세트의 처리, 역합성 및 화합물 검출은 DataAnalysis 소프트웨어 (4.0 SP4, Bruker)를 사용하여 수행하였다. 처리된 데이터세트의 피크리스트 파일을 사용한 데이터베이스 검색은 NCBInr 데이터베이스의 박테리아 서열들에서 Mascot 검색 엔진 (Matrixscience)을 사용하여 수행되었다. 검색 매개 변수는 MS와 MS/MS 모드 모두에 대한 0.3 Da의 질량 오차 및 산화에 의한 메티오닌, 프로피온아미드 유도 및 N-말단 아세틸화에 의한 시스테인의가변 변형을 허용하였다.
IgG 분해능에 대한 S. suis 균주의 스크리닝
상이한 15 종의 S. suis 균주(표 2)의 배양 상층액을 ~ 0.6의 OD600에서 분리하고, 포화 암모늄 설페이트 용액을 첨가하여 50%의 최종 포화 농도로 농축시켰다. 침전물을 PBS로 시작 부피의 1/20에 재현탁하고 Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO (Thermo Scientific)로 PBS에 대한 완충액 교환을 실시하였다. S. suis 배양 상층액의 50% 암모늄 설페이트 침전 분획을 IgG 분해 분석에 사용하였다.
본 실시예에 사용된 S. suis 균주들
균주 캡슐 유형 소스 (참조)
10 cps 2 Smith et al. 1999. Infect. Immun. 67, 1750-1756
A1731/94 cps 1 Allgaier et al. 2001. J Clin Microbiol . 39, 445-453
P1/7 cps 2 Jacobs et al. 1994. Infect. Immun . 62, 1742-1748
T15 cps 2 Smith et al. 1999. Infect. Immun. 67, 1750-1756
I9841/1 cps 2 Allgaier ibid
199 cps 2 (인간) Baums et al. 2007. Appl. Environ. Microbiol . 73, 711-717
MAC724 cps 2 (인간) Baums ibid
B2795/96 cps 7 Allgaier ibid
B2441/96 cps 2 Allgaier ibid
A5505/93 비유형(untypeable) Allgaier ibid
V2569/1 cps 5 Baums, unpublished
#451 cps 7 Unterweger et al. 2014. Berl. Munch Tierarztl. Wochenschr. 127, 194-201
V3667/1 cps 7 Baums, unpublished
A5683/94 cps 9 Allgaier ibid
A3286/94 cps 9 Allgaier ibid
5223 cps 14 Wisselink et al. 2002. J. Clin. Microbiol. 40, 2922-2929
10M7 cps 2 Smith et al. 1996. Infect. Immun . 64, 4409-4412
10△ideSsuis cps 2 Seele et al. 2013 J. Bacteriol. 195, 930-940
10△igdE cps 2 본 출원
10△ideSsuis △igdE cps 2 본 출원
5223 cps 14 Wisselink ibid
△igdE 결실 균주의 제작
igdE의 인 프레임 결실은 S. suis 균주 10을 이용한 Seele 그룹(2013, J. Bacteriol. 195, 930-940)에서와 같이 대체로 수행되었다. 열감수성 벡터 pSET5_△igdE의 구축을 위해 618 bp 5'-igdE 앰플리콘을 프라이머 preProIgdEPstI (TCACTGCAGTTTTGGGGAGTAGG, 서열번호 12) 및 postSSIgdEBamHI (ATGGATCCCAGTTCAGAACCTC, 서열번호 13)로 제작하였고, 612 bp 3'-igdE 앰플리콘을 프라이머 preEndIgdEBamHI (CGGGATCCAGAGAAAAAAGAGATCC, 서열번호 14) 및 postEndIgdEEcoRI (AGGAATTCACCGTTATTGTAGCG, 서열번호 15)로 제작하였다. pSET5_△igdE를 제작하기 위한 프라이머의 이름으로 표시된 제한 효소로 이들 앰플리콘을 pSET5(18)에 클로닝하였다. 결실 클론은 프라이머 IgdE-seq_frw (ATTGTATTTGGTGGAGGAG, 서열번호 16) 및 IgdE-seq_rev (TTTAGCAGCTAAGTTGATACC, 서열번호 17)를 사용하여 선택적 PCR 분석 및 게놈 앰플리콘의 시퀀싱에 의해 확인되었다.
서열 분석
서열 분석은 SIB Bioinformatics Resource Portal Expasy (www.expasy.ch)를 사용하여 수행되었다. SignalP 4.0를 수행하여 추정(putative) 신호 펩타이드 및 각각의 절단 부위를 확인하였다(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)을 사용하여 잠재적인 활성 부위 잔기를 확인하기위한 S. suis IgdE의 인 실리코(in silico) 모델링이 실시되었다. 추정된 트랜스멤브레인 영역은 공통 예측 웹 서버 TOPCONS (http://topcons.cbr.su.se/) 최신 어세션 2015-11-06을 사용하여 확인되었다.
DNA 기술 및 프라이머 서열
프라이머는 게놈 S. suis P1/7에서 유전자 SSU_RS08150에 기초하여 설계되었다. 모든 PCR은 Phusion Master Mix HF (Thermo Scientific)로 수행되었다. 수득 된 모든 플라스미드를 제한 분석, PCR 및 시퀀싱으로 검사하였다.
S. suis igdE의 클로닝 및 IgdE 돌연변이의 제작
신호 펩타이드 코딩 서열이 결핍된 S. suis igdE 유전자(아미노산 38-1121 코딩)를 프라이머 IgdE-frw_NcoI (GTTTCCATGGATGAAAACTCACATTTACAATCG, 서열번호:18) 및 IgdE-rev_NotI (ACGTGCGGCCGCATAAGCTTCGTAC, 서열번호:19)을 사용하여 주형인 S. suis 균주 10의 염색체 DNA로부터 증폭하여, NcoI 및 NotI (Thermo Scientific)로 절단한 후 pET_ZZ_1a에 클로닝하였다. 전체 인서트를 시퀀싱하여 S. suis igdE의 클로닝 및 서열을 확인하였다. S. suis 균주 10 igdE의 수득된 서열은 S. suis 05ZYH33의 서열과 동일하였고 S. suis P1/7의 SSU_RS08150과 비교하여 32 아미노산의 삽입을 함유하였다.
QuickChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies) 및 프라이머 IgdE-C302S (aacgtcagaaagcgatgagtgtaggtttcagcact, 서열번호:20), IgdE-H333A (cagaaggtgtcccggctgctacagcgcgtg, 서열번호:21) 및 IgdE-D348A (taaaaagtggcacaccattgccggtacaggttttattacag, 서열번호:22)를 사용하여 제조 회사의 지시에 따라 추정 활성 부위 잔기인 C302가 S, H333가 A 및 D348가 A로 유발되는 직접 돌연변이 유발을 수행하였다.
S. suis IgdE의 N-말단 470 아미노산으로 이루어진 IgdE△C는 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonucleases) XhoI(Thermo Scientific)로 pZZ1a에서 전장 igdE를 절단함으로써 생성되었다. 절단된 플라스미드를 정제, 재-라이게이션 및 대장균으로 형질전환시켰다.
재조합 S. suis IgdE의 발현 및 정제
pET_ZZ_1a igdE, igdE C302S , igdE H302A, igdE D302A 또는 igdE △C를 포함하는 E.coli ArcticExpress (DE3) _RIL(Agilent Technologies) 분리 균주를 30℃에서 OD600 0.6까지 배양시켰다. 단백질 발현을 12℃에서 1 mM IPTG로 유도하였고 인큐베이션은 추가로 22 시간 동안 계속하였다.
