CN102584989B - 用于解离Fcgamma-受体-IgG复合物及纯化与检测IgG的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于用于解离Fcgamma-受体-IgG复合物及纯化与检测IgG的方法和试剂盒。本发明的用于从含有IgG的样品中分离Fab片段的方法包括：(a)使所述含有IgG的样品与IdeS和Fc结合蛋白接触；(b)从所述接触过的样品中分离所述IdeS和所述Fc结合蛋白；以及由此分离Fab片段；其中所述Fc结合蛋白是缺乏IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽。

Description

用于解离Fcgamma-受体-IgG复合物及纯化与检测IgG的方法和试剂盒

本申请是申请日为2008年9月11日、申请号为“200880115576.5”、发明名称为“用于解离Fcgamma-受体-IgG复合物以及纯化与检测IgG的方法和试剂盒”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及分离细胞群、用于分离和评价IgG的方法、用于分离IgG的Fab或Fc片段的方法以及用于实施所述方法的试剂盒。

背景技术

抗体的免疫球蛋白G(IgG)类在人宿主抵抗病原体的适应性免疫防御中起着重要作用。IgG由两条相同的重链和两条相同的轻链构成，而重链和轻链由可变区和恒定区组成。IgG分子经木瓜蛋白酶处理可生成识别抗原的Fab片段和作为宿主受体的识别位点和与多个效应分子相互作用的位点的Fc片段。

IgG的Fc部分还含有与各重链的C_H2结构域中天冬酰胺297残基连接的保守的复合糖或聚糖。当IgG是其天然形式时，这些聚糖位于C_H2结构域之间的相接处。它们由具有添加的末端及支链糖残基(例如N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、唾液酸以及半乳糖)的N-乙酰葡糖胺和甘露糖的二天线核心(biantennary core)构成。该糖的存在对于正确的抗体结构以及与细胞免疫球蛋白G Fcγ受体(FcγR)和补体系统的相互作用来说至关重要。

内切糖苷酶S(EndoS)由化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)分泌，通过水解与IgG重链上的天冬酰胺297残基连接的保守聚糖而对天然IgG具有特异性内切糖苷酶活性。EndoS是第一种已知对天然IgG具有专一特异性的细菌酶。相比之下，其他已知的内切糖苷酶的活性需要对糖蛋白底物进行变性，或通过对糖蛋白底物进行变性而加强。

诸如IgG的抗体在基础研究以及在诊断和药物开发中具有许多应用。在一些应用中，诸如，在免疫组织化学、免疫测定、肿瘤检测、放射疗法、抗体结合位点和免疫靶向的晶体学研究中，使用Fab片段要比使用完整的IgG分子方便。使用Fab片段的一些优点是它们不会受到细胞上的Fc受体或沉淀抗原影响，它们表现出免疫原性降低和对吞噬作用较不敏感，并且放射性标记的Fab片段比完整的IgG分子被更快速地从组织中清除。对于其他应用，使用IgG的Fc片段是合乎需要的。

如果要大规模制备Fab或Fc片段，可以以重组蛋白的形式进行制备。为了纯化的目的，通常制备重组IgG和血清IgG的完整分子，然后进行化学处理以获得Fab或Fc片段。

最常使用诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的蛋白水解酶将IgG切成Fab和Fc片段。这些酶经常切割其他蛋白，所以切割反应通常必须对纯化的IgG级分进行。另外，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶通常在多处切割IgG。这意味着所获得的片段经常不对应于完整的Fab或Fc片段，即使切割确实产生Fab和Fc片段，它们也通常容易进一步切割成更小的片段。通常使用蛋白A或G亲和分离柱来进行Fc片段与Fab片段的分离，该分离柱利用了细菌蛋白A和G的Fc结合特性。

发明内容

本发明人获得了下述令人惊讶的发现，使细胞与EndoS接触去除已经与FcγR结合的IgG。根据本发明，由此提供了一种体外解离Fcγ-受体-IgG复合物的方法，所述方法包括：使该复合物与EndoS多肽接触，由此获得不与IgG结合的Fcγ-受体，其中，所述Fcγ-受体-IgG复合物可随意地存在于含有细胞的样品中。本发明还提供了一种用于分离基本不含Fcγ-受体-结合的IgG分子的细胞群的方法，所述方法包括：

(a)使含有细胞的样品与EndoS多肽接触；以及

(b)从所述接触过的样品中分离所述细胞；由此获得所述细胞群。

本发明人还确定了用于分离IgG的改良方法。所述方法利用了缺乏内切糖苷酶活性的修饰的EndoS多肽。本发明人首次揭示了所述修饰的EndoS多肽对于功能活性形式的天然IgG糖蛋白具有专一的特异性。因此，所述方法特别有助于分离糖基化的和/或具有功能活性的IgG。通过将所述修饰的EndoS多肽与能够结合变性和/或去糖基化的IgG的另外IgG结合试剂联合使用，本发明人还确定了一种用于评价含有IgG的样品的糖基化状态或功能特性的方法。

因此，根据本发明，提供了一种用于从含有IgG的样品中分离IgG的方法，所述方法包括：(a)使所述含有IgG的样品与缺失IgG内切糖苷酶活性的修饰的EndoS多肽接触；(b)从所述接触过的样品中分离所述EndoS；由此获得分离的IgG。

另外，本发明提供了一种评价含有IgG的样品的糖基化状态或功能特性的方法，所述方法包括取含有IgG的样品的第一小例样和第二小例样，其中，对所述第一小例样实施上述方法的步骤(a)和(b)，并且，其中除了使用可选的能够结合变性和/或去糖基化的IgG的IgG结合试剂取代EndoS多肽以外，对所述第二小例样实施上述步骤(a)和(b)，并且所述方法还包括：(c)对所述第一小例样中的与EndoS多肽结合的IgG的量和所述第二小例样中的与可选的IgG结合试剂结合的IgG的量进行定量；以及(d)将(c)中测定的结合的IgG的量进行比较；由此，评价含有IgG的样品的糖基化状态或功能特性。

本发明人还确定了用于分离IgG的Fab或Fc片段的改良方法。本发明的方法利用了来自化脓性链球菌的高特异性IgG切割酶IdeS(化脓性链球菌的IgG降解酶)和Fc结合蛋白。因此，本发明的方法不受到背景技术部分描述的现有方法的限制(例如使用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶)。这是因为IdeS在IgG分子的铰链区内仅有一个确定的切割位点，因此不可能进一步切割Fab和Fc片段。

在本发明的一个方法中，使含有IgG的样品与IdeS和Fc结合蛋白接触。Fc结合蛋白优选是如上所述缺乏内切糖苷酶活性的修饰的EndoS多肽。所述修饰的EndoS蛋白优选为广泛使用的可选的Fc结合蛋白，例如蛋白A和蛋白G。这是因为修饰的EndoS蛋白仅结合Fc，而本发明人发现蛋白A和蛋白G还可以结合Fab片段。因此，使用这些蛋白将Fab片段与Fc片段分离更加困难。其他优选的Fc结合蛋白包括蛋白H。

在本发明的方法中，通常IdeS将IgG切割成Fab和Fc片段，并且Fc结合蛋白结合Fc片段。然后将Fc片段与Fab片段分离。

该方法特别有助于从包含纯化的IgG的样品中分离Fab或Fc片段。更特别地，使用本发明的修饰的EndoS多肽，有助于从包含纯化的IgG的样品中分离Fab或Fc片段。然而，所述方法还可适用于含有未纯化的IgG的样品，例如血清、细胞裂解物或细胞培养基。

本发明还提供了实施本发明方法的试剂盒和通过本发明的方法分离的细胞群。

附图说明

图1显示了EndoS对人IgG所有四种亚类的糖苷酶活性。小图A：人IgG的聚糖结构。IgG的γ链上的聚糖与天冬酰胺297连接。GlcNAc，N-乙酰葡糖胺；Fuc，岩藻糖；Man，甘露糖；Gal，半乳糖；NeuAc，唾液酸。示出了EndoS的切割位点和小扁豆凝集素(LCA)的识别位点。小图B：纯化的IgG_1-4与EndoS一起孵育，通过SDS-PAGE进行分析，并进行染色。小图C：IgG_1-4与EndoS一起孵育，使用LCA凝集素印迹进行分析。

图2显示了血浆环境中EndoS对人IgG亚类的水解。使用EndoS或PBS处理人血浆，然后对纯化的IgG级分进行LCA凝集素ELISA。使用LCA凝集素ELISA检测IgG聚糖水解。将结果表示为各亚类与来自未处理的血浆的信号进行比较的水解百分数。

图3显示了EndoS(E235Q)结合所有IgG亚类。小图A：表示EndoS和EndoS(E235Q)以3μg、1.5μg以及0.75μg的量与固定化至硝酸纤维素膜上的各IgG亚类结合的狭线印迹。使用针对EndoS的抗血清检测结合。小图B：使用BIAcore技术将EndoS(E235Q)与固定化的IgG亚类结合。所选择的曲线使用IgG1作为参照(扣除批变化)显示了与IgG1结合的EndoS(E235Q)。结合动力学常数示于适用的表格中。Nb表示使用BIAcore技术研究组合但显示未结合。

图4显示了IgG亚类的EndoS处理抑制IgG与FcγRII的结合。小图A：使用EndoS处理或未使用EndoS处理的纯化的IgG亚类与固定化至微量滴定板的FcγRIIa和FcγRIIb结合。HRP标记的蛋白G用于检测结合的IgG亚类。(+)表示完整的IgG，(-)表示EndoS水解的IgG。小图B：使用BIAcore表面等离子共振观察到的IgG亚类与固定化的受体结合。曲线显示了典型的传感图(sensorgram)，这里，IgG1结合FcγRIIa。空流动细胞用作参照(扣除的)。表2中显示的数据是结合IgG亚类的动力学常数。Nb表示使用所述技术研究的IgG受体对，但这里显示未相互作用。

图5显示了EndoS处理的IgG不与K562细胞上的FcγRIIa结合。小图A：使用EndoS处理或未使用EndoS处理的放射性IgG与K562细胞的相对结合。将该细胞与¹²⁵I-标记的IgG(完整或EndoS处理的)一起孵育。检测所洗涤的细胞沉淀物的放射性。¹²⁵I-IgG(完整)与K562细胞结合(这里表示为100％)，表示IgG与K562细胞特异性结合可通过添加冷IgG而抑制。小图B：将K562细胞与使用EndoS或PBS处理的人血浆一起孵育。将细胞重悬浮于裂解缓冲液，使用针对人IgG的抗血清通过SDS-PAGE和蛋白质印迹(Western blot)进行分析。

图6显示了EndoS处理的IgG不与单核细胞结合。小图A：将单核细胞与¹²⁵I-标记的IgG(完整或EndoS处理的)一起孵育。在室温下孵育30分钟之后，通过10％SDS-PAGE从细胞裂解物分离蛋白质(10μg总蛋白)。干燥凝胶，并通过感光成像进行分析。小图B：流式细胞计量分析显示在使用EndoS处理的血液中IgG与活化的单核细胞结合减少。在添加白细胞活化剂fMLP之前，使用EndoS处理人血液。使用小鼠抗人IgG和FITC标记的山羊抗小鼠IgG作为第二抗体检测与单核细胞结合的IgG。

图7显示了使用EndoS处理时，IgG与FcγRII解离。小图A：当与K562细胞结合的IgG与EndoS一起孵育但不与EndoS(E235Q)一起孵育时，IgG与FcγRIIa解离。将K562细胞与血浆一起孵育，然后与EndoS、EndoS(E235Q)或PBS一起孵育。通过SDS-PAGE并使用针对人IgG的抗血清的印迹来分析细胞裂解物(10μg总蛋白)的IgG。小图B：在使用EndoS处理之后与单核细胞结合的IgG与FcγR解离。将单核细胞与血浆一起孵育，之后与EndoS或PBS一起孵育。使用针对人IgG的抗血清对于重悬浮的细胞沉淀物的IgG进行分析。通过印迹法检测IgG的聚糖，并使用LCA凝集素检测其放射性。小图C：BIAcore设置显示了EndoS影响IgG1与固定化的受体FcγRIIa解离。在两个平行实验中，在IgG1-FcγRIIa相互作用的解离过程中，在相同时间点对注入EndoS(黑色曲线)与注入缓冲液(虚线)进行比较。

图8显示了来自不同化脓性链球菌血清型的马链球菌(S.equi)和兽疫链球菌(S.zooepidemicus)的EndoS同源物的ClustalW氨基酸序列比对。菌株名称、种以及M血清型在左侧显示。氨基酸同一性和相似性以灰色显示，共有序列在比对下显示。保守的壳多糖酶基序被加上边框，在比对下使用星号标记活性所必需的谷氨酸。

图9显示了EndoS α-结构域与来自脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)的EndoF₂和来自假结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)的CP40的ClustalW氨基酸序列比对。蛋白质名称在左侧显示。氨基酸同一性和相似性以灰色显示，共有序列在比对下显示。保守的壳多糖酶基序以方框表示，在比对下方使用星号标记活性所必需的谷氨酸。

序列说明

SEQ ID NO：1是从化脓性链球菌AP1分离的EndoS多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是衍生自SEQ ID NO：1的序列的修饰的EndoS多肽(E235Q)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是从化脓性链球菌AP1分离的EndoS多肽的氨基酸序列，包括信号序列。该序列对应于NCBI登录号AAK00850。

SEQ ID NO：4是从化脓性链球菌AP1分离的编码EndoS的核酸序列，包括信号序列。

SEQ ID NOS：5至7为引物序列。

SEQ ID NO：8是从化脓性链球菌AP1分离的IdeS的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是从化脓性链球菌AP1分离的IdeS的氨基酸序列，包括推定的信号序列。

SEQ ID NO：10是从化脓性链球菌AP1分离的编码IdeS的核酸序列，包括信号序列。

SEQ ID NO：11是成熟的蛋白H的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是蛋白H的氨基酸序列，包括信号序列。

SEQ ID NO：13是编码蛋白H的核酸序列，包括信号序列。

具体实施方式

一般多肽特性

本发明提供了利用细菌蛋白质EndoS和IdeS以及其他蛋白质的多种方法。术语“蛋白质”、肽以及多肽在本文可互换使用。可以这样理解：本发明的某些方法需要具有IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽，而本发明的其他方法需要缺失所述活性的修饰的EndoS多肽。

下列部分涉及本发明所有多肽的一般特性，特别涉及本发明多肽的氨基酸序列的变异、改变、修饰或衍生。可以这样理解：本文所述的多肽的变异、改变、修饰或衍生需要满足使这些多肽保留此说明书的后续部分所详述的任何必须的活性或特性的要求。

