JP5722627B2 - FCガンマ受容体−IgG複合体の解離、ならびにIgGの精製および検出のための方法およびキット - Google Patents
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Description
(a)細胞含有試料をEndoSポリペプチドと接触させるステップと、
(b)細胞を接触試料(contacted sample)から分離するステップと
を含み、それによって前記細胞集団を得る方法を提供する。
(a)前記IgG含有試料を、IgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変EndoSポリペプチドと接触させるステップと、
(b)接触試料から前記EndoSを分離するステップと
を含み、それによって単離IgGを得る方法を提供する。
(c)第1の部分試料におけるEndoSポリペプチドに結合したIgGの量および第2の部分試料における代替のIgG結合試薬に結合したIgGの量を定量するステップと、
(d)(c)で決定した結合IgGの量の両方を比較するステップと
を含み、それによってIgG含有試料のグリコシル化状態または機能的品質を評価する方法を提供する。
本発明は、細菌タンパク質EndoSおよびIdeSならびにその他のタンパク質を利用する様々な方法を提供する。タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドという用語は、本明細書では同義に使用する。本発明の特定の方法は、IgGエンドグリコシダーゼ活性を有するEndoSポリペプチドを必要とし、一方、本発明の他の方法は、前記活性を欠如した改変EndoSポリペプチドを必要とする。
この場合のEndoSポリペプチドは、S.ピオゲネスEndoS、またはIgGエンドグリコシダーゼ活性を保持するS.ピオゲネスEndoSの変異体もしくは断片であることが好ましい。変異体は、別の生物、例えば、別の細菌由来のEndoSポリペプチドであってもよい。細菌は好ましくは、ストレプトコッカス、例えば、ストレプトコッカス エクイ、ストレプトコッカス ズーエピデミカス、または、好ましくはストレプトコッカス ピオゲネスである。あるいは、変異体は、ヒツジ偽結核菌由来、例えば、CP40タンパク質;エンテロコッカス フェカリス由来、例えば、EndoEタンパク質;またはエリザベトキンギア メニンゴセプティカ(以前は、フラボバクテリウム メニンゴセプティカム)由来、例えば、EndoF2タンパク質であってもよい。様々なS.ピオゲネス血清型由来およびS.エクイおよびS.ズーエピデミカス由来のEndoS変異体の配列を図8に示す。図9は、EndoSαドメインとエリザベトキンギア メニンゴセプティカ由来のEndoF2およびヒツジ偽結核菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)由来のCP40との配列比較を示した図である。
(a)配列番号:1のアミノ酸配列、
(b)配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも50%の同一性を有し、IgGエンドグリコシダーゼ活性を有するその変異体、または
(c)IgGエンドグリコシダーゼ活性を有するそのいずれかの断片
を含むことができる。
この場合のEndoSポリペプチドは、IgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如するように操作されているが、IgG結合活性を有する改変S.ピオゲネスEndoSであることが好ましい。IgG結合活性によって、改変EndoSは、IgGまたはその変異体もしくは断片、特に正常にグリコシル化されているそのFc断片に結合すると理解されたい。「正常にグリコシル化された(normally glycosylated)」とは、IgG分子またはその断片の変異体が、天然に存在するIgG分子に結合することが見出された少なくとも1種の炭水化物基が結合したIgGポリペプチド重鎖(またはその断片の変異体)を少なくとも含む糖タンパク質であることを理解されたい。特に、少なくとも1個の炭水化物基は、完全長IgG重鎖ポリペプチドの残基297に対応するアスパラギン残基に結合したグリカンである。好ましくは、アスパラギン結合グリカンは、β−1,4−ジ−N−アセチルキトビオースコアを有する。
(a)配列番号:2のアミノ酸配列、
(b)配列番号:2のアミノ酸配列と少なくとも50%の同一性を有し、IgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如したその変異体、または
(c)IgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如したそのいずれかの断片
を含むことができる。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号:2の配列を含むか、またはそれからなる。配列番号:2は、配列番号:1の配列から得られるが、配列番号:1の199位のグルタミン酸(E)をグルタミン(Q)に置換することによってIgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如するように操作されている。これは、配列番号:3(NCBI Accession No:AAK00850)の235位に対応しており、この特定の改変をE235Qと称する。このようなポリペプチドは一般的に、前述のようにIgG結合活性を有する。
(1)プラスミドベクターに挿入する対象のタンパク質をコードするDNAをクローニングするステップ。
(2)1本鎖を生成するためにプラスミドDNAを変性させるステップ。
(3)合成オリゴヌクレオチドが標的領域にアニールするように、変性したDNAと、標的配列に相補的であるが所望する変異(複数可)(点突然変異、欠失または挿入)を組み込んだ合成オリゴヌクレオチド(またはオリゴヌクレオチド類)とを接触させる、ステップ。
(4)鋳型としてプラスミドDNA鎖を使用してDNAポリメラーゼによって変異した鎖を伸長するステップ。
(5)大腸菌での形質転換によってヘテロ2本鎖(変異/非変異鎖)を増殖させるステップ。
(1)特異的変異誘発プライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースにした方法、または後でタンパク質機能の所望する変異もしくは欠如/獲得をスクリーニングするエラープローンPCR、
(2)対象とする遺伝子を有するプラスミドの大腸菌変異株(DNA校正系を欠如している)への導入およびその後の所望する変異またはタンパク質機能の欠如/獲得のスクリーニング、
(3)所望する変異を含有する部分的遺伝子または完全な遺伝子の化学的合成およびその後の適切なタンパク質発現系への導入が含まれる。
IdeSは、ヒト病原体S.ピオゲネスによって産生される細胞外システインプロテアーゼであり、WO03/051914に記載されている。IdeSは元々、血清型M1のA群ストレプトコッカス株から単離されたが、ides遺伝子は、今では試験されたA群ストレプトコッカス株全てで同定されている。IdeSは、基質特異性が極端に高く、唯一同定された基質はIgGである。IdeSは、ヒトIgGの低いヒンジ領域の単一のタンパク質分解切断を触媒する。このタンパク質分解は、A群ストレプトコッカスの殺滅を妨害するオプソニン化貪食作用の阻害を促進する。IdeSはまた、様々な動物のIgGのいくつかのサブクラスを切断し、IgGをFcおよびFab断片に効率よく変換する。ides遺伝子をクローニングし、GST融合タンパク質として大腸菌で発現させた。