세포를 조 추출물을 위해 BugBuster HT 단백질 추출 시약 (Novagen)으로, 또는 정제를 위해 50 mM Bis-Tris pH 7, 0.5 M NaCl, 5% 글리세롤, 40 μM 이미다졸에서 Stansted high pressure cell disrupter (Stansted Fluid Power)로 용해시켰다. His-ZZ-태깅 단백질을 표준 프로토콜을 사용하여 HisTrap FF (GE healthcare) 상에서 정제하였다. 태그는 5℃에서 20 시간 동안 Tev-프로테아제로 효소 절단에 의해 제거된 다음 HisTrap FT에서 2 차 정제되었다. 태깅되지 않은 rIgdE가 포함된 통과액(flow through)이 수집되었다. 재조합 IgdE△C를 전장 rIgdE와 비교하여 높은 수율 및 순도로 상기 기재된 바와 같이 정제하였다.
정성적 IgG 분해 분석
농축 및 분획된 배양 상층액에서 IgG 절단 활성을 모니터링하기 위해, 웨스턴 블롯 분석 전에, 샘플을 37℃에서 16 시간 동안 PBS 내의 1% 돼지 혈장과 함께 인큐베이션하였다.
IgG 프로테아제의 촉매 타입(catalytic type)을 확인하기 위해, 0.1-5 mM AEBSF (Sigma), 0.1-5 mM EDTA, 50-250 μM E-64 (Sigma), 0.1-5 mM Z-LVG-CHN2 (Bachem), 0.1-5 mM 아이오도아세트아마이드 (Sigma) 또는 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (Roche)의 1/200에서 1/50 희석액의 존재하에서 IgG 분해 반응을 수행하였다.
PBS 내의 0.5 mg/ml 돼지 IgG (Sigma) 또는 다른 종(인간, 염소, 젖소, 말 및 마우스; 모두 Sigma)의 것을 상술한 S. suis IgdE 컨스트럭트를 갖는 유도된 대장균의 조 추출물 또는 10 nM 정제 rIgdE와 함께 37℃에서 16 시간 동안 인큐베이션한 다음, 환원 조건 또는 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 실시하였다.
돼지의 체액에서 내인성 IgG의 분해를 분석하기 위해 하기와 같이 희석하여 사용하였다: 심장 낭액, 복강액 및 관절액의 경우 1/10; 혈청의 경우 1/50; 뇌척수액은 희석하지 않음. 뇌척수 및 관절액은 S. suis 감염에 의해 발생한 섬유 혈성 화농성 뇌막염 및 활액막염을 가진 새끼 돼지 또는 병변이 없는 새끼 돼지로부터 유래된 것이다. 그렇지 않으면 IgG 분해 분석을 정제 rIgdE로 상기 상술한 바와 같이 수행하고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다. 실험은 최소 3 회 반복되었으며 대표적인 분석 결과를 표시하였다.
정량적 IgG 분해 분석
시간 경과 분석과 저해제 프로파일을 위해, 0.25 mg/ml 돼지 IgG 및 2 μM 정제된 IgdE△C를 억제되지 않은 PBS 또는 2.5 μM 또는 250 μM AEBSF (Sigma), EDTA, E-64 (Sigma), 아이오도아세트아마이드 (Sigma), 또는 Z-LVG-CHN2 (Bachem)의 존재하에서, IgG 분해 반응을 37℃에서 실시하였다. 250 μM Z-LVG-CHN2 내의 DMSO 함량에 상응하는 0.275%의 DMSO(Sigma)를 용매 대조군으로 사용하였다. 반응을 연속적으로 샘플링하고 환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 실시하였다. Coomassie Fluor ™ Orange Protein Gel Stain (Invitrogen)으로 염색하여 단백질 밴드를 검출하였다. IgG 분해 산물은 LAS4000 이미징 시스템 (Fujifilm)으로 이미징하여 농도 측정을 하고 Image Studio Version 3.1 (LI-COR Biosciences) 소프트웨어로 분석하였다. 억제되지 않은 밤새 절단은 시간 경과 실험을 위해 100 % 상대 절단으로 설정되었다. 억제제 프로파일에 대하여, 절단 산물의 초기 증가(0-25 % 상대 절단)로부터 초기 절단율을 계산하고, 억제되지 않은 반응의 초기 절단율을 100% 상대 활성으로 설정하였다. 실험은 적어도 3 회 수행되었다. 통계 분석은 GraphPad Prism Version 5.0을 사용하여 수행되었다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석
SDS-PAGE 용 샘플을 환원 또는 비-환원 샘플 완충액으로 준비하고 95℃에서 5 분간 가열하였다. 12% SDS-PAGE는 쿠마시 블루 (Sigma), Coomassie Fluor ™ Orange Protein Gel Stain (Invitrogen)로 염색하거나 또는 웨스턴 블롯 분석을 위해 Hybond-P PVDF 멤브레인 (GE Healthcare)으로 블로팅하였다. 멤브레인을 0.1% PBS-Tween 내의 5% 건조 분유로 블로킹한 다음, 호올스-래디쉬 퍼옥시다아제 접합 항체와 함께 인큐베이션하였다. 염소 항-돼지 IgG-HRP (Thermo Scientific) 및 염소 항-돼지 IgM-HRP (Thermo Scientific)를 1:25000으로 희석하고 염소 항-돼지 IgA-HRP (Thermo Scientific)를 1:12,500으로 희석하였다. 멤브레인은 제조사의 지시에 따라 Amersham ECL Select Western blotting 검출 시약 (GE Healthcare)으로 현상하기 전에 0.1% PBS-Tween으로 철저히 세척하고 LAS4000 이미징 시스템 (Fujifilm)으로 촬영하였다.
N-말단 에드만 시퀀싱(N-terminal Edman sequencing)
S. suis IgdE 처리된 돼지 IgG를 상술한 바와 같이 SDS-PAGE로 분리하고 Hybond-P PVDF 멤브레인 (GE Healthcare)으로 50 mM 소듐-보레이트(sodium-borate) /20% MetOH를 사용하여 반-건조 블럿팅으로 트랜스퍼하였다. 멤브레인을 Ponceau S (Sigma)로 염색하고, 건조시킨 후 ~ 32 kDa 분해 산물을 단단히 잘라냈다. 분해 산물의 N- 말단 에드만 시퀀싱은 Proteome Factory (Berlin, Germany)로 수행하고 서열 W/C PICPACE를 수득하였다. 첫번째 위치 서열 결정은 강한 트립토판 피크 및 시스테인 위치에서 작은 피크를 야기할 가능성이 있는 오염으로 인해 복잡했다. 그러나, BLAST에서 상동성(homology)은 상응하는 위치에 시스테인 잔기를 함유하는 돼지 IgG 힌지 영역 서열로 표시된 명백한 서열을 탐색한다. 시스테인은 시스테인이 변형된 프로피온아미드의 신호에 의해 동정되었으나, 시스테인은 보정 표준의 일부가 아니다.
ELISA
S. suis IgdE에 대한 IgG 역가의 검출을 위하여 Maxisorb® 플레이트 (Nunc)를 탄산염 완충액을 사용하여 0.6μg rIgdE 단백질로 코팅하였다. 코팅 후 플레이트를 PBS + 0.1% Tween 20 (PBST)로 3 회 세척하고 PBS 내의 5% 분유로 37℃에서 2 시간 동안 블록킹하였다. 모든 샘플과 대조군은 1:100의 희석으로 시작하여 PBST에서 이중으로 일련의 4(양성 기준 혈청: 6)개로 2배씩 희석하여 측정되었다. S. suis IgdE 특이 IgG 항체의 검출을 위해, 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 1:10000으로 희석한 염소 항-돼지 IgG-HRP (1 mg/ml, Bethyl, A100-105P)와 함께 인큐베이션하였다. 37℃의 모든 인큐베이션 단계는 37℃에서 진탕기에서 수행하고 각 인큐베이션 단계 후 플레이트를 PBST로 세척하였다. 플레이트는 기질로서 2,2-아지노-디-[3-에틸벤지티아졸린 설포네이트](ABTS) 및 0.003% H2O2를 사용하여 현상되었다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기 (Synergy H1, BioTek Instruments GmbH)에서 405 nm을 측정하였다. 배경 농도를 제거한 후 log 선형 회귀 분석을 통해 광학 밀도를 항체 농도로 전환시켰다. 각 샘플에 대한 ELISA 단위는 두 일련의 4 가지 희석액 각각에 대해 계산된 단위의 평균으로 정의되었다. S. suis 균주 10의 실험 감염 20 일 후에 수득된 혈청 샘플로부터 수득된 ELISA 값은 100 ELISA 단위로 임의로 설정한 반면, 초유를 먹이지 않은 새끼 돼지로부터 유래된 혈청 샘플의 ELISA 값을 음성 대조군으로 사용하였다.