本发明多肽的变体可通过本说明书后续部分更详细描述的氨基酸同一性的特定水平来定义。可使用任何适当的算法来计算氨基酸同一性。例如，PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或比对序列(诸如识别同等或对应序列(特别是在它们的缺省设置下)，例如在“J Mol Evol”(Altschul S.F.(1993)，36：290-300)；“J Mol Biol”(Altschul S.F.等人(1990)，215：403-10)中所述。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法包括：首先通过识别查询序列中的长度W的短字段(当与数据库序列中相同长度的字段进行比对时，匹配或满足某一正阈值得分T)来识别高得分序列对(high scoring sequence pair，HSP)。T是指邻近字段得分阈值(Altschul等人，同上文)。这些初始的邻近字段命中用作起始搜索的种子，以发现含有它们的高得分序列对。该字段命中沿着各序列向两个方向延伸至累积比对得分不能增加。各方向的字段命中的延伸在下列情况停止；累积比对得分从其最大获得值降低X量；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分达到零或更低；或者，达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T以及X决定比对的敏感性和速度。BLAST程序使用11的字段长(W)，50个比对(B)的BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)、10的期望值(E)、M＝5、N＝4以及两条链的比较作为缺省值。

BLAST算法进行两个序列之间相似性的统计分析，参见例如“Karlin和Altschul (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787”。由BLAST算法提供的一种对相似性的测量值是最小总概率(P(N))，其提供了两条多核苷酸或氨基酸序列之间匹配偶然存在的概率读数。例如，如果在第一和第二序列比较的最小总概率小于约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，以及最优选小于约0.001，则认为该序列与另一序列相似。可选地，UWGCG软件包提供了可用于计算同源性(例如根据其缺省设置使用)(Devereux等人(1984)Nucleic Acids Research 12，387-395)的BESTFIT程序。

可以这样理解：本发明的多肽的变体还包括取代变体。取代变体优选包括使用一个或多个氨基酸取代相同数量的氨基酸，以及进行保守性氨基酸取代。例如，可使用具有相似特性的可选氨基酸取代氨基酸，所述可选氨基酸例如为另一碱性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一带电荷氨基酸、另一亲水性氨基酸、另一疏水性氨基酸、另一极性氨基酸、另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸。可用于选择适当的取代基的20种主要氨基酸的一些特性如下：

用于本发明的多肽可以是实质上的分离形式。可以这样理解：所述多肽可与不干扰所述多肽的预期目的的载体或稀释剂混合，并仍旧被认为是实质上分离的。用于本发明的多肽还可为实质上纯化的形式，在该情况中，通常在制剂中包含多肽，在该制剂中按重量计大于50％、例如大于80％、90％、95％或99％的多肽是本发明的多肽。

用于本发明的多肽的氨基酸序列可被修饰成包括非天然存在的氨基酸或增加化合物的稳定性。当通过合成方式制备多肽时，可在制备过程中引入所述氨基酸。所述多肽还可在合成或重组制备之后进行修饰。

用于本发明的多肽还可使用D-氨基酸制备。在这样的情况中，氨基酸以C至N方向连接在反向序列中。制备这样的多肽在本领域中是常规的。许多侧链修饰在本领域中是已知的，在多肽保留本文规定的任何所需活性或特征的条件下，可以对所述多肽的侧链实施所述的侧链修饰。

还可以这样理解：可对用于本发明的多肽进行化学修饰，例如翻译后修饰。例如，多肽可以进行糖基化、磷酸化或可以包含修饰的氨基酸残基。可通过添加信号序列将多肽修饰成促进插入细胞膜中。

还可将本发明的多肽衍生或修饰成有助于其分离或纯化。因此，在本发明的一个实施方案中，通过添加能够直接并特异性与分离工具相结合的配体对用于本发明的多肽进行衍生或修饰。可选地，通过添加结合对的一个成员对多肽进行衍生或修饰，并且分离工具包括通过添加结合对的另一成员而衍生或修饰的试剂。可以使用任何适当的结合对。在优选实施例中，通过添加结合对的一个成员而衍生或修饰用于本发明的多肽，所述多肽优选具有组氨酸标记或生物素标记。通常，以基因水平将组氨酸或生物素标签的氨基酸编码序列包括在内，在大肠杆菌(E.coli)中重组表达所述蛋白。组氨酸或生物素标签通常存在于多肽的一个末端，或者在N末端或者在C末端。组氨酸标签通常由六个组氨酸残基组成，但可以比该长度更长，通常达7、8、9、10或20个氨基酸，或比该长度更短，例如5、4、3、2或1个氨基酸。另外，组氨酸标签可含有一个或多个氨基酸取代，优选如上定义的保守取代。

具有IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽

在该情况中的EndoS多肽优选是化脓性链球菌EndoS，或者保留IgG内切糖苷酶活性的化脓性链球菌EndoS的变体或片段。所述变体可为来自诸如另一种细菌的另一种生物体的EndoS多肽。所述细菌优选为链球菌，例如马链球菌(Streptococcus equi)、兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)或优选化脓性链球菌。或者，所述变体可来自：假结核棒状杆菌，例如CP40蛋白，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，例如EndoE蛋白；或脑膜脓毒性伊丽莎白菌(以前称为脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)，例如EndoF2蛋白。来自多种化脓链球菌血清型和来自马链球菌和兽疫链球菌的EndoS变体序列示于图8。图9显示了EndoS的α结构域与来自脑膜脓毒性伊丽莎白菌的EndoF2和来自假结核棒状杆菌的CP40进行比对。

EndoS多肽可包括：

(a)SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

(b)(a)的变体，与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％同一性且具有IgG内切糖苷酶活性；或

(c)上述任一者的具有IgG内切糖苷酶活性的片段。

优选地，所述多肽包括SEQ ID NO：1或由其组成。SEQ ID NO：1是来自化脓性链球菌的无信号序列的EndoS的成熟形式。本发明的EndoS多肽可另外包含信号序列。例如，本发明的EndoS多肽可包含来自化脓性链球菌的EndoS的非成熟形式的氨基酸序列，该序列可公开获得(NCBI登录号：AAK00850)，并作为SEQ ID NO：3提供。SEQ ID NO：1对应于SEQ ID NO：3的氨基酸37至995。

在该部分中描述的变体多肽与SEQ ID NO：1或3中的氨基酸序列不同，但保留EndoS的IgG内切糖苷酶活性。只要肽保留IgG内切糖苷酶活性，所述变体可包括等位基因变体以及蛋白质序列内缺失、修饰或添加单个氨基酸或氨基酸组的变体。

变体序列通常通过至少1、2、3、5、10、20、30、50、100个或更多突变(可为氨基酸的取代、缺失或插入)而不同。只要修饰的多肽保留作为IgG特异性内切糖苷酶的活性，例如，可以进行1至100、2至50、3至30或5至20个氨基酸取代、缺失或插入。

SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的变体优选含有SEQ ID NO：1的残基191至199，即SEQ ID NO：1的Leu-191、Asp-192、Gly-193、Leu-194、Asp-195、Val-196、Asp-197、Val-198以及Glu-199(SEQ ID NO：3的残基227至235，即SEQ ID NO：3的Leu-227、Asp-228、Gly-229、Leu-230、Asp-231、Val-232、Asp-233、Val-234以及Glu-235)。这些氨基酸构成了以谷氨酸结束的壳多糖酶家族18活性位点。壳多糖酶的活性位点中谷氨酸为酶活性所必需的。因此，最优选地，SEQ ID NO：1或3的变体在与SEQ ID NO：1的199位(SEQ ID NO：3的235位)相当的位置含有谷氨酸。只要变体在与SEQ ID NO：1的199位(SEQ ID NO：3的235位)相当的位置含有谷氨酸，SEQ ID NO：1的变体可含有具有一个或多个保守取代的SEQ ID NO：1的残基191至199(SEQ ID NO：3的227至235)。

通常，认为下列多肽是SEQ ID NO：1或3的变体，即与SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列具有大于约50％、55％或65％同一性、优选至少70％、至少80％、至少90％以及特别优选至少95％、至少97％或至少99％同一性，显示EndoS的IgG内切糖苷酶活性。SEQ ID NO：1或3的变体的同一性可在SEQ ID NO：1中所示序列的至少100、至少250、至少500、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950、至少955个或更多连续的氨基酸的区域上测定，或更优选在SEQ ID NO：1或3的全长上测定。

用于本发明的EndoS多肽的片段只要保留EndoS的IgG内切糖苷酶活性，通常为至少10个氨基酸，例如长度为至少20、30、40、50个或更多氨基酸，直至长度达到100、200、250、300、500、750、800、850、900、950或955个氨基酸。优选地，用于本发明的EndoS多肽的片段包括SEQ ID NO：1的残基191至199，即SEQ ID NO：1的Leu-191、Asp-192、Gly-193、Leu-194、Asp-195、Val-196、Asp-197、Val-198以及Glu-199(SEQ ID NO：3的残基227至235，即SEQ ID NO：3的Leu-227、Asp-228、Gly-229、Leu-230、Asp-231、Val-232、Asp-233、Val-234以及Glu-235)。本发明的优选片段由SEQ ID NO：1的氨基酸1至409(SEQ ID NO：3的氨基酸37至445)组成，该片段对应于由链球菌半胱氨酸蛋白酶SpeB切割而产生的EndoS的酶活性的α结构域。另一优选的片段由SEQ IDNO：3的氨基酸37至995组成，该片段对应于去除信号序列之后的EndoS的分泌形式。

可从表达EndoS多肽或EndoS多肽的变体的任何适当的生物体分离用于本发明的多肽。通常，从适当的表达EndoS的链球菌的菌株(优选化脓性链球菌的菌株)分离EndoS多肽。可以通过多种技术来鉴定适当的生物体和菌株。例如，可以首先对化脓性链球菌菌株检测ndoS基因的存在。多核苷酸引物或探针可基于例如SEQ ID NO：1或3来设计。然后，可以通过使用所述引物的PCR或通过探针与化脓性链球菌菌株基因组DNA杂交来证实ndoS基因的存在。

可通过分析培养上清中IgG内切糖苷酶活性或通过使用针对EndoS的抗体进行免疫检测来鉴定表达活性EndoS的链球菌菌株或其变体。已经证实为表达活性EndoS的链球菌菌株为化脓性链球菌M1血清型菌株AP1和SF370、马链球菌菌株4047以及兽疫链球菌菌株H70。另外，在下列化脓性链球菌中发现ndoS基因：M1血清型菌株SSI-1和MGAS5005、M2血清型菌株MGAS10270、M3血清型菌株MGAS315、M4血清型菌株MGAS10750、M5血清型菌株Manfredo、M6血清型菌株MGAS10394、M12血清型菌株MGAS9429、M18血清型菌株MGAS8232、M28血清型菌株MGAS6180和M49血清型菌株591。

从表达化脓性链球菌的培养物或从表达EndoS的其他细胞的培养物分离和纯化EndoS通常基于IgG内切糖苷酶活性。优选地，所述纯化方法包括硫酸铵沉淀步骤和离子交换色谱步骤。根据一种方法，通过添加数量渐增的硫酸铵对培养基进行分级。硫酸铵的量可为10％-80％。优选地，使用50％的硫酸铵对培养基进行分级，并使用70％的硫酸铵对所得上清液进一步沉淀。然后将沉淀的多肽进行离子交换色谱，例如通过在Mono Q柱上进行快速蛋白液相色谱(FPLC)。可对洗脱级分分析IgG内切糖苷酶活性，并合并峰值活性的级分。可通过SDS PAGE对级分进行分析。可将各级分储存于-80℃。在纯化EndoS的替代方法中，使用GST基因融合系统(Amersham-Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)在大肠杆菌中表达无信号序列的EndoS(即具有SEQ ID NO：1的序列)。使用具有BamHI位点(其具有下划线)的引物5’-ACT-GGG-ATC-CCG-GAG-GAG-AAG-ACT-3’和具有XhoI位点(加下划线)的引物5’-TTA-ATC-TCG-AGG-TTG-CTA-TCT-AAG-3’从化脓性链球菌基因组DNA扩增覆盖ndoS序列的碱基304至3232的2929个碱基对PCR产物。使用BamHI和XhoI消化该片段，并将其连接至生成质粒pGEXndoS的pGEX-5X-3中，所述质粒用于转化大肠杆菌BL21(DE3)pLys。使用0.1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷诱导pGEXndoS/BL21(DE3)pLys。在诱导之后，使用BugBuster^TM(Novagen)裂解细菌，并于Glutathione-Sepharose上纯化GST-EndoS融合蛋白。根据规程(Amersham-Pharmacia Biotech)使用因子Xa去除GST标签，并使用Xarrest^TM琼脂糖(Novagen)去除残留的因子Xa。得到重组EndoS(rEndoS)的制剂，通过使用SDS-PAGE和使用EndoS特异性抗体的蛋白质印迹评价该重组EndoS为同质。在体内实验之前，通过0.2μm过滤器(Millipore)无菌过滤蛋白样品。将纯化的EndoS蛋白在-80℃下储存于磷酸盐缓冲盐水中。

用于本发明的多肽还可以此分离多肽的片段的形式来制备。另外，所述EndoS多肽还可通过人工合成或重组的方式制备。例如，重组EndoS多肽可以通过如下方式制备：用包含与适当的调控序列连接的编码所述多肽的核酸序列的表达载体在培养基中转染哺乳动物细胞，培养该细胞，提取并纯化由该细胞产生的EndoS多肽。

在该部分中描述的本发明的EndoS多肽表现了IgG内切糖苷酶活性。优选地，该多肽通过水解与天冬酰胺残基(对应于IgG重链多肽全长中的残基297)连接的保守聚糖来水解IgG或IgG Fc片段。优选地，该多肽水解连接天冬酰胺的聚糖的β-1，4-二-N-乙酰壳二糖核。优选地，该活性对于IgG是特异性的。

可通过适当的分析方法来测定内切糖苷酶活性。例如，可在适当的温度诸如37℃下将试验多肽与IgG一起孵育。然后，可以通过SDS PAGE分析起始材料和反应产物。通常，如果试验多肽具有IgG内切糖苷酶活性，则IgG重链的分子量减少大约3kDa。用于测定试验多肽是否具有IgG内切糖苷酶活性的另一分析方法是通过使用小扁豆(Lens culinaris)凝集素(LCA)，并可选地使用辣根过氧化物酶和过氧化物酶底物检测糖基化的IgG。通常，如果试验多肽具有IgG内切糖苷酶活性，则糖信号减弱。用于测定试验多肽是否具有IgG内切糖苷酶活性的另一分析方法是通过将试验多肽与纯化的IgG Fc片段一起孵育，然后使用10mM二硫苏糖醇对样品进行还原并进行质谱(MALDI-TOF)分析。通常，如果试验多肽具有IgG内切糖苷酶活性，则单体IgG Fc的质量减少1417±14Da。

所述多肽的内切糖苷酶活性可进一步通过抑制研究来表征。

所述多肽的内切糖苷酶活性通常具有IgG特异性，因为当在能够切割IgG的条件下将所述多肽与其他种类的Ig(即IgM、IgA、IgD以及IgE)一起孵育时，所述多肽不会降解这些免疫球蛋白。EndoS多肽能够水解存在于从受试者取得的样品中的IgG分子。因此，在受试者为人的情况下，EndoS多肽能够水解人IgG的重链上的聚糖。EndoS能够水解人IgG的所有四种亚类(IgG_1-4)。在优选的实施方案中，EndoS多肽具有水解人、恒河猴、小鼠、大鼠、家兔、马、山羊、狗以及猪IgG的能力。

缺失IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽

该情况中的EndoS多肽优选为被设计成缺失IgG内切糖苷酶活性但具有IgG结合活性的修饰的化脓性链球菌EndoS。对于IgG结合活性，可以这样理解：该修饰的EndoS结合正常糖基化的IgG或其变体或其片段，特别是其Fc片段。对于“正常糖基化的”，可以这样理解：IgG分子或其片段的变体是糖蛋白，其中至少包含与至少一个糖基团(如被发现的与天然存在的IgG分子偶联的糖基团)偶联的IgG多肽重链(或其片段的变体)。特别地，所述至少一个糖基团是与对应于IgG重链多肽全长中的残基297的天冬酰胺连接的聚糖。优选地，连接天冬酰胺的聚糖具有β-1，4-二-N-乙酰壳二糖核。

优选通过定点突变来设计EndoS多肽。对于IgG结合活性，可以这样理解：该部分中描述的EndoS多肽结合至少一种IgG亚类、优选两种、三种或所有四种IgG亚类(IgG_1-4)。优选地，以高亲和力和/或高特异性结合至少一种IgG亚类。

高亲和力表示所述修饰的EndoS与IgG亚类相互作用的结合亲和常数(K_D)大于0.05μM，优选大于0.06μM、0.07μM或0.08μM。可对结合活性进行测定，并通过任何适当的方法评价结合亲和力。例如，通过表面等离子共振相互作用分析、平衡透析或结合例如Scatchard分析的任何标准生物化学方法。

高特异性表示当在能够结合IgG的条件下将所述多肽与其他种类的Ig(即IgM、IgA、IgD以及IgE)一起孵育时，所述多肽不会结合这些免疫球蛋白。

除了这一例子中的变体缺乏IgG内切糖苷酶活性，但具有IgG结合活性外，该变体也可以如前一部分中所描述那样，从来自其另外的有机体，例如其他细菌的EndoS多肽衍生得到。所述修饰的IgG多肽可包含：

(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；

(b)(a)的变体，该变体缺乏IgG内切糖苷酶活性，与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少50％同一性；或

(c)上述任一者的片段，该片段缺失IgG内切糖苷酶活性。

优选地，所述多肽包含SEQ ID NO：2的序列或由SEQ ID NO：2的序列组成。SEQ ID NO：2衍生自SEQ ID NO：1的序列，但通过在SEQ ID NO：1的199位用谷氨酸(E)取代谷氨酰胺(Q)而被设计成缺乏IgG内切糖苷酶活性。这对应于SEQ ID NO：3(NCBI登录号AAK00850)的235位，该特别的修饰被称为E235Q。如上所述，这些多肽通常具有IgG结合活性。

该部分中所描述的变体多肽是指氨基酸序列与SEQ ID NO：2中的氨基酸序列不同，但缺乏IgG内切糖苷酶活性并保留IgG结合活性的那些多肽。只要该肽保留上述特征，这些变体可包括等位基因变体，以及在蛋白序列内缺失、修饰或添加单个氨基酸或氨基酸组的变体。

所述变体序列通常有至少1、2、3、5、10、20、30、50、100个或更多突变(可为氨基酸的取代、缺失或插入)而不同。只要修饰的多肽缺乏IgG内切糖苷酶活性，并保留IgG结合活性，例如，可以进行1至100、2至50、3至30或5至20个氨基酸取代、缺失或插入。

SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变体优选含有SEQ ID NO：2的残基191至199，即SEQ ID NO：2的Leu-191、Asp-192、Gly-193、Leu-194、Asp-195、Val-196、Asp-197、Val-198以及Gln-199(相当于SEQ ID NO：1的残基191至199)。除了C末端的谷氨酸被谷氨酰胺取代，与在SEQ ID NO：1中相同，这些氨基酸构成了壳多糖酶家族18活性位点。壳多糖酶的活性位点中谷氨酸为酶活性所必需的。因此，最优选地，SEQ ID NO：2的变体在与SEQ ID NO：2的199位相当的位置含有谷氨酰胺。只要该变体在与SEQ ID NO：2的199位相当的位置不含有谷氨酸，SEQ ID NO：2的变体可含有具有一个或多个保守取代的SEQ ID NO：2的残基191至199。

通常，认为下列多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变体，该多肽与SEQID NO：2的氨基酸序列具有大于约50％、55％或65％同一性，优选至少70％、至少80％、至少90％，特别优选至少95％、至少97％或至少99％同一性，并缺乏IgG内切糖苷酶活性，保留IgG结合活性。SEQ ID NO：2的变体的同一性可以在SEQ ID NO：2所示序列的至少100、至少250、至少500、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950、至少955个或更多连续的氨基酸的区域测定，或更优选在SEQ ID NO：2的全长测定。

只要EndoS多肽的片段缺乏IgG内切糖苷酶活性并保留IgG结合活性，用于本发明的EndoS多肽的片段通常为至少10个氨基酸，例如长度为至少20、30、40、50个或更多氨基酸，长度长达100、200、250、300、500、750、800、850、900、950或955个氨基酸。优选地，在该种情况下用于本发明的EndoS多肽的片段包括SEQ ID NO：2的残基191至199，即SEQ ID NO：2的Leu-191、Asp-192、Gly-193、Leu-194、Asp-195、Val-196、Asp-197、Val-198以及Gln-199。本发明的优选片段由SEQ ID NO：2的氨基酸1至409组成，其对应于由链球菌半胱氨酸蛋白酶SpeB切割而生成的EndoS的酶活性的α结构域。

可使用针对EndoS的抗体通过免疫检测来鉴定表达缺乏IgG内切糖苷酶活性并保留IgG结合活性的EndoS或其变体的链球菌菌株，然后如上所述分析IgG内切糖苷酶活性和IgG结合活性。被证实表达活性EndoS的链球菌菌株在上文部分中有描述。这些菌株代表可表达缺乏IgG内切糖苷酶活性和保留IgG结合活性的的优秀候选。从化脓性链球菌表达培养物分离和纯化EndoS也在上文中有描述。

在一个可选方法中，具有所需特性的EndoS蛋白可通过改变编码EndoS蛋白的核苷酸，然后在适当系统中表达所述核苷酸来制备。适当的方法包括编码所述蛋白的核苷酸的定点突变。该技术广泛用于蛋白功能的研究。该技术通常基于寡核苷酸并包括下列步骤：

(1)将编码目的蛋白的DNA克隆至质粒载体；

(2)对该质粒DNA进行变性而产生单链；

(3)使变性的DNA接触与一条靶序列互补但引入所需突变(点突变、缺失或插入)的合成寡核苷酸(或多条寡核苷酸)，使得所述合成的寡核苷酸与靶区域发生退火；

(4)使用质粒DNA链作为模板通过DNA聚合酶延伸突变的链；

(5)通过转化到大肠杆菌中来扩增异源双链(突变/非突变链)。

在扩增之后，生成的异源双链约50％为突变体，其他50％为“野生型”(非突变)。使用筛选和富集方法来帮助产生突变体。例如，可使用仅消化甲基化DNA(DpnI)的限制酶消化亲本非突变链。由于新合成的链为非甲基化，而亲本链被甲基化(如果从正确的大肠杆菌背景纯化)，所以该操作允许在转化大肠杆菌之前从反应中去除亲本链。

定点突变的可选方案包括：

(1)使用特异性诱变引物的基于聚合酶链反应(PCR)的方法，或者具有随后对所需突变或蛋白功能的丧失/获得进行筛选的错配PCR；

(2)将携带目的基因的质粒导入大肠杆菌突变菌株(DNA校正系统缺失)，随后筛选所需突变或蛋白功能的丧失/获得；

(3)化学合成含有所需突变的部分或完整基因，然后将其引入适当的蛋白表达系统。

可选地，具有所需特性的EndoS蛋白可通过DNA非依赖性方法制备，所述方法包括化学合成具有所需突变的多肽的一部分。

用于本发明的多肽也可以这些分离的多肽的片段的形式被制备。另外，EndoS多肽还可以通过人工合成或重组的方式制备。例如，重组EndoS多肽可以通过如下方式制备：用包含与适当的调控序列连接的编码所述多肽的核酸序列的表达载体转染哺乳动物细胞，培养该细胞，提取并纯化由该细胞产生的EndoS多肽。

所述多肽的IgG结合活性通常是IgG特异性的，因为当在允许相互结合的条件下将所述多肽与其他类型的Ig(即IgM、IgA、IgD以及IgE)一起孵育时，所述多肽不结合这些免疫球蛋白。EndoS多肽能够结合存在于从受试者所取的样品中的IgG分子。因此，在受试者为人的情况下，EndoS多肽能够结合人IgG。EndoS能够结合人IgG的所有四种亚类(IgG_1-4)。在优选的实施方案中，EndoS多肽具有结合人、恒河猴、小鼠、大鼠、家兔、马、山羊、狗以及猪IgG的能力。

IdeS

IdeS是由人病原体化脓性链球菌产生的细胞外半胱氨酸蛋白酶，描述于WO03/051914中。IdeS最初是从血清型M1的A组链球菌菌株分离得到，但目前已经在所有试验的A组链球菌菌株中鉴定到ides基因。IdeS具有非常高度的底物特异性，其唯一鉴定到的底物是IgG。IdeS催化人IgG的低铰链区中的单一蛋白酶剪切。该蛋白酶降解加强对于调理吞噬的抑制，并干扰对于A组链球菌的杀伤。IdeS还切割多种动物中的IgG的某些亚类，并将IgG有效转变为Fc和Fab片段。Ides基因已经被克隆并在大肠杆菌中以GST融合蛋白的形式表达。

用于本发明方法的IdeS多肽优选为化脓性链球菌IdeS，或化脓性链球菌IdeS的保留半胱氨酸蛋白酶活性的变体或片段。所述变体可为来自另一种生物体(例如另一种细菌)的IdeS多肽。所述细菌优选为链球菌。所述链球菌优选为A组链球菌，C组链球菌或G组链球菌。特别地，所述变体可为来自诸如马链球菌或兽疫链球菌的C组链球菌的IdeS多肽。可选地，所述变体可来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。

IdeS多肽可包括：

(a)SEQ ID NO：8的氨基酸序列；

(b)(a)的变体，该变体与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少50％同一性，并具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性；或

(c)上述任一者的片段，该片段具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性。

优选地，IdeS多肽包括SEQ ID NO：8的序列或由该序列组成。SEQ ID NO：8是IdeS的成熟形式的序列，无信号序列，对应于SEQ ID NO：9的氨基酸30至339。

变体IdeS多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：8的氨基酸序列，但表现与IdeS相同的IgG半胱氨酸蛋白酶活性。通常，认为与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有大于约50％、55％或65％同一性，优选至少70％、至少80％、至少90％，特别优选至少95％、至少97％或至少99％同一性的多肽是该蛋白的变体。只要所述变体保留IdeS的基本功能，该肽可以包括等位基因变体，以及在蛋白质序列内删除、修饰或添加单个氨基酸或氨基酸组的变体。SEQ ID NO：8的变体的同一性可以在SEQ ID NO：8所示序列的至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少250、至少275、至少300个或更多连续的氨基酸的区域上测定，或更优选在SEQ ID NO：8的全长上测定。

SEQ ID NO：8的氨基酸序列的变体优选含有SEQ ID NO：8的残基Lys-55和/或Cys-65和/或His-233和/或Asp-255和/或Asp-257。最优选地，SEQ ID NO：8的变体含有SEQ ID NO：8的Lys-55、Cys-65、His-233、Asp-255以及Asp-257各残基。

所述变体序列通常有至少1、2、5、10、20、30、50个或更多突变(可为氨基酸的取代、缺失或插入)而不同。例如，可以进行1至50、2至30、3至20或5至10个氨基酸取代、缺失或插入。所述修饰的多肽保留作为IgG特异性半胱氨酸蛋白酶的活性。优选地，所述变体多肽在半胱氨酸蛋白酶通常存在半胱氨酸残基和组氨酸残基的间距中包含半胱氨酸残基和组氨酸残基。例如，在SEQ ID NO：8中，这些残基间隔约130个氨基酸，同半胱氨酸蛋白酶中通常存在的间隔一样。

只要保留IdeS的IgG半胱氨酸蛋白酶活性，用于本发明的IdeS多肽的片段通常为至少10个氨基酸，例如长度为至少15、20、25、30、40、50个或更多氨基酸，长度长达100、150、200、250或300个氨基酸。优选地，用于本发明的IdeS多肽的片段包括SEQ ID NO：1的残基Lys-55和/或Cys-65和/或His-233和/或Asp-255和/或Asp-257。最优选地，所述片段包括SEQ ID NO：8的Lys-55、Cys-65、His-233、Asp-255以及Asp-257各残基。

用于本发明的IdeS多肽表现有免疫球蛋白半胱氨酸蛋白酶活性，特别是IgG半胱氨酸蛋白酶活性。优选地，该多肽在铰链区裂解IgG，更特别地在重链的铰链区裂解IgG。裂解导致产生IgG的Fc和Fab片段。优选地，该活性对于IgG具有特异性。半胱氨酸蛋白酶活性可借助于适当的分析方法来测定。例如，可在适当的温度(例如37℃)下将试验多肽与IgG一起孵育。然后通过SDS PAGE分析起始材料和反应产物，以确定是否存在所需的IgG裂解产物。通常，该裂解产物为31kDa的片段。通常，在该第一裂解之后没有IgG的进一步裂解。对该裂解产物进行N末端测序，以证实在IgG的铰链区发生了裂解。优选地，N末端序列包括序列GPSVFLFP。