(a)配列番号:8のアミノ酸配列、
(b)配列番号:8のアミノ酸配列と少なくとも50%の同一性を有し、IgGシステインプロテアーゼ活性を有するその変異体、または
(c)IgGシステインプロテアーゼ活性を有するそのいずれかの断片
を含むことができる。
本発明の方法で使用するために好ましいFc結合タンパク質は、前述の関連した部分で記載したようなエンドグリコシダーゼ活性を欠如した改変EndoSポリペプチドである。本発明の改変EndoSポリペプチドは、正常にグリコシル化されるならば、IgGサブクラス全てのFc断片に結合する。
(a)配列番号:11のアミノ酸配列、
(b)配列番号:11のアミノ酸配列と少なくとも50%の同一性を有し、IgG Fc結合活性を有するその変異体、または
(c)IgG Fc結合活性を有するそのいずれかの断片
を含むことができる。
4種類のサブクラス、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4に分類されたIgGは、様々な活性化プロファイルをもたらす様々な種類のFcγRと相互作用することが記載されている。FcγRは、体液性および細胞性免疫応答の間の連携をもたらす。食細胞は、構造的および機能的相同性ならびにIgGのCH2領域上の特異的認識部位を特徴とする、3種類のIgG−Fc受容体、FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIの構成要素を発現する。病原体−IgG複合体のFcγRへの結合は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞障害(CDCC)、エンドサイトーシス、食作用、酸化的バースト、炎症媒介物の放出などを引き起こすシグナルのカスケードを開始することによって、病原体に対する宿主の重要な応答を媒介する。複合体化したIgG−FcγRは、補体のC1q成分の活性化の他に、その他のリガンド、例えば、マンナン結合レクチン(MBL)、新生児受容体FcRn、マンノース受容体(MR)なども活性化することができる。FcγRは、構造的に造血細胞上で発現することができ、サイトカインおよびその他の薬剤によって誘導または上方制御することができる。FcγRは、IgG媒介エフェクター刺激を活性化および阻害する両方の能力を備えた、免疫系の活性化シグナル(FcγRI、FcγRIIaおよびFcγRIIIa)と阻害シグナル(FcγRIIb)の均衡に関与する。
IgGの単離および/または検出は一般的に、プロテインGまたはプロテインAのような薬剤を使用して当技術で実施される。これらの細菌タンパク質は、IgGと十分に相互作用する。しかし、プロテインAは、4種類のIgGサブクラス(IgG1〜4)全てと結合せず、プロテインAおよびプロテインGはどちらも、グリコシル化されておらず、かつ/または変性した不活性型IgGと、グリコシル化した、かつ/または天然の機能的に活性のあるIgGとを区別することができない。それに反して、本発明者らは、IgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如したEndoSポリペプチドは一般的に高い親和性で4種類のIgGサブクラス全てと結合し、正常にグリコシル化されたIgG、すなわち、天然の機能的に活性のある形態のIgGに選択的であることを同定した。
−好ましくは約0.5Mから約1Mの濃度のナトリウムもしくはカリウム塩、
−天然IgG上のAsn−297に結合したグリカンと類似した構造を有する単糖類、二糖類、もしくは多糖類、
または任意のその組み合わせの少なくとも1種を含む。
前述したように、IgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如し、IgG結合活性を有する本発明のEndoSポリペプチドは、グリコシル化された、かつ/または天然の機能的に活性のあるIgGに特異的である。したがって、前記EndoSポリペプチドを代替のIgG結合試薬と併用することによって、本発明は、IgG含有試料のグリコシル化状態または機能的品質を評価する方法であって、IgG含有試料から第1および第2の部分試料を採取し、第1の部分試料を前記部分で記載したようなEndoSポリペプチドと接触させ、第2の部分試料を、グリコシル化されておらず、かつ/または変性した、不活性型IgGを結合できる代替のIgG結合試薬と接触させるステップと、その後第1の部分試料中のEndoSポリペプチドに結合したIgGの量および第2の部分試料中の代替のIgG結合試薬に結合したIgGの量を定量するステップとを含む方法を提供する。最終的に、第1の部分試料および第2の部分試料中で測定された結合IgG量の両方を比較することによって、IgG含有試料のグリコシル化状態または機能的品質を評価することができる。
によって評価することができる。
本発明の方法は、IgG含有試料からFab断片を単離するために使用することができる。一実施形態では、本発明は、IgG含有試料からFab断片を単離する方法であって、
(a)前記IgG含有試料をIdeSおよびFc結合タンパク質と接触させるステップと、
(b)接触試料から前記IdeSおよび前記Fc結合タンパク質を分離するステップと
を含み、それによってFab断片を単離する方法を提供する。
(i)前記IgG含有試料を、IgGエンドグリコシダーゼ活性を欠如するEndoSポリペプチドと接触させ、それによってIgG−EndoSポリペプチド複合体の形成を可能にするステップと、
(ii)前記IgG−EndoSポリペプチド複合体を接触試料から分離するステップと、
(iii)IgG−EndoSポリペプチド複合体からIgGを溶出し、それによってIgG接触試料を得るステップと
を含み、ステップ(a)および(b)がステップ(iii)で得られたIgG含有試料で実施される、前述の方法を包含する。IgG−EndoSポリペプチド複合体の試料からの分離は、試料中のIgGの有無を決定する方法、またはIgG含有試料からIgGを単離する方法に関して前記部分で記載した方法にしたがって実施することが好ましい。
(a)前記IgG含有試料をFc結合タンパク質と接触させ、それによってIgG−Fc結合タンパク質複合体の形成を可能にするステップと、
(b)前記IgG−Fc結合タンパク質複合体を接触した試料から分離するステップと、
(c)ステップ(b)で得られたIgG−Fc結合タンパク質にIdeSを添加するステップと、
(d)(c)で得られた混合物から前記IdeSおよび前記Fc結合タンパク質を分離するステップと
を含み、それによってFab断片を単離する。
(a)前記IgG含有試料をIdeSと接触させるステップと、
(b)ステップ(a)で得られた混合物からIdeSを分離し、それによってFabおよびFc断片を単離するステップと、
(c)前記FabおよびFc断片をFc断片結合タンパク質と接触させ、それによってFc断片−Fc結合タンパク質複合体の形成を可能にするステップと、
(d)ステップ(c)で得られた混合物からFc断片−Fc結合タンパク質複合体を分離するステップと、
(e)ステップ(d)で得られたFc断片−Fc結合タンパク質複合体からFc断片を単離するステップとを含む。
(a)前記IgG含有試料をIdeSおよびFc結合タンパク質と接触させるステップと、
(b)(a)で得られた混合物からFc結合タンパク質を分離するステップと
