JP2013506404A - 抗体における非フコシル化の検出法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗体調製物内のFcあたりのフコースの量および分布を決定するための新規の分析方法を記載する。

Description

本発明は、グリコシル化抗体またはそのフラグメント内のフコース残基の有無を検出するための方法に関する。
背景
抗体のFab（抗原結合フラグメント）ドメイン内の可変領域は抗原の認識を担い、Fc（結晶性フラグメント）領域は抗体の不変部分に相当し、これはエフェクター機能の仲介を担う。免疫グロブリンG（IgG）の場合、これには、補体の固定およびFcγ受容体（FcγR）への結合が含まれる。ホモ二量体FcフラグメントのCH2ドメイン内の単一保存部位（Asn297）にN結合Fcオリゴ糖が存在することが、これらのエフェクター機能両方を仲介するために必須である。付着した糖質の改変が、FcγRIIIaとIgGの間の相互作用に関して親和性改善効果を有しうることも、近年発見された。この効果の原因となる糖質改変とは、二分岐複合型IgGグリカン（図1）中の第一のN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）残基に通常付着しているフコース残基の不在である。
そのような高い親和性は、主にナチュラルキラー（NK）細胞に仲介される抗体依存性細胞障害（ADCC）の増強をもたらすことを、インビボおよびインビトロ実験によって実証することができた。その結果、そのような非フコシル化抗体は、オプソニン化細胞の根絶を目的とする処理における改善された有効性を有するとも考えられる。
非フコシル化抗体の生成はバイオテクノロジーにおける重要な課題であり、複数の方法により実現可能である。フコシル化の生合成に関与する酵素を（例えば、遺伝子ノックアウトにより）完全に枯渇させた細胞系は、定量的に非フコシル化された抗体を生成できるが、他のほとんどの方法では生成できない。例えば、抗体発現細胞のsiRNA処理またはキフネンシンとの共培養（Zhou et al., Biotechnol Bioeng (2008) 99, 652-655（非特許文献1））、および、バイセクト（bisected）オリゴ糖の形成を促進して結果的にフコシル化反応を阻害するN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（GnT-III）による、糖質改変（Umana et al., Nat Biotech (1999) 17, 176-180（非特許文献2））では、部分的に非フコシル化された抗体しか得られない。
これらの部分的非フコシル化抗体は主に、抗体のプール内で不均一な非フコシル化分布を示す可能性がある。例えば発酵の際のフコシル化割合が異なる可能性がある。またフコシル化の事象は協同的である可能性があり、即ち、ホモ二量体抗体上での第二のフコシル化が、第一のフコシル化よりも高い（正の協同性）または低い（負の協同性）割合で起こる場合がある。
FcγRIIIa/IgG複合体の化学量論比は1:1であるが、IgGは、FcγRIIIaへの結合部位を2ヶ所有する。その結果、一つの非フコシル化抗体中で該受容体は、IgGの非フコシル化グリカンおよびタンパク質コアにより形成された結合部位と高い親和性で、または、フコシル化糖質とタンパク質コアとからなる結合部位と低い親和性で、結合することができる。それゆえ、非フコシル化50%の抗体プールは、N-グリカン2個のうち1個のみがフコシル化された均一な抗体集団で構成されうるか、または、両方のN-グリカンがフコシル化されている抗体50％と、どちらのN-グリカンもフコシル化されていない残り50％とで構成されうる、と結論づけることができる。そのような非フコシル化の異なる分配が、FcγRIIIaに対する全体的な親和性に影響を及ぼし、かつ異なる生物活性をもたらすことは明白である。それゆえ、生物学的検査システム（バイオアッセイ）を用いて直接的に、または非フコシル化の割合および分布を生化学的に測定することにより間接的に、そのような抗体調製物の生物活性を分析して、より厳密な結果を得ることが必須である。
現在の最先端の糖分析論（Glycoanalytics）は、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacteium meningosepticum）のN-グリコシダーゼF（PNGアーゼF）を利用してN結合糖質を切除し、続いてMALDI-MS（マトリックス支援レーザ脱離イオン化法）分析を行う（Papac et al., Glycobiology(1998)8, 445-454（非特許文献3）による）。しかしそのような処理を用いることにより結合情報が失われ、抗体調製物内のフコシル化分布の決定が不可能になる。
その一方で、ESI-MS（エレクトロスプレーイオン化質量分析）を用いた完全抗体の分析により複雑な質量パターンが得られ、これは、ホモ二量体IgGの両方のサブユニットで起こることも起こらないこともあるフコシル化以外の様々な改変（ガラクトシル化、C末端リシン不均一性、脱アミド化などのような）のせいで、定量的解釈が不可能である。
それゆえ、先に挙げた不均一性を解消するが結合情報を保持する、新規の分析方法が求められている。
Zhou et al., Biotechnol Bioeng (2008) 99, 652-655 Umana et al., Nat Biotech (1999) 17, 176-180 Papac et al., Glycobiology(1998)8, 445-454
発明の説明
グリコシル化抗体内のフコース残基の有無を検出する方法を提供する本発明により、先に記載された欠点が克服される。好ましくは、抗体またはそのフラグメント内のフコース残基の量およびその分布パターンが測定される。抗体調製物内のFc分子あたりのフコース残基の分布を分析することも、本発明の一部である。加えて、本発明は、発酵の際の抗体調製物における協同的フコシル化の判定に用いることができる。つまり本発明は、抗体分析論における欠落を補う方法を提供する。この新規方法により得られる抗体またはそのフラグメント内のフコシル化パターンに関する知識によって、Fcに仲介される力価のより正確な予測が可能となる。
