BR112013018751B1

BR112013018751B1 - método para modular o nível de componentes de homogeneidade de uma proteína, método para produzir uma proteína desejada, medicamento e método para preparação do mesmo

Info

Publication number: BR112013018751B1
Application number: BR112013018751-4A
Authority: BR
Inventors: Shohei Kishishita; Tomoko Okui; Yasuharu Shinoda; Shiniya Takuma
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.)
Priority date: 2010-12-28
Filing date: 2011-12-28
Publication date: 2021-01-05
Also published as: JP6001456B2; JPWO2012091124A1; AU2011350456B2; CA2822947A1; SG191371A1; IL227185B; NZ611862A; MX2013007650A; MY163081A; RU2615448C2; EP2660328A4; HK1248242A1; EP2660328A1; KR101903208B1; CN107629124A; KR20130131415A; WO2012091124A1; RU2013135255A; AU2011350456A1; BR112013018751A2

Abstract

MÉTODO PARA MODULAR O NÍVEL DE COMPONENTES DE HOMOGENEIDADE DE UMA PROTEÍNA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA DESEJADA, MEDICAMENTO E MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DO MESMO. A presente invenção refere-se a um método para modular o nível de componentes de homogeneidade de uma proteína desejada que é preparada cultivando-se uma célula animal que produz a proteína para fazer com que a proteína seja produzida, em que a cultura é realizada em uma temperatura de cultura normal durante certo período de tempo e em seguida a cultura é continuada em uma temperatura de cultura reduzida de 25 a 35°C. A presente invenção também se refere a um método para produzir uma proteína desejada, bem como a um medicamento e a um método para preparação do mesmo.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a um método de cultura para modular a heterogeneidade de uma proteína desejada ao mesmo tem- po em que a proteína é preparada cultivando-se células animais que produzem a proteína, e um método de preparar a proteína desejada usando o mesmo método. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um método de preparar uma proteína desejada cultivando- se células que produzem a proteína, em que a cultura é realizada em uma temperatura de cultura normal durante certo período de tempo e em seguida a cultura é continuada em uma temperatura de cultura re- duzida de 25 a 35 °C.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[002] Nos casos onde as células animais são cultivadas para ten- tar obter uma proteína nativa produzida pelas células, ou onde uma proteína desejada, ou similar, é preparada cultivando-se células ani- mais em que um gene que codifica a proteína foi introduzido, o pro- blema era como modelar o nível na referida proteína nativa ou proteína desejada de componentes de homogeneidade tais como heterogenei- dade de carga (picos acídicos, picos básicos) e forma associada, que são tipicamente formadas devido a diferenças na forma demasiada, forma deletada- ou substituída por aminoácido, e estrutura de cadeia de açúcar.

[003] Nos últimos anos, houve preocupações em relação a pro- blemas tal como imunogenicidade, e a fim de garantir a segurança e evitar a complicação de etapas de isolamento e purificação, houve a necessidade do desenvolvimento de um método de cultura de célula que modula o nível de tais componentes de homogeneidade tanto quanto possível.

[004] Convencionalmente, vários métodos de cultivo de células animais foram desenvolvidos para resolver os problemas acima obser- vados. Para ser mais específico, foram desenvolvidos métodos para reduzir a produção de proteínas em uma forma mal enovelada ou a- gregada cultivando-se as células em uma temperatura baixa de 27 a 30 °C em um pH baixo (Documento de Patente 1: WO 2008/131374), ou adicionando-se cobre e/ou glutamato (Documento de Patente 2: WO 2008/109410). Entretanto, não houve nenhuma descrição de um método para controlar a homogeneidade de carga.

[005] Como um método de cultura pelo qual uma temperatura de cultura é reduzida a uma temperatura baixa durante a cultura de célu- las CHO, foi descrito um método pