KR101591671B1 - 항체의 이질성을 감소시키는 방법 및 그 항체의 제조방법 - Google Patents

항체의 이질성을 감소시키는 방법 및 그 항체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배양 중에 항체의 이질성을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 이질성은 항체의 전하 변이체의 비율에 기인하는 것이다. 본 발명은 또한 이질성이 감소된 항체를 결과시키는 세포 배양 시스템에서 세포를 성장시키는 방법에 관한 것이기도 하다. 일 구체예에서 항체 이질성은 아연(Zn2+)와 같은 2가의 전이금속 이온을 배양 배지에 첨가함으로써 감소된다. 또 다른 구체예에서, 항체 이질성은 세포 배양 배지의 오스몰 농도를 저감시킴으로써 감소된다.

Description

항체의 이질성을 감소시키는 방법 및 그 항체의 제조방법{ METHOD FOR REDUCING HETEROGENEITY OF ANTIBODIES AND A PROCESS OF PRODUCING THE ANTIBODIES THEREOF}
본 발명은 세포 성장 단계 단계와 폴리펩타이드 생산 단계를 포함하여 이루어지는 변형된 세포 배양법을 이용하여, 항체 생산과 같은 단백질 생산, 예컨대 대규모의 상업적 단백질을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 변형된 세포 배양법은 변경된 전하 변이체/염기 변이체 (charge variants/basic variants)를 갖는 폴리펩타이드 산물을 얻기 위하여 공정 변수 및 작업 변수를 제어한다. 본 발명은 항체에 있어서 이질성(heterogeneity)을 감소시키기 위한 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 염기 변이체의 비율을 감소시킴으로써 전하 변이체 중의 이질성을 감소시키는 세포 배양 시스템에서 세포를 성장시키는 방법을 포함한다.
본 발명의 배경기술 및 종래기술
바이오기술을 이용한 제품 중 가장 많은 비율을 차지하는 것은, 시판되는 것이건 아직 개발 중에 있는 것이건, 단연 단백질 치료제이다. 따라서, 예컨대 동물 세포 배양과 같은 세포 배양시 단백질 생산, 이러한 생산과 관련된 개선된 제조 방법에 대한 요구가 점점 커지고 있다. 이에 따라, 동물 세포 배양 조건 및 폴리펩타이드 생산량을 최적화시킬 수 있는 방법, 즉 높은 세포 밀도 및 높은 단백질 역가를 뒷받침하는 조건과 방법에 대하여 집중적으로 연구가 이루어지고 있다.
바이오의약 모노클로날 항체 분야에서 C-말단 라이신 변이가 일반적으로 관찰되고 있다. 모노클로날 항체 이질성은 아미노 말단 변형(예컨대 파이로글루타메이트), C-말단의 불완전한 프로세싱, 아스파라긴 탈아미드화, 포스포릴화, 글리코실화, 산화, 돌연변이 등 다양한 인자에 기인할 수 있다. 이러한 종류의 변이들은 다양한 종류의 단백질에서 발생하여 바이오의약품에 있어서 이들의 안정성과 활성에 영향을 미칠 수 있다. 항체 균질성(homogeneity)은 중요한 특성이며 FDA 및 기타 규제 당국이 요구하는 약물의 안전성과 효능을 입증하는데 있어서 필수적인 것으로 여겨지고 있다.
재조합 모노클로날 항체는 C-말단에서 아르기닌(Arg) 또는 라이신(lys)에 있어서 C-말단 이질성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이들 MAbs의 C-말단 변이체들이 엑소펩티다제인 카르복시펩티다제 B와 반응할 경우, 항체의 2개 서브유닛 모두의 C-말단으로부터 Arg와 Lys이 절단되어, C-말단 이질성이 제거된다.
카르복시펩티다제(CPs)는 펩타이드와 단백질에 있어서 C-말단 펩타이드의 가수분해를 촉매하는 효소이다. 펩타이드 또는 단백질의 C- 말단으로부터 하나 또는 수개의 아미노산을 제거하는 것은 그 분자의 생물학적 활성에 심대한 영향을 미칠 수 있다. MAb의 이질성은 합성 시점으로부터 대상체로부터 완전히 소거되는 시점까지의 그 항체 분자의 수명 전반에 걸쳐서 다양한 변형이 도입됨으로 해서 일반적인 현상이다. 치료제의 변형에 관한 연구는 매우 중요한데 이는, 이러한 변형이 제제의 활성/안정성에 영향을 미쳐서 효능이 상실되고 부작용의 위험으로 이어질 수 있기 때문이다.
미국특허 5,126,250호는 항체를 생산하는 세포들로부터 분비된 항체의 이질성을 감소시키는 방법이 개시되어 있다.