驚くべきことに、本発明の発明者は、Endo S（最初は化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）において同定された、エンドグリコシダーゼ活性を有する酵素（Collin and Olsen, EMBO J(2001) 20, 3046-3055））が、ヒトIgGのFc領域から複合型グリカン部分を切断し、フコース残基が付着しうる第一のGlcNAc残基のみを残留させることを見出した。Endo Sに識別される（切断されない）ハイブリッド型糖質は、同じ部位で、エンドグリコシダーゼH（Endo H）により定量的に切断することができる。このように両方の酵素を組み合わせることにより、フコース含量のみが異なる、均一にグリコシル化されたタンパク質の調製が可能になる。そのように処理されたFcフラグメントの分析は、分析される抗体プールのフコース含量の決定だけでなく、該プール内のフコース残基の分布の決定も可能にする。これらの新規の知見は、分析論の欠落を補い、ADC誘導における有効性に関連して、分析される抗体の力価の推定も可能にし得る。
したがって本発明は、グリコシル化抗体またはそのフラグメント内のフコース残基の有無を検出する方法に関する。
一態様において、本発明は、
（a）タンパク質から不均一な糖残基を全て除去する段階、
（b）前記タンパク質から他の不均一な残基を全て除去する段階、
（c）引き続いて前記タンパク質を分析する段階
を含む。
別の態様において、前記方法の段階（c）は、分析前に精製する段階を更に含む。特定の態様において、精製は、アフィニティークロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーにより実現される。アフィニティークロマトグラフィーは、例えばプロテインAまたはプロテインGを用いて、実施することができる。
一態様において、本発明の方法により処理および分析されるタンパク質は、抗体または抗体フラグメントである。好ましくは前記抗体は、IgG型抗体である。前記抗体フラグメントは、好ましくはFcフラグメント、特にIgG型抗体のFcフラグメントである。
特定の態様において、除去する段階（a）は、複合型N結合糖質またはハイブリッド型N結合糖質を特異的に切断する酵素1種以上により実施される。好ましくはこれらの酵素は、Endo SおよびEndo Hを含む。
別の特定の態様において、除去する段階（b）は、酵素1種以上により実施される。好ましくはこれらの酵素は、プラスミンおよび／またはカルボキシペプチダーゼBを含む。
更なる特定の態様において、分析する段階（c）は、CE-SDS MW（キャピラリー電気泳動-ドデシル硫酸ナトリウム分子量）分析、ESI-MS分析もしくは液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）、またはそれらの組み合わせを含む。
好ましい態様において、先に記載された方法の段階（a）は、タンパク質の糖質構造由来の不均一な糖を、該構造の第一のGlcNAc残基の後ろで切断し、それにより抗体コアに付着したフコース残基を残すことを含む。この段階は、バイオテクノロジーにより生成された抗体中で頻繁に生じる複合型N結合糖質またはハイブリッド型N結合糖質を特異的に切断する2種の酵素、例えば、Endo SおよびEndo Hを用いて実施することができる。
好ましい態様において、先に記載された方法の段階（b）は、好ましくは酵素を用いた、抗体重鎖のC末端リシン残基の定量的除去を含み、該酵素は好ましくはカルボキシペプチダーゼBを含む。
別の好ましい態様において、先に記載された方法の段階（b）は、抗体のFabフラグメントとFcフラグメントの間の切断を含む。重鎖のヒンジペプチド内の共有結合的鎖間ジスルフィド架橋は好ましくは、FabフラグメントとFcフラグメントの間の切断の後、Fcフラグメント内で維持される。好ましくは該切断は、酵素により実現される。好ましくはそのような酵素は、プラスミンを含む。
好ましい態様において、先に記載された方法の段階（c）は、いかなる事前の精製段階も伴わずに、処理された抗体分子またはFcフラグメントのLC-MSにより分析することを含む。そのような分析では通常、2つのフコシル化グリカンを有するタンパク質、1つのフコシル化グリカンおよび1つの非フコシル化グリカンを有するタンパク質、ならびに両方のグリカンが非フコシル化されたタンパク質に対応する、3種の質量のみが得られる。
別の態様において、先に記載された方法の段階（c）には、処理された抗体分子またはFcフラグメントを、標準的な方法を用いて精製すること、およびそれをESI-MS分析により分析することが含まれる。そのような分析では通常、2つのフコシル化グリカンを有するタンパク質、1つのフコシル化グリカンおよび1つの非フコシル化グリカンを有するタンパク質、ならびに両方のグリカンが非フコシル化されたタンパク質に対応する、3種の質量のみが得られる。
一態様において、本発明の方法は、以下の段階を含む：抗体調製物を提供する段階、そのような抗体調製物のFcフラグメント部分を任意で単離する段階、Endo HおよびEndo Sを用いて前記抗体またはFcフラグメントから不均一な糖残基を全て除去する段階、カルボキシペプチダーゼBを用いて前記抗体またはFcフラグメントからC末端リシン残基を除去する段階、ならびに、ESI-MS、LC-MSまたはCE-SDS MW分析により、処理された抗体またはFcフラグメントを分析する段階。
別の態様において、前記方法は、以下の段階を含む：抗体調製物を提供する段階、プラスミンを用いてそのような抗体調製物のFcフラグメント部分を任意で単離する段階、Endo HおよびEndo Sを用いて前記抗体またはFcフラグメントから不均一な糖残基を全て除去する段階、カルボキシペプチダーゼBを用いて前記抗体またはFcフラグメントからC末端リシン残基を除去する段階、ならびにESI-MS、LC-MSまたはCE-SDS MW分析により、処理された抗体またはFcフラグメントを精製および分析する段階。