결과
S. suis는 IgG-절단 효소를 분비한다.
S. suis 균주 10의 농축 상등액 및 동종의(isogenic) IgM 프로테아제 돌연변이 10△ide Ssuis 을 추정 기질로서 2% 돼지 혈장과 함께 인큐베이션하여 S. suis 균주의 세포외 효소의 단백질 분해 활성을 분석하였다. 인큐베이션 3 시간 후, 반응물을 환원된 SDS-PAGE로 분석하였다. 흥미롭게도, 야생형 균주 10 균주 및 동종의 IgM 프로테아제 돌연변이 10△ide Ssuis 모두의 박테리아 배양 상등액으로부터 얻은 혈장 단백질 밴드 패턴은 약 32kDa의 부가적인 단백질 밴드를 함유하며, 이는 돼지 혈장 대조군에서 나타나지 않았다(도 1A). 32 kDa 밴드를 잘라내어, MALDI-TOF 질량 분광법을 실시하고, S. suis에서 IgG 단백질 분해 활성의 존재를 나타내는 IgG 분해 산물로서 동정하였다. 이 발견을 확인하고 단백질 분해 활성은 S. suis의 분비된 효소에 기인한다는 것을 유지하기 위해, 암모늄 설페이트(0 내지 80% 포화)를 증가시켜 박테리아 배양물의 배양 상층액을 분획하였다. 분획을 IgG 절단 활성에 대해 돼지 혈장으로 시험하고, IgG 분해 단편을 특정 폴리클로날 항-돼지 IgG 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 검출하였다. 20 내지 60%의 암모늄 설페이트 포화도의 침전물은 IgG-절단 활성을 명백히 나타냈고, 이는 관찰된 IgG 단백질 분해 활성이 최근에 기술된 IgM 프로테아제 IdeSsuis (Seele supra)와 별개이며 S. suis의 배양 상등액에서 분비된 단백질로 인한 것임을 입증한다(도 1b).
임상 관련 혈청형 2의 여러 균주를 포함한 15 종의 상이한 S. suis 균주의 배양 상등액; 혈청형 2인 2 개의 인간 분리체, 및 추가적인 혈청형을 나타내는 균주 세트(표 2)를 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 모든 균주에 대해, 약 32 kDa의 IgG 절단 산물은 웨스턴 블랏 분석(도 1C)으로 검출될 수 있으며, 이는 IgG 분해 활성이 상이한 S. suis 균주간에 보존됨을 나타낸다.
S. suis의 신규한 프로테아제인 IgdE의 정제 및 서열 특성
정제 시험 이전에, 프로테아제가 풍부한 암모늄 설페이트 침전물을 클래스 특이적 프로테아제 억제제의 존재 하에서 IgG 절단 활성에 대해 시험하여 추정 IgG 프로테아제를 예비 분류하였다. 메탈로 프로테아제 억제제 EDTA는 IgG 절단에 영향을 미치지 않은 반면, 세린 프로테아제 억제제 AEBSF는 IgG 절단과 함께 적당히 작용하였다. 그러나, 시스테인 프로테아제 억제제 E-64, Z-LVG-CHN2 및 아이오도아세트아미드는 모두 IgG 분해 활성을 억제하는 것으로 나타났다(도 8). 따라서, 활성 위치 시스테인 잔기가 AEBSF (24, 25)에 의해 억제될 수 있기 때문에, 전체 억제 인자 프로파일은 IgG 절단 프로테아제가 시스테인 프로테아제 계열에 속한다는 가정과 가장 일치한다. 정제를 위해 균주 10의 동종의 돌연변이인 S. suis 10M7 균주를 사용하여 MRP(muraminidase-release protein)이 매우 풍부한 배양 상등액에 의한 저발현 단백질의 마스킹을 피하였다. 박테리아 배양 상등액을 암모늄 설페이트 침전으로 분획하고 침전물은 음이온-교환 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피(SEC)를 실시하였다다. IgG 절단 활성을 나타내는 샘플을 SDS-PAGE를 환원시켜 분리하였다. 단백질 밴드는 MALDI-TOF 질량 분석 및 pBLAST 알고리즘을 사용한 NCBI 데이터베이스에 대한 유사성 검색에 의해 확인되었다. IgG 단백질 분해 효소의 초기 특성 분석에서 프로테아제가 분비된 시스테인 프로테아제일 가능성이 높은 것으로 밝혀졌기 때문에, 동정된 단백질의 서열은 i) 단백질 핵내 시스테인 잔기의 존재 및 ii) 분비 시그널 펩타이드의 존재에 대해 스크리링하였다. 이미 IgM에 특이적인 것으로 밝혀진 IdeS suis 외에도 동정된 단백질 2 개(10 개 중)에는 추정 촉매성 시스테인 잔기를 함유하고 있었으나, 유일하게 하나에만 SignalP 알고리즘에 의해 예측된 시그널 펩타이드 서열 및 핵심 시스테인 잔기 모두가 포함되어 있었다. 이 단백질은 S. suis 혈청형 2 균주 (www.sanger.ac.uk)의 게놈 서열 데이터베이스에서 추정 수송된 단백질로서 설명을 추가하고 P1/7 균주에서 SSU_RS08150으로 명명하였다. SSU_RS08150은 아미노산 188 내지 265 내의 단백질의 N-말단 절반에 위치하는 추정 트랜스글루타미나아제(transglutaminase) 핵심 서열 모티프를 갖는 1121 아미노산 단백질 (GenBank 등록 번호 WP_012027720)을 코딩한다. 막 단백질 토폴로지의 TOPCONS 일치 예측은 약 아미노산 1059-1080 사이의 C-말단에 있는 추정 트랜스멤브레인 헬릭스인 것으로 확인되었다. (시그널 서열이 없는) 예측된 118kDa 크기는 SDS-PAGE 상의 낮은 pI(pI 4.66)를 갖는 단백질의 약간 더 느린 이동에 기인하여 SDS-PAGE 이후의 초기 정제된 단백질 밴드의 추정된 크기보다 약간 작다(데이터는 나타내지 않음). 전장 추정 단백질 서열을 pBLAST 알고리즘을 사용하는 NCBI 데이터베이스에 대한 유사성 검색에 사용하였다. 이 연구는 MEROPS 펩티다제 데이터베이스 (Rawlings et al. 2014. Nucleic Acids Res. 42, 503-509)의 임의의 공지된 프로테아제와 전장 단백질의 유사성을 나타내지 않았고; 임의의 진핵 단백질과 유사성을 나타내지 않았으나, 트랜스글루타미나아제 핵심 모티프를 함유하는 프로테아제의 N-말단 절반과 스트렙토코커스 포르시너스(Streptococcus porcinus) 및 스트렙토코커스 슈도포르시너스(Streptococcus pseudoporcinus)의 가상 단백질(480-492 아미노산 잔기의 영역에서 54% 동일성) 및 스트렙토코커스 에쿠이(Streptococcus equi)의 가상 단백질 (264 내지 406 아미노산 잔기의 영역에서 40%의 동일성)이 일부 유사성을 나타냈다. 또한, 프로테아제의 N-말단 부분은 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae) 및 스트렙토코커스 메리오니스(Streptococcus merionis)의 가상 단백질(약 32% 동일성)과 일부 유사성을 나타낸다. 추정 단백질은 일부 데이터베이스에서 리보뉴클레아제 또는 리보뉴클레아제 G 및 E로 나타났으나, 실험적으로 확인된 기능이 없고 돼지 IgG에 대한 효소 활성을 기반으로 하기 때문에, 상기 단백질을 Streptococcus suis의 면역글로불린 G 분해 효소(Immunoglobulin G degrading enzyme)에 대한 IgdE로 표시되었다.