を含み、それによってFc断片を単離する方法によって、Fc断片はIgG含有試料から単離することができる。
本発明は、
(a)エンドグリコシダーゼ活性を有する本発明によるEndoSポリペプチドと、所望により
(b)試料から細胞を分離するための手段および/または指示と
を含む、Fcγ受容体結合IgG分子を実質的に含まない細胞集団を単離するためのキット、
(a)エンドグリコシダーゼ活性を欠如した本発明によるEndoSポリペプチドと、所望により
(b)試料から前記EndoSポリペプチドを分離するための手段と
を含む、IgG含有試料からIgGを単離するためのキット、
(a)エンドグリコシダーゼ活性を欠如した本発明によるEndoSポリペプチドと、所望により
(b)試料から前記EndoSポリペプチドを分離するための手段と
を含む、試料中のIgGの有無を決定するためのキット、
(a)エンドグリコシダーゼ活性を欠如した本発明によるEndoSポリペプチドと、所望により
(b)変性し、かつ/または脱グリコシル化したIgGに結合できる代替のIgG結合試薬と、
(c)試料から前記EndoSポリペプチドを分離するための手段と、
(d)試料から前記代替のIgG結合試薬を分離するための手段と
を含む、IgG含有試料のグリコシル状態および/または機能的品質を評価するためのキットを提供する。代替のIgG結合試薬は、プロテインGおよび/またはプロテインAおよび/またはプロテインA/Gを含む。
(a)IdeSと、
(b)Fc結合タンパク質と、
(c)前記IdeSおよび前記Fc結合タンパク質を試料から分離するための手段と
を含む、IgGのFabまたはFc断片を単離するためのキットを提供する。
本発明の研究において、EndoSのIgGサブクラスに対する効果(複数可)およびIgG−FcgR相互作用を明らかにする。結果によって、EndoSは、可溶性および血漿環境の両方の4種類のヒトIgGサブクラス(IgG1〜4)全ての重鎖を加水分解することが明らかになった。さらに、IgGグリカンのEndoS加水分解は、IgGの可溶性、固定化FcγRIIaおよびFcγRIIbならびにFcγR発現細胞への結合に劇的な影響を及ぼすことを発見した。さらに、これらの細胞に結合したIgGは、細胞をEndoSで処理することによって解離する。さらに、部位特異的変異誘発によって生じたEndoSの完全な形態は、高い親和性でIgG1〜4に結合し、一方、活性型はその基質と一時的に相互作用するにすぎない。これらの結果は、細菌による宿主免疫防御の酵素的調節機構についての新たな情報を提供し、IgGグリカン加水分解酵素とIgGの間の分子的相互作用についての新たな情報を提供し、正確な抗体エフェクター機能のためのIgGグリコシル化の重要性を強調する。
タンパク質および試薬
血液は、健康な個体から採取し、ヘパリン含有試験管に収集した。融合物としてグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)を有する(GST−EndoS)または有さない完全長EndoSは、組換えによって発現し、プラスミドpGEXndoSを有する大腸菌から精製した。EndoSのグルタミン酸235のグルタミンへの変異は、以下の通りに実施した。グルタミン酸235(Glu−235)のグルタミン(E235Q)への変異は、QuickChangeII部位特異的変異誘発キット(Stratagene、La Jolla、CA)を使用して実施した。変異原性オリゴヌクレオチドプライマー(変異は下線を引いてある)5’−CCT TGA TGG CTT AGA TGT GGA TGT TCA ACA TGA TAG TAT TCC−3’および前記配列のアンチセンスは、変性したプラスミドpGEXndoSにアニールすることができた。変異した鎖は、高忠実度DNAを使用して増幅し、メチル化された親鎖はDpnIで消化した。その後、ニック修復および複製のためにスーパーコンピテント大腸菌Xl−1 Blueに形質転換し、変異したプラスミドpGEXndoS(E235Q)を作製した。その後、組換えEndoS(E235Q)を発現させ、EndoSについて前述したように精製した。可溶性の精製Fc受容体は、pNT−neo−FcγRIIまたはpNT−neo−FcγRIIIプラスミドでCHO−K1(CHO)細胞を同時形質移入し、その後ジェネテシン1mg/mlで選択することによって作製した。IgGサブクラスは、記載されたように(参考文献)ヒト血漿から精製した。RPMI1640培地およびハンクス平衡塩溶液(HBSS)は、GIBCO、Paisley、U.K.製であった。その他の試薬は全て、特に指示しない限り、Sigma−Aldrichから購入した。
ヒト血漿2ml量をEndoSまたはPBS20μgと37℃で1.5時間インキュベートした。プロテインGセファロース(GE Healthcare Biosciences AB、Uppsala、Sweden)を使用してIgG画分を精製した。簡単に説明すると、PBS(リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝液10mM、pH7.4、NaCl 120mM、KCl 3mM)に1:1で懸濁したプロテインGセファロース200μlを血漿試料に添加し、4℃で2時間または一晩インキュベートした。8000×gで5分間遠心した後、上清を廃棄し、ペレットをPBSで3回洗浄した。IgGをグリシン0.1M pH2.0で溶出し、1M トリス−HCl、pH8.0を用いて中和した。IgG濃度は、Advanced Protein Assay(Cytoskeleton、Denver、USA)を使用して8mg/mlに決定した。
K562細胞系は、Glutamax−I、抗生物質(ペニシリンおよびストレプトマイシン)100μg/mlおよび牛胎児血清10%を補給したRPMI1640培地中で、37℃で、5%CO2を含有し、湿度95%の大気中で培養した。細胞培養用のNunclonフラスコを使用した(Nunc A/S、Roskilde、Denmark)。細胞は、実験に使用する前に無血清培地で20時間培養した。単球は、Polymorphprep調製用キット(AXIS−SHIELD、Oslo、Norway)またはFicoll−Paque Plus(Amersham Bioscience、Uppsala、Sweden)を使用して、製造者によって提供された指示にしたがってヒト全血から単離した。単離後、細胞を計数し、PBSまたはRPMI培地に再懸濁した。