所述多肽的半胱氨酸蛋白酶活性可通过抑制研究来进一步表征。优选地，通过作为蛋白酶抑制剂的肽衍生物Z-LVG-CHN₂和/或碘乙酸来抑制活性。然而，活性通常不受E64抑制。

所述多肽的半胱氨酸蛋白酶活性通常具有IgG特异性，因为当在能够裂解IgG的条件下将所述多肽与其他种类的Ig(即IgM、IgA、IgD以及IgE)一起孵育时，所述多肽不会降解这些免疫球蛋白。IdeS多肽能够裂解人IgG。在优选的实施方案中，IdeS多肽具有裂解人、家兔、小鼠或山羊IgG的能力。

可从表达IdeS多肽的任何适当的生物体分离用于本发明的IdeS多肽。通常，从适当的表达IdeS的化脓性链球菌的菌株分离IdeS多肽。适当的生物体和菌株可通过多种技术来鉴定。例如，可以首先对化脓性链球菌菌株检测ides基因的存在。多核苷酸引物或探针可基于例如SEQ ID NO：8、9或10来设计。然后，可通过使用所述引物的PCR或通过探针与化脓性链球菌菌株基因组DNA杂交来证实ides基因的存在。

可通过分析培养上清中的IgG半胱氨酸蛋白酶活性来鉴定表达活性IdeS的化脓性链球菌菌株。优选地，将抑制剂E64添加至上清液中以抑制任何SpeB半胱氨酸蛋白酶活性。至少五种菌株表达活性IdeS：菌株AP1、AP12、AP55、KTL3以及SF370。优选地，所述表达菌株选自AP1、AP12以及AP55。

从表达化脓性链球菌的培养物或从表达IdeS的其他细胞的培养物分离和纯化IdeS通常基于IgG半胱氨酸蛋白酶活性。优选地，所述纯化方法包括硫酸铵沉淀步骤和离子交换色谱步骤。一种方法是通过添加数量渐增的硫酸铵对培养基进行分级。硫酸铵的量可为10％-80％。优选地，使用50％的硫酸铵对培养基进行分级，并使用70％的硫酸铵对所得上清液进一步沉淀。然后对沉淀的多肽实施离子交换色谱，例如在Mono Q柱上进行FPLC。可对洗脱的级分分析IgG半胱氨酸蛋白酶活性，合并峰值活性的级分。可通过SDS PAGE对级分进行分析。例如，可从SDS PAGE蛋白带获得N末端序列。可将级分储存于-20℃。

Fc结合蛋白

优选用于本发明方法的Fc结合蛋白是在上述相关部分中描述的缺乏内切糖苷酶活性的经修饰的EndoS多肽。只要是正常糖基化的，本发明所述经修饰的EndoS多肽结合所有IgG亚类的Fc片段。

用于本发明方法的另一种优选的Fc结合蛋白是蛋白H。蛋白H由化脓性链球菌表达，其在EP-A-0371199和WO 91/19740中描述。蛋白H具有免疫球蛋白结合特性(例如结合IgG的Fc部分)的特征光谱。它还能够结合白蛋白。已经鉴定了蛋白H内的多个区域，并将其命名为S、A、B、C1、C2、C3以及D区。IgG Fc结合结构域存在于AB区，而C重复(C1、C2以及C3)负责白蛋白结合。已发现蛋白H靶向细胞核并具有抑制细胞效应。

用于本发明方法的蛋白H多肽优选为化脓性链球菌蛋白H，或保留IgG Fc结合活性的化脓性链球菌蛋白H的变体或片段。该变体可为来自另一种生物体(例如另一种细菌)的蛋白H多肽。该细菌优选为链球菌。

蛋白H多肽可包括：

(a)SEQ ID NO：11的氨基酸序列；

(b)(a)的变体，该变体与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少50％同一性，并具有IgG Fc结合活性；或

(c)上述任一者的片段，该片段具有IgG Fc结合活性。

优选地，蛋白H多肽包含SEQ ID NO：11的序列或其由该序列组成。SEQ IDNO：11是蛋白H的成熟形式的序列，没有信号序列，对应于SEQ ID NO：12的氨基酸42至376。

所述变体多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：11的氨基酸序列，但表现与蛋白H相同的IgG Fc结合活性。通常，认为与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有大于约50％、55％或65％同一性，优选至少70％、至少80％、至少90％同一性，特别优选至少95％、至少97％或至少99％同一性的多肽是所述蛋白的变体。只要保留蛋白H的基本功能，所述变体可包括等位基因变体，以及蛋白质序列内缺失、修饰或添加单个氨基酸或氨基酸组的变体，。SEQ ID NO：11的同一性可以在SEQ ID NO：11所示序列的至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少250、至少275、至少300个或更多连续的氨基酸的区域上测定，或更优选在SEQ ID NO：11的全长上测定。

SEQ ID NO：4的氨基酸序列的变体优选含有SEQ ID NO：11的氨基酸1至117(为含有负责IgG Fc结合的残基的蛋白H的N末端AB区)。这样的变体最优选含有SEQ ID NO：11的残基84至108(为蛋白H的IgG Fc结合部分)。蛋白H的变体优选含有蛋白H的C重复(C1、C2以及C3)，即SEQ ID NO：11的氨基酸118至242。

所述变体序列通常有至少1、2、5、10、20、30、50个或更多突变(可为氨基酸的取代、缺失或插入)而不同。例如，可以进行1至50、2至30、3至20或5至10个氨基酸的取代、缺失或插入。所述修饰的多肽保留IgG Fc结合活性。

只要保留蛋白H的IgG Fc结合活性，用于本发明的蛋白H多肽的片段通常为至少10个氨基酸，例如长度为至少15、20、25、30、40、50个或更多氨基酸，长度长达100、150、200、250、300或325个氨基酸。优选地，用于本发明的蛋白H多肽的片段包括SEQ ID NO：11的残基84至108。SEQ ID NO：11的优选片段包括SEQ ID NO：11的氨基酸1至117(蛋白H的N末端AB区，含有负责IgG Fc结合的区域)；SEQ ID NO：11的氨基酸1至108；SEQ ID NO：11的氨基酸1至80(为N末端A区)；SEQ ID NO：11的氨基酸1至77；SEQ ID NO：11的氨基酸81至117(蛋白H的B区)；SEQ ID NO：11的氨基酸1至305(在大肠杆菌中重组制备的蛋白H的形式)；以及SEQ ID NO：11的氨基酸1至285(为通过链球菌半胱氨酸蛋白酶作用从链球菌细胞表面裂解的蛋白H的形式)。

用于本发明的多肽表现有IgG Fc结合活性。可借助于诸如使用放射性标记的IgG Fc作为探针的蛋白质印迹或狭线印迹的适当分析方法或借助于例如“Molecular Microbiology”(Frick等人，(1994)，12：143-151)中描述的ELISA来测定IgG Fc结合活性。

蛋白H多肽的IgG Fc结合活性可通过抑制研究来进一步表征。例如，如“Molecular Microbiology”(Frick等人，1994，12：143-151)中描述的那样，可使用蛋白H多肽来抑制放射性标记的蛋白H与固定于聚丙烯酰胺珠上的IgG Fc的结合。

所述蛋白H多肽的Fc结合活性通常具有IgG特异性，因为当在能够结合IgG的条件下将所述多肽与其他种类的Ig(即IgM、IgA、IgD以及IgE)一起孵育时，所述多肽不会结合这些免疫球蛋白。蛋白H多肽能够结合人IgG。在优选的实施方案中，该多肽具有结合人、家兔以及狒狒IgG的能力。

可从表达蛋白H的任何适当的生物体分离用于本发明的蛋白H多肽。通常，从适当的表达蛋白H的化脓性链球菌的菌株分离蛋白H多肽。适当的生物体和菌株可通过多种技术来鉴定。例如，可以首先对化脓性链球菌菌株检测编码蛋白H的基因的存在。多核苷酸引物或探针可基于例如SEQ ID NO：11、12或13来设计。然后，可通过使用所述引物的PCR或通过探针与化脓性链球菌菌株的基因组DNA杂交来证实编码蛋白H的基因的存在。

可通过分析培养上清中IgG结合活性来鉴定表达活性蛋白H的化脓性链球菌菌株。表达活性蛋白H的化脓性链球菌菌株属于M1血清型，例如AP1。

从表达化脓性链球菌的培养物或从表达蛋白H的其他细胞的培养物分离和纯化蛋白H通常基于IgG结合活性。优选地，所述纯化方法包括使用偶联至凝胶的IgG的亲和色谱的步骤。

与上述相似的考虑事项应用于可用于本发明方法的其他适当的Fc结合蛋白。例如，一种或多种蛋白G(通常来自链球菌)、蛋白A(通常来自葡萄球菌)以及蛋白A/G(将蛋白A和蛋白G的IgG结合结构域组合的重组融合蛋白)可以被用来代替本发明方法中的蛋白H或与本发明方法中的蛋白H一起使用。这些蛋白作为微生物来源的天然和重组蛋白被良好表征，所有都具有结合哺乳动物免疫球蛋白的Fc区的能力。对于所有抗体亚类来说，各种蛋白和免疫球蛋白之间的相互作用不相同，应理解优选具有IgG特异性Fc结合活性的Fc结合蛋白。

用于分离基本上不含与FcγR结合的IgG分子的细胞群的方法

被分为四个亚类IgG₁、IgG₂、IgG₃以及IgG₄的IgG被描述为与提供不同活化模式的不同类型的FcγR相互作用。FcγR提供了体液免疫反应和细胞免疫反应之间的联系。吞噬细胞表达三种类别的IgG-Fc受体FcγRI、FcγRII以及FcγRIII的成员，其具有以下特征：结构和功能同源性以及在IgG的C_H2区上的特异性识别位点。病原体-IgG复合物与FcγR的结合通过起始导致抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、补体依赖性细胞毒作用(CDCC)、胞吞作用、吞噬作用、氧化爆发、炎症介质释放等的信号级联而介导宿主针对病原体的基本反应。除了激活补体的C1q组分，复合的IgG-FcγR还激活其他配体，例如，甘露聚糖结合凝集素(MBL)、新生儿受体FcRn、甘露糖受体(MR)等。FcγR可于造血细胞上组成性表达，并可被细胞因子和其他因子诱导或上调。FcγR负责平衡免疫系统中激活信号(FcγRI、FcγRIIa以及FcγRIIIa)和抑制信号(FcγRIIb)，具有活化和抑制IgG介导的效应子刺激(effector stimulation)的能力。

因此，在免疫学研究中，对FcγR介导的效应很感兴趣。然而，体外评价这些效应是复杂的，因为从受试者或个体分离的细胞通常预先装载了与其FcγR结合的IgG。因此，受体被封闭，阻止了进一步的分析。现有技术中无适当的试剂从FcγR去除结合的IgG而不对细胞产生额外的损害。因此，研究者不得不使用可在无IgG的情况下培养的表达FcγR的细胞系。这仅提供了与从受试者分离的天然细胞近似的细胞，因此该领域的研究受阻。本发明人证明，具有IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽可水解IgG的所有亚类，阻止它们与FcγR结合。另外，本发明人证明，使细胞与EndoS接触导致结合的IgG从FcγR释放。因此，可对天然细胞进行先前被限制于细胞系的研究。例如，能够研究IgG/受体亲和力、动力学以及计算每个细胞的受体数量，且阐明非细胞系的天然细胞中Fc介导的信号传导事件。

因此，本发明提供了用于分离基本不含与Fcγ受体结合的IgG分子的细胞群的方法，所述方法包括使含有细胞的样品与EndoS多肽接触，以及从所接触过的样品中分离细胞，由此获得所述细胞群。

所述含有细胞的样品可以是取自受试者或个体的血液或血清样品，或者可以是细胞培养基。所述受试者或个体优选为人，但可为动物，优选地，选自恒河猴、小鼠、大鼠、家兔、马、山羊、狗以及猪。

在适于EndoS多肽和细胞之间产生相互作用并呈现内切糖苷酶活性的条件下，使含有细胞的样品与该多肽接触。适当的条件包括使用浓度为至少1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、15μg/ml或20μg/ml的EndoS，优选至少10μg/ml的EndoS。适当的条件还包括将含有细胞的样品与EndoS一起孵育至少20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟或120分钟，优选至少90分钟。孵育优选在室温下进行，更优选在大约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃下进行，以及最优选在大约37℃进行。

通过任何适当的方法从所述接触的样品中分离细胞。适当的方法包括导致活细胞分离的方法。因此，这些方法包括不损害细胞或不诱导细胞炎症反应的方法。适当的方法包括，例如轻柔洗涤细胞。轻柔洗涤旨在涵盖至少一个下列情况：在大约1000×g下离心含有细胞的样品大约5分钟，然后抽吸上清液并将沉淀物重悬浮于适当的新鲜细胞培养基中。所述离心、抽吸以及重悬浮步骤优选重复至少1、2、3、4次或优选5次。

可选方法可包括用于从样品中去除EndoS多肽的方法，或从样品中去除裂解的IgG的方法。用于从样品中去除EndoS的优选方法包括使用如上所述被衍生或修饰的EndoS。

优选的修饰包括添加组氨酸标签。组氨酸标签的存在意味着多肽以高亲和力与在其表面含有携带镍、铜或锌离子的螯合基团的试剂或分离工具结合。组氨酸标签与这些金属离子强力结合。因此这样的试剂可用于从样品分离EndoS。

另一种优选的修饰包括添加生物素标签。生物素标签的存在意味着多肽以高亲和力与包含链霉亲和素的试剂或分离工具结合。生物素标签与链霉亲和素强力结合。这样的试剂可因此用于从样品分离EndoS。

优选的试剂或分离工具为能够结合EndoS多肽的磁性颗粒群。例如，在使用组氨酸标签衍生EndoS多肽的情况中，磁性颗粒在其表面含有携带镍、铜或锌离子的螯合基团。或者，在使用生物素标签衍生EndoS多肽的情况中，磁性颗粒在其表面含有链霉亲和素。

因此，从样品中去除EndoS的优选方法包括使用如上所述的磁性颗粒群并对样品进行磁场分离。磁性颗粒优选为磁性纳米颗粒，磁场分离优选为高梯度磁场分离。

应理解，可使用任何适当的分离方法。例如，可使用基于超速离心和超声的分离技术。另一示例是在一个实施方案中，所述分离工具包括固体载体。优选的固体载体包括可用作亲和色谱柱中的基质的交联琼脂珠或类似物。或者，固体载体可包括适当的硅基材料或聚苯乙烯。在一个实施方案中，固体载体可以包括可直接吸附待分离的多肽的塑料容器(例如微量滴定板或相当物)。