IgdE는 신규한 시스테인 프로테아제이다
S. suis IgdE 서열은 위치 302에서 하나의 시스테인 잔기의 존재를 나타내며, 이는 억제제 프로파일로 인해 촉매성 부위 시스테인을 나타내는 것으로 추정된다. S. suis IgdE의 in silico 3D-모델링 (http://swissmodel.expasy.org)은 알려진 트랜스글루타미나제 도메인 구조를 주형으로 사용하여, 시스테인 302, 히스티딘 333 및 아스파르트산 348로 이루어진 잠재적 촉매성 트리아드를 함유한 단백질의 N-말단 부분에 추정 활성 부위 절단(cleft)이 있음을 밝혔다.
S. suis IgdE의 추정 프로테아제 도메인 및 촉매 부위 잔기의 동정을 위해 여러 재조합 IgdE 컨스트럭트를 생성하였다(도 2A). 3 개의 모든 추정 촉매 부위 잔기는 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 생성된 돌연변이 단백질인 IgdEC302S, IgdEH333A 및 IgdED348A로 각각 대체되었다. 또한, S. suis IgdE의 C-말단 부분이 결여 된 컨스트럭트는 XhoI 제한 효소 절단에 의해 생성되었다. 이러한 컨스트럭트들을 발현하는 대장균의 조 용해성 분획(Crude soluble fractions)을 돼지 IgG로 함께 인큐베이션하고 SDS-PAGE로 분석하였다. 재조합 S. suis IgdE의 존재하에서, 32kDa IgG-유래 밴드가 나타났고, 이는 재조합 단백질이 IgG 단백질 분해 활성을 함유함을 나타낸다(도 2B, 레인 3). IgG 절단 활성은 아미노산 471 내지 1121이 결실된 재조합 단백질이 IgG 절단 활성에 충분하기 때문에 단백질의 N-말단 부분에 할당될 수 있었다(도 2B, 레인 7). 돌연변이 단백질(도 .2B, 레인 4-6)과 함께 인큐베이션된 돼지 IgG의 SDS-PAGE 분석에서, rIgdEC302S 또는 rIgdEH333A도 gG 절단 활성을 나타내지 않는 반면, rIgdED348A는 다소 감소된 IgG 절단 활성을 나타내었다. 전체적으로, 이러한 데이터는 이들 3 개의 잔기가 S. suis IgdE의 촉매 부위의 일부임을 강하게 나타낸다.
억제제 스크린은 정제된 재조합 IgdE△C 및 계열 특이적 프로테아제 억제제로 반복하였다. 전통적인 트랜스글루타미나제 효소와 달리, EDTA의 존재하에서 프로테아제는 완전히 활성이기 때문에 IgdE는 칼슘 의존성이 아닌 반면, 시스테인 계열 특이 억제제인 아이도아세프아미드 및 Z-LVG-CHN2는 절단 산물이 전혀 없으므로 IgG 단백질 분해 활성을 효과적으로 방해 할 수 있어 18 시간 인큐베이션한 후에도.125배 몰 과량의 억제제에서 검출될 수 있었다(도 3). 세린 프로테아제 억제제 AEBSF는 IgdE△C를 적당히 125 배 몰 과량으로 저해하였다. 흥미롭게도, E-64는 이 실험 조건에서 정제된 IgdE△C를 억제하지 않았고, 이는 IdeS 및 IdeSsuis와 같은 다른 스트렙토코커스 Ig-프로테아제에 대해 기술된 것과 유사한 좁은 활성 부위로 인한 것일 수 있다. 그러나, 매우 높은 농도에서, E-64는 S. suis 배양 상등액의 IgG 절단 활성을 방해하였다(도 8). 시스타틴 C의 억제 반응 부위에 구조적으로 기초한시스테인 프로테아제 특이적 억제제인 Z-LVG-CHN2(Green and Shaw. 1981. J. Biol. Chem. 256, 1923-1928)는 125 배 몰 과량으로 IgdE△C를 완전히 저해하였다. IgdEC302S 및 IgdEH333A 돌연변이의 효소 활성의 결핍뿐만 아니라 아이오도아세트 아미드 및 Z-LVG-CHN2에 의한 효소 활성의 억제는 IgdE가 시스테인 프로테아제 계통의 신규하고 고유한 구성원임을 시사한다.
S. suis IgdE는 힌지 영역에서 높은 특이성으로 돼지 IgG를 절단한다
돼지 IgG 분해 산물을 환원 및 비-환원 SDS-PAGE로 분석하였다. 비-환원 조건하에서 관찰된 밴드 패턴은 상호연결되는 디설파이드 결합의 N-말단의 중쇄의 힌지 영역에 위치한 절단 부위와 일치한다(도 4A). 환원 조건에서 얻어진 IgG 분해 산물(도 4B)에 N-말단 에드만 시퀀싱을 실시하고, 얻어진 서열 C*PICPACE은 돼지 IgG2ab, IgG4ab 및 IgG6ab 아형의 힌지 영역 서열에서 발견되었다. 공통 모티프로서 CPICPGCE를 갖는 유사한 서열이 IgG1ab 및 IgG5ab 아형의 힌지 영역에 존재하는 반면, IgG3은 힌지 영역에서 CPxxxxC 서열을 나타냈다(표 3).
돼지 IgG 분해 산물의 N-말단 에드만 시퀀싱
아형 힌지(IgG1a의 aa 99-121에 해당
IgG1a GTKTKPP↓ C PI C PGCEVAG
IgG1b GIHQPQT↓ C PI C PGCEVAG
IgG2a GTKTKPP↓ C PI C PACESPG
IgG2b GTKTKPP↓ C PI C PACEAPG
IgG3 DIEPPTPI↓ C PEICSCPAAEVLGA
IgG4a GTKTKPP↓ C PI C PACEGPG
IgG4b GIHQPQT↓ C PI C PACEGPA
IgG5a GRP↓ C PI C PGCEVAG
IgG5b GKKTKPR↓ C PI C PGCEVAG
IgG6a GRP↓ C PI C PACEGPG
IgG6b GRP↓ C PI C PACEGNG
모든 돼지 IgG 아형의 힌지 부위 서열. S-S 공유 결합 (밑줄) 및 잠재적 절단 부위(↓)에 관여한다고 여겨지는 시스테인 잔기를 표에 표시하였다.
확인된 절단 부위 이외에, 환원 및 비-환원 SDS-PAGE에서 관찰된 절단 패턴은 제2 단계 가수분해가 제2 중쇄를 절단하기 전에 하나의 IgG 중쇄가 동종-이합체 다이설파이드 결합의 N-말단에서만 가수분해되는 절단 반응과 일치한다(도 4C). 흥미롭게도, IgG 힌지 영역과 유사한 서열은 돼지 IgA 및 IgM의 중쇄 서열에서 발견 할 수 없었다. 따라서 S. suis IgdE 특이성은 돼지 IgG, IgM 및 IgA에 대한 특이 적 항체를 사용하여 추가로 조사되었다. 재조합 S. suis IgdE로 인큐베이션한 돼지 혈장을 웨스턴 블롯으로 분석하였고, 이는 프로테아제가 돼지 혈장에서 IgG를 표적으로 하나 IgA 또는 IgM을 절단하지 않음을 입증하였다(도 5A).
프로테아제의 숙주 특이성은 정제된 S. suis IgdE를 인간, 염소, 소, 말 및 마우스의 IgG 제제와 함께 인큐베이션하여 조사하였다(도 5B). 흥미롭게도 돼지 IgG만이 이러한 신규 IgG 프로테아제의 기질로 밝혀졌다. 따라서, IgdE는 명백한 종 특이성을 나타내며 돼지 IgG만을 표적으로 한다.
생체외에서 S. suis IgdE의 특이성을 추가로 평가하기 위해, 건강하거나 또는 질환이 있는 새끼 돼지의 체액을 사용하였다. 심낭, 복강 및 관절뿐만 아니라 뇌척수액 및 혈청으로부터의 유체를 재조합 S. suis IgdE로 처리하고 SDS-PAGE(도 6A) 및 돼지 IgG 특이적 항체를 사용하는 웨스턴 블롯으로 분석하였다(도 6B). 심낭, 복강 및 혈청 샘플에서 rIgdE의 존재하에 진단 IgG 절단 산물의 출현을 제외하고는, 단백질 밴드 패턴에서 명백한 변화가 관찰되지 않았다. 또한, 건강한 돼지의 관절액 및 뇌척수액에는 IgG, 즉 절단 산물이 존재하지 않았다. 대조적으로, 임상 징후, 예컨대, 수막염(meningitis) 및 활액막염(synovialitis)으로 고통받는 새끼 돼지로부터 수득된 모든 체액은 염증 반응의 결과로 IgG를 함유하고 또 한편 진단 32kDa 단일 밴드를 rIgdE로 처리된 모든 샘플에서 관찰할 수 있었다(도 6). S. suis IgdE의 특이성은 프로테아제와 돼지 체액의 인큐베이션 후 SDS-PAGE에서 추가적인 분해 산물이 확인되지 않았다는 관찰에 의해 강조된다. 따라서, 추가적인 기질이 존재한다는 것을 배제할 수는 없으나, 이러한 결과는 S. suis IgdE가 이전에 기술된 S. suis의 IgA 및 IgM 분해 프로테아제를 보완하는 고특이적 IgG 프로테아제임을 나타낸다(Seele supra; Zhang et al. Vet.Microbiol.140, 171-175).
IgdE는 S. suis에 의해 발현되는 유일한 IgG 절단 효소이다
균주 10 및 IgM 절단 활성이 결핍된 균주 10△ide Ssuis 를 사용하여 S. suis igdE 인-프레임(in-frame) 결실 돌연변이를 제작하였다. 야생형 균주 10으로부터의 배양 상등액에서 IgG 및 IgM 절단 활성을 특정 폴리클로날 항-돼지 IgG 또는 IgM 항체를 사용하는 웨스턴 블롯으로 결정하였다(도 7). 예상한 바와 같이, 야생형 균주 10은 IgG 및 IgM 절단 활성을 나타내었으나(도 7A 및 B, 레인 3), 균등한 돌연변이 균주 10△igdE의 상등액은 IgM 절단 활성만을 함유하고 IgG 또는 IgM 분해는 이중 돌연변이 균주 10△ide Ssuis △igdE 의 상등액에서 검출되지 않았다(도 7A 및 B, 레인 5). 따라서, S. suis IgdE는 돼지 IgG를 절단하는데 필요하고 충분하며, 이러한 실험 조건 하에서 다른 IgG 절단 활성은 방출되지 않음을 나타낸다.
S. suis IgdE의 생체 내 발현
이유식 중인 새끼 돼지는 초유 유래 모체 항체를 통해 박테리아 감염으로부터 초기에 보호된다. 모체 항체의 수준은 시간이 지남에 따라 감소하고 활성 IgG 매개 면역은 2 주 후 가장 초기에 발생한다. 따라서, 초유를 먹지 않은 돼지의 혈청(SCDP, serum of colostrum-deprived piglets)에서 IgG 항체의 수준은 ELISA 측정에서 배경 값을 초과하지 않는다. 항원으로 rIgdE로 ELISA를 수행하여 이러한 IgG 프로테아제에 대한 직접적인 항체의 존재시 새끼 돼지로부터의 상이한 혈청 샘플을 조사하였다. S. suis 균주 10의 실험 감염 20 일 후에 추출한 혈청 샘플은 rIgdE(100 ELISA 유닛로 정의됨, 재료 및 방법 참조)에 대해 매우 높은 역가를 함유하였다. 음성 대조군으로 사용된 SCDP와는 대조적으로, S. suis IgdE에 대한 특이 항체의 상당량은 5-6 주령의 전통적인 이유식 중인 새끼 돼지 9 마리 중 7 마리에서 검출 가능하였다(ELISA 유닛은 36에서 92까지). 이러한 결과는 S. suis IgdE가 생체 내 S. suis에 의해 발현되는 면역원성 항원임을 입증하였다.
실시예 2. 다른 스트렙토코커스 종으로부터의 IgdE의 동정
이용가능한 모든 스트렙토코커스 게놈의 코딩 서열을 NCBI [ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Bacteria/ Aug-21-2015] 및 PATRIC [ftp : //ftp.patricbrc. org / patric2 / Aug 25-2015]으로부터 다운로드하였다.
IgdE에 대한 기준 시퀀스로 RefSeq 시퀀스 WP_014636499.1을 사용하였다. S. suis로부터의 서열에서만 존재하는 N-말단 시그널 펩타이드 및 C-말단 영역이 제거되어, "IgdE_도메인(domain)"이라 불리는 아미노산 38-520이 남았다.
IgdE_도메인은 NCBI 서열뿐만 아니라 PATRIC 서열에 대해 blastp 검색 (모든 가능한 프로테아제를 유지하기 위해 E-값 컷오프 1)에서 쿼리 서열로 사용되었다. 획득한 히트를 동일한 매개 변수를 사용하여 동일한 데이터베이스에 대한 쿼리 서열로 차례로 사용되었다. 매치된 서열 목록으로부터, 본 발명자들은 두 번째 라운드에서 IgdE가 쿼리로 사용되었을 때 첫 번째 라운드에서 일치하는 영역과 중복되는 매치를 갖는 것을 선택하였다. 촉매 위치에서 'C'를 포함하지 않는 서열은 더 이상 고려되지 않았으며, 동일한 서열의 경우 단 하나의 사본만 유지하였다.
발견된 서열의 대부분은 S-층 단백질로서 또는 S-층 상동성 도메인 W를 함유하는 것으로 주석 처리된다. 이들은 종종 동일한 게놈에서 2 개 이상의 카피로 존재하며, 원래 IgdE 서열에서 발견된 AxC 모티프 대신에 촉매 위치에 SxC 또는 GxC 모티프를 갖는다. Pfam에 대해 모든 서열을 검색할 때, 이러한 서열들은 Pfam 모델 'Transglut_core'에 잘 맞는다. IgdE 계열의 구성원이 아닌 이들 서열을 제거하기 위해 E-값이 최대 1e-6인 Transglut_core 모델과 매칭하는 모든 서열뿐만 아니라 AxC 모티프가 없는 서열도 제거하였다. 나머지 서열들은 양 끝에서 IgdE_도메인 서열과 매칭하는 부분만 함유되도록 잘라냈다. 이러한 동일한 "도메인" 서열을 초래하는 경우에는 오직 하나의 카피만이 유지되었다.
IgdE 계열에 속하는 프로테아제는 S. porcinus, S. agalactiae, S. equi 및 S. pseudoporcinus에서 동정되었다. 상기 프로테아제를 클로닝, 발현 및 특성 분석하였다.
실시예 3. S. porcinus 로부터 분리된 IgdE의 특성
· 32 kDa 분해 산물을 야기하는 재조합 IgdEporcinus 절단 정제 폴리크로날 돼지 IgG를 환원 SDS-PAGE로 검출하였다.
· 재조합 IgdEporcinus를 소, 말, 인간, 염소 또는 마우스의 정제된 폴리크로날 IgG와 함께 인큐베이션했을 때 분해 산물이 관찰되지 않았다.
· 재조합 IgdEporcinus는 돼지 혈청에서 IgG를 절단하나, 항-IgG, IgM 및 IgA 웨스턴 블롯 분석으로 IgM 또는 IgA는 검출되지 않았다.
· 돼지 IgG의 32 kDa 분해 산물의 N-말단 서열은 N-말단 에드만 시퀀싱에 의해 나타난 바와 같이 CPICPACE이며, 이 단백질은 돼지 IgG 내에서 S. suis로부터의 IgdE와 동일한 절단 부위를 갖는다는 것을 나타낸다.
· 재조합 IgdEporcinus는 쉽게 과-발현되고 고순도로 정제되었다.
· 시험한 모든 S. porcinus 균주는 재조합 단백질로서 이들의 배양 상등액에서 동일한 돼지 IgG 절단 표현형을 보였다.
실시예 4. S. agalactiae 로부터 분리된 IgdE의 특성
· 32 kDa 분해 산물을 야기하는 재조합 IgdE agalactiae 절단 정제 폴리크로날 인간 IgG를 환원 SDS-PAGE로 검출하였다(도 10).
· 32 kDa 분해 산물을 야기하는 재조합 IgdE agalactiae 절단 정제 폴리크로날 인간 IgG1 카파 및 IgG1 람다를 환원 SDS-PAGE로 검출하였다(도 10D).
· 재조합 IgdE agalactiae 를 모노크로날 인간 IgG2, IgG3 또는 IgG4와 함께 인큐베이션했을 때 분해 산물은 관찰되지 않았다(도 10D).
· 재조합 IgdE agalactiae 를 소, 말, 돼지, 염소 및 마우스의 정제된 폴리크로날IgG와 함께 인큐베이션했을 때 분해 산물이 관찰되지 않았다(도 10A).
· 재조합 IgdE agalactiae 는 인간 혈청에서 IgG를 절단하나, 항-IgG, IgM 및 IgA 웨스턴 블롯 분석으로 IgM 또는 IgA는 검출되지 않았다
· 재조합 IgdE agalactiae 는 인간 혈청 IgG1을 완벽한 단일 절단된 IgG1로 분해한다(도 11).
· 인간 IgG의 32 kDa 분해 산물의 N-말단 서열은 N-말단 에드만 시퀀싱에 의해 나타난 바와 같이 H(또는 G 또는 S) TCPPCPAPE이며, 이 단백질은 중쇄 간의 H-H 공유 결합에 관여하는 것으로 생각되는 시스테인 잔기의 힌지 영역 N-말단의 IgG1에서 파파인과 동일한 절단 부위를 갖는다는 것을 나타낸다.
· 재조합 IgdE agalactiae 는 쉽게 과-발현되고 정제되었다.
실시예 5. S. equi 로부터 분리된 IgdE의 특성
· 32 kDa 분해 산물을 야기하는 재조합 IgdEequi 절단 정제 폴리크로날 말 IgG를 발현하는 대장균의 용해물을 환원 SDS-PAGE로 검출하였다.
· 재조합 IgdEequi를 소, 인간, 돼지, 염소, 랫트, 토끼 및 마우스의 정제된 폴리크로날IgG와 함께 인큐베이션했을 때 분해 산물이 관찰되지 않았다.
· 재조합 IgdEequi는 말 혈청에서 IgG를 절단하나, 항-IgG, IgM 및 IgA 웨스턴 블롯 분석으로 IgM 또는 IgA는 검출되지 않았다
· 32 kDa 분해 산물을 야기하는 재조합 IgdEequi 절단 정제 모노크로날 재조합 말 IgG7을 환원 SDS-PAGE로 검출하였다(도 12).
· 재조합 IgdEequi를 재조합 모노클로날 말 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5 또는 IgG6와 함께 인큐베이션했을 때 분해 산물이 관찰되지 않았다.
· 말 IgG의 32 kDa 분해 산물의 N-말단 서열은 N-말단 에드만 시퀀싱에 의해 나타난 바와 같이 (G)PTCPECXGV이다. 이 서열은 말 IgG7의 힌지 영역에서 발견된다.
실시예 6. S. pseudoporcinus 로부터 분리된 IgdE의 특성
· S. pseudoporcinus 배양 상층액은 돼지 IgG 절단 표현형을 가지고 있었으나, 인간 IgG 절단 표현형은 가지고 있지 않았다.
· 32 kDa 분해 산물을 야기하는 재조합 IgdEpseudoporcinus 절단 정제 폴리클로날 인간 및 돼지 IgG를 환원 SDS-PAGE로 검출하였다
· 재조합 IgdEpseudoporcinus를 소, 말, 염소, 마우스 또는 래트의 정제된 폴리크로날 IgG와 함께 인큐베이션했을 때 분해 산물이 관찰되지 않았다.
· 재조합 IgdEpseudoporcinus는 인간 및 돼지 혈청에서 IgG를 절단하나, 돼지 혈청에서 IgM 또는 IgA는 항-IgG, IgM 및 IgA 웨스턴 블롯 분석으로 검출되지 않았다
· 돼지 IgG의 32 kDa 분해 산물의 N-말단 서열은 N-말단 에드만 시퀀싱에 의해 나타난 바와 같이 CPICPACE이며, 이 단백질은 돼지 IgG 내에서 IgdE와 동일한 절단 부위를 갖는다는 것을 나타낸다.
· 재조합 IgdEpseudoporcinus는 대장균 BL21 pLysS에서 쉽게 과-발현되었다.
또한, 본 명세서에 기재된 발명은 하기 양태에 관한 것이다:
1. 다음을 포함하며 대상에서 면역 반응을 생성시키는데 사용하기 위한 폴리펩타이드:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열;
(b) 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 1의 변이체;
(c) 스트렙토코커스, 바람직하게는 S. suis에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열번호 1의 단편, 서열번호 1의 변이체, 또는 서열번호 1의 변이체의 단편;
(d) 서열번호 3의 아미노산 서열;
(e) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 변이체;
(f) 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　agalactiae에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열번호 3의 단편, 서열번호 3의 변이체, 또는 서열번호 3의 변이체의 단편;
(g) 서열번호 5의 아미노산 서열;
(h) 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 5의 변이체;
(i) 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　porcinus에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열번호 5의 단편, 서열번호 5의 변이체, 또는 서열번호 5의 변이체의 단편;
(j) 서열번호 7의 아미노산 서열;
(k) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 7의 변이체;
(l) 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　equi에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열번호 7의 단편, 서열번호 7의 변이체, 또는 서열번호 7의 변이체의 단편;
(m) 서열번호 9의 아미노산 서열;
(n) 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 9의 변이체;
(o) 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　pseudoporcinus에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열번호 9의 단편, 서열번호 9의 변이체, 또는 서열번호 9의 변이체의 단편.
2. 대상에서 면역 반응을 생성시키는 데 사용하기 위한, 양태 1에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
3. 다음을 포함하며 대상에서 면역 반응을 생성시키는데 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드:
(a) 서열번호 2 또는 이의 상보적인 서열;
(b) (a)에 정의된 서열에 대한 유전 암호의 결과로서 디제너레이트(degenerate)된 서열;
(c) 엄격한 조건 하에서 (a) 또는 (b)에 정의된 서열과 혼성화하는 서열;
(d) (a) 또는 (b)에 정의된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열;
(e) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하고/하거나 스트렙토코커스, 바람직하게는 S. suis에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열 (a), (b), (c) 또는 (d) 중 어느 하나의 단편;
(f) 서열번호 4 또는 이의 상보적인 서열;
(g) (f)에 정의된 서열에 대한 유전 암호의 결과로서 디제너레이트(degenerate)된 서열;
(h) 엄격한 조건 하에서 (f) 또는 (g)에 정의된 서열과 혼성화하는 서열;
(i) (f) 또는 (g)에 정의된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열;
(j) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하고/하거나 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　agalactiae에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열 (f), (g), (h) 또는 (i)의 중 어느 하나의 단편;
(k) 서열번호 6 또는 이의 상보적인 서열;
(l) (k)에 정의된 서열에 대한 유전 암호의 결과로서 디제너레이트(degenerate)된 서열;
(m) 엄격한 조건 하에서 (k) 또는 (l)에 정의된 서열과 혼성화하는 서열;
(n) (k) 또는 (l)에 정의된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열;
(o) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하고/하거나 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　porcinus에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열 (k), (l), (m) 또는 (n) 중 어느 하나의 단편;
(p) 서열번호 8 또는 이의 상보적인 서열;
(q) (a)에 정의된 서열에 대한 유전 암호의 결과로서 디제너레이트(degenerate)된 서열;
(r) 엄격한 조건 하에서 (p) 또는 (q)에 정의된 서열과 혼성화하는 서열;
(s) (p) 또는 (q)에 정의된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열;
(t) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하고/하거나 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　equi에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열 (p), (q), (r) 또는 (s) 중 어느 하나의 단편;
(u) 서열번호 10 또는 이의 상보적인 서열;
(v) (u)에 정의된 서열에 대한 유전 암호의 결과로서 디제너레이트(degenerate)된 서열;
(w) 엄격한 조건 하에서 (u) 또는 (v)에 정의된 서열과 혼성화하는 서열;
(x) (u) 또는 (v)에 정의된 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열; 또는
(y) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하고/하거나 스트렙토코커스, 바람직하게는 S.　pseudoporcinus에 대한 면역 반응을 대상에서 생성할 수 있는 서열 (u), (v), (w) 또는 (x) 중 어느 하나의 단편.
4. 다음을 포함하며 IgG 항체에 의해 매개되는 질환 또는 증상의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 폴리펩타이드:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열;
(b) 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 1의 변이체;
(c) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 1의 단편 또는 서열번호 1의 변이체의 단편;
(d) 서열번호 3의 아미노산 서열;
(e) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 변이체;
(f) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 단편 또는 서열번호 3의 변이체의 단편;
(g) 서열번호 5의 아미노산 서열;
(h) 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 5의 변이체;
(i) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 5의 단편 또는 서열번호 5의 변이체의 단편;
(j) 서열번호 7의 아미노산 서열;
(k) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 7의 변이체; 또는
(l) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 7의 단편 또는 서열번호 7의 변이체의 단편; 또는
(m) 서열번호 9의 아미노산 서열;
(n) 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 9의 변이체;
(o) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 9의 단편 또는 서열번호 9의 변이체의 단편;
(p) 서열번호 11의 아미노산 서열;
(q) 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 11의 변이체; 또는
(r) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 11의 단편 또는 서열번호 11의 변이체의 단편.
5. IgG 항체에 의해 매개되는 질환 또는 증상의 치료 또는 예방에 사용하기위한 양태 4에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
6. 다음을 포함하는 폴리펩타이드와 IgG를 접촉시키는 단계를 포함하는, IgG의 절단을 위한 시험관 내(in vitro) 방법:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열;
(b) 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 1의 변이체;
(c) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 1의 단편 또는 서열번호 1의 변이체의 단편;
(d) 서열번호 3의 아미노산 서열;
(e) 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 변이체;
(f) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 3의 단편 또는 서열번호 3의 변이체의 단편;
(g) 서열번호 5의 아미노산 서열;
(h) 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 5의 변이체;
(i) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 5의 단편 또는 서열번호 5의 변이체의 단편;
(j) 서열번호 7의 아미노산 서열;
(k) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 7의 변이체;
(l) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 7의 단편 또는 서열번호 7의 변이체의 단편;
(m) 서열번호 9의 아미노산 서열;
(n) 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 9의 변이체;
(o) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 9의 단편 또는 서열번호 9의 변이체의 단편;
(p) 서열번호 11의 아미노산 서열;
(q) 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖고 IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 11의 변이체;
(r) IgG 분해 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 서열번호 11의 단편 또는 서열번호 11의 변이체의 단편.
7. 다음 단계를 포함하며 IgdE 폴리펩타이드의 IgG 시스테인 활성을 활성화 또는 저해하는 물질을 동정하는 방법:
a) 물질의 부재하에 IgG 시스테인 활성을 허용하는 조건 하에서 IgdE 폴리펩타이드 및 IgG를 후보 물질과 접촉시키는 단계;
b) 상기 물질의 부재하에서와 비교하여 후보 물질의 존재하에 분해된 IgG의 양을 결정하는 단계,
c) b) 단계에서 얻은 결과를 기반으로 상기 물질이 IgdE 폴리펩타이드의 IgG 시스테인 활성을 활성화 또는 저해하는지 여부를 결정하는 단계.
SEQUENCE LISTING <110> von Pawel-Rammingen, Ulrich Spoerry, Christian <120> NEW STREPTOCOCCAL PROTEASES <130> N410149WO <150> SE1630021-2 <151> 2016-02-04 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1084 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 1 Asp Glu Asn Ser His Leu Gln Ser Pro Lys Asn Thr Asn Lys Ile Glu 1 5 10 15 Val Leu Asn Trp Glu Ala Phe Ser Lys Lys Leu Lys Asp Tyr Ser Ser 20 25 30 Asp Gln Arg Gln Phe His Val Leu Lys Leu Gly Phe Glu Asn Arg Leu 35 40 45 Gly Thr Leu Ser Thr Arg Glu Glu Leu Glu Glu Phe Gly Lys Asn Asn 50 55 60 Asn Phe Leu Val Ile Asn Gly Lys Val Thr Gln Asn Ile His Asp Phe 65 70 75 80 Pro His Ile Leu Val Met Asn Lys Gly Asp Val Ile Ala His Asn Glu 85 90 95 Glu Asp Tyr His Asn Gln Met Arg Glu Leu Arg Phe Ser Gly Asn Gly 100 105 110 Asp Leu His Asn Ser Met Glu Pro Lys Arg Ile His Ala Leu Phe Lys 115 120 125 Ile Glu Leu Asp Ser Asn Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ala Ala Gly Leu 130 135 140 Gly Thr Ala Glu Asn Ser Leu Lys Asn Ile Asn Gly Met Thr Ile Tyr 145 150 155 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420 gctgcgggtc taggaactgc tgagaatagt ttgaaaaata ttaatggaat gactatttac 480 tcgcatggtc ttacagttga taataagtac tatgaggatt atagtaaata tactcataat 540 tcagttaaaa atataaacgt taccaaagag cgttttatag caaatgatga cttgattcat 600 aagttgatag agtcctcaga agctatgaag caatcaagtg aacgcgataa agttaaggca 660 tttgttcagt atgttgccaa tcatacaaca tatgattggg aagctgctaa taaggctgtt 720 caaaattatg cagacatcaa ttactactta ggatcagatt tgttcgcggt tactgaacgt 780 cagaaagcga tgtgtgtagg tttcagcact actgcggccc gtgcatttaa tatgttaggg 840 cttcctgctt atgttgttgt tgggaaaaat gcagaaggtg tcccgcatgc tacagcgcgt 900 gtttattatg ataaaaagtg gcacaccatt gacggtacag gttttattac agggaataag 960 catcagcgct cagctaaata tagcgagaaa cacttttcta ctattggtga ggatagttat 1020 gatgttgttg aggcaggaca ggagcctaag gcggagcgta actacatgat tattgatagt 1080 aattatgaga gttgggctat gaaacaaaaa acagcagatt tactgttgtt caacaaagaa 1140 aagtccttgg ttggtttgga ttatattgca tatgttgagc caacttatat aacagaaaat 1200 aagaaaaatc atttgctaga catctataaa gctttgaaac gtaaagtaga agaaacgaaa 1260 gcaacggata aagacgataa agatgataaa caagaggggt atgatcgtgt tttacaattt 1320 gtcaattctg atattgataa attgagtgct ctctccaaga ttacagaaga agaatttaaa 1380 gcactcgaaa attcaatgga tttagctcga gtgttcttgg ggcaaatgaa tgcgaaggct 1440 ggaaaagaat tttcggaagg agaaacttat caaagttatc taaagaatcg tcagaaaaat 1500 aacacaaatt ctgatgatga tagaaaccga aatgaattgc aagaaaacca agctaattct 1560 gatgaagtca gccaaaattc caaggatgct tcggctccaa gtgttaattc tgcacagcaa 1620 tctgaggagc ttgaaggaac tccttcaaca caggaaacaa tctcagctgc tccttctcaa 1680 caaacaccag cagctcctaa agcactacaa gctaaaactg agttagagga taaaacagag 1740 acttcatctt taggaaatac agagatggtt tcaccgagtt cagaaacagc tcagaataca 1800 gttgattcta aggaagaaag tgatgctaaa ttaccatatg ttgagccttc atccaaagaa 1860 tcgagtgaag cgcaggttaa tacagtttcc tctccacaag taagttctgc atccccaact 1920 tcatcagaaa ctatttctac agatacggta acagctagtc aagaaaaagc tgaatcacgg 1980 gtttctgccc cacaagtaat ttcagcatct caaacttcac cggaaactaa ttctgccgag 