更に別の態様において、本発明は、糖タンパク質内のフコース残基の有無を検出するアッセイを実施するのに適したキットを対象とする。本発明のキットは、先に記載された方法の中で言及された構成要素（例えば、Endo H、Endo S、カルボキシペプチダーゼB、プラスミン、適切な緩衝剤）の全て、先に記載された方法の任意の一つによる手順を示す使用説明書、および該キットの内容物のための容器を含む。
糖タンパク質、好ましくはグリコシル化抗体またはそのフラグメントの複合型N結合オリゴ糖を切断するためのEndo Sの使用も、本発明の一部である。
定義
用語は、本明細書では、以下において特に定義されない限り、当技術分野で一般に用いられるのと同様に用いられる。
本明細書で用いられる用語「不均一な糖」は、フコース残基に連結されていない、グリコシル化抗体または抗体フラグメントの任意の単糖部分を包含する。グリコシル化抗体または抗体フラグメントの不均一な糖の非限定的例は、マンノース、シアラート、ガラクトース、アセチルグルコサミンである。一般に、本発明による方法の段階（a）で除去される不均一な糖は、第一のGlcNAc残基と、即ちタンパク質のアスパラギン残基に付着したGlcNAc残基と、該第一のGlcNAc残基に結合したフコース残基とを除く、全ての糖であろう。
本明細書で用いられる用語「不均一な残基」は、グリコシル化抗体または抗体フラグメント内のフコース残基の検出を妨害しうる、前記抗体または抗体フラグメント（不均一な糖以外）の任意の他の部分を意味する。不均一な残基の非限定的例は、フコシル化以外のグリコシル化抗体または抗体フラグメントの様々な改変、例えば、ガラクトシル化、C末端リシン不均一性および脱アミド化である。用語「不均一な残基」は、グリコシル化されていない抗体フラグメント、例えば、Fabフラグメント、scFvフラグメントおよび他のフラグメントを更に含んでいてもよい。
本明細書で用いられる用語「抗体」は、抗体分子全体、抗体フラグメント、または、免疫グロブリンのFc領域と同等の領域を含む融合タンパク質を包含することが意図される。
用語「複合型オリゴ糖」および「ハイブリッド型オリゴ糖」は、抗体または抗体フラグメントのグリコシル化パターンを指す。「複合型オリゴ糖」および「ハイブリッド型オリゴ糖」の非限定的な例を、図7に示す。当業者に理解される通り、バイセクトハイブリッド型オリゴ糖に富んだ糖タンパク質は典型的に、生産細胞系におけるGnT-IIIの過剰発現により生じる。バイセクトハイブリッド型オリゴ糖の例示的構造を、図7-IIIに詳細に示す。バイセクト複合型オリゴ糖に富んだ糖タンパク質は典型的に、生産細胞系におけるManIIおよびGnT-IIIの共発現により生じる。バイセクト複合型オリゴ糖の例示的構造を、図7-IVに詳細に示す（Ferrara et al., Biotechnol Bioeng (2006) 93, 851-861）。
本明細書で用いられる糖残基「の後ろ」を切断するとは、該残基に対して遠位の切断、即ち、該残基と糖質構造の外側末端方向に隣接した残基とをつなぐ糖結合の切断を意味する。N結合グリカン「の第一のGlcNAc残基の後ろ」の切断は、オリゴ糖のキトビオースコアの、第一の（即ち、アスパラギンに付着した）GlcNAc残基と第二の（即ち、第一の残基に付着した）GlcNAc残基の間での切断を意味する。
抗体調製物内のフコース残基の「分布」とは、Fc領域中のN結合グリカンと会合したフコース残基の数が異なる抗体またはFc分子が該調製物内で存在することを指す。例えばIgG分子は、Fc領域中にN結合グリカンを2個有し、そのそれぞれが、糖質構造の第一のGlcNAc残基に結合したフコース残基を有し得る。従って、IgG調製物中には、以下の3種の異なる分子種が存在する可能性がある：Fc領域中のN結合グリカンに会合したフコース残基を2個有する、1個有する、または全く有さない、IgG。総フコース含量、即ちフコシル化N-グリカンまたは非フコシル化N-グリカンの画分の決定に加えて、これらの異なる種の比率（即ち、Fc分子あたりのフコース残基の分布）を、本発明の方法により決定することができる。
以下の実施例では、本発明をより詳細に説明する。実施例は、当業者に本発明をより明確に理解および実践させるために示す。しかし本発明は、例示的態様により範囲を限定されず、それは本発明の単なる一局面の例示であることが意図され、かつ、機能的に同等な方法は、本発明の範囲に含まれる。
ヒトIgG1-FcのAsn-297に付着した糖質部分の略図である。太字の糖は、N結合グリカン構造の五糖コアを定義しており、その他の糖残基の付着は可変的である。灰色は、バイセクトGlcNAc残基を表す。 CE-SDSによりモニタリングされた抗体A（野生型）およびC（グリコエンジニアリング（glycoengineered））の完全Fcフラグメントの脱グリコシル化。非還元型Fcフラグメントのエレクトロフェログラムを酵素処理の前後で示す。（A）酵素処理されていないか（破線）、PNGアーゼFで脱グリコシル化されたか（点線）、またはEndo Sで脱グリコシル化された（実線）、抗体CのFcフラグメント、（B）酵素処理されていないか（破線）、PNGアーゼFで脱グリコシル化されたか（点線）、またはEndo Sで脱グリコシル化された（実線）、抗体AのFcフラグメント。 Endo SとPNGアーゼFによる連続処理、またはEndo SとEndo Hによる連続処理によって抗体CのFcフラグメントから遊離されたN結合オリゴ糖の陽イオンMALDI-TOF質量スペクトル。（A）Endo Sによる処理によって遊離されたグリカンのスペクトル。（B）引き続いたPNGアーゼFによる処理によって遊離されたEndo S抵抗性糖質のスペクトルであり、m/z=1663で分離したシグナルが得られた（略図で示されたハイブリッド型または複合型構造に対応する可能性がある）。（C）引き続いてハイブリッド型構造特異的な酵素Endo Hによる処理によって遊離された、グリカンのスペクトル（Endo H処理により遊離されたm/z=1460に対応するハイブリッド型構造を略図で示す）。 