可选的分离工具包括包含待分离多肽的特异性抗体的试剂，该试剂可通过本领域的标准方法生成。在该意义上的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体或人源化抗体。所述抗体可为完整的免疫球蛋白分子或其片段(诸如Fab、F(ab’)2或Fv片段)。如果存在多于一个抗体，则所述抗体优选具有不同的非重叠决定簇，使得它们可以同时结合多肽。所述抗体可结合固体载体或可标记或与另一化学基团或分子结合以有助于它们的分离或离析。例如，典型的化学基团包括诸如荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)的荧光标记，或诸如生物素的标签。

其他可选方法可还包括用于去除已经从Fcγ受体解离的IgG的方法。可通过添加能够结合非糖基化和/或变性形式的IgG的可选IgG结合试剂而从样品中去除解离的IgG。适当的试剂包括蛋白A和蛋白G。然后，从样品中分离这些试剂，由此去除解离的IgG。对可选的IgG结合试剂进行上述对EndoS实施的衍生或修饰以有助于它们的分离。可对优选的可选IgG结合试剂进行衍生或修饰以与分离工具相互作用，所述分离工具与上述衍生或修饰的EndoS相同。例如，可将可选的IgG结合试剂进行衍生或修饰以与磁性颗粒群相互作用，所述磁性颗粒群与衍生或修饰的EndoS相同。然后，可通过磁场分离从样品中去除EndoS多肽和可选的IgG结合试剂。

测定样品中是否存在IgG的方法或从含有IgG的样品中分离IgG的方法

本领域中通常使用诸如蛋白G或蛋白A的试剂进行IgG的分离和/或检测。这些细菌蛋白很好地与IgG相互作用。然而，蛋白A不结合所有四种IgG亚类(IgG_1-4)，并且蛋白A和蛋白G均不能区分非糖基化和/或变性的无活性IgG和糖基化和/或天然的功能活性IgG。相比之下，本发明人已经鉴定了缺乏IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽通常以高亲和力结合所有四种IgG亚类，并对正常糖基化的IgG(即其天然的功能活性形式的IgG)具有选择性。

因此，本发明提供了用于测定样品中是否存在IgG的改良方法，所述方法包括使所述样品与缺乏IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽接触，从所述接触过的样品中分离所述EndoS，并由此测定是否存在IgG，可选地，在IgG存在的情况，获得分离的IgG。因此，本发明还提供了一种用于从含有IgG的样品中分离IgG的方法，所述方法包括使所述样品与缺失IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽接触，从所述接触过的样品中分离所述EndoS，由此获得分离的IgG。

在适于EndoS多肽和上述样品之间产生相互作用并呈现IgG结合活性(即能够形成IgG-EndoS多肽复合物)的条件下，使所述多肽与所述样品接触。适当的条件包括使用浓度为至少1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、15μg/ml或20μg/ml的EndoS，优选至少10μg/ml的EndoS。适当的条件还包括将所述样品与EndoS一起孵育至少20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟或120分钟，优选至少60分钟。孵育优选在室温下进行，更优选在大约20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃下进行，最优选在大约37℃进行。

这些方法中EndoS特有的优点是EndoS特异性结合正常糖基化的IgG。其他IgG结合剂的IgG结合活性通常需要IgG糖蛋白变性或通过IgG糖蛋白变性而提高。这通常通过使用酸来处理含有IgG的样品来实现。这样的处理可损害某些抗体(酸敏感性抗体)或使其变性。由于本发明的方法不需要这样的处理，所述方法特别适于从样品中分离天然形式的酸敏感性IgG。

可通过任何适当的方法从所述接触过的样品中分离EndoS。用于从样品中去除EndoS的优选方法包括使用如上所述被衍生或修饰的EndoS。

优选的修饰包括添加组氨酸标签。组氨酸标签的存在意味着多肽以高亲和力与在其表面含有携带镍、铜或锌离子的螯合基团的试剂或分离工具结合。组氨酸标签与这些金属离子强力结合。这样的试剂可因此用于从样品中分离EndoS。

另一种优选的修饰包括添加生物素标签。生物素标签的存在意味着多肽以高亲和力与包含链霉亲和素的试剂或分离工具结合。生物素标签与链霉亲和素强力结合。这样的试剂可因此用于从样品中分离EndoS。

优选的试剂或分离工具为能够结合EndoS多肽的磁性颗粒群。例如，在使用组氨酸标签衍生EndoS多肽的情况中，磁性颗粒在其表面含有携带镍、铜或锌离子的螯合基团。或者，在使用生物素标签衍生EndoS多肽的情况中，磁性颗粒在其表面含有链霉亲和素。

因此，从样品中去除EndoS的优选方法包括使用如上所述的磁性颗粒群，并对于样品进行磁场分离。磁性颗粒优选为磁性纳米颗粒，磁场分离优选为高梯度磁场分离。

应理解，可使用任何适当的分离工具。例如，前一部分中描述的可选工具。

可通过任何适当的方法评价所述接触过的样品的EndoS是否存在结合的IgG。

例如，可对EndoS的分子量进行分析。结合IgG的EndoS具有比不结合IgG的EndoS更高的分子量。因此，适当的方法包括任何能够通过分子量区分蛋白质种类的方法，例如SDS-PAGE和蛋白质印迹，质谱法等。或者，可通过使用IgG特异性抗体或对特定IgG亚类具有特异性的抗体直接对上述蛋白质印迹分析IgG的存在。以该方式在印迹中检测蛋白质是本领域中广泛使用的技术。

用于检测是否存在结合EndoS的IgG的其他适当方法包括在偶联酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)的存在下，将EndoS与IgG或IgG结合蛋白的抗体一起孵育，然后添加生荧光/生色底物。在该情况中，颜色信号的显现提示IgG的存在，IgG的量与信号强度成比例。以该方式对蛋白质进行检测是本领域中广泛使用的技术。

用于检测是否存在结合EndoS的IgG的其他适当的方法包括首先将结合的IgG与EndoS分离，使得可通过任何上述方法或任何适当的方法不受EndoS影响地对IgG进行分析/检测。可通过任何适当的方法将IgG与EndoS分离。适当的方法包括通过使来自所接触过的样品的EndoS与适当的洗脱缓冲液接触来从EndoS洗脱IgG。洗脱缓冲液的选择通常依赖于结合EndoS的IgG是否已知或推测为酸敏感性，即，通过与酸接触而被变性/灭活。

在抗体为非酸敏感性的情况下，通常可应用使用低pH洗脱缓冲液的洗脱方案。该类型的洗脱方案为本领域熟知的。这样的洗脱缓冲液具有通常低于约pH3、最优选低于约pH 2的pH。优选的实例包括pH 2的0.1M甘氨酸。另外，或任选地，这样的洗脱缓冲液可通常包括以下的至少一种：

-钠盐或钾盐，优选约0.5M至约1M的浓度；

-具有与聚糖相似的结构的单糖、二糖或多糖，所述聚糖与天然IgG上Asn-297相连；

或它们的任何组合。

然而，如上所述，本发明的方法特别适于检测/分离酸敏感性抗体。因此，在结合EndoS的IgG已知或推测为酸敏感性的情况中，优选使用不要求低pH的洗脱缓冲液和方案。这样的方案也是本领域已知的，并基于这样的原则：提供包含与结合的IgG竞争结合EndoS由此导致结合的IgG释放的分子的缓冲液。因此，适当的竞争洗脱缓冲液通常包括具有与聚糖相似的结构的一种或多种单糖、二糖或多糖，所述聚糖与天然IgG上的Asn-297相连。特别优选的洗脱缓冲液包括约0.25M至约0.5M、优选具有约5.3至约8.3的pH的蔗糖。具体的优选洗脱缓冲液的实例包括，例如：含有0.25M蔗糖的pH7.4的PBS；含有0.5M蔗糖的pH7.4的PBS；含有0.25M蔗糖的pH5.3的PBS；含有0.25M蔗糖的pH8.5的PBS；以及含有0.25M蔗糖、0.25M麦芽糖的pH7.4的PBS。

另外，或任选地，这样的竞争洗脱缓冲液通常可包括优选约0.5M至约1M的钠盐或钾盐。

上述用于将结合的IgG与EndoS分离的方法还可用于获得分离的IgG。

评价含有IgG的样品的糖基化状态和/或功能特性的方法

如上所述，缺乏IgG内切糖苷酶活性并具有IgG结合活性的本发明的EndoS多肽对糖基化和/或天然的功能活性IgG具有特异性。因此，通过使用所述EndoS多肽和可选的IgG结合试剂，本发明提供了一种评价含有IgG的样品的糖基化状态或功能特性的方法，所述方法包括从所述含有IgG的样品取第一小例样和第二小例样，如前一部分中所述使所述第一小例样与EndoS多肽接触，并使所述第二小例样与可选的能够结合非糖基化和/或变性的无活性IgG的IgG结合试剂接触，然后对所述第一小例样中与EndoS多肽结合的IgG的量进行定量，并对所述第二小例样中与可选的IgG结合试剂结合的IgG的量进行定量。最后，通过比较所述第一和第二小例样中测定的结合的IgG的量，可评价含有IgG的样品的糖基化状态或功能特性。

可选的IgG结合试剂通常为蛋白A或蛋白G，其结合所有形式(天然或变性)的IgG。因此，在该情况下，结合所述试剂的IgG的量代表了存在于所述第二小例样中的总IgG。EndoS多肽仅结合糖基化和/或天然的功能活性IgG，因此，结合EndoS的IgG的量仅代表存在于所述第一小例样中的糖基化和/或天然的功能活性IgG。通过将来自所述第二小例样的总IgG的浓度与所述第一样品中天然IgG的浓度进行比较，本领域技术人员应认识到，可获得反映原始样品中以IgG的糖基化和/或天然的功能活性形式存在的IgG的比例的比值。

在另一个实施方案中，可选的IgG结合试剂对于非糖基化和/或变性的IgG具有特异性。这样的试剂例如可以是抗体。因此，在该实施方案中，可通过下列方程式估计原始样品中以IgG的糖基化和/或天然的功能活性形式存在的IgG的比例：

第一小例样中IgG的量/(第一小例样中IgG的量+第二小例样中IgG的量)

在适于EndoS多肽或可选的IgG结合试剂和样品之间产生相互作用并呈现IgG结合活性的条件下，使上述方法中的样品与所述多肽或试剂接触。适当的条件例如相当于前一部分中所述的条件。

用于从含有IgG的样品中分离IgG Fab或Fc片段的方法

本发明的方法可用于从含有IgG的样品中分离Fab片段。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于从含有IgG的样品中分离IgG的Fab片段的方法，所述方法包括：

(a)使所述含有IgG的样品与IdeS和Fc结合蛋白接触；

(b)从所述接触过的样品中分离所述IdeS和所述Fc结合蛋白；以及

由此分离Fab片段。

优选的用于从样品中分离IdeS和Fc结合蛋白的方法包括使用如上所述被衍生或修饰的IdeS和/或Fc结合蛋白。可对IdeS和Fc结合蛋白各自实施相同或不同的修饰。

优选的修饰包括添加组氨酸标签。组氨酸标签的存在意味着多肽以高亲和力与在其表面含有携带镍、铜或锌离子的螯合基团的试剂或分离工具结合。组氨酸标签与这些金属离子强力结合。这样的试剂可因此用于从样品中分离IdeS和/或Fc结合蛋白。

另一种优选的修饰包括添加生物素标签。生物素标签的存在意味着多肽以高亲和力与包含链霉亲和素的试剂或分离工具结合。生物素标签与链霉亲和素强力结合。这样的试剂可因此用于从样品中分离IdeS和/或Fc结合蛋白。

优选的试剂或分离工具为能够结合EndoS多肽的磁性颗粒群。例如，在使用组氨酸标签衍生IdeS和/或Fc结合蛋白的情况中，磁性颗粒在其表面含有携带镍、铜或锌离子的螯合基团。或者，在使用生物素标签衍生IdeS和/或Fc结合蛋白的情况中，磁性颗粒在其表面含有链霉亲和素。

因此，从样品中去除EndoS的优选方法包括使用如上所述的磁性颗粒群，并对样品进行磁场分离。磁性颗粒优选为磁性纳米颗粒，磁场分离优选为高梯度磁场分离。

因此，上述方法的步骤(a)优选还包括使样品与能够结合IdeS和Fc结合蛋白的磁性纳米颗粒群接触，其中步骤(b)包括对样品进行磁场分离。

应理解，可使用任何适当的分离方法。例如，在关于分离基本无结合FcγR的IgG分子的细胞群的方法的部分中描述的可选方法可适于分离IdeS和/或Fc结合蛋白。

Fc结合蛋白优选为蛋白H或缺乏内切糖苷酶活性的修饰的EndoS多肽。

在本发明的上述实施方案中，含有IgG的样品通常包含纯化或分离的IgG。对于“纯化或分离的IgG”，是指具有正常商业级纯度的IgG级分。通常从诸如血清的样品中分离IgG，或在重组IgG的情况下从细胞裂解物中分离IgG。可根据任何适当的方法进行分离，优选根据上述使用缺乏内切糖苷酶活性的修饰的EndoS多肽分离IgG的方法来进行分离。因此，本发明的一个实施方案包括上文所述的方法，该方法在步骤(a)之前包括：

(i)使所述含有IgG的样品与缺乏IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽接触，由此能够形成IgG-EndoS多肽复合物；

(ii)从所述接触过的样品中分离所述IgG-EndoS多肽复合物；

(iii)从IgG-EndoS多肽复合物中洗脱IgG，由此获得含有IgG的样品；其中，对在步骤(iii)中获得的含有IgG的样品进行步骤(a)和(b)。优选根据上述关于测定样品中是否存在IgG或从含有IgG的样品中分离IgG的方法的部分中所述的方法从样品中分离IgG-EndoS多肽复合物。

在本发明的一个可选实施方案中，所述方法适于从含有IgG的样品中分离Fab片段，而不需要在实施所述方法之前纯化IgG。可以对含有非纯化的IgG的样品(例如全血清、细胞裂解物或细胞培养基)实施这些方法。在本发明的这个实施方案中，所述方法包括：