2040 gtggtaacaa ctagtcaaga agtagctaaa gcaccggttt ctgctccaca agtaagttct 2100 gaaatccaaa ctttatcaga aacagctcct acagaggtgg caacagaagc accggaatta 2160 agtgcacttg agagtaatcc agcacctcaa acttcattgg aaacaactcc tacagaggag 2220 gtaacagaaa caccggaacc aagtgtagtt gagagtaatt cagcatcccc aacttcaccg 2280 gaaactaatt ctgcagaggc agtaacaact agtcaagaaa tggctgaacc ttcggtttct 2340 gttccacaag taagttctga aatcccaact tcatcagaaa cagctccagc agaagtggca 2400 acagaagtat cggaagagag tagttcagca tctcaacctt caccggaaac aactcctaca 2460 gagacggtaa caactagtca agaagtagct gaagcaccgg tttctgctcc acaagtaagt 2520 tctgaaatcc caacttcacc ggaaacagct tctacagagg tggtggtagc taaacaagaa 2580 gtagctgact caccggtttc agctccacaa gtaatttctg aaatcccaac ttcatcagaa 2640 acagctccag cagaagtggc aacagaagta acagaaccaa gtgtagttgc gagtagttca 2700 gcatccccaa cttcaccgga agctaattct acagaggtgg tggtagctaa acaagaagta 2760 gctgacccac tggtttctgc tccacaaaca agttctgctt cacttacttt agaggttcct 2820 aaaaatgaac atttagacga gaaagcagat gcaactacgc caaatggagt tgaagcaaat 2880 actcatgagg cagtttctgt tccgacatca gatattcgtg ttcaagatgc tggttcagac 2940 acggtgcctc aaccttactc tttatctgcg acattgtttg aagaagcaat ttcaacagtt 3000 gagcctgtag gtgttgcaac ttcttctcaa gagagaagtg cagtagctgg caaggtgaaa 3060 gtgcctacct ctcttgaacg tagtaacaat tctgttgagg aagaaaaagt ggtcgattca 3120 aatgcaacaa ttgagaatcg agagccagag aaaaaagaga tccttacttc ggaaaatgta 3180 cttaacagct tagtaacaat ttgggtagct ttatctacta gtttcttcat gagatatttt 3240 tctcgaggaa aataa 3255 <210> 3 <211> 586 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 3 Asn Gln Asn Asn Ile Gln Glu Thr Asn Leu Val Glu Lys Asn Ser Glu 1 5 10 15 Asp Lys Phe Ile Gln Glu Leu Asn Arg Tyr Lys Thr Glu Ile Pro Asn 20 25 30 Phe Lys Gly Phe Asn Val Trp Ile Leu Gly Asp Lys Gly Tyr Tyr Lys 35 40 45 Asn Leu Ile Asn Leu Glu Glu Ile Lys Asn Ile Gln Ala Thr Leu Lys 50 55 60 Lys Glu Arg Asn Glu Glu Tyr Val Phe Val Lys Leu Asn Gly Lys Ile 65 70 75 80 Ala His Asp Thr Thr Val Phe Leu Met Asn Lys Lys His Lys Leu Leu 85 90 95 Lys Asn Ile Glu Glu Phe Lys Thr Ile Thr Gln Lys Arg Leu Thr Glu 100 105 110 Arg Gly Lys Phe Pro Tyr Asp Thr Val His Ser Thr 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130 135 140 Gly Thr Ala Glu Asn Ser Leu Lys Asn Ile Asn Gly Met Thr Ile Tyr 145 150 155 160 Ser His Gly Leu Thr Val Asp Asn Lys Tyr Tyr Glu Asp Tyr Ser Lys 165 170 175 Tyr Thr His Asn Ser Val Lys Asn Ile Asn Val Thr Lys Glu Arg Phe 180 185 190 Ile Ala Asn Asp Asp Leu Ile His Lys Leu Ile Glu Ser Ser Glu Ala 195 200 205 Met Lys Gln Ser Ser Glu Arg Asp Lys Val Lys Ala Phe Val Gln Tyr 210 215 220 Val Ala Asn His Thr Thr Tyr Asp Trp Glu Ala Ala Asn Lys Ala Val 225 230 235 240 Gln Asn Tyr Ala Asp Ile Asn Tyr Tyr Leu Gly Ser Asp Leu Phe Ala 245 250 255 Val Thr Glu Arg Gln Lys Ala Met Cys Val Gly Phe Ser Thr Thr Ala 260 265 270 Ala Arg Ala Phe Asn Met Leu Gly Leu Pro Ala Tyr Val Val Val Gly 275 280 285 Lys Asn Ala Glu Gly Val Pro His Ala Thr Ala Arg Val Tyr Tyr Asp 290 295 300 Lys Lys Trp His Thr Ile Asp Gly Thr Gly Phe Ile Thr Gly Asn Lys 305 310 315 320 His Gln Arg Ser Ala Lys Tyr Ser Glu Lys His Phe Ser Thr Ile Gly 325 330 335 Glu Asp Ser Tyr Asp Val Val Glu Ala Gly Gln Glu Pro Lys Ala Glu 340 345 350 Arg Asn Tyr Met Ile Ile Asp Ser Asn Tyr Glu Ser Trp Ala Met Lys 355 360 365 Gln Lys Thr Ala Asp Leu Leu Leu Phe Asn Lys Glu Lys Ser Leu Val 370 375 380 Gly Leu Asp Tyr Ile Ala Tyr Val Glu Pro Thr Tyr Ile Thr Glu Asn 385 390 395 400 Lys Lys Asn His Leu Leu Asp Ile Tyr Lys Ala Leu Lys Arg Lys Val 405 410 415 Glu Glu Thr Lys Ala Thr Asp Lys Asp Asp Lys Asp Asp Lys Gln Glu 420 425 430 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 12 tcactgcagt tttggggagt agg 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 13 atggatccca gttcagaacc tc 22 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 14 cgggatccag agaaaaaaga gatcc 25 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 15 aggaattcac cgttattgta gcg 23 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 16 attgtatttg gtggaggag 19 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 17 tttagcagct aagttgatac c 21 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 18 gtttccatgg atgaaaactc acatttacaa tcg 33 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 19 acgtgcggcc gcataagctt cgtac 25 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 20 aacgtcagaa agcgatgagt gtaggtttca gcact 35 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 21 cagaaggtgt cccggctgct acagcgcgtg 30 <210> 22 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer/probe <400> 22 taaaaagtgg cacaccattg ccggtacagg ttttattaca g 41

Claims (9)

  1. 다음을 포함하는 폴리펩타이드와 IgG를 접촉시키는 단계를 포함하는, IgG의 절단을 위한 시험관 내 (in vitro) 방법:
    (a) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 아미노산 서열;
    (b) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성(identity)을 갖고 IgG 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 이의 변이체; 또는
    (c) IgG 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아미노산 서열은 서열번호 3인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 방법은 폴리펩타이드를 특정 시스테인 프로테아제 활성이 발생하는 조건하에서 IgG를 함유하는 샘플과 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 IgG는 인간 IgG1인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    절단 산물의 동정 및/또는 분리를 추가적으로 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 동정 및/또는 분리는 겔 전기영동 또는 질량 분광법에 의한 분석을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 Fc 또는 Fab 단편을 생성시키는 데 이용되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 IgG를 검출하는 데 이용되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    (i) 폴리펩타이드의 IgG 특이 시스테인 프로테아제 활성을 허용하는 조건하에서, 샘플을 제1항에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; 및
    (ii) IgG 특이 절단 단편의 존재에 대해 모니터링하는 단계;를 포함하며
    상기 특이 절단 단편의 존재는 샘플에서 IgG를 나타내는 것인 방법.
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