CE-SDS MW分析（A）および陽イオンMALDI-TOF質量分析（B）によりモニタリングされた抗体CのFcフラグメントの脱グリコシル化。（A）グリコシダーゼで処理されていない（破線）およびEndo SとEndo Hで併用処理された（実線）、非還元型Fcフラグメントのエレクトロフェログラムのオーバーレイ。（B）Endo SおよびEndo Hで処理されたFcフラグメントから遊離されたN結合オリゴ糖の質量スペクトル。Endo Hにより遊離されたm/z=1460に対応するハイブリッド型構造を略図で示す。 Endo SおよびEndo Hで処理された後のFcフラグメントのESI-MSスペクトル。（A）抗体AのFcフラグメント、（B）抗体BのFcフラグメント、（C）抗体CのFcフラグメント。ピーク1:Fc-GlcNAc/GlcNAc、ピーク2:Fc-GlcNAc/GlcNAc+Fuc、ピーク3:Fc-GlcNAc +Fuc/GlcNAc+Fuc。 CE-SDS（A）および陽イオンMALDI-TOF質量分析（B）によりモニタリングされた抗体Cの脱グリコシル化。（A）非還元型IgGのエレクトロフェログラムを酵素処理の前後で示す：酵素処理されていない（破線）、PNGアーゼFで脱グリコシル化された（点線）、またはEndo SとEndo Hとで併用処理された（実線）、抗体C。（B）Endo SおよびEndo Hで処理された全IgGから遊離されたN結合オリゴ糖の質量スペクトル。 複合型またはハイブリッド型構造に至る、N結合オリゴ糖の生合成経路。M1：マンノシダーゼI、G1:β1,2-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI、G3:β1,4-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII、Gt:β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ。 Endo SおよびEndo Hで処理された後の全IgGのESI-MSスペクトル。（A）抗体A、（B）抗体D。ピーク1:Fc-GlcNAc/GlcNAc、ピーク2:Fc-GlcNAc/GlcNAc+Fuc、ピーク3:Fc-GlcNAc+Fuc/GlcNAc+Fuc。 Endo SおよびEndo Hで処理された後の全IgGのLC-MSスペクトル。（A）抗体A、（B）抗体D。ピーク1:Fc-GlcNAc/GlcNAc、ピーク2:Fc-GlcNAc/GlcNAc+Fuc、ピーク3:Fc-GlcNAc+Fuc/GlcNAc+Fuc。
実施例1：方法
ヒトIgGからのFcの生成
Papac et al., 1998により決定された、非フコシル化グリカン含量の異なる4種の異なるヒトIgG（カッコ内は含有量）を、非フコシル化分布の分析に用いた：野生型抗体A（2.12%）、グリコエンジニアリング抗体B（47.0%）、グリコエンジニアリング抗体C（69.6%）、およびグリコエンジニアリング抗体D（85%）。
タンパク質を、50mM Tris pH8.0、150mM NaCl中で、0.42Uプラスミン（Roche）/mgと共に25℃で72時間インキュベートした。緩衝液A（50mM Tris pH8.0、100mMグリシン、150mM NaCl）で平衡化および洗浄（カラム容積（CV）の5倍）したプロテインAアフィニティーカラム（5ml HiTrap（商標）Protein A HPカラム、GE Healthcare）を用いて、切断されたFcをFabフラグメントから分離した。緩衝液B（50mM Tris pH3.0、100mMグリシン、150mM NaCl）を用いたpH段階により、Fcを溶離した。Fcを含有する画分をプールして、1:40（v/v）の2M Tris pH8.0を添加することにより中和した。ウルトラコンセントレーター（ultra concentrators）（Vivaspin 15R 10'000 MWCO HY, Sartorius）を用いて試料を容量2.5mlまで濃縮し、続いて、2mM MOPS pH7.4、150mM NaCl、0.02%(w/v)NaN3で平衡化したPD-10脱塩カラム（GE Healthcare）に加えた。精製されたタンパク質を液体窒素中で凍結して、-80℃で保存した。
ヒトFcからのN結合オリゴ糖の遊離
ヒトIgGのN結合グリカンを加水分解するのに、別の酵素を用いた。N結合オリゴ糖を、0.005U組換えPNGアーゼF（QAbio, Vista Monte, USA）とのインキュベーションにより、Fc 1mgから切断した。非標識Endo S（Genovis）を用いてFcから糖質を遊離するために、単独のまたは0.1U/mg Endo H（QAbio）と組み合わせたモル比1:20のEndo Sと共に、試料をインキュベートした。反応物は全て、20mM Tris pH8.0中、37℃で16時間インキュベートした。
Endo Sにより切断されない糖質を分析するために、Endo S処理の後に、上述のプロテインAを用いるアフィニティークロマトグラフィーによってFcを精製し、続いてPNGアーゼFまたはEndo Hのいずれかで消化した。
ヒト全IgGからのN結合オリゴ糖の遊離
別の酵素を用いて、ヒトIgGのN結合グリカンを遊離した。20mM Tris pH8.0中、0.005Uの組換えPNGアーゼF（QAbio）と共に37℃で16時間インキュベートすることにより、IgG 1mgからN結合オリゴ糖を切断した。タグ付けされていないEndo S（Genovis）を用いてIgGから糖質を遊離するために、20mM Tris pH8.0で平衡化したNAP-5脱塩カラム（GE Healthcare）に試料を加えた。溶離された試料を、ウルトラコンセントレーター（Amicon 5'000 MWCO, Millipore）を用いて最終濃度4mg/mlまで濃縮し、0.1U/mg Endo H（QAbio）と組み合わせたEndo Sと共にモル比1:7で、37℃で16時間インキュベートした。
カルボキシペプチダーゼB処理