グリカン検出のために、マイクロタイタープレート(NUNC、Roskilde、Denmark)を、Na2CO3 16mMおよびNaHCO3 35mMを含有するコーティング緩衝液、pH9.6で最終濃度1.5〜0.5μg/mlまで希釈したマウス抗ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4モノクローナル抗体(SIGMA(登録商標)、Saint Louis、MO、USA)100μlでコーティングし、4℃で一晩維持した。次に、プレートを、HEPES 10mM、pH7.5、NaCl 0.15M、MnCl2 0.01mM、CaCl2 0.1mMおよび0.1% v/v Tween 20を含有するレクチン緩衝液で3回洗浄し、同緩衝液で室温で1時間ブロックした。次のステップで、精製したIgG画分(1:100に希釈)を添加し、37℃でさらに2時間インキュベートを続行した。レクチン緩衝液で3回洗浄した後、ビオチン化レンズマメアグルチニン(LCA)−レクチン(Vector Laboratories、Burlingame、CA、USA)1μg/mlを添加し、37℃で1時間インキュベートを続行した。さらに3回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン0.1μg/ml(Vector Laboratories)を添加し、プレートを37℃で1時間インキュベートした。色反応は、0.012% v/v H2O2および2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS)1.7mAを含有するクエン酸1水和物 0.1M、Na2HPO4×2H2O 0.1M緩衝液 pH4.5で発色させた。吸光度は、マイクロタイタープレートリーダーモデル550(BIO−RAD、Hercules、CA、USA)で415nmで読み取った。ヒトIgGサブクラスのFcγRへの結合を検出するために、プレートを可溶性FcγRIIaまたはFcγRIIbまたはFcγRIIIaで濃度5μg/mlで4℃で20時間コーティングした。翌日、プレートを、0.05%v/v Tween20(PBST)および2%w/v牛血清アルブミンを補給したPBSで室温で2時間ブロックした。このステップの後、精製したIgGサブクラスそれぞれ0.1μgを添加した。コーティングステップの後およびその後のインキュベーションステップそれぞれの間にプレートをPBSTで3回洗浄した。ペルオキシダーゼ結合プロテインG(BIO−RAD、Hercules、CA、USA)(1:5000に希釈)を検出用に使用した。色反応は前記の通り実施した。実験は全て3連(triplicates)で行った。
タンパク質は、0.2mCi Na125I(PerkinElmer、Upplands−Vasby、Sweden)で、IODE−BEADSヨウ素化試薬キット(PIERCE、Rockford、IL、USA)を使用して、製造者の指示書にしたがって標識した。未結合の放射活性は、PD−10セファロース(Pharmacia、Sweden)上のタンパク質を脱塩することによって除去した。標識したタンパク質の活性は、4μCi/μgタンパク質と推定した。
IgGは、前述のようにEndoSまたはPBSで処理したヒト血漿から精製し、その後125ヨウ素(125I)で標識した。K562細胞に結合した125I−IgGを検出するために、細胞2×106個を125I−IgGまたは125I−脱グリコシル化IgG 0.5×106cpmと室温で30分インキュベートした。PBSで5回洗浄し、1000×gで3分間遠心した後、細胞ペレットの放射活性をWallac Wizard(商標)1470自動ガンマカウンター(PerkinElmer、Waltham、MA、USA)を使用して検出した。他の実験では、単球1×106個を125I−IgGまたは125I−EndoS処理IgG 0.5×106cpmと室温で30分間インキュベートした。細胞をPBSで5回繰り返して洗浄し、1000×gで5分間遠心して細胞を最終的にペレットにした後、Tris−HCl 20mM pH7.4、NaCl 0.150M、1% v/v Triton−100および0.25% v/v NP40を含有する溶解緩衝液に4℃で10分間再懸濁した。次に、試料を14000×gで10分間遠心し、上清をポリアクリルアミドゲルに添加した。分離後、ゲルを乾燥させ、試料をFujix BAS 2000バイオイメージング分析器(Fujifilm Sverige AB、Stockholm、Sweden)でホスホイメージングによって分析した。(前述の通り)IgGの細胞への結合をウェスタンブロットによって分析する実験では、細胞0.5〜106個をEndoSまたは緩衝液で処理した血漿と37℃で1時間インキュベートした。その後、細胞はPBSまたはRPMI培地で3回洗浄し、溶解緩衝液100μlに再懸濁し、細胞溶解物中の結合IgGはウェスタンブロットによって分析した。
K562細胞2×106個または単球8×106個をヒト血漿2mlと37℃で30分間インキュベートした。細胞は、PBSで5回洗浄し、各洗浄後、1000gで10分間遠心した。PBSに溶かしたEndoS40μgまたはPBSのみを細胞に添加し、その後37℃で1時間インキュベートした。細胞は、PBSで3回洗浄し、溶解緩衝液100μLに再懸濁した。試料を14000×gで5分間遠心し、ペレットを廃棄し、上清を分析のために保存した。上清は、SDS−PAGEおよびウェスタンブロットを使用してIgGおよびグリカンの含量を分析した。
PBS中のIgG1〜4それぞれ0.3、0.15、0.075μgをSchleicher and Schuell、Inc.、Kene、NH 03431、USA製のスロットブロット装置を使用してPVDF膜に添加した。この膜をPBST、5%脱脂乳で1時間インキュベートし、PBSTで洗浄し、PBSTおよび5%脱脂乳に溶かしたEndoSまたはEndoS(E235Q)0.05mg/mlで1時間インキュベートした。洗浄後、この膜をウサギEndoS抗血清でインキュベートし、その後ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体でインキュベートした。発色は、ペルオキシダーゼ基質としてABTSを使用して行った。インキュベートステップは全て室温で実施した。
受容体、IgGおよび脱グリコシル化IgGは、酢酸ナトリウム10mM pH4で希釈し、CM5センサーチップ(BIAcore、Uppsala、Sweden)の異なるフローセルにアミン結合によって固定した。固定レベルは、約8000〜10000レスポンスユニットに最適化した。EndoS(E235Q)が脱グリコシル化IgG変異体に対して非結合剤であることが決定された後、これらのフローセルはIgG1からIgG4にそれぞれ結合するEndoS(E235Q)のバルク屈折率変化の対照と見なされた。受容体FcγRIIa、FcγRIIbおよびFcγRIIIaに対するIgG1−IgG4の親和性を測定する実験では、固定方法は行うが、タンパク質を添加しないフローセルを対照として使用した。親和性を測定するために、結合および解離相をBIAcore2000装置でモニターした。可能性のある物質移動制限の対照実験において、IgGを受容体に、EndoS変異体はIgGサブクラスに様々な流速で注入した。5μl/分以上では初期の結合に差は認められず、いかなる組み合わせの制限も示されなかった。反応体を、様々な濃度(通常、10〜1.25μg/ml)で35μl/分で25℃で様々なコーティング表面(フローセル)に注射した(ランニング緩衝液:Hepes10mM、pH7.5、NaCl 150mM、サーファクタントP20 0.005%およびEDTA 3.4mM)。実験間には、表面はNaCl 2Mを含有するランニング緩衝液でパルスし、その後基準に到達した後徹底的に洗浄処置を行うことで再生した。予備固定したFcγRIIaに結合したIgGのEndoS消化のために、IgG1濃度(10μg/ml)は、IgG1注入を中断し、ランニング緩衝液に置換した時点で適切な定常状態解離相を与えるように選択した。この実験は対照と見なされ、それ自体、IgG1がFcγRIIaに結合した後の同時点でのEndoS注入と比較した。データをXおよびYで正規化した後、各注入濃度の対照フローセルの盲検曲線を差し引いた。適用可能ならば、結合定数(Ka)および解離速度定数(Kd)は、BIA評価4.1ソフトウェア(BIAcore)において1:1ラングミュア結合の式を使用して同時に測定した。結合曲線は、局所的に適合させ、平衡解離定数(KD)は得られた速度定数の平均値から計算した。