따라서, 본 발명은 세포 배양에 의해 수득된 항체에 있어서 이질성을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 2가의 전이금속 이온을 항체 생산 배양 배지에 첨가하거나 또는 배양 배지의 오스몰 농도를 변경시키거나 또는 이들 두가지를 조합함으로써 이질성이 감소된 상기 항체를 얻는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이질성이 감소된 항체의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 (a) 항체 생산을 위한 배양 배지에서 항체를 배양하고, 상기 배양 배지에 2가의 전이금속 이온을 첨가하거나 상기 배양 배지의 오스몰 농도를 변경시키거나 또는 이들 두 가지를 조합하는 것 및 (b) 상기 배양 배지로부터 이질성이 감소된 항체를 회수하는 것을 포함하여 이루어진다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 세포 배양에 의해 수득된 항체에서 이질성을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 금속 이온을 항체 생산 배양 배지에 첨가하거나 배양 배지의 오스몰 농도를 변경시키거나 또는 이들 두 가지를 조합하는 것에 의해 이질성이 감소된 상기 항체를 얻는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 이질성은 항체의 전하 변이체의 비율에 기인하는 것으로; 이질성의 감소는 항체의 C-말단 상의 라이신 잔기의 비율을 감소시킴으로써 수행한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 이질성은 상기 방법을 약 75% 내지 약 100% 범위의 항체 비율에 대해 수행함으로써 감소된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 항체는 모노클로날 항체, 변형 항체, 항체 유도체 및 항체 단편 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 자연발생 항체 또는 재조합 항체이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 이질성은 항체의 염기 변이체 비율을 약 3% 내지 약 30%로 감소시키고 메인 피크/0 라이신을 약 5% 내지 약 25%로 증가시킴으로써 감소된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 2가 전이금속 이온은 Zn+2이고 약 0.05 mM 내지 약 1.5 mM의 농도로 사용된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양 배지의 오스몰 농도는 오스몰 농도가 약 240 mOsm/Kg 내지 약 260 mOsm/Kg의 범위로 제공되도록 변경된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양은 유가식 배양(fed batch culturing)이며; 포유동물 세포, 좋기로는 차이니즈 햄스터 난소(CHO: hamster ovary) 세포주를 배양한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 금속이온의 첨가는 먼저 세포 성장 단계와 두번째로 세포 배양체의의 폴리펩타이드 생산 단계에서 수행되며; 또는 금속이온의 첨가는 상기 세포들을 배양하기 전에 초기 단계에서 행하기도 한다.
본 발명은 또한 이질성이 감소된 항체의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: (a) 항체 생산용 배양 배지에서 세포를 배양하고, 상기 배양 배지에 2가 전이금속 이온을 첨가하거나 배양 배지의 오스몰 농도를 변경하거나 또는 이들 두 가지를 모두 수행하고 (b) 배양 배지로부터 이질성이 감소된 항체를 회수하는 것을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 일 구체예에서, 세포는 약 0.5x106 세포/ml 내지 약 0.6x106 세포/ml의 농도 범위로 배양된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양은 36℃ 내지 약 38℃의 온도 범위에서 수행된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 항체는 모노클로날 항체, 변형된 항체, 항체 유도체 및 항체 단편 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 자연발생 항체 또는 재조합 항체이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 이질성은 항체의 전하 변ㅇ체의 비율에 기인하는데; 여기서 이질성의 감소는 항체의 C-말단 상의 L 라이신 잔기의 비율을 감소시킴으로써 수행된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 이질성은 상기 방법을 약 75% 내지 약 100% 범위의 항체 비율에 대하여 수행함으로써 감소된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 이질성은 항체의 염기 변이체 비율을 약 3 % 내지 약 30%로 저하시키고 메인 피크/0 라이신을 약 5% 내지 약 25%로 증가시킴으로써 감소된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양은 유가식 배양이고; 포유동물 세포 배양체, 좋기로는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주를 배양한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 금속 이온은 Zn+2이며 약 0.05 mM 내지 약 1.5 mM의 농도로 사용한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 배양 배지의 오스몰 농도는 오스몰 농도가 약 240 mOsm/Kg 내지 약 260 mOsm/Kg의 범위가 되도록 변경시킨다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 금속이온의 첨가는 약 30℃ 내지 약 32℃의 온도 범위에서 먼저 세포 성장 단계와 두번째로 세포 배양체의의 폴리펩타이드 생산 단계에서 수행되며; 또는 금속이온의 첨가는 상기 세포들을 배양하기 전에 초기 단계에서 행하기도 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 세포 성장 단계의 세포 농도는 약 12x106 세포/ml 내지 약 13x106 세포/ml이고, 폴리펩타이드 생산 단계의 세포 농도는 약 13x106 세포/ml 세포/ml 내지 약 15x106 세포/ml 세포/ml이다.
본 발명의 일 구체예에서 2가 아연 이온은 좋기로는 황산아연 칠수화물(Zinc Sulphate hepta hydrate)의 형태로 사용되는 것이 바람직하다. 다른 아연 화합물의 예로 ZnH2, Zn(OH)2, Zn(NO3)2 ·H2O 및 ZnCl2를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서 이질성의 감소는 라이신 잔기를 제거하는 효소를 사용함이 없이, 항체의 C-말단 상의 라이신 잔기의 비율을 감소시킴으로써 수행된다.
본 발명은 항체의 이질성을 감소시키기 위한 종래기술 방법의 제약사항들을 극복한다. 본 발명의 한가지 목적은 세포 성장 단계와 폴리펩타이드 생산 단계를 포함하는 변형된 세포 배양법을 이용함으로써 단백질 생산, 예컨대 대규모의 상업적 단백질 생산, 예컨대 항체 생산법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적에서, 항체의 염기 변이체는 아연+2와 같은 금속 이온의 첨가에 의해 감소된다.
본 발명의 또 다른 목적에서, 아연 이온의 농도는 0.05-1.5 mM이다.