(a)使所述含有IgG的样品与Fc结合蛋白接触，由此能够形成IgG-Fc结合蛋白复合物；

(b)从所述接触过的样品中分离所述IgG-Fc结合蛋白复合物；

(c)向步骤(b)获得的IgG-Fc结合蛋白复合物中添加IdeS；以及

(d)从(c)获得的混合物中分离所述IdeS和所述Fc结合蛋白；

以及由此分离Fab片段。

上述用于从样品/混合物中分离IdeS和/或Fc结合蛋白的方法优选包括使用如上所述被衍生或修饰的IdeS和/或Fc结合蛋白。可以对IdeS和Fc结合蛋白各自实施相同或不同的修饰。优选的试剂或分离工具为能够结合IdeS和/或Fc结合蛋白的磁性颗粒群。例如，在使用组氨酸标签衍生IdeS和/或Fc结合蛋白多肽的情况中，磁性颗粒在其表面含有携带镍、铜或锌离子的螯合基团。或者，在使用生物素标签衍生IdeS和/或Fc结合蛋白多肽的情况中，磁性颗粒在其表面含有链霉亲和素。

因此，上述方法的步骤(a)优选还包括使所述样品与能够结合Fc结合蛋白的磁性纳米颗粒群接触，步骤(c)还包括使步骤(b)获得的所述IgG-Fc结合蛋白复合物与能够结合IdeS和Fc结合蛋白的磁性纳米颗粒群接触，其中步骤(b)和(d)包括对(a)的样品和(c)获得的混合物分别进行磁场分离。

应理解为可使用任何适当的分离方法。例如，在关于分离基本不含与FcγR结合的IgG分子的细胞群之方法的部分中描述的可选方法可适于分离IdeS和/或Fc结合蛋白。

上述实施方案中的Fc结合蛋白优选为蛋白H或缺乏内切糖苷酶活性的修饰的EndoS多肽。

本发明的上述方法还可用于从含有IgG的样品中分离Fc片段。在本发明的一个这样的实施方案中，所述方法包括：

(a)使所述含有IgG的样品与IdeS接触；

(b)从步骤(a)获得的混合物中分离IdeS，由此分离Fab和Fc片段；

(c)使所述Fab和Fc片段与Fc结合蛋白接触，由此能够形成Fc片段-Fc结合蛋白复合物；

(d)从步骤(c)获得的混合物中分离所述Fc片段-Fc结合蛋白复合物；以及

(e)从步骤(d)获得的所述Fc片段-Fc结合蛋白复合物中分离Fc片段。

应理解为可以使用如上所述的任何适当的方法，然而，上述用于从样品/混合物中分离IdeS和/或Fc结合蛋白的方法优选包括使用如上所述被衍生或修饰的IdeS和/或Fc结合蛋白。

优选地，上述方法的步骤(a)优选还包括使所述样品与能够结合IdeS的磁性纳米颗粒群接触，步骤(c)还包括使步骤(b)获得的Fab和Fc片段与能够结合Fc结合蛋白的磁性纳米颗粒群接触，其中步骤(b)和(d)包括分别对(a)的样品和(c)获得的混合物进行磁场分离。Fc结合蛋白优选为蛋白H或缺乏内切糖苷酶活性的修饰的EndoS多肽。

在一个可选的实施方案中，可通过包括下述步骤的方法从含有IgG的样品中分离Fc片段：

(a)使所述含有IgG的样品与IdeS和Fc结合蛋白接触；

(b)从(a)获得的混合物中分离Fc结合蛋白；由此分离Fc片段。

应理解为可使用如上所述的任何适当的分离方法。然而，优选地，上述方法的步骤(a)还包括使样品与能够结合Fc结合蛋白但不结合IdeS的磁性纳米颗粒群接触，其中步骤(b)包括对(a)中获得的混合物进行磁场分离。优选地，如上所述对IdeS和/或Fc结合蛋白进行衍生或修饰，并且分别应用不同的修饰。例如，在通过添加组氨酸标签修饰IdeS使得其结合表面含有携带镍、铜或锌离子的螯合基团的磁性颗粒群的情况中，可通过添加生物素标签对Fc结合蛋白进行修饰使得其结合表面含有链霉亲和素的磁性颗粒群。Fc结合蛋白优选为蛋白H或缺乏内切糖苷酶活性的修饰的EndoS多肽。

与用于分离Fab片段的方法相似，应理解为在用于分离Fc片段的方法中，含有IgG的样品通常包含纯化或分离的IgG。分离IgG的优选方法在如上所述的步骤(i)至(iii)中描述。

试剂盒

本发明提供：

-一种用于分离基本不含与Fcγ-受体结合的IgG分子的细胞群的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)根据本发明的具有内切糖苷酶活性的EndoS多肽；以及任选地

(b)用于从样品分离细胞的工具和/或说明书。

-一种用于从含有IgG的样品中分离IgG的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)根据本发明的缺乏内切糖苷酶活性的EndoS多肽；以及任选地

(b)用于从样品中分离所述EndoS多肽的工具。

-一种用于测定样品中是否存在IgG的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)根据本发明的缺乏内切糖苷酶活性的EndoS多肽；以及任选地

(b)用于从样品中分离所述EndoS多肽的工具。

-一种用于评价含有IgG的样品的糖基化状态和/或功能特性的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)根据本发明的缺乏内切糖苷酶活性的EndoS多肽；以及任选地

(b)可选的能够结合变性和/或去糖基化IgG的IgG结合试剂；

(c)用于从样品中分离所述EndoS多肽的工具；以及

(d)用于从样品中分离所述可选的IgG结合试剂的工具。

所述可选的IgG结合试剂包括蛋白G和/或蛋白A和/或蛋白A/G。

本发明还提供：

一种用于分离IgG的Fab或Fc片段的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)IdeS；

(b)Fc结合蛋白；以及

(c)从样品中分离所述IdeS和所述Fc结合蛋白的工具。

在一个优选的实施方案中，试剂盒还包含根据本发明的缺乏内切糖苷酶活性的EndoS多肽和用于从样品中分离所述EndoS多肽的工具。Fc结合蛋白优选为蛋白H或根据本发明的缺乏内切糖苷酶活性的EndoS多肽。

上述试剂盒的优选实施方案还包括在本发明方法中使用试剂盒的说明书。进一步优选的实施方案包括用于从样品中分离EndoS多肽、可选的IgG结合试剂、IdeS多肽或Fc结合蛋白的工具为磁性纳米颗粒群的试剂盒，其中，各群能够结合指出的多肽/试剂/蛋白质中的至少一者。在该实施方案中。试剂盒通常还包括用于对样品进行磁场分离的说明书。

在上述方法和试剂盒的优选实施方案中，使用亲和标记物(优选组氨酸标签)对所使用的多肽/蛋白质/试剂进行衍生，以帮助所述多肽分离。

下列实施例说明了本发明：

实施例1

在本研究中，我们阐明了EndoS对IgG亚类和IgG-FcgR相互作用的影响。结果揭示EndoS水解可溶性的和在血浆环境中的人IgG的所有四种亚类(IgG_1-4)的重链。另外，我们发现EndoS对IgG聚糖的水解显著影响IgG与可溶性固定化的FcγRIIa和FcγRIIb以及与FcγR表达细胞的结合。另外，与这些细胞结合的IgG由于使用EndoS处理细胞而解离。另外，由定点突变产生的EndoS的完整形式以高亲和力与IgG_1-4结合，而其活性形式仅瞬时与其底物相互作用。这些结果提供了关于细菌引起的宿主免疫防御的酶调控机制的新信息，提供了关于IgG聚糖水解酶和IgG之间的分子相互作用的新信息，并强调了IgG糖基化对于正确的抗体效应子功能的重要性。

材料与方法

蛋白质和试剂

从健康个体抽取血液并收集于含有肝素的试管中。在携带质粒pGEXndoS的大肠杆菌中以融合蛋白的形式重组表达并纯化具有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的全长EndoS(GST-EndoS)或无谷胱甘肽-S-转移酶的全长EndoS。如下实施EndoS的谷氨酸235向谷氨酰胺的突变：使用QuickChange II定点突变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)实施EndoS的谷氨酸235(Glu-235)向谷氨酰胺(E235Q)的突变。使诱变的寡核苷酸引物(加下划线的核苷酸发生突变)5’-CCTTGA TGG CTT AGA TGT GGA TGT TCA ACA TGA TAG TAT TCC-3’及上述序列的反义序列与变性的质粒pGEXndoS发生退火。使用高保真性DNA扩增突变链，并使用DpnI消化亲本甲基化链。然后转化至超级感受态大肠杆菌XL-1Blue中，用于切口修复(nick repair)和复制，生成突变的质粒pGEXndoS(E235Q)。然后与上述表达和纯化EndoS相同地表达和纯化重组的EndoS(E235Q)。

通过用pNT-neo-FcγRII或pNT-neo-FcγRIII质粒共转染CHO-K1(CHO)细胞然后在1mg/ml Genetecin中筛选来产生可溶性纯化的Fc受体。如(Ref)所述从人血浆纯化IgG亚类。RPMI 1640培养基和汉克氏平衡盐溶液(HBSS)来自GIBCO，Paisley，U.K。除非另有指明，所有其他试剂均购自Sigma-Aldrich。

使用EndoS处理人血浆和IgG的纯化

在37℃将体积为2ml的人血浆与20μg EndoS或PBS一起孵育1.5小时。使用蛋白G Sepharose(GE Healthcare Bio-sciences AB，Uppsala，Sweden)纯化IgG级分。简言之，将以1∶1悬浮于PBS(磷酸盐缓冲液，10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4，120mM NaCl，3mM KCl)中的200μl蛋白G Sepharose添加至血浆样品，并在4℃孵育2小时或过夜。在8000×g离心5分钟之后，弃除上清液，使用PBS洗涤沉淀物3次。使用0.1M的甘氨酸(pH 2.0)洗脱IgG，并使用1M Tris-HCl(pH 8.0)中和。使用Advanced Protein Assay(Cytoskeleton，Denver，CO，USA)测定IgG浓度为8mg/ml。

细胞制剂

于37℃含有5％CO₂和95％湿度的气氛中在添加有Glutamax-I、100μg/ml抗生素(青霉素和链霉素)以及10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养K562细胞系。使用用于细胞培养的Nunclon烧瓶(Nunc A/S，Roskilde，Denmark)。在用于实验之前在无血清培养基中培养细胞20小时。使用Polymorphprep制备试剂盒(AXIS-SHIELD，Oslo，Norway)或Ficoll-Paque Plus(Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)根据制造商提供的说明书从人全血分离单核细胞。在分离之后，对细胞进行计数，并将其重悬浮于PBS或RPMI培养基中。

酶联免疫吸附实验(ELISA)

对于聚糖检测，使用100μL在含有16mM Na₂CO₃和35mM NaHCO₃的包被缓冲液(pH 9.6)中稀释成1.5-0.5μg/ml终浓度的小鼠抗人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体(SIGMA，Saint Louis，MO，USA)包被微量滴定板(NUNC，Roskilde，Denmark)，并在4℃保持过夜。然后，使用含有10mM HEPES(pH 7.5)，0.15M NaCl，0.01mM MnCl₂，0.1mM CaCl₂和0.1％v/v Tween 20的凝集素缓冲液洗涤滴定板3次，并在相同缓冲液中于室温封闭1小时。在接下来的步骤中，添加纯化的IgG级分(1∶100稀释)，在37℃继续孵育2小时。在使用凝集素缓冲液洗涤3次之后，添加1μg/ml生物素化的小扁豆凝集素(LCA)-凝集素(VectorLaboratories，Burlingame，CA，USA)，并在37℃继续孵育1小时。再洗涤3次之后，添加0.1μg/ml过氧化物酶标记的链霉亲和素(Vector实验室)，并在37℃将滴定板孵育1小时。使用0.1M柠檬酸一水合物、含有0.012％v/v H₂O₂的0.1M Na₂HPO₄×2H₂O缓冲液(pH 4.5)以及1.7mM 2，2′-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)显现颜色反应。在550型微孔板读板机(BIO-RAD，Hercules，CA，USA)上在415nm读取吸光度。为了检测人IgG亚类与FcγR的结合，使用浓度为5μg/ml的可溶性FcγRIIa或FcγRIIb或FcγRIIIa在4℃包被微孔板20小时。次日，使用添加了0.05％v/v Tween 20(PBST)和2％w/v牛血清白蛋白的PBS在室温封闭微孔板2小时。在该步骤之后，添加纯化的IgG亚类，各0.1μg。在包被步骤之后以及在接下来的各孵育步骤之间使用PBST洗涤微量板三次。将过氧化物酶共轭的蛋白G(1∶5000稀释)(BIO-RAD，Hercules，CA，USA)用于检测。如上所述进行颜色反应。所有实验均重复进行三次。

放射性标记

根据制造商的说明书，使用IODE-BEADS碘化试剂盒(PIERCE，Rockford，IL，USA)使蛋白质标记上0.2mCi Na ¹²⁵I(PerkinElmer，Sweden)。通过在PD-10Sepharose(Pharmacia，Sweden)上对蛋白质进行脱盐而去除非结合放射性。标记的蛋白质的活性被估计为4μCi/μg蛋白质。

IgG结合细胞的检测

从如上所述使用EndoS或PBS处理的人血浆纯化IgG，然后使用¹²⁵碘(¹²⁵I)标记。为了检测结合K562细胞的¹²⁵I-IgG，在室温下将2×10⁶个细胞与0.5×10⁶cpm的¹²⁵I-IgG或¹²⁵I-去糖基化的IgG一起孵育30分钟。在使用PBS洗涤5次和在1000×g离心3分钟之后，使用Wallac Wizard^TM 1470自动γ计数仪(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)检测细胞沉淀物的放射性。在另一个实验中，在室温下将1×10⁶个单核细胞与0.5×10⁶cpm的¹²⁵I-IgG或¹²⁵I-EndoS处理的IgG一起孵育30分钟。在使用PBS将细胞重复洗涤5次以及通过1000×g离心5分钟使细胞最终沉淀之后，在4℃将细胞重悬浮于含有20mM Tris-HCl(pH 7.4)，0.150M NaCl，1％v/v Triton-100和0.25％v/v NP40的裂解缓冲液中10分钟。接下来，在14000×g离心样品10分钟，并将上清液用于聚丙烯酰胺凝胶。在分离之后，干燥凝胶，并在Fujix BAS 2000生物影像分析仪(Fujifilm Sverige AB，Stockholm，Sweden)中通过感光成像(phosphoimaging)分析样品。在实验中，当通过蛋白质印迹分析IgG与细胞的结合时，在37℃将0.5-1×10⁶个细胞与使用EndoS或缓冲液(如上所述)处理的血浆一起孵育1小时。之后，使用PBS或RPMI培养基洗涤细胞3次，将其重悬浮于100μL裂解缓冲液中，通过蛋白质印迹分析细胞裂解物中的结合IgG。