血液15ml量をEndoS 0.4mgまたはPBSと37℃で35分間インキュベートした。次に、白血球の活性化剤、ホルミル−メチオニン−ロイシン−フェニルアラニン(fMLP)(1:10000に希釈)(SIGMA、Saint Louise、MO、USA)を添加し、インキュベーションを37℃で10分間続行した。次に、血液試料を1000gで5分間遠心した。血漿およびバフィーコートを別の管に移し、1000gで5分間遠心した。その後、細胞を、30%v/vRPMIを含有するHBSSで3回洗浄し、最終的に同媒体100mlに再懸濁した。マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体は、等量のマウス抗ヒトIgG1(51mg/ml)、IgG2(22mg/ml)、IgG3(16mg/ml)およびIgG4(24mg/ml)と混合することによって調製し、この混合物5μlを添加し、試料は室温で10分間インキュベートした。次のステップでは、DakoCytomation Uti−Lyse赤血球キット(Carpinteria、CA)を使用して赤血球を溶解する前に、FITC結合ヤギ抗マウスIgG(DakoCytomation、Glostrup、Denmark)5μlを添加した。シグナルは、FACSCaliburフローサイトメータ(Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ、USA)で分析した。単球は、前方散乱光および側方散乱光の特徴によって同定した(FSC/SSC)。
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)は、BIO−RAD(Hercules、CA、USA)製のMini Protean II装置またはLKB prudukter(Bromma、Sweden)製の装置を使用して、Laemmli(17)によって記載された緩衝系を使用して実施した。試料は5%メルカプトエタノールを補給した試料緩衝液と1:1(v/v)で混合し、10%ポリアクリルアミドゲルに添加する前に5分間煮沸した。PageRuler(商標)Protein Ladder Plus(Fermentas、Burlington、Canada)は、高分子質量標準物質として使用した。ポリアクリルアミドゲルは、Coomassie Brilliant Blue R−250で染色し、場合によっては乾燥させた。イムノブロッティングのため、Matsudaira(18)によって記載されたようにゲルをポリビニリデンフルオリド(PVDF)膜(Immobilon P、Millipre、Bedford、MA)に移した。ブロッティング後、膜を、0.05%v/v Tween20(PBST)および5%w/v脱脂乳(DIFCO、Detroit、MI)を補給したPBSで室温で20分間ブロックした。IgGを検出するために、ブロットをその後PBSTで洗浄し、ウサギ抗ヒトIgG(1:3000に希釈)(BIO−RAD、Hercules、CA)で37℃で1時間インキュベートした。洗浄ステップの後、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG(BIO−RAD)(1:1000に希釈)とインキュベートした。レクチンブロット分析のために、膜をレクチン緩衝液、HEPES 10mM、pH7.5、NaCl 0.15M、MnCl2 0.01mM、CaCl2 0.1mMおよび0.1%v/v Tween20で20分間室温でブロックし、ビオチン化LCAレクチン(Vector Laboratories)(1:5000に希釈)とインキュベートした。レクチン緩衝液で繰り返し洗浄した後、膜をペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Vector Laboratories)(1:10000に希釈)とインキュベートした。膜は全て、Chemidoc XRSイメージングシステムおよびQuantity One画像分析ソフトウェア(BIO−RAD)によって分析する前に、SuperSignal West Pico(PIERCE、Rockford、IL)を使用して、製造者の指示にしたがって発色させた。
EndoSは4種類のヒトIgGサブクラス全てに対してグリコシダーゼ活性を有する
EndoSがヒトポリクローナルIgGのγ鎖の保存されたN結合グリカンのキトビオースコア(chitobiose core)を加水分解することが以前に示されている(図1A)。したがって、EndoSがヒトIgGの4種類のサブクラス(IgG1〜4)全てに対して活性を有するかどうかを解明することに関心が持たれた。精製した組換えEndoSを精製したヒトIgG1〜4とインキュベートした。SDS−PAGE分析によって、全サブクラスのEndoS処理IgGは未処理IgGよりも約3kDa低い見かけ上の分子量に移動したことが明らかになり(図1B)、これはIgGグリカンのキトビオースコアの加水分解と一致する。グリカンの加水分解を確認するために、試料はまた、α結合マンノース残基を認識するレンズマメアグルチニン(LCA)レクチンを使用したレクチンブロットによって分析した(図1A)。試料のレクチンブロット分析によって、全IgGサブクラスは全て、EndoSとインキュベート後、LCAとの反応性を欠如することが明らかになり、グリカンの完全な、またはほぼ完全な加水分解と一致する(図1C)。さらに、血漿環境中においてIgG1〜4に対するEndoSのグリコシダーゼ活性を調べた。この実験では、ヒト血漿を、精製したEndoSまたは緩衝液とインキュベートし、その後IgG画分の親和性精製を行った。その後、これらの画分に、IgGを捕捉するためにIgG1〜4に対する固定化モノクローナル抗体を使用したLCA ELISAを行った。これによって、血漿を緩衝液(対照)とインキュベートすると4種類のIgGサブクラス全てはレクチンと反応し、グリカンが存在することが明らかになった。対照的に、血漿をEndoSで処理すると、IgG1〜4とLCAレクチンとの反応性の著しい減少が認められ、IgG1〜4上のグリカンが加水分解されていることが示された(図2)。考え合わせると、これらの結果は、EndoSが精製型(purified form)ならびに全血漿中のヒトIgGの全サブクラスを加水分解する能力を有することを明らかに示している。
以前に、IgGのEndoS加水分解の分子的な必要性を部分的に解明した。触媒トンネルの提示された入り口の配列番号:1のグルタミン酸199(配列番号:3の235位)のグルタミンへの部位特異的変異誘発(EndoS(E235Q))によって酵素的活性が消失する。さらに、トリプトファンの化学的ブロックによって、これらのアミノ酸残基は活性に重要であることが明らかになった。酵素と基質の間の物理的相互作用をさらに調べるために、EndoSおよびEndoS(E235Q)の固定化ポリクローナルIgGおよびIgG1〜4サブクラスへの結合は、EndoSおよびEndoS(E235Q)で探査された固定化IgGによるスロット結合実験を使用して研究した。精製した、可溶性IgGサブクラス1〜4は、それぞれニトロセルロース膜に固定し、EndoSおよびEndoS(E235Q)で探査し、その後EndoSに対する抗体とインキュベーションした。この実験によって、ポリクローナルIgG、IgG1およびIgG2へのEndoS(E235Q)の強力な結合(binding)、およびIgG3およびIgG4への弱い会合(association)が明らかになり、一方、活性EndoSと全サブクラスの間には非常に弱い相互作用のみが認められた(図3A)。