본 발명의 또 다른 목적에서, 항체의 염기 변이체는 생산 배지의 오스몰 농도를 저하시킴으로써 감소된다.
본 발명의 또 다른 목적은 항체의 어느 사슬의 C-말단에서도 기본적으로 라이신이 0개 존재하는, 메인 피크/0 라이신의 형성을 증가시킴으로써 전하 변이체들의 이질성을 감소시키는 세포 배양 시스템에서 세포들을 성장시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 배양 배지에서 염기 변이체를 3-30 %까지 감소시키는 것이다.
따라서 본 발명은 세포 성장 단계와 폴리펩타이드 생산 단계를 포함하는 변형된 세포 배양법을 이용하는, 단백질 생산, 예컨대 대규모의 상업적 단백질 생산, 예컨대 항체 생산을 개선하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항체의 미세이질성(microheterogeneity)을 감소시키는 것에 관한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 염기 변이체의 형성을 감소시킴으로써 전하 변이체 중의 이질성을 감소시키는 세포 배양 시스템에서 세포들을 성장시키는 방법을 포함한다.
본 발명은 포유동물 세포를 배양하고 배양 배지 및/또는 세포로부터 MAb를 분리함으로써 염기 변이체의 비율이 변경된 모노클로날 항체의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 항체의 염기 변이체는, Zinc+2와 같은 금속 이온을 0.05-1.5 mM의 범위로 첨가하고 오스몰 농도가 240-260mOsm/Kg 범위인 생산 배지를 사용함으로써 감소된다.
본 발명의 또 다른 구체예는 표준 생산 방법과 일반적으로 관련된 항체의 염기 변이체의 %를 감소시키는 것이다. 본 발명은 특히 바이오시밀러 항체에 요구되는 품질을 갖는 제품을 보다 대량으로 회수함으로써 경제적 및 상업적 이득을 제공한다는 장점을 갖는다.
용어의 정의
용어 "항체"에는 항체 또는 항체 유도체 또는 그의 단편이 포함되며 항체에관한 상세 설명은 본 발명의 항체 제조에도 적용된다. 항체 단편들 중 폴리펩타이드를 비롯하여 항체의 등가물 또는 항체 동족체들은 Fc 영역과 함께 면역글로불린 결합 도메인 또는 이 결합 도메인을 모방하는 펩타이드 또는 Fc 영역에 상동성인 영역 또는 적어도 그의 일부를 포함한다. 다른 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 분자, 또는 그의 등가물 역시도 포함된다.
예시적인 항체 분자들은 온전한(intact) 면역글로불린 분자들 및 Fab, Fab', F(ab')2 ,Fc 및 F(v) 및 N-글리칸 구조로서 알려진, 부분들을 포함, 파라토프를 함유하는 면역글로불린 분자의 일부분들이다.
항체는 혈청의 기본 구성요소이며 분자들의 집합체 (항체들 또는 면역글로불린들, 단편들 등) 또는 하나의 분자 (항체 분자 또는 면역글로불린 분자)로서 칭해진다. 항체 분자는 특이적인 항원 결정기(항원 또는 항원 에피토프)에 결합하거나 이것과 반응하여, 면역학적 이펙터 메카니즘을 유도할 수 있다. 개개의 항체 분자는 대개 단일특이(monospecific)적인 것으로 간주되며, 항체 분자들의 조성물은 모노클로날 (즉, 동일한 항체 분자들로 구성됨)이거나 또는 폴리클로날 (즉, 동일한 항원 또는 다른 항원 상의 같거나 다른 에피토프들과 반응하는 서로 다른 항체 분자들로 구성됨)일 수 있다. 폴리클로날 항체를 구성하는 서로 다른 항체 분자들은 "멤버"로 칭해지기도 한다. 각 항체 분자는 그의 대응하는 항원에 대한 특이적인 결합을 가능케 해주는 독특한 구조를 가지며 모든 천연 항체 분자들은 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄라는 전체적으로 동일한 기본 구조를 갖는다.
이질성은 분비된 항체가 예컨대 비제한적인 예로서 항체 중쇄들 중 일방 또는 양방 모두의 카르복시 말단 상에 여분의(extra) 아미노산 또는 아미노산들을 갖는다던가 또는 항체의 전체적인 전하 분포에 차이를 일으키는 아미노산에 있어서의 변형과 같은 다양한 별개의 생화학적 형태들을 갖는 현상을 일컫는다.
본 발명에서, "폴리펩타이드" 또는 "폴리펩타이드 산물"이라는 표현은 각각 "단백질" 및 "단백질 산물"과 동의어이며, 일반적으로 이 기술분야에서 이해되는 바의 의미를 갖는 것으로, 즉 순차적인 펩타이드 결합에 링크된 아미노산의 적어도 하나의 사슬을 가리킨다. 특정 구체예에서, "대상 단백질(protein of interest)" 또는 "대상 폴리펩타이드(polypeptide of interest)" 등의 표현은 숙주 세포 내로 형질전환된 외인성 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질이다. 숙주 세포에 형질전환된 외인성 DNA가 "대상 단백질"을 코딩하는 특정 구체예에서, 그 외인성 DNA의 핵산 서열은 아미노산의 서열을 결정한다. 특정 구체예에서, "대상 단백질"은 숙주 세포에 내재적인(endogenous) 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질이다. 특정 구체예에서, 이러한 내인성 대상 단백질의 발현은 숙주 세포를 예컨대 1 이상의 조절 서열을 함유하고 및/또는 대상 단백질의 발현을 향상시키는 단백질을 코딩할 수 있는 외인성 핵산 분자에 의해 형질도입됨으로써 변경된다.