C末端リシン残基によりもたらされた不均一性を解消するために、試料を脱グリコシル化した後、カルボキシペプチダーゼB（Roche; 1mg/ml）と共に更にインキュベートした。それゆえ、1μlカルボキシペプチダーゼB/50μgヒトFcまたは全抗体をエンドグリコシダーゼ反応物に添加して、再度37℃で1時間インキュベートした。
遊離されたオリゴ糖のMALDI-TOF質量分析
ヒトFcまたは全抗体の中性オリゴ糖プロファイルを、陽イオンモードの質量分析（Autoflex, Bruker Daltonics GmbH）により分析した（Papac et al., 1998）。
脱グリコシル化されたヒトFcまたは全抗体の精製
Fcまたは全IgGを、Agilent HPLC 1100シリーズ（Agilent Technologies）を用いたプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより、酵素および切断した糖質から分離した。ガードカラム2×20mm C-130B（Upchurch Scientific）に充填されて緩衝液A（50mM Tris、100mMグリシン、150M NaCl、pH8.0）で平衡化したプロテインAマトリックス（Poros 20A；Applied Biosystems）に、試料を加えた。5.5CVの緩衝液Aで洗浄した後、8.3CVを超える緩衝液B（50mM Tris、100mMグリシン、150M NaCl、pH3.0）を用いたpH段階によりヒトFcまたは全IgGを溶離した。1:40（v/v）の2M Tris pH8.0を添加することにより、該タンパク質を含有する画分を中和した。
精製されたタンパク質を、次に、非切断糖質を分析するための酵素による処理である、CE-SDS分析またはESI-MSのいずれかに更に用いた。
CE-SDS MW分析
脱グリコシル化を、UV検出と共にBeckman PA800を用いたCE-SDS-MW分析によりモニタリングした。各プロテインA精製試料100μgの緩衝液を、スピンコンセントレーター（5000MWCO, Millipore）を用いて20mM Tris pH8.0に交換した。非還元試料を、SDS-MW Analyses Guideに記載された通り、ProteomeLab SDS-MW Analysis Kit（Beckman Coulter）を用いて調製した。最終的なタンパク質濃度は、1mg/mlであった。試料を、前処理した、被覆のない溶融シリカキャピラリー（50μm ID×30.2cm）に加えた。前処理および分離は、使用説明書に従って実施した。
ESI-MSのための試料調製
プロテインA精製試料の緩衝液を、スピンコンセントレーター（5000MWCO, Millipore）を用いて、2mM MOPS pH7.4, 150mM NaCl, 0.02%(w/v)NaN3に交換した。タンパク質を液体窒素中で凍結して、-80℃で保存した。
直接注入によるヒトFcおよび全IgGのグリカン構造のESI-MS分析（オフライン検出）
サイズ排除クロマトグラフィーによる脱塩：
プロテアーゼであるプラスミンおよびカルボキシペプチダーゼBと、エンドグリコシダーゼであるEndo SおよびEndo Hとによる抗体処理の後のFc、または、Endo S、Endo H、およびカルボキシペプチダーゼBによる処理の後の全IgGを20〜50μg（90μlに増量）、2%ギ酸、40%アセトニトリルにより流速0.5ml/分で30分間平衡化したSephadex G25自己充填式ECO SRカラム（5×250mm、KronLab）に注入した。注入されたタンパク質試料を脱塩して、2%ギ酸、40%アセトニトリルを用いて流速1ml/分で8分間、均一濃度溶離を適用した。脱塩されたタンパク質の溶離を、280nmのUVにより記録して、溶離された試料（容量約200〜300μl）を、1.5ml反応バイアルに回収した。脱塩された試料のアリコートを、金属コーティングされたガラス針（Proxeon Biosystems Nano ESI針、カタログ番号ES387）に手作業で充填して、質量分析機器のナノスプレー源に挿入し、WatersのESI-Q-TOF II質量分析計またはApplied BiosystemsのQ-Star Elite質量分析計にスプレーした。
直接注入のためのMSパラメータ：
A） Q-TOF II機器（Waters）におけるプラスミン処理試料（ヒトFc）
ソース温度80℃を使用した陽イオンモードのマスレンジ1000〜2000m/zで、キャピラリー電圧1000V、コーン電圧30Vを使用して、MSスペクトルを得た。デソルベーション温度をオフにした。MSデータを各機器のソフトウェアにより約2〜3分間にわたり得た。
B）MaXis-ESI-MS機器（Bruker）における全抗体
NanoMate装置をスプレーインターフェースとして用いて、MSスペクトルを得た。MS機器におけるデータ取得のための値を、移動パラメータに関しては400Vpp（ファンネルRF）、120eV（ISCIDエネルギー）および400Vpp（Multipol RF）に、四重極パラメータでは5.0eV（イオンエネルギー）および300m/z（低質量）に、コリジョンセルの調整は15eV（コリジョンエネルギー）および3000Vpp（コリジョンRF）に、そしてイオンクーラーでは800Vpp、移動時間160μs、およびプレパルス蓄積20μsに設定した。陽イオンモードのマスレンジ１０００〜４０００m/zで、データを記録した。
適用されたエンドグリコシダーゼにより切断されたグリカン構造の様々な組み合わせ、即ちGlcNAc/GlcNAc、GlcNAc+Fuc /GlcNAcおよびGlcNAc+Fuc /GlcNAc+Fucを含む、二量体Fcフラグメントおよび全抗体のモル質量を、インハウスで開発されたソフトウエアを用いて、該Fcフラグメントまたは全抗体種の各m/zパターンから決定した。様々な、グリコシル化が完全ではない（residually glycosylated）二量体Fcフラグメントまたは全抗体の相対比を、該二量体Fcフラグメントまたは全抗体の明確なグリコシル化変異体のm/zスペクトルのピーク面積の合計を用いて、同じインハウスのソフトウェアで算出した。