EndoSと固定化IgG1〜4の間の親和定数を計算するために、表面プラズモン共鳴を使用した。スロット結合結果と同様に、これらによって、EndoS(E235Q)はIgGサブクラス全てに高い親和性で結合し、一方、EndoSのIgGに対する結合は検出できないことが示された(図3B、表1)。固定化IgGサブクラスに対するEndoS(E235Q)結合の動力学的変数は、類似の指標を示し、最も強い相互作用は、IgG1とEndoS(E235Q)の間で示され、結合親和定数(KD)は0.42μMであった。EndoSまたはEndoS(E235Q)はいずれも、固定前(immobilized)にEndoSによって加水分解されたIgG1〜4サブクラスには結合しないことが検出された。これらの発見は、完全な(intact)IgGグリカンはEndoSとIgGの間の相互作用に必要であることを示している。さらに、EndoS、EndoS(E235Q)およびIgGの間の相互作用を比較する実験によって、EndoSは高い親和性でIgGに結合するが、活性型酵素は、グリカンがグリカン加水分解後直ちに「touch and go」方式で遊離されることを示している。
FcγRとIgGのFcドメインの間の相互作用の性質はIgGグリコシル化状態に強く左右されるので、IgGのFcγRとの相互作用に対するEndoS活性の影響を調査した。したがって、ELISA実験において、可溶性FcγRIIa、FcγRIIbおよびFcγRIIIaを固定し、精製したIgG1〜4サブクラスで探査した。その他の観察と一致して、本明細書ではFcγRIIaおよびFcγIIbはIgG1に結合することがわかった。この結合は、IgG1をEndoSで処理した後ほとんど消失した。その他のIgGサブクラスのこれらの受容体に対する結合は弱く、EndoSで処理した後、さらに減少した。一般に、ELISA研究では、IgGサブクラスの結合親和性パターンは、FcγIIaではIgG1>IgG3>IgG4>IgG2であり、FcγRIIbではIgG1>IgG4>IgG3>IgG2であることが明らかになった(図4A)。さらに、EndoSで加水分解されたIgGは、FcγIIa/FcγRIIbへの結合に関していえば、未処理IgG2と比較して、より広範な結合能力で異なる結果を有することが認められた。FcγRIIIaは全IgGサブクラスの結合では否定的であった(データは示さず)。EndoSで処理した、または処理していないIgG1〜4とFcγRとの相互作用はさらに、表面プラズモン共鳴によって分析した。IgGサブクラスそれぞれは、FcγRIIa、FcγRIIbまたはFcγRIIIaを固定した表面に捕捉された。ELISAデータと一致して、この結果は、IgGがFcγRIIaおよびFcγIIbの両方に最強の親和性を有し、結合親和定数は類似しており、それぞれ97nMおよび17nMであることを示した(図4B、表2)。以前の発見と一致して、EndoS処理IgG1を使用したとき、これらの受容体へのIgGの結合は検出できなかった。FcγRIIa/FcγRIIbとIgG2またはIgG3の間、あるいはIgG4とFcγRIIaの間には相互作用は検出されなかった(表2)。可溶性IgG1〜4サブクラスの固定化FcRIIIaへの結合は検出できなかった。これらの結果は、EndoS加水分解がIgGのFcγRへの親和性を劇的に減少させることを示している。
ELISAおよび表面プラズモン共鳴の結果に基づいて、EndoSグリコシダーゼ活性のFcγRとIgGの間の相互作用に対する効果(複数可)の分析を続行した。この目的のため、FcγRIIaを広範に発現する赤白血病細胞系(K562)を使用した。可溶性FcγRIは入手できなかったので、FcγRIによってIgGに主に結合するヒト単球も調べた。したがって、IgGはEndoSまたはPBSで処理した血漿から精製し、125Iで標識し、K562細胞とインキュベートした。細胞ペレットの放射活性を測定した。これらの細胞への特異的なIgG結合は、放射活性IgGの結合を阻害した冷却ヒトIgGを添加することによって計算した。これによって、EndoSで処理した血漿から元々精製した放射活性IgGの結合は、完全に消失することが示された(図5A)。細胞をヒト血漿とインキュベーションした後、IgGのK562細胞への強力な結合は、ウェスタンブロットおよび細胞溶解物とヒトIgGに対する抗体との反応性によって確認された。対照的に、EndoSで予め処理した血漿でインキュベートしたK562細胞に対するIgGの結合は明らかに減少した(図5B)。同様に、SDS−PAGEによって分析した125I−IgGの単球への結合は、IgGをEndoSで処理したとき、完全に阻害された(図6A)。単球上のFcγRとIgGの間の相互作用に対するEndoSの影響をさらに分析するために、全血のフローサイトメトリー分析を実施した。ヒト血液は、血液を白血球活性化剤fMLPで予めインキュベートした後EndoSとインキュベートした。単球は、前方散乱光および側方散乱光をベースにしてゲートし、単球の抗ヒトIgGモノクローナル抗体との反応性を評価した。この結果によって、単球の87%がIgG結合について陽性であり、一方EndoSとインキュベートした血液中の単球は43%のみが陽性であることが(図6B)明らかになった。これらの結果は、EndoS加水分解IgGが、FcγRの様々な組を発現するヒト細胞の結合能力を著しく減少させることを示した。
ここまでの実験によって、IgGのEndoS加水分解は細胞および表面上のFcγRへの結合を阻害するが、EndoSが既にFcγRに結合したIgGに活性を有するかどうか、このような活性がFcγRに結合したIgGを遊離させ得るかどうかは不明なままであった。したがって、ヒト血漿に曝露し、その後EndoSで処理したK562細胞に結合したIgGに対するEndoSの効果を調べた。細胞溶解物は、SDS−PAGEおよびヒトIgGに対する抗体を使用したウェスタンブロットによって分析した。図7Aに提示した結果によって判断されるように、K562細胞に対するIgGの著しい結合が存在した。興味深いことに、細胞をEndoSで処理したとき、ブロット上にはIgGのバンドは認められず、IgGは全て細胞から解離していることが示唆された(図7A)。EndoS(E235Q)を使用した対照実験では、K562細胞の表面上のIgGシグナルは未処理細胞と同程度であることが明らかになった。これらの結果は、EndoSによるN−グリカンの加水分解によって、IgGが細胞表面から解離することを強く示唆する。同様に、単球に結合したIgGに対するEndoSの効果を分析した。これによって、単球結合IgGのほとんどは、未処理細胞と比較されるように、EndoSによる処理によって細胞から解離したことが示された(図7B)。予測通り、対照細胞とは対照的に、EndoSで処理した単球は、LCAレクチンとの反応は示さず、IgGブロットで検出されたように細胞上に残存するわずかな量のIgGはEndoSによって加水分解される可能性が高いことが示された(図7B)。前記に示した結果はさらに、表面プラズモン共鳴実験によって確認された。IgG1がFcγRIIの最強の結合剤であることが以前観察されたため、可溶性IgG1およびFcγRII受容体を選択した。IgG1が予め固定したFcγIIaに結合し、定常状態の解離相に達した後、IgG1注入を中断し、EndoS注入またはランニング緩衝液に置換した。これによって、EndoS注入は、固定されたFcγRIIa受容体からのIgG1の解離を引き起こし、一方、FcγRIIaからのIgG1解離は、ランニング緩衝液を添加しても影響を受けないことが明らかになった(図7C)。これらを考え合わせると、これらの結果は、IgGグリカン加水分解によってEndoSは細胞および表面上のFcγRに結合したIgGを遊離することができることを明らかに示している。