본 발명에서, "항체 변이체(antibody variant)"라 함은 친(親) 항체의 아미노산 서열과는 다른 아미노산 서열을 갖는 항체를 일컫는다. 좋기로는 항체 변이체는 천연에서는 발견되지 않는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변부 또는 경쇄 가변부를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 변이체들은 친 항체와의 서열 동일성 또는 유사성이 반드시 100% 미만이다. 바람직한 구체예에서, 항체 변이체는 친 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변부 중 어느 한 쪽의 아미노산 서열과 아미노산 서열 동일상 또는 유사성이 약 75% 내지 100% 미만, 더욱 좋기로는 약 80% 내지 100% 미만, 더욱 좋기로는 약 85% 내지 100% 미만, 더욱 좋기로는 약 90% 내지 100%인 아미노산 서열, 더욱 좋기로는 약 95% 내지 100% 미만인 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 이 서열과 관련된 동일성 또는 유사성은, 최대의 서열 동일성 백분율을 얻기 위해, 필요하다면 서열들을 정렬하고 갭을 도입한 후에, 후보 서열 중 친 항체 잔기와 동일한 아미노산 잔기 (즉 동일한 잔기)의 백분율로서 정의된다.
본 발명에서 "배지", "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"라는 용어는 성장 중으 동물 세포, 예컨대 포유동물 세포에 영양을 공급하는 영양원들을 함유하는 액체를 일컫는 것으로서, 세포가 들어있는, 즉 세포와 조합된 배지를 가리키기도 한다. (일반적으로 시판되는 배지들 예컨대 배양 배지 Hyclone CDM4NS0, Hyclone CDM4Mab, Invitrogen CDOptiCHO 및 Lonza Power CHO를 사용할 수 있다).
바람직한 포유동물 숙주는 CHO 세포이며 바람직한 발효 형태는 유가식 배양법이다. NS0 (비분비성: Non Secreting) 및 BHK (베이비 햄스터 신장: Baby Hamster Kidney)와 같은 다른 세포주도 사용가능하다.
대상 단백질을 발현시키기 위해 세포 및/또는 세포주들을 유전자 조작하는 방법 및 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있다. 유전자 조작 기술의 예로는 발현 벡터, 표적화된 상동성 재조합 및 유전자 활성화 방법 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 필요에 따라, 단백질들을 예컨대 본래 그 폴리펩타이드의 생산에 지향되지 않은 프로모터와 같은 이질적인 조절 구성요서의 조저러 하에서 발현시킨다. 예를 들어, 그 프로모터는 포유동물의 폴리펩타이드의 발현에 지향된 강력한 바이러스 프로모터 (예컨대, CMV, SV40)일 수 있다. 숙주 세포는 일반적으로 단백질을 생산할수도 생산하지 않을 수도 있다. 예컨대, 숙주 세포는 단백질을 생산하도록 유전자 조작된 CHO 세포일 수 있으며, 이는 그 CHO 세포 내로 그 단백질을 코딩하는 핵산이 도입되었음을 의미한다.
당업자들은 특정 세포주를 어떤 온도 및/또는 농도에서 배양해야 하는지 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, 대부분의 포유동물 세포들, 예컨대 CHO 세포들은 약 35℃ 내지 약 39℃, 좋기로는 37℃에서 잘 자라는 반면, 곤충 세포들은 대체로 27℃에서 배양된다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 방법을 이용하여 생산된 단백질은 항체 또는 항원-결합 단편이다. 본 발명에서, "항체"라는 용어는 적어도 1개 또는 대체로 2개의 VH 도메인 또는 그의 일부 및/또는 적어도 1개 또는 대체로 2개의 VL 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. 특정 구체예에서, 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄와 2개의 면역글로불린 경쇄로 된 테트라머로서, 상기 면역글로불린 중쇄와 경쇄는 예컨대 이황화(disulfide) 결합에 의해 상호 연결되어 있다. 항체 또는 그의 일부는 비제한적인 예로서 설치류, 영장류 (예컨대 인간 및 비인간 영장류), 상어 등과 같은 다양한 기원으로부터 유래할 수 있으며, 이들은 재조합적으로 예컨대 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해, 예컨대 키메라, 인간화 및/또는 시험관내-생산 등의 방법으로 재조합 생산될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포 배양은 쉐이크 플라스크 (30 ml 작업 용량) 및/또는 바이오리액터(1L/50 L)에서 수행되며 유가식(fed batch) 방식이 사용된다. 이 유가식 배양에서동물 숙주 세포와 오스몰 농도가 300-310 mOsm/Kg인 배양 배지를 초기에 공급하고 영양원 (아미노산, 글루코스 및 비타민)을 주기적으로 주입한다. 발효 생산은 37±1℃에서 초기 세포 수 0.5-0.6x106 세포/ml로 시작하며 처음 3-4일간은 전적으로 세포 성장에만 집중한다. 다음 단계에서는 온도를 31±1℃로 저하시키고 아연 이온을 간헐적으로 2회 첨가하되 아연 이온의 총 첨가량이 최대 0.05-1.5mM이 되도록 투입한다 (성장 단계-3일/4일 중에 한번 투입하고 생산 단계-6일/7일/8일에 나머지 한번을 투입한다). 본 발명의 구체예에 따른 항체들은 변형된 항체, 그의 유도체 또는 단편들의 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 99%, 가장 좋기로는 100%는 특히 중쇄 (중쇄는 대개 라이신을 포함할 수 있다)의 합량을 기준으로 C-말단 라이신 잔기를 결여하는 것이 바람직하다. 항체들은 C-말단 라이신을 잠재적으로 포함하는 사슬들을 더 가질 수 있기 때문에, 라이신 결여(lack of lysine)의 정량적 백분율은 C-말단 라이신을 잠재적으로 갖는 모든 사슬에 대한 것이다. 모노클로날 항체들은 C-말단 라이신의 존재 하에 이질적인 것으로 나타났다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 세포 배양은 쉐이크 플라스크 (30 ml 작업 용량) 및/또는 바이오리액터(1L/50 L)에서 수행되며 유가식(fed batch) 방식이 사용된다. 이 유가식 배양에서동물 숙주 세포와 오스몰 농도가 240-260 mOsm/Kg인 배양 배지를 초기에 공급하고 영양원 (아미노산, 글루코스 및 비타민)을 주기적으로 주입한다. MilliQ/WFI로 배지를 희석함으로써 배지의 오스몰 농도를 감소시킨다. 발효 생산은 37±1℃에서 초기 세포 수 0.5-0.6x106 세포/ml로 시작하며 처음 3-4일간은 전적으로 세포 성장에만 집중한다. 다음 단계에서는 온도를 31±1℃로 저하시키고 아연 이온을 0.1 mM의 농도로 간헐적으로 2회 첨가한다 (성장 단계-3일/4일 중에 한번 투입하고 생산 단계-5일/6일/7일/8일에 나머지 한번을 투입한다). 본 발명의 구체예에 따른 항체들은 변형된 항체, 그의 유도체 또는 단편들의 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 99%, 가장 좋기로는 100%는 특히 중쇄 (중쇄는 대개 라이신을 포함할 수 있다)의 합량을 기준으로 C-말단 라이신 잔기를 결여하는 것이 바람직하다. 항체들은 C-말단 라이신을 잠재적으로 포함하는 사슬들을 더 가질 수 있기 때문에, 라이신 결여(lack of lysine)의 정량적 백분율은 C-말단 라이신을 잠재적으로 갖는 모든 사슬에 대한 것이다. 모노클로날 항체들은 C-말단 라이신의 존재 하에 이질적인 것으로 나타났다.
본 발명의 전술한 특정 구체예들은 본 발명을 더욱 상세히 설명할 목적으로 제시된 것들이다. 이들 구체예들로 본 발명의 범위가 한정되는 것으로 이해되어서는 아니된다. 전술한 교시 내용에 비추어 다양한 변형과 변화가 가능하다. 뿐만 아니라, 본 발명의 특정 상황, 재료, 물질의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들, 목적, 정신 및 범위에 따라서 다양한 변화가 가해질 수 있다. 이러한 모든 변형 역시도 본 발명의 청구범위에 포함된다.
본 발명의 기술을 다음 실시예를 참조로 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것으로 이해되어서는 아니된다.
본 발명의 보다 명쾌한 이해와 용이한 실시를 위해, 첨부된 도면을 참고로 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 후술되는 설명과 도면은 본 명세서의 일부를 구성하며, 특정 구체예들 및 다양한 원리와 장점들을 보다 구체적으로 설명해 줄 것이다:
도 1은 264h 즉 제11일에 아연 이온의 존재 및 부재 하에서 염기 변이체 %의 차이를 나타낸 도면이다. (항체 1)
도 2a는 168h 즉 제7일에 아연 이온의 존재 및 부재 하에서 염기 변이체 %의 차이를 나타낸 도면이다. (항체 1)
도 2b는 168h 즉 제7일에 마그네슘의 존재 및 부재 하에서 염기 변이체 %의 차이를 나타낸 도면이다. (항체 1)
도 3은 168h 즉 제7일에 아연 이온이 있는 낮은 오스몰 농도 (240-260mOsm/Kg) 배지와 중간 오스몰 농도 310-320mOsm/Kg의 생산 배지에서의 염기 변이체 %의 차이를 나타낸 도면이다. (항체 1)
도 4는 168h 즉 제7일에 아연 이온의 존재 및 부재 하에서 염기 변이체 %의 차이를 나타낸 도면이다. (항체 2)
도 5 아연 이온이 있는 낮은 오스몰 농도 (240-260mOsm/Kg) 배지와 중간 오스몰 농도 (310-320mOsm/Kg)의 생산 배지에서의 염기 변이체 %의 차이를 나타낸 도면이다. (항체 3)
도 6은 배지의 초기 오스몰 농도를 달리한 경우 총 염기 변이체의 % 차이를 나타낸 도면이다. (항체 1)
도 7은 168h 즉 제7일에 아연 이온 (1 mM)의 존재 및 부재 하에서 염기 변이체의 % 차이를 나타낸 도면이다. (항체 1)
도 8은 168h 즉 제7일에 아연 이온 (0.5 mM)의 존재 및 부재 하에서 염기 변이체의 % 차이를 나타낸 도면이다. (항체 1)
도 9는 168h 즉 제7일에 아연 이온의 존재 및 부재 하에서 염기 변이체의 % 차이를 나타낸 도면이다. (항체 3)
도 10은 168h 즉 제7일에 아연 이온의 존재 및 부재 하에서 염기 변이체의 % 차이를 나타낸 도면이다. (항체 4)
도 11은 168h 즉 제7일에 아연 이온의 존재 및 부재 하에서 염기 변이체의 % 차이를 나타낸 도면이다. (항체 1)
도 12 192h 즉 제8일에 아연 이온의 존재 및 부재 하에서 염기 변이체의 % 차이를 나타낸 도면이다. (항체 3)
참고: 대조군에는 아연 이온이 주입되지 않았다.