LC-MSによる全IgGのグリカン構造のESI-MS分析（オンライン検出）
LC-MSを、Q-TOF II質量分析計（Waters）に接続されたDionex HPLCシステム（Dionex Ultimate 3000）で実施した。クロマトグラフィー分離を、ACE C4カラム（5μm粒径、300A孔径、1×30mm；Advanced Chromatography Technologies）で実施した。溶離液Aは、0.1%ギ酸であり、溶離液Bは、99.9%アセトニトリルおよび0.1%ギ酸であった。流速は100μl/分であり、分離は75℃で実施し、Endo SおよびEndo Hで処理したがプラスミンでは処理していない完全抗体試料2μg（10μl）を用いた。
（表１）LC-MSのパラメータ
Figure 2013506404
ソース温度100℃を使用した陽イオンモードのマスレンジ1000〜4000m/zで、キャピラリー電圧2700V、コーン電圧80Vを使用して、MSスペクトルを得た。デソルベーション温度を、200℃に設定した。MSデータを、各機器のソフトウェアにより約11.4分間（勾配時間3.5〜14.9分）にわたって得た。
適用されたエンドグリコシダーゼにより切断されたグリカン構造の様々な組み合わせ、即ちGlcNAc/GlcNAc、GlcNAc+Fuc /GlcNAcおよびGlcNAc+Fuc /GlcNAc+Fucを含む、完全抗体（2個の重鎖および2個の軽鎖からなる）のモル質量を、インハウスで開発されたソフトウエアを用いて、抗体種の各m/zパターンから決定した。様々な、グリコシル化が完全ではない完全抗体の相対比を、該完全抗体の明確なグリコシル化変異体のm/zスペクトルのピーク面積の合計を用いて、同じインハウスのソフトウェアで算出した。
Endo SおよびEndo Hで処理された抗体をTCEP（Tris（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）で還元して、同じカラムタイプおよび勾配設定を用いるがMSデータ獲得のためのパラメータの一部が改変された、上記のLC-MS分析を実施することにより、非フコシル化重鎖の比を決定した。MSパラメータは、先に記載されたものと同一であったが、コーン電圧は25Vに設定し、マスレンジは600〜2000m/zであった。
実施例2：結果
Fcの脱グリコシル化
PNGアーゼFとしても公知のN-グリコシダーゼFは、高マンノース型、ハイブリッド型および複合型N結合オリゴ糖の最内側のN-アセチルグルコサミンと、グリカンが付着した糖タンパク質のアスパラギン残基との間を切断する、高特異性デグリコシダーゼである（Tarentino et al., 1985）。製造業者の使用説明書に従った、PNGアーゼFによる抗体AおよびCのFcフラグメントの処理を、CE-SDSによりモニタリングした。これらの条件下で、PNGアーゼFにより両方の分析試料のグリカン部分が定量的に除去され、3.79×10-5から3.9×10-5へのメインピークの移動度シフトが生じた（図2）。
Endo Sは、N結合オリゴ糖のキトビオースコアを切断して、第一のN-アセチルグルコサミン残基（およびフコシル化糖質の場合にはα-フコース残基）をタンパク質に付着したままにする。そのような消化されたグリコエンジニアリング試料のCE分析により、移動度3.84×10-5のピークにより実証されたように、タンパク質の約10%が消化されていないままであることが明らかとなった（図2a、表2）。引き続くPNGアーゼF処理による分析で、Endo S抵抗性糖質が完全にハイブリッド型構造であることが示され、複合型糖質に対するこの酵素の特異性が示唆された。この結果は、野生型抗体Aの定量的Endo S消化が、均一に脱グリコシル化されたタンパク質をもたらしたことにより、裏付けることができた（図2（b）。
（表２）CE-SDSにより評価された酵素処理Fcフラグメントのピーク面積
Figure 2013506404
この仮説を確認するために、抗体CのEndo S処理されたFcをアフィニティークロマトグラフィーにより精製して、酵素および切断された糖質を除去し、次にPNGアーゼFと共にインキュベートして、グリカン部分全体を除去した。加水分解された糖質を、MALDI TOF MSで更に分析した。得られたスペクトルから、Endo Sがm/z=1663に対応する複合型バイセクト構造またはハイブリッド型バイセクト構造のいずれかを識別している（即ち、切断しない）ことが示された（図3b）。
更なる実験を実施して、識別された糖質が複合型バイセクト構造とハイブリッド型バイセクト構造のどちらであるかを判定した。アフィニティークロマトグラフィーによる精製の後に、抗体CのEndo S処理FcフラグメントをPNGアーゼFまたはエンドグリコシダーゼH（Endo H）と共にインキュベートした。Endo Hは、糖タンパク質の高マンノース型およびハイブリッド型N結合オリゴ糖のキトビオースコア内を切断する組換えグリコシダーゼである。これは、複合型構造内を切断することはできない。MALDI TOF MSスペクトルは、Endo Sにより識別された糖質がEndo Hにより切断され、m/z=1460の主要ピークをもたらすことを示した（図3c）。これらのデータから、Endo Sはアスパラギン結合N-アセチルグルコサミンからハイブリッド型バイセクト糖質を遊離できないことが、明確に示された。
α結合フコース含量のみが異なる均一に脱グリコシル化された材料を得るために、抗体CのFcフラグメントをEndo SとEndo Hによる併用処理に供すと、CE-SDSにより観察された通り、第一のGlcNAc残基の後ろで定量的に脱グリコシル化されたタンパク質が得られた （図4a）。MALDI-TOF MS分析から、ハイブリッド型バイセクト構造（m/z=1460）はこれら2種の酵素の併用により遊離されることが示された（図4b）。α結合フコース残基を有するまたは有さないN-アセチルグルコサミンに対していかなる他の糖質も付着していないことを確認するために、Endo SおよびEndo Hで処理された、抗体CのFcフラグメントを、PNGアーゼFと共にインキュベートした。MALDI TOFスペクトルはこの処理の後に得られず、このことは、Endo SでもEndo Hでも切断することができない他の糖質は全く残存していなかったことを示唆するものである（データは示さず）。