将细胞与EndoS一起孵育

在37℃将2×10⁶个K562细胞或8×10⁶个单核细胞与2ml人血浆一起孵育30分钟。使用PBS洗涤细胞5次，并在每次洗涤之后于1000g离心10分钟。将含有40μgEndoS的PBS或仅仅PBS添加至细胞中，继续在37℃孵育1小时。使用PBS洗涤细胞3次，并重悬浮于100μL裂解缓冲液中。在14000×g离心样品5分钟，弃除沉淀物，并分析保留的上清液。使用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析上清液中IgG和聚糖的含量。

狭线印迹分析

使用来自“Schleicher & Schuell，Inc.，Kene，NH 03431，USA”的狭线印迹仪器，分别将含有0.3、015、0.075μg的IgG1-4的PBS置于PVDF膜上。将膜与PBST、5％脱脂乳一起孵育1小时，使用PBST洗涤，并与含有0.05mg/ml的EndoS或EndoS(E235Q)的PBST和5％脱脂乳一起孵育1小时。在洗涤之后，将膜与家兔EndoS抗血清一起孵育，然后与过氧化物酶共轭的山羊抗家兔抗体一起孵育。使用ABTS作为过氧化物酶底物进行显色。所有孵育步骤均在室温下进行。

BIAcore表面等离子共振相互作用分析

使用10mM醋酸钠(pH 4)洗脱IgG和去糖基化的IgG，并经胺偶联固定至CM5 sensorchips(BIAcore，Uppsala，Sweden)的不同流动细胞。将固定化水平优化至8000-10000左右的反应单位。在确定EndoS(E235Q)与所有去糖基化的IgG变体都不结合之后，这些流动细胞被作为EndoS(E235Q)分别结合IgG1至IgG4的批间折射率(bulk refraction index)变化的对照。在测定IgG1-IgG4对受体FcγRIIa、FcγRIIb以及FcγRIIIa的亲和力的实验中，将实施了固定化方案但不添加蛋白质的流动细胞用作对照。在BIAcore 2000仪器中监测结合相和解离相，从而测定亲和力。在用于可能存在的传质限制的对照实验中，以不同流速对受体注入IgG，对IgG亚类注入EndoS变体。在等于或大于5μl/min的流速时没有观察到初始结合的差异，表明对于任何结合没有限制。在25℃以35μl/min对不同包被的表面(流动细胞)(在运行缓冲液：10mM Hepes，pH 7.5，150mM NaCl，0.005％表面活性剂P20，以及3.4mM EDTA中)注入不同浓度(通常10-1.25μg/ml)的相互作用物。在各实验之间，用含有2M NaCl的运行缓冲液脉冲严格再生表面，然后在达到基线之后进行大规模洗涤程序。对于与预固定化的FcγRIIa结合的IgG的EndoS消化，选择IgG1浓度(10μg/ml)以在中断IgG1注入并被运行缓冲液取代的时间点给出适当的稳定态解离相。将该实验作为对照，与在IgG1结合FcγRIIa之后在相同时间点注入EndoS进行比较。在对数据进行X和Y标准化之后，扣除来自各注入浓度的对照流动细胞的空白曲线。在适当的情况下，使用BIAEvaluation 4.1软件((BIAcore))中的1∶1 Langmuir结合方程同时测定结合速率常数(k_a)和解离速率常数(k_d)。局部拟合结合曲线，并从获得的速率常数的平均值计算平衡解离常数(K_D)。

全血的流式细胞术分析

在37℃将体积为15ml的血液与0.4mg EndoS或PBS一起孵育35分钟。然后添加白细胞活化剂甲酰-甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(fMLP)(1∶10000稀释)(SIGMA，Saint Louise，MO，USA)，并在37℃继续孵育10分钟。接下来，在1000g离心血液样品5分钟。将血浆和暗黄覆盖层(buffy coat)转移至另一试管并在1000g离心5分钟。然后使用含有30％v/v RPMI的HBSS洗涤3次，并最后重悬浮于100μl相同的培养基中。通过混合相同量的小鼠抗人IgG1(51mg/ml)、IgG2(22mg/ml)、IgG3(16mg/ml)以及IgG4(24mg/ml)来制备小鼠抗人IgG，并添加5μl的该混合物，在室温下孵育样品10分钟。在下一步骤中，添加5μl FITC共轭的山羊抗小鼠IgG(DakoCytomation，Glostrup，Denmark)，之后使用DakoCytomation Uti-Lyse红细胞试剂盒(Carpinteria，CA)裂解红细胞。于FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA)上分析信号。通过前向散射和侧向散射特性(FSC/SSC)鉴定单核细胞。

SDS-PAGE和蛋白质印迹分析

使用来自BIO-RAD(Hercules，CA，USA)的Mini Protean II细胞设备或来自LKB produkter(Bromma，Sweden)的设备，并利用Laemmli(17)描述的缓冲系统进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将样品与添加了5％巯基乙醇的样品缓冲液以1∶1(v/v)混合，并煮沸5分钟，之后上样于10％聚丙烯酰胺凝胶。将PageRuler^TM Protein Ladder Plus(Fermentas，Burlington，Canada)用作高分子量标准。使用考马斯亮蓝R-250对聚丙烯酰胺凝胶进行染色，并在某些情况中进行干燥。对于免疫印迹，如Matsudaira(18)描述的将凝胶转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Immobilon P，Millipore，Bedford，MA)。在印迹之后，在室温下使用具有0.05％v/v Tween 20(PBST)和5％w/v脱脂乳(DIFCO，Detroit，MI)的PBS封闭20分钟。对于IgG的检测，接着使用PBST洗涤印迹，然后在37C与家兔抗人IgG(1∶3000稀释)(BIO-RAD，Hercules，CA)一起孵育1小时。在洗涤步骤之后，将膜与辣根过氧化物酶共轭的山羊抗家兔IgG(BIO-RAD)(1∶1000稀释)一起孵育。对于凝集素印迹分析，在室温下使用凝集素缓冲液，10mM HEPES，pH 7.5，0.15M NaCl，0.01mM MnCl₂，0.1mM CaCl₂以及0.1％v/vTween 20封闭20分钟，并将其与生物素化的LCA凝集素(Vector实验室)(1∶5000稀释)一起孵育。在使用凝集素缓冲液重复洗涤之后，将膜与过氧化物酶标记的链霉亲和素(Vector实验室)(1∶10000稀释)一起孵育。根据制造商的说明书，使用SuperSignal West Pico(PIERCE，Rockford，IL)对所有膜进行显像，之后通过Chemidoc XRS成像洗脱和Quantity One图像分析软件(BIO-RAD)分析。

结果

EndoS对所有四种IgG亚类均具有糖苷酶活性

先前已经揭示，EndoS水解人多克隆IgG的γ链上的保守N联聚糖的壳二糖核(图1A)。因此，对于阐明EndoS是否对人IgG的所有四种亚类(IgG_1-4)均具有活性是有意义的。将纯化的重组EndoS与纯化的人IgG_1-4一起孵育。SDS-PAGE分析揭示EndoS处理的IgG的所有亚类以低于处理的IgG约3kDa的表观分子量迁移(图1B)，这与IgG聚糖的壳二糖核的水解一致。为了证实聚糖水解，还使用识别α-连接甘露糖(α-linked mannose)残基的小扁豆凝集素(LCA)，通过凝集素印迹分析样品(图1A)。样品的凝集素印迹分析揭示所有IgG亚类在与EndoS一起孵育之后丧失与LCA的反应性，这与聚糖的完全水解或几乎完全水解一致(图1C)。另外，研究了EndoS在血浆环境中对IgG_1-4的糖苷酶活性。在该实验中，将人血浆与纯化的EndoS或缓冲液一起孵育，之后对IgG级分进行亲和纯化。接着使用固定化的针对IgG_1-4的单克隆抗体将这些级分进行LCA ELISA以捕获IgG。这揭示了当血浆与缓冲液(对照)一起孵育时，所有四种IgG亚类均与凝集素反应，从而提示了聚糖的存在。相比之下，当使用EndoS处理血浆时，观察到IgG_1-4与LCA凝集素的反应性显著降低，提示IgG_1-4上的聚糖水解(图2)。总而言之，这些结果清楚地显示EndoS具有水解纯化形式的和于全血浆中的人IgG的所有四种亚类的能力。

EndoS的失活形式结合IgG

我们先前部分阐明了EndoS对IgG水解的分子要求。在催化通道的预定开口处将SEQ ID NO：1的谷氨酸199(SE ID NO：3的235位)(EndoS(E235Q))定点突变成谷氨酰胺，从而丧失了酶活性。另外，色氨酸的化学封闭揭示了这些氨基酸残基对于活性来说是重要的。为了进一步研究酶和底物之间的物理相互作用，使用由EndoS和EndoS(E235Q)探测的固定化的IgG，通过狭缝结合实验研究EndoS和EndoS(E235Q)与固定化的多克隆IgG和IgG_1-4亚类的结合。使用EndoS和EndoS(E235Q)探测纯化的可溶IgG亚类1-4(各自固定化至硝酸纤维素膜)，然后将IgG亚类1-4与针对EndoS的抗体一起孵育。该实验揭示了EndoS(E235Q)与多克隆IgG、IgG1以及IgG2强力结合，与IgG3和IgG4弱结合，而在活性EndoS和所有亚类之间仅见非常弱的相互作用(图3A)。使用表面等离子共振计算EndoS和固定化的IgG_1-4之间的亲和常数。与狭缝结合结果相似，这显示EndoS(E235Q)以高亲和力结合所有IgG亚类，而没有检测到EndoS与IgG的结合(图3B，表1)。EndoS(E235Q)结合固定化的IgG亚类的动力学参数具有相似的特征，在IgG1和EndoS(E235Q)之间表现了最强的相互作用，具有0.42μM的结合亲和常数(K_D)。没有检测到EndoS或EndoS(E235Q)与在固定化之前被EndoS水解的IgG_1-4亚类的结合。这些发现表明完整的IgG聚糖对于EndoS和IgG之间的相互作用是必要的。另外，对比EndoS、EndoS(E235Q)与IgG之间相互作用的实验表明，EndoS以高亲和力与IgG结合，但在聚糖水解之后活性酶以“一触即发”方式立即被释放。

EndoS影响IgG_1-4与FcγR结合

由于FcγR和IgG的Fc结构域之间相互作用的性质高度依赖于IgG糖基化状态，我们探究了EndoS活性对IgG与FcγR相互作用的影响。因此，在ELISA实验中，将可溶性的FcγRIIa、FcγRIIb以及FcγRIIIa固定化，并使用纯化的IgG_1-4亚类探测。与其他观察结果一致，在这里可见FcγRIIa和FcγRIIb结合IgG1。该结合在使用EndoS处理IgG1之后而几乎被消除。其他IgG亚类与这些受体的结合弱，在使用EndoS处理之后甚至减少更多。总的来说，ELISA研究揭示了IgG亚类对FcγRIIa的亲合模式IgG1＞IgG3＞IgG4＞IgG2，IgG亚类对FcγRIIb的亲合模式IgG1＞IgG4＞IgG3＞IgG2(图4A)。另外，我们观察到，EndoS水解的IgG2与未处理的IgG2相比关于与FcγRIIa/FcγRIIb的结合具有不同的结果，即具有更广泛的结合力。在与所有IgG亚类的结合中，FcγRIIIa显示阴性(未显示数据)。通过表面等离子共振进一步分析EndoS处理或未处理的IgG_1-4与FcγR之间的相互作用。利用固定化的FcγRIIa、FcγRIIb或FcγRIIIa在表面捕获各IgG亚类。结果与ELISA数据一致，显示IgG1对于FcγRIIa和FcγRIIb具有最强的亲和力，亲合常数相似，分别为97nM和17nM(图4B，表2)。与我们先前的发现一致，当使用EndoS处理的IgG1时，未检测到IgG1与这些受体结合。在FcγRIIa/FcγRIIb和IgG2或IgG3之间或IgG4和FcγRIIa之间无可检测到的相互作用(表2)。未检测到可溶性IgG_1-4亚类与固定化的FcRIIIa结合。这些结果表明EndoS水解显著降低IgG对FcγR的亲和力。

EndoS减少IgG结合血细胞

基于ELISA和表面等离子共振的结果，我们继续分析了EndoS的糖苷酶活性对FcγR和IgG之间相互作用的影响。对于该目的，我们使用了专门表达FcγRIIa的红白血病细胞系(K562)。由于我们不能获得可溶性FcγRI，我们还研究了通过FcγRI主要结合IgG的人单核细胞。因此，从使用EndoS或PBS处理的血浆纯化IgG，使用¹²⁵I标记并将其与K562细胞一起孵育。检测细胞沉淀物的放射性。通过添加抑制放射性IgG结合的冰冷的人IgG来计算IgG与这些细胞的特异性结合。这显示最初从使用EndoS处理的血浆纯化的放射性IgG的结合完全被消除(图5A)。通过蛋白质印迹和细胞裂解物与针对人IgG的抗体的反应性证实了在将K562细胞与人血浆一起孵育之后IgG与K562细胞的强力结合。相比之下，与使用EndoS预处理的血浆一起孵育的K562细胞与IgG的结合明显减少(图5B)。同样，当使用EndoS处理IgG时，通过SDS-PAGE分析，¹²⁵I-IgG与单核细胞的结合完全受抑制(图6A)。为了进一步分析EndoS对单核细胞上的FcγR与IgG之间的相互作用的影响，进行了全血细胞的流式细胞术分析。在将血液与白细胞活化剂fMLP一起孵育之后，将人血液与EndoS一起孵育。基于前向散射和侧向散射对单核细胞进行门控(gate)，评价单核细胞与单克隆抗人IgG的反应性。结果显示87％的单核细胞对于IgG结合为阳性，而与EndoS一起孵育的血液中仅43％的单核细胞为阳性(图6B)。这些结果表明EndoS水解的IgG显著降低其与表达不同组(set)的FcγR的人细胞的结合能力。