실시예 :
본 발명은 이질성이 감소된 항체의 생산 방법에 관한 것이다. 항체-1은 혈관내피성장인자 A (VEFG-1)를 억제하는 인간화된 모노클로날 항체이다. 항체-2는 HER2/neu 수용체를 간섭하는 모노클로날 항체이다 (항 2 항체). 항체-3은 TNF를 억제하는 인간화된 모노클로날 항체이고 항체-4는 항CD6이다.
실시예 1 :
항체 1의 염기 변이체를 감소시키거나 메인 피크/0 라이신을 증가시키기 위한 아연 이온의 사용
오스몰 농도가 300-310 mOsm/kg인 배양 배지를 준비하고 세포를 0.5-0.6x10^6/ml의 농도로 접종하여 성장시켰다. 일단 세포수가 제4일에 12-13x106/ml에 도달하면, 온도를 37℃에서 31℃로 변경시켰다. 아연을 0.1 mM의 농도로 1차 주입하였다. 제 8일에 0.1 mM의 농도로 아연을 다시 주입하였으며 이 때 세포 수는 13-15x106/ml이었다. 제11일까지 계속 성장시켰다. 관찰된 이질성을 아래 표에 나타내었다.
Figure 112013109700881-pct00001
실시예 2 :
항체 1의 염기 변이체를 감소시키거나 메인 피크/0 라이신을 증가시키기 위한 아연 이온의 사용
유가식으로 세포를 배양하였다. 이 유가식 배양에서 포유동물 숙주 세포와 배양 배지를 초기에 공급하고 영양원을 주기적으로 공급하였다. 배양 배지에 세포를 0.5-0.6x106/ml의 농도로 접종하고 성장시켰다. 일단 세포 수가 12-13x106/ml (제3일)에 도달하면, 온도를 37℃로부터 31℃로 변경시킨 다음 아연 이온을 0.1 mM의 농도로 1차 주입하였다. 세포 수가 13-15x106/ml (제6일)에 도달하면 아연을 다시 0.1 mM의 농도로 2차 주입하고 제7일이 될 때까지 플라스크 배양하였다. 또 다른 배양 배지에서는, 마그네슘 이온을 주입하였는데 염기 변이체에 아무런 차이가 없었고 이 실시예를 음성 대조군으로서 사용하였다. 관찰된 이질성을 아래 표에 나타내었다:
Figure 112013109700881-pct00002
실시예 3 :
항체 1의 염기 변이체의 감소 또는 메인 피크/0 라이신의 증가를 위한 아연 이온을 이용한 낮은 오스몰 농도 생산 배지의 사용
유가식으로 세포를 배양하였다. 이 배양에서, 포유동물 숙주 세포와 낮은 오스몰 농도의 배양 배지를 초기에 공급하고 영양원을 주기적으로 주입하였다. 배양 배지에 세포를 0.5-0.6x106/ml의 농도로 접종하고 성장시켰다. 일단 세포 수가 12-13x106/ml (제3일)에 도달하면, 온도를 37℃로부터 31℃로 변경시킨 다음 아연 이온을 0.1 mM의 농도로 1차 주입하였다. 세포 수가 13-15x106/ml (제6일)에 도달하면 아연을 다시 0.1 mM의 농도로 2차 주입하고 제7일이 될 때까지 계속 발효시켰다. 관찰된 오스몰 농도를 다음 표에 나타내었다.
Figure 112013109700881-pct00003
실시예 4 :
항체 2의 염기 변이체를 감소시키거나 메인 피크/0 라이신을 증가시키기 위한 아연 이온의 사용
유가식으로 세포를 배양하였다. 이 배양에서, 포유동물 숙주 세포와 배양 배지 (낮은 오스몰 농도)를 초기에 공급하고 영양원을 주기적으로 주입하였다. 배양 배지에 세포를 0.5-0.6x106/ml의 농도로 접종하고 성장시켰다. 일단 세포 수가 12-13x106/ml (제3일)에 도달하면, 온도를 37℃로부터 31℃로 변경시킨 다음 아연 이온을 0.1 mM의 농도로 1차 주입하였다. 세포 수가 13-15x106/ml (제6일)에 도달하면 아연을 다시 0.1 mM의 농도로 2차 주입하고 제7일이 될 때까지 계속 발효시켰다. 관찰된 이질성을 다음 표에 나타내었다.