Fc調製物中のフコース分布の決定
Fcに付着したN-アセチルグルコサミン残基に結合したフコースの分布を定量するために、ESI-MS分析を実施した。Endo SおよびEndo Hと共にインキュベートしてから、アフィニティークロマトグラフィーにより分離した後、抗体A、BおよびCのFcドメイン（プラスミン消化により生成）をカルボキシペプチダーゼBで処理して、C末端リシンにより導入された不均一性を解消した。
残存GlcNAcに結合したフコースを2個有する、1個有する、または全く有さないFcフラグメントは、Endo S/Endo H処理の後にタンパク質に付着したままであることが、ESI-MSスペクトルから明らかとなった（図5）。これらの3種のフコース種の分布を、検査された3種の異なるIgGであるA、BおよびCについて要約する（m/z-スペクトルのピーク面積合計の相対比として計算）。その結果は、MALDI-TOF MSにより決定されたフコース含量と良好に相関する（表3）。
（表３）抗体A、BおよびCのFcフラグメントの質量分析により決定された非フコシル化度の比較
Figure 2013506404
全IgGの脱グリコシル化
Endo SとEndo Hによる併用処理で全IgGを脱グリコシル化するために、切断条件を最適化する必要があった。Fcフラグメントの脱グリコシル化で用いられたのと同じ、Endo S 対IgGのモル比1:20での脱グリコシル化は、全IgGを脱グリコシル化するには不十分であった。Endo Sの濃度をモル比1:7まで上昇させると、CE-SDSにより観察された、α結合フコース含量のみが異なる均一に脱グリコシル化した材料が十分に得られた（図6a）。MALDI-TOF分析から、該糖質がEndo SとEndo Hによる併用処理によって遊離されることが示された（図6b）。このアプローチを用いて、Fcフラグメントを別々に作製する必要なくIgGあたりのフコースの配分を分析することが可能である。
全IgGのフコース分布の決定
全IgGのN結合グリカンの最内側のN-アセチルグルコサミン残基に結合したフコースの分布の定量を、野生型抗体A（非フコシル化 2.12%）およびグリコエンジニアリング抗体D（非フコシル化 85.0%）を用いて実施した。Endo SとEndo Hによる併用処理の後、両方のIgGをカルボキシペプチダーゼBと共にインキュベートして、C末端リシンにより導入された不均一性を解消した。次に、抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
IgGあたりのコアフコースの配分を、2種の異なる方法を用いて決定した。Endo S/Endo H処理の後、残留GlcNAcに付着したフコースを2個有する、1個有する、または全く有さないIgG種が、ESI-MSオフライン検出により得られたm/z-スペクトルのパターンによって明らかになった（図8）。これら3種のフコース種の分布を、検査された2種の異なるIgGであるAおよびDについて要約する（m/z-スペクトルのピーク面積合計の相対比として計算）（表4）。
IgGあたりのフコースの配分を決定するために、LC-MS分析も実施した（図9）。両方のIgGに関して、m/z-スペクトルによって示された、付着したフコースを2個有する、1個有する、または全く有さないIgG種の比率は、ESI-MSオフライン検出において観察されたのと類似であった（表4）。5%未満のピーク面積は、全IgGに対する方法の検出感度内である。非フコシル化重鎖の比率を、表4の非フコシル化[%]の列に示す。
（表４）抗体AおよびDのESI-MSおよびLC-MS分析により決定された非フコシル化度およびフコース配分の比較
Figure 2013506404

Claims (13)

  1. 以下の段階を含む、グリコシル化抗体またはそのフラグメント内のフコース残基の有無を検出する方法：
    （a）該タンパク質から不均一な糖残基を酵素的に除去する段階、
    （b）該タンパク質からの他の不均一な残基を酵素的に除去する段階、
    （c）引き続いて該タンパク質を分析する段階。
  2. 段階（c）が、分析前に精製する段階を更に含む、請求項1記載の方法。
  3. 抗体調製物内の分子のなかでフコース残基の量およびその分布パターンが決定される、請求項1または2記載の方法。
  4. 抗体調製物中のFc分子あたりのフコース残基の分布が決定される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
  5. 除去する段階（a）がEndo Sおよび/またはEndo Hにより実施される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
  6. 除去する段階（b）がプラスミンおよび/またはカルボキシペプチダーゼBにより実施される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
  7. 分析する段階（c）がLC-MS分析、CE-SDS MW分析またはESI-MS分析を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
  8. （a）抗体調製物を提供すること、
    （b）そのような抗体調製物のFcフラグメント部分を任意で単離すること、
    （c）Endo HおよびEndo Sを用いて前記抗体またはFcフラグメントから不均一な糖残基を全て除去すること、
    （d）カルボキシペプチダーゼBを用いて前記抗体またはFcフラグメントからC末端リシン残基を除去すること、
    （e）LC-MS分析、ESI-MS分析またはCE-SDS MW分析により前記抗体またはFcフラグメントを分析すること