当使用EndoS处理时IgG从FcγRIIa解离

至此我们的实验已经揭示IgG的EndoS水解抑制与细胞和表面上FcγR的结合，但EndoS对已经结合FcγR的IgG是否具有活性和该活性是否能够释放与FcγR结合的IgG还不清楚。因此，我们研究了EndoS对与已经暴露于人血浆并随后使用EndoS处理的K562细胞结合的IgG的影响。通过SDS-PAGE和使用针对人IgG的抗体的蛋白质印迹分析细胞裂解物。通过在图7A中呈现的结果判断IgG与K562细胞显著结合。有趣的是，当使用EndoS处理细胞时，印迹上未见到IgG条带，提示全部IgG从细胞解离(图7A)。使用EndoS(E235Q)的对照实验与未处理的细胞实验相比，在K562细胞表面显示IgG信号。这些结果充分提示由于EndoS对IgG的N聚糖水解，IgG从细胞表面解离。相似地，分析了EndoS对结合单核细胞的IgG的影响。这显示了与未处理的细胞相比，由于使用EndoS处理，大多数结合单核细胞的IgG从细胞解离(图7B)。如所预料的，与对照细胞相比，使用EndoS处理的单核细胞显示与LCA凝集素无反应，提示在IgG印迹中检测到的存在于细胞上的微量IgG很可能已经被EndoS水解(图7B)。通过表面等离子共振实验进一步证实了上文呈现的结果。因为我们较早期观察到IgG1是FcγRII的最强结合剂，所以选择了可溶性IgG1和FcγRII受体。在IgG1与预固定化的FcγRIIa结合并达到稳定态解离相之后，中断IgG1注入，并被EndoS注入或运行缓冲液取代。这揭示了EndoS注入导致IgG1从固定化FcγRIIa受体解离，而当添加运行缓冲液时IgG1从FcγRIIa解离不受影响(图7C)。总而言之，这些结果明确证明通过水解IgG聚糖，EndoS可释放与细胞和表面上的FcγR结合的IgG。

讨论

在该实施例中，我们阐明了EndoS和IgG之间的物理相互作用和EndoS的IgG N聚糖水解活性对于IgG-FcγR相互作用的生理关联性。我们首次提出EndoS特定用作纯化形式的和血浆环境中的所有人IgG亚类的内切糖苷酶。如所预料的，在酶和所有IgG亚类之间具有物理相互作用，我们使用EndoS的无酶解活性的突变形式成功证实了这点。在该研究中，我们观察到EndoS水解的IgG不与单核细胞结合，当通过EndoS水解时，IgG几乎完全从单核细胞解离。既然单核细胞表达FcRI，且该受体对于IgG具有最高的亲和力，所以我们推断出EndoS甚至影响IgG与FcRI的结合，因为我们观察到的EndoS的影响主要由于FcRI的参与。有趣的是，EndoS看起来对FcγRII受体的两种同型抗原(isotypes)均有影响，因此影响IgG介导的效应子刺激的激活和抑制。

上述数据支持了利用EndoS多肽的本发明的方法。具有IgG内切糖苷酶活性的EndoS多肽可用于体外处理样品，例如全血或纯化的血细胞，以去除已经结合这些细胞上的多种FcγR的IgG。这将有助于分析添加至细胞的特定IgG制剂在受体结合和细胞活化方面的效应，而无预结合的IgG干扰。缺失IgG内切糖苷酶活性但具有IgG结合活性的EndoS多肽(例如EndoS(E235Q))具有作为IgG的特异性纯化和检测工具的巨大潜能。在该研究中，我们证实了EndoS(E235Q)与IgG的所有亚类同等良好地相互作用。这与使用蛋白G(目前用于IgG制备和检测的主要分子)可见到的情形相似，但与不结合IgG3的蛋白A相比是有利的。另外，蛋白A还在某种程度上结合IgM和IgA。我们先前揭示了EndoS和IgM或IgA之间无相互作用。另外，在这里我们能够揭示EndoS(E235Q)不与缺失重链聚糖的IgG相互作用。这与结合IgG(不考虑糖基化状态)的蛋白G和蛋白A形成对比。当仅需要具有功能效应子区的完整IgG时，这尤其是重要的。当使用类似蛋白G的当前可获得的试剂时，需要使用例如凝集素柱的第二纯化步骤以仅获得IgG的糖基化级分。EndoS(E235Q)的该特性可联合例如蛋白G使用，以评价IgG制剂的糖基化/功能特性

实施例2：带组氨酸标记的蛋白H的构建

克隆

使用限制性位点Not I和Bam HI将编码蛋白H的结构基因的核苷酸124至1048克隆至pET21b载体。使用以载体pHD389作为模板的PCR获得结构基因。

所使用的PCR引物如下：

5′-TCG GAT CCG GCG CCG GAA GGG GCT AAA ATT GAT TGG C-3′(37-mer)

5’-CTC TGC GGC CGC TGC TGT TTC ACC TGT TGAAGG TAA-3’(36-mer)

使用Bam HI和Not I消化PCR片段和载体pET21b。于0.8％琼脂糖凝胶(E-gel，Invitrogen)上分离消化的片段，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。使用来自Invitrogen的连接酶将PCR片段连接至载体pET21b。

为了检查DNA构建体(construct)，通过电穿孔使连接混合物进入大肠杆菌DH10B细胞中。使用质粒纯化随后使用Bam HI和Not I进行消化来检测5个克隆。挑选阳性菌落，并进行培养用以质粒纯化。将质粒转移至大肠杆菌BL21中，用以有效的蛋白质表达。

蛋白质表达和纯化

使用通过pET21b载体进行表达的标准方案和说明书进行蛋白质表达。收集细胞，将其重悬浮于缓冲液中并进行超声处理。使用离心弃除细胞碎片，并使用标准方案将澄清的裂解物添加至来自Amersham BioSciences的1ml HisTrap柱。使用NuPage 4-12％BisTris凝胶(Invitrogen)在还原条件下使用电泳分析从柱洗脱的蛋白质。蛋白质的分子量为约35kDa，HisProtein H的理论分子量为36kDa。

通过混合人IgG和HisProtein H并在HisTrap(GE Healthcare)柱上捕获复合物，然后在NuPage 4-12％ BisTris凝胶(Invitrogen)上分析，从而显示IgG结合活性。洗脱物不含有IgG片段，这提示IgG与蛋白H一起被柱子捕获。

实施例3.带组氨酸标记的IdeS的构建

克隆

使用限制性位点Xho I和Bam HI将编码IdeS的结构基因的核苷酸79至1020克隆至pET21b载体。使用pGEX:IdeS载体通过PCR获得结构基因。

所使用的PCR引物如下：

5′-CCG GAT CCG CTA GCA GAT AGT TTT TC-3′(26-mer)

5’-GGC CTC GAG GGA ATT GGT CTG ATT CC-3’(26-mer)

使用Bam HI和Xho I消化PCR片段和载体pET21b。于0.8％琼脂糖凝胶(E-gel，Invitrogen)上分离消化的片段，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。使用来自Invitrogen的连接酶将PCR片段连接至载体pET21b。

为了检查DNA构建体，通过电穿孔使连接混合物进入大肠杆菌DH10B细胞中。使用质粒纯化随后使用Bam HI和Not I消化来检测5个克隆。挑选阳性菌落，并进行培养用以质粒纯化。将质粒转移至大肠杆菌BL21中，用以有效的蛋白质表达。

蛋白质表达和纯化

使用利用pET21b载体进行表达的标准方案和说明书进行蛋白质表达。收集细胞，将其重悬浮于缓冲液中并进行超声处理。使用离心弃除细胞碎片，并使用标准方案将澄清的裂解物添加至来自Amersham BioSciences的1ml HisTrap柱。使用Nupage 4-12％ BisTris凝胶(Invitrogen)在还原条件下使用电泳分析从柱洗脱的蛋白质。通过使用NuPage 4-12％BisTris凝胶(Invitrogen)的电泳分析表达和纯化的蛋白质。蛋白质的分子量为约34kDa。

通过在37℃混合人IgG和IdeS来检测IdeS活性。在还原条件下通过使用NuPage 4-12％BisTris凝胶(Invitrogen)的电泳来评价结果。将纯HisIdeS和纯IgG用作参照物。该凝胶揭示IgG分子被消化并因此在该凝胶上出现约31kDa的另外的条带，如先前所述(Vincents等人，2004，Biochemistry 43：15540-15549)，该条带与IgG裂解产物相对应。

实施例4：在蛋白H存在的情况中带组氨酸标记的IdeS的活性

在Eppendorf管中建立了下列反应，并通过使用NuPage 4-12％BisTris凝胶(Invitrogen)的电泳分析结果。

上述结果表明在未标记的和带组氨酸标记的蛋白H的存在下带组氨酸标记的IdeS裂解IgG级分。

实施例5

洗脱缓冲液

下列方案用于检测用于从IgG sepharose洗脱EndoS(E235Q)的不同洗脱缓冲液。所检测的缓冲液特别适用于针对酸敏感性抗体的本发明的方法。所检测的不同缓冲液为：

1.含有0.25M蔗糖的PBS，pH7.4；

2.含有0.5M蔗糖的PBS，pH7.4；

3.含有0.25M蔗糖的PBS，pH5.3；

4.含有0.25M蔗糖的PBS，pH8.5；

5.含有0.25M蔗糖、0.25M麦芽糖的PBS，pH7.4；

6.PBS，pH7.4。

根据标准方案制备IgG-sepharose凝胶，并使用pH7.4的PBS洗涤。对于各检测的洗脱缓冲液，将0.3mg GST标记的EndoS(E235Q)作为检测样品上样于凝胶。在振动平台上孵育样品1小时，并通过在500g离心3分钟去除上清液。使用pH7.4的1.0ml PBS洗涤样品4次。然后使用1.0ml选自上述1-6的洗脱缓冲液洗脱GST标记的EndoS(E235Q)。针对分离样品检测了1-6中的各缓冲液。在振动平台上孵育所有样品1.5小时。然后通过在500g离心3分钟去除第一洗脱物(洗脱物1)。再向各样品中添加1.0ml的各洗脱缓冲液，在振动平台上孵育样品约30分钟。如上所述通过离心去除第二洗脱物(洗脱物2)。最后再向各样品中添加1.0ml的各洗脱缓冲液，并在振动平台上孵育样品约50分钟。如上所述通过离心去除最终的洗脱物(洗脱物3)。

然后，在通过凝胶电泳分析(未显示)前在300μl PBS中稀释来自各样品的所有洗脱物和最初的上清液。

凝胶分析证实，使用不同浓度和类型的糖作为洗脱剂可从IgG洗脱GST标记的EndoS(E235Q)。具有0.25M和0.5M蔗糖的洗脱缓冲液最有效。

Claims (16)

1.一种用于从分离的IgG样品中分离Fab片段的方法，所述方法包括通过下列步骤制备所述样品：

(a)使得含有IgG的样品与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽接触，由此能够形成IgG-多肽复合物；

(b)从接触过的样品中分离所述IgG-多肽复合物；

(c)从IgG-多肽复合物洗脱IgG，由此获得含有IgG的样品；以及然后

(d)使步骤(c)获得的样品与IdeS和由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽接触；

(e)从接触过的样品中分离所述IdeS和所述多肽；由此分离Fab片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)还包括使所述样品与能够结合IdeS多肽和所述由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽的磁性纳米颗粒群接触，且步骤(e)包括对所述接触过的样品进行磁场分离。

3.一种用于从含有IgG的样品中分离糖基化的Fc片段的方法，所述方法包括：

(a)使所述含有IgG的样品与IdeS接触；

(b)从步骤(a)获得的混合物中分离IdeS，由此分离Fab和Fc片段；

(c)使所述Fab和Fc片段与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽接触，由此能够形成Fc片段-多肽复合物；

(d)从步骤(c)获得的混合物分离所述Fc片段-多肽复合物；以及

(e)从步骤(d)获得的所述Fc片段-多肽复合物分离Fc片段。

4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(a)还包括使所述样品与能够结合IdeS的磁性纳米颗粒群接触，步骤(c)还包括使步骤(b)获得的所述分离的Fab和Fc片段与能够结合由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽的磁性纳米颗粒群接触，且步骤(b)和(d)包括对所述接触过的样品或分离的Fab和Fc片段分别进行磁场分离。

5.一种用于从含有IgG的样品中分离糖基化的IgG的方法，所述方法包括：

(a)使所述含有IgG的样品与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽接触，由此能够形成IgG-多肽复合物；

(b)从所述接触过的样品中分离所述多肽；以及

由此获得分离的糖基化的IgG。

6.一种用于测定样品中是否存在糖基化的IgG的方法，所述方法包括：

(a)使所述样品与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽接触，由此能够形成IgG-多肽复合物；

(b)任选地，从所述接触过的样品中分离所述多肽；以及

(c)测定所述分离的多肽是否与IgG结合，以及

由此测定所述样品中是否存在IgG。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述分离或检测到的IgG为天然的功能活性形式。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述分离或检测到的IgG包括IgG亚类IgG₁、IgG₂、IgG₃以及IgG₄中的至少一种。

9.根据权利要求5或6所述的方法，其中步骤(a)还包括使所述样品与能够结合由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽的磁性纳米颗粒群接触，且步骤(b)包括对所述接触过的样品进行磁场分离。

10.一种评价含有IgG的样品的糖基化状态的方法，所述方法包括取含有IgG的样品的第一小例样和第二小例样，其中，对所述第一小例样实施根据权利要求6所述的步骤(a)和(b)，除了使用可选的能够结合非糖基化IgG的IgG结合试剂取代由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽之外对所述第二小例样实施根据权利要求6所述的步骤(a)和(b)，以及所述方法还包括：

(c)对所述第一小例样中的与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽结合的IgG的量和所述第二小例样中的与可选的IgG结合试剂结合的IgG的量进行定量；以及

(d)将(c)中测定的结合的IgG的量进行比较；

由此，评价含有IgG的样品的糖基化状态。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述可选的IgG结合试剂包括蛋白G和/或蛋白A。

12.一种用于分离IgG的糖基化的Fc片段的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)IdeS；

(b)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽；以及

(c)从样品中分离所述IdeS和所述由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽的工具。

13.一种用于从含有IgG的样品中分离糖基化的IgG或者用于确定样品中是否存在糖基化的IgG的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽；以及任选地

(b)用于从样品中分离所述多肽的工具。

14.一种用于评价含有IgG的样品的糖基化状态的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽；

(b)可选的能够结合去糖基化的IgG的IgG结合试剂；

(c)用于从样品中分离所述由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽和所述可选的IgG结合试剂的工具。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述可选的IgG结合试剂包括蛋白G和/或蛋白A和/或蛋白A/G。

16.根据权利要求12至14中任一项所述的试剂盒，其中所述用于从样品中分离所述由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽、所述可选的IgG结合试剂、或者所述IdeS的工具为磁性纳米颗粒群，其中各群能够结合指明的多肽/试剂/蛋白质的至少一者，以及任选地所述试剂盒还包括用于对所述样品进行磁场分离的说明书。