Figure 112013109700881-pct00004
실시예 5 :
항체 3의 염기 변이체를 감소시키거나 메인 피크/0 라이신을 증가시키기 위한 오스몰 농도가 낮은 생산 배지의 사용
대규모 바이오리액터에서 세포 배양을 수행하되 유가식으로 배양하였다. 유가식 배양에서 포유동물 숙주 세포와 오스몰 농도가 낮은 세포 배지를 초기에 공급하고 영양원을 주기적으로 주입하였다. 이 시험에서 바이오리액터에 세포를 0.5-0.6x106/ml의 농도로 접종하고 성장시켰다. 일단 세포 수가 12-13x106/ml (제3일)에 도달하면, 온도를 37℃로부터 31℃로 변경시킨 다음 아연 이온을 0.1 mM의 농도로 1차 주입하였다. 세포 수가 13-15x106/ml (제5일)에 도달하면 아연을 다시 0.1 mM의 농도로 2차 주입하고 제12일이 될 때까지 계속 발효시켰다.
관찰된 오스몰 농도를 다음 표에 나타내었다.
Figure 112013109700881-pct00005
실시예 6 :
항체 1의 염기 변이체를 감소시키거나 메인 피크/0 라이신을 증가시키기 위한 오스몰 농도가 낮은 생산 배지의 사용
유가식으로 세포를 배양하였다. 이 유가식 배양에서 포유동물 숙주 세포와 오스몰 농도가 낮은 배양 배지를 초기에 공급하고 영양원을 주기적으로 공급하였다.초기 오스몰 농도 수준을 달리하는 3종의 배지를 사용하였다. 배양 배지에 세포를 0.5-0.6x106/ml의 농도로 접종하고 성장시켰다. 제7일이 될 때까지 유가식 배양하였다. 초기 배지의 오스몰 농도가 감소함에 따라 전체적인 염기 변이체의 %가 감소하는 것으로 나타났다. 세포주의 성장 프로파일에는 아무런 변화가 없는 것으로 관찰되었다. 오스몰 농도의 감소에 따라 염기 변이체도 감소된 결과를 아래 표에 나타내었다.
Figure 112013109700881-pct00006
실시예 7 :
항체 1의 염기 변이체를 감소시키거나 메인 피크/0 라이신을 증가시키기 위한 아연 이온의 사용
유가식으로 세포를 배양하였다. 이 유가식 배양에서 포유동물 숙주와 배양 배지를 초기에 공급하고 (1 mM 아연 이온 함유됨) 영양원을 주기적으로 공급하였다. 배양 배지에 세포를 0.5-0.6x106/ml의 농도로 접종하고 성장시켰다. 일단 세포 수가 12-13x106/ml에 도달하면, 제7일까지 플라스크 배양을 계속하였다. 관찰된 이질성의 감소를 아래 표에 나타내었다.
Figure 112013109700881-pct00007
실시예 8 :
항체 1의 염기 변이체를 감소시키거나 메인 피크/0 라이신을 증가시키기 위한 아연 이온의 사용
유가식으로 세포를 배양하였다. 0.5mM의 아연이 함유된 배양 배지에 0.5-0.6x106/ml의 세포를 접종하고 영양원을 주기적으로 공급하였다. 일단 세포 수가 12-13x106/ml에 도달하면, 온도를 31℃로 변경시키고 제7일까지 계속 발효시켰다. 관찰된 이질성의 감소를 아래 표에 나타내었다.
Figure 112013109700881-pct00008
실시예 9 :
항체 3의 염기 변이체를 감소시키거나 메인 피크/0 라이신을 증가시키기 위한 아연 이온의 사용
유가식으로 세포를 배양하였다. 세포 배지에 0.5-0.6x106/ml의 세포를 접종하고 성장시켰다. 세포 수가 12-13x106/ml에 달하면 온도를 37℃에서 31℃로 변경시키고 0.1 mM 농도의 아연을 1차 주입한 다음 제6일에 아연을 2차로 주입하고 제7일까지 계속 배양하였다. 관찰된 이질성을 아래 표에 나타내었다.
Figure 112013109700881-pct00009
실시예 10 :
항체 4의 염기 변이체를 감소시키거나 메인 피크/0 라이신을 증가시키기 위한 아연 이온의 사용
유가식으로 세포를 배양하였다. 이 유가식 배양에서 포유동물 숙주 세포와 배양 배지를 초기에 공급하고 영양원을 주기적으로 공급하였다. 배양 배지에 세포를 0.5-0.6x106/ml의 농도로 접종하고 성장시켰다. 일단 세포 수가 12-13x106/ml (제3일)에 도달하면, 온도를 37℃로부터 31℃로 변경시킨 다음 아연 이온을 0.1 mM의 농도로 1차 주입하였다. 세포 수가 13-15x106/ml (제6일)에 도달하면 아연을 다시 0.1 mM의 농도로 2차 주입하고 제7일이 될 때까지 계속 발효시켰다 관찰된 이질성의 감소를 아래 표에 나타내었다
Figure 112013109700881-pct00010
실시예 11 :
항체 1의 염기 변이체를 감소시키거나 메인 피크/0 라이신을 증가시키기 위한 아연 이온의 사용
유가식으로 세포를 배양하였다. Hyclone CDM4Mab 배양 배지에 영양원을 주기적으로 공급하였다. 배양 배지에 세포를 0.5-0.6x106/ml의 농도로 접종하고 성장시켰다. 일단 세포 수가 12-13x106/ml (제 일)에 도달하면, 온도를 37℃로부터 31℃로 변경시킨 다음 아연 이온을 0.15 mM의 농도로 1차 주입하고 제6일에 2차로 아연을 주입한 다음 제7일까지 계속 발효시켰다. 관찰된 이질성의 감소를 아래 표에 나타내었다.