    を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
  9. 段階（e）が、分析前に精製する段階を更に含む、請求項8記載の方法。
  10. 発酵の際の抗体調製物中の協同的フコシル化を判定するための、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法の使用。
  11. Endo Sおよび/またはEndo Hと、プラスミンおよび/またはカルボキシペプチダーゼBと、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法の構成要素全てと、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法のいずれか一つによる手順を示す使用説明書と、キットの内容物のための容器とを含む、ペプチド内のフコース残基の定性的および定量的検出に使用するための、該キット。
  12. 糖タンパク質から複合型オリゴ糖を切断するためのEndo Sの使用。
  13. 特に前述の実施例を参照して本明細書に実質的に記載された、方法、キット、および使用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101591671B1 (ko) * 2011-04-29 2016-02-04 바이오콘 리서치 리미티드 항체의 이질성을 감소시키는 방법 및 그 항체의 제조방법
GB201115841D0 (en) * 2011-09-13 2011-10-26 Genovis Ab Protein and method
MX355048B (es) 2011-10-19 2018-04-03 Roche Glycart Ag Metodo de separacion para anticuerpos fucosilados.
US9434786B2 (en) * 2012-02-10 2016-09-06 University Of Maryland, Baltimore Chemoenzymatic glycoengineering of antibodies and Fc fragments thereof
TWI682033B (zh) * 2014-03-17 2020-01-11 泉盛生物科技股份有限公司 製造具有經修飾的糖苷化作用之重組糖蛋白之方法
EP3064507A1 (en) 2015-03-06 2016-09-07 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Fusion proteins comprising a binding protein and an interleukin-15 polypeptide having a reduced affinity for IL15ra and therapeutic uses thereof
WO2017137459A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Enzymes for trimming of glycoproteins
CN108982737B (zh) * 2018-08-07 2021-06-22 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种规模化的核心岩藻糖基化修饰位点占有率定量方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5126250A (en) * 1988-09-28 1992-06-30 Eli Lilly And Company Method for the reduction of heterogeneity of monoclonal antibodies
JP4253233B2 (ja) * 2003-08-25 2009-04-08 大塚製薬株式会社 術後癌患者の予後判定方法
US8207303B2 (en) * 2005-02-18 2012-06-26 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies against CD30 lacking in fucosyl residues
CN101238148A (zh) * 2005-06-03 2008-08-06 健泰科生物技术公司 具有改良的岩藻糖化水平的抗体的生产方法
US20070166306A1 (en) * 2006-01-17 2007-07-19 Fey Georg H M Anti-CD19 antibody composition and method
CN101460522B (zh) * 2006-04-11 2014-07-23 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 糖基化抗体
US20080226635A1 (en) * 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
RU2475751C2 (ru) 2007-04-16 2013-02-20 Момента Фармасьютикалз, Инк. Способы, связанные с гликозилированием клеточной поверхности
PL2190984T3 (pl) 2007-09-14 2014-02-28 Genovis Ab Sposoby i zestawy do oczyszczania i wykrywania glikozylowanego IgG

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016082962A (ja) * 2014-04-25 2016-05-19 公益財団法人野口研究所 糖鎖切断抗体の製造方法及び均一糖鎖抗体

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