本実施例では、EndoSとIgGの間の物理的相互作用およびIgG−FcγR相互作用に対するEndoSのIgG N−グリカン加水分解活性の生理学的関連を解明する。EndoSが、精製された形態および血漿環境の両方においてヒトIgGサブクラス全てに対してエンドグリコシダーゼとして特異的に作用することを初めて提示する。予測通り、酵素と全IgGサブクラスの間には物理的相互作用があることを酵素的に不活性なEndoSの変異型を使用して示すことに成功した。この研究では、EndoSで加水分解したIgGは単球に結合せず、EndoSによる加水分解によって単球からIgGがほとんど完全に解離することを認めた。単球はFcRIを発現し、この受容体はIgGに最高の親和性を有するので、EndoSはFcRIに結合しているIgGであっても影響を及ぼすと結論づけた。なぜならば、観察したEndoSの効果は主にFcIIの関与によるものに違いないからである。興味深いことに、EndoSはFcγRII受容体の両イソタイプに対して効果を有するものと考えられ、したがって、IgGが媒介するエフェクター刺激の活性化および阻害の両方に影響を及ぼす。
クローニング
プロテインHをコードする構造遺伝子のヌクレオチド124から1048は、制限部位NotIおよびBamHIを使用して、pET21bベクターにクローニングした。構造遺伝子は、鋳型としてベクターpHD389を用いてPCRを使用して得られた。
5’−TCG GAT CCG GCG CCG GAA GGG GCT AAA ATT GAT TGG C−3’(37mer)
5’−CTC TGC GGC CGC TGC TGT TTC ACC TGT TGA AGG TAA −3’(36mer)
タンパク質発現は、pET21bベクターを使用する発現のための標準的方法および指示を使用して実施した。細胞を収集し、緩衝液に再懸濁し、超音波処理した。細胞残渣は、遠心を使用して廃棄し、透明な溶解物をAmersham BIoSciences製の1ml HisTrapカラムに標準的方法を使用して添加した。カラムから溶出したタンパク質は、NuPage4〜12%BisTrisゲル(Invitrogen)を使用して還元条件下でエレクトロポレーションを使用して分析した。タンパク質の分子量は約35kDaであった。HisプロテインHの理論的分子量は36kDaである。
クローニング
IdeSをコードする構造遺伝子のヌクレオチド79から1020は、制限部位XhoIおよびBamHIを使用して、pET21bベクターにクローニングした。構造遺伝子は、pGEX:IdeSベクター上でPCRを使用して得られた。
5’−CCG GAT CCG CTA GCA GAT AGT TTT TC−3’ (26mer)
5’−GGC CTC GAG GGA ATT GGT CTG ATT CC −3’(26mer)
タンパク質発現は、pET21bベクターを使用する発現のための標準的方法および指示を使用して実施した。細胞を収集し、緩衝液に再懸濁し、超音波処理した。細胞残渣は、遠心を使用して廃棄し、透明な溶解物をAmersham BioSciences製の1mlHisTrapカラムに標準的方法を使用して添加した。カラムから溶出したタンパク質は、NuPage4〜12%BisTrisゲル(Invitrogen)を用いて還元条件下でエレクトロポレーションを使用して分析した。発現し、精製したタンパク質は、NuPage4〜12%BisTrisゲル(Invitrogen)を使用してエレクトロポレーションを使用して分析した。タンパク質の分子量は、約34kDaであった。
以下の反応は、エッペンドルフ管内で設定し、結果はNuPage4〜12%BisTrisゲル(Invitrogen)を使用したエレクトロポレーションで分析した。
溶出緩衝液
以下の方法は、IgGセファロースからのEndoS(E235Q)の溶出において使用するための様々な溶出緩衝液を試験するために使用した。試験した緩衝液は、酸感受性抗体に特異的な本発明の方法で使用するために特に適しているだろう。試験した様々な緩衝液は、
1.PBS pH7.4に溶かしたスクロース0.25M
2.PBS pH7.4に溶かしたスクロース0.5M
3.PBS pH5.3に溶かしたスクロース0.25M
4.PBS pH8.5に溶かしたスクロース0.25M
5.PBS pH7.4に溶かしたスクロース0.25M、マルトース0.25M
6.PBS、pH7.4
配列番号:1は、S.ピオゲネスAP1から単離したEndoSポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号:2は、配列番号:1の配列から得られた改変EndoSポリペプチド(E235Q)のアミノ酸配列である。
配列番号:3は、シグナル配列を含む、S.ピオゲネスAP1から単離したEndoSポリペプチドのアミノ酸配列である。この配列は、NCBI Accession No:AAK00850に対応する。
配列番号:4は、シグナル配列を含む、S.ピオゲネスAP1から単離したEndoSをコードする核酸配列である。
配列番号:5から7は、プライマー配列である。
配列番号:8は、S.ピオゲネスAP1から単離したIdeSのアミノ酸配列である。
配列番号:9は、推定シグナル配列を含む、S.ピオゲネスAP1から単離したIdeSのアミノ酸配列である。
配列番号:10は、シグナル配列を含む、S.ピオゲネスAP1から単離したIdeSをコードする核酸配列である。
配列番号:11は、成熟プロテインHのアミノ酸配列である。
配列番号:12は、シグナル配列を含む、プロテインHのアミノ酸配列である。
配列番号:13は、シグナル配列を含む、プロテインHをコードする核酸配列である。
Claims (17)
- IgG含有試料からグリコシル化されたIgGを単離する方法であって、
(a)前記IgG含有試料を、
(i)配列番号:2のアミノ酸配列を含むEndoSポリペプチド、
(ii)配列番号:2の残基191から199を含有し、配列番号:2のアミノ酸配列の完全長と少なくとも90%の同一性を有する(i)の変異体、または
(iii)配列番号:2の199位と同等の位置にグルタミン酸を含有しない場合において、配列番号:2の残基191から199が1個または複数の保存的置換を有する、前記(ii)の変異体
と接触させるステップであって、前記ポリペプチドまたは変異体が、IgGエンドグリコシダーゼの活性を欠如し、グリコシル化されたIgGに特異的に結合することができるものである、前記ステップと、
(b)それによってIgG−EndoSポリペプチド複合体の形成を可能にするステップと、
(c)接触試料から前記EndoSを分離するステップと
を含み、それによってグリコシル化された単離IgGを得る方法。 - 試料中のグリコシル化されたIgGの有無を決定する方法であって、
(a)前記試料を、
(i)配列番号:2のアミノ酸配列を含むEndoSポリペプチド、
(ii)配列番号:2の残基191から199を含有し、配列番号:2のアミノ酸配列の完全長と少なくとも90%の同一性を有する(i)の変異体、または
(iii)配列番号:2の199位と同等の位置にグルタミン酸を含有しない場合において、配列番号:2の残基191から199が1個または複数の保存的置換を有する、前記(ii)の変異体