Figure 112013109700881-pct00011
실시예 12 :
항체 3의 염기 변이체를 감소시키거나 메인 피크/0 라이신을 증가시키기 위한 아연 이온의 사용
유가식으로 세포를 배양하였다. Invitrogen CDOptiCHO 배양 배지에 영양원을 주기적으로 공급하였다. 배양 배지에 세포를 0.5-0.6x106/ml의 농도로 접종하고 성장시켰다. 일단 세포 수가 12-13x106/ml (제3일)에 도달하면, 온도를 37℃로부터 31℃로 변경시킨 다음 아연 이온을 0.1 mM의 농도로 1차 주입하고 제6일에 2차로 아연을 주입한 다음 제8일까지 계속 발효시켰다. 관찰된 이질성의 감소를 아래 표에 나타내었다.
Figure 112013109700881-pct00012

Claims (23)

  1. 항체의 C-말단 상의 라이신 잔기의 비율을 감소시킴으로써, 세포 배양에 의해 수득된 항체들에 있어서 이질성을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 배양 배지의 오스몰 농도를 240 mOsm/Kg 내지 260 mOsm/Kg의 범위로 감소시켜 이질성이 감소된 상기 항체를 얻는 것인, 세포 배양에 의해 수득된 항체들에 있어서 이질성을 감소시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 이질성은 항체의 전하 변이체의 비율에 기인하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 이질성은 상기 방법을 75% 내지 100% 범위의 항체 비율에 대해 수행함으로써 감소되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 항체는 모노클로날 항체, 변형된 항체, 항체의 유도체 및 항체 단편 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 자연발생 항체 또는 재조합 항체인 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 항체의 염기 변이체 비율의 이질성의 감소는 3% 내지 30%이고 항체의 메인 피크/0 라이신의 증가는 5% 내지 25%인 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 2가 전이 금속 이온으로서 Zn+2을 0.05 mM 내지 1.5 mM의 농도로 항체 생성 배양 배지에 첨가하는 것을 더욱 포함하는 것인 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 배양은 유가식 배양이고; 포유동물 세포를 배양하는 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 2가 전이 금속 이온으로서 Zn+2의 첨가는 세포 성장 단계 중에 먼저 수행하고 두번째로 세포 배양의 폴리펩타이드 생산 단계 중에 수행하며; 또는 금속 이온의 첨가는 상기 세포의 배양 전에 초기 단계에서 수행하는 것인 방법.
  10. 항체의 C-말단 상의 라이신 잔기의 비율을 감소시킴으로써 이질성이 감소된 항체의 생산방법으로서:
    a) 항체 생산을 위한 배양 배지에서 세포를 배양하고 상기 배양 배지의 오스몰 농도를 240 mOsm/Kg 내지 260 mOsm/Kg의 범위로 감소시키는 것; 및
    b) 상기 배양 배지로부터 이질성이 감소된 항체를 회수하는 것
    을 포함하여 이루어지는 것인, 이질성이 감소된 항체의 생산방법.
  11. 제10항에 있어서, (a) 단계에서 세포들을 0.5x106 세포/ml 내지 0.6x106 세포/ml의 농도 범위로 배양하는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서 (a) 단계에서 36℃ 내지 38℃의 온도 범위에서 배양을 수행하는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 항체는 모노클로날 항체, 변형된 항체, 항체의 유도체 및 항체 단편 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 자연발생 항체 또는 재조합 항체인 것인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 이질성은 항체의 전하 변이체의 비율에 기인하는 것인 방법.
  15. 제10항에 있어서, 이질성은 상기 방법을 75% 내지 100% 범위의 항체 비율에 대해 수행함으로써 감소되는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 항체의 염기 변이체 비율의 이질성의 감소는 3% 내지 30%이고 항체의 메인 피크/0 라이신의 증가는 5% 내지 25%인 것인 방법.
  17. 제10항에 있어서, 배양은 유가식 배양이고; 포유동물 세포를 배양하는 것인 방법.
  18. 제10항에 있어서, 2가 전이 금속 이온으로서 Zn+2을 0.05 mM 내지 1.5 mM의 농도로 항체 생성 배양 배지에 첨가하는 것을 더욱 포함하는 것인 방법.
  19. 삭제
  20. 제18항에 있어서, 2가 전이 금속 이온으로서 Zn+2의 첨가는 30℃ 내지 32℃의 온도 범위에서 성장 단계 중에 먼저 수행하고 두번째로 세포 배양의 폴리펩타이드 생산 단계 중에 수행하며; 또는 2가 전이금속 이온의 첨가는 상기 세포의 배양 전에 초기 단계에서 수행하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 세포 성장 단계에서 세포 농도는 12x106 세포/ml 내지 13x106 세포/ml의 범위이고; 폴리펩타이드 생산 단계에서 세포 농도는 13x106 세포/ml 내지 15x106 세포/ml 범위인 것인 방법.
  22. 삭제
  23. 삭제
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