と接触させるステップであって、前記ポリペプチドまたは変異体が、IgGエンドグリコシダーゼの活性を欠如し、グリコシル化されたIgGに特異的に結合することができるものである、前記ステップと、
(b)それによってIgG−EndoSポリペプチド複合体の形成を可能にするステップと、
(c)所望により、前記EndoSを接触試料から分離するステップと、
(d)前記分離したEndoSがIgGに結合しているかどうかを決定するステップと
を含み、それによって前記試料中のグリコシル化されたIgGの有無を決定する方法。 - 前記EndoSポリペプチドが、配列番号:2のアミノ酸配列、または配列番号:2のアミノ酸1から409からなる前記断片からなるものである、請求項1または2に記載の方法。
- 単離された、または検出されたIgGが天然の機能的に活性のある形態である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 単離された、または検出されたIgGが、IgGサブクラスIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4の少なくとも1種、好ましくは2種、3種または4種全てを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)がさらに、試料を、EndoSポリペプチドに結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることを含み、ステップ(c)が、接触試料上で磁場分離を実施することを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- IgG含有試料のグリコシル化状態を評価する方法であって、IgG含有試料の第1および第2の部分試料を採取することを含み、請求項1または3から5のいずれか一項に記載のステップ(a)から(c)を第1の部分試料に適用し、EndoSポリペプチドが、グリコシル化されていないIgGに結合できる代替のIgG結合試薬で置換されていることを除いて、請求項1または3から5のいずれか一項に記載のステップ(a)から(c)を第2の部分試料に適用し、さらに、
(e)第1の部分試料におけるEndoSポリペプチドに結合したIgGの量および第2の部分試料における代替のIgG結合試薬に結合したIgGの量を定量するステップと、
(f)(e)において決定した結合IgGの量の両方を比較するステップと
を含み、それによってIgG含有試料のグリコシル化状態を評価する方法。 - 代替のIgG結合試薬がプロテインGおよび/またはプロテインAを含む、請求項7に記載の方法。
- 単離IgG試料からFab断片を単離する方法であって、
(a)前記IgG含有試料を、請求項1の(a)(i)から(iii)に記載のEndoSポリペプチドまたは変異体と接触させ、それによってIgG−EndoSポリペプチド複合体の形成を可能にするステップと、
(b)前記IgG−EndoSポリペプチド複合体を接触試料から分離するステップと、
(c)IgG−EndoSポリペプチド複合体からIgGを溶出し、それによってIgG含有試料を得るステップ
によって前記試料を調製するステップと、
そして次に、
(d)(c)の試料と、配列番号:8または9のポリペプチドおよび請求項1の(a)(i)から(iii)に記載のEndoSポリペプチドまたは変異体とを接触させるステップと、
(e)前記配列番号:8または9のポリペプチド、及びEndoSポリペプチドまたは変異体を、(c)の接触試料から分離し、それによってFab断片を単離するステップ
を含む、方法。 - ステップ(d)がさらに、試料を、前記配列番号:8もしくは9のポリペプチド、および/またはEndoSポリペプチドもしくは変異体に結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることを含み、ステップ(e)が、接触試料上で磁場分離を実施することを含み、かつ/またはEndoSポリペプチドが請求項3に記載のものである、請求項9に記載の方法。
- IgG含有試料からグリコシル化されたFc断片を単離する方法であって、
(a)前記IgG含有試料を前記配列番号:8または9のポリペプチドと接触させるステップと、
(b)ステップ(a)で得られた混合物から前記配列番号:8または9のポリペプチドを分離し、それによってFabおよびFc断片を単離するステップと、
(c)前記FabおよびFc断片を、請求項1の(a)(i)から(iii)に記載のEndoSポリペプチドまたは変異体と接触させ、それによってFc断片−EndoSポリペプチド複合体の形成を可能にするステップと、
(d)ステップ(c)で得られた混合物からFc断片−EndoSポリペプチド複合体を分離するステップと、
(e)ステップ(d)で得られたFc断片−EndoSポリペプチド複合体からFc断片を単離するステップと
を含む方法。 - ステップ(a)がさらに、試料を、配列番号:8もしくは9のポリペプチドに結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることを含み、ステップ(c)がさらに、ステップ(b)で得られた単離FabおよびFc断片を、前記EndoSポリペプチドに結合できる磁性ナノ粒子の集団と接触させることを含み、ステップ(b)および(d)が、それぞれ接触試料または単離されたFabおよびFc断片上で磁場分離を実施することを含み、かつ/または前記EndoSポリペプチドが請求項3に記載のものである、請求項11に記載の方法。
- IgG含有試料からグリコシル化されたIgGを単離するための、または試料中のグリコシル化されたIgGの有無を決定するためのキットであって、
(a)請求項1の(a)(i)から(iii)に記載のEndoSポリペプチドまたは変異体と、所望により
(b)試料から前記EndoSポリペプチドまたは変異体を分離するための手段と
を含むキット。 - IgG含有試料のグリコシル状態を評価するためのキットであって、
(a)請求項1の(a)(i)から(iii)に記載のEndoSポリペプチドまたは変異体と、
(b)脱グリコシル化されたIgGに結合できる代替のIgG結合試薬と、
(c)前記EndoSポリペプチドまたは変異体および前記代替のIgG結合試薬を試料から分離するための手段と、
を含み、所望により前記代替のIgG結合試薬は、プロテインGおよび/またはプロテインAおよび/またはプロテインA/Gを含むものである、キット。 - IgGのグリコシル化されたFc断片を単離するためのキットであって、
(a)配列番号:8または9のポリペプチドと、
(b)請求項1の(a)(i)から(iii)に記載のEndoSポリペプチドまたは変異体と、
(c)前記配列番号:8もしくは9のポリペプチドおよびEndoSポリペプチドを試料から分離するための手段と
を含む、キット。 - 前記EndoSポリペプチドが請求項3に記載のものである、請求項11から15のいずれか1項に記載のキット。
- 前記EndoSポリペプチドもしくは変異体、前記代替のIgG結合試薬、または前記配列番号:8もしくは9のポリペプチドを試料から分離するための手段が、磁性ナノ粒子の集団であり、各集団は、示されたポリペプチド/試薬/タンパク質の少なくとも1種に結合することができ、所望により、試料上において磁場分離を実施するための指示をさらに含むものである、請求項11から16のいずれか1項に記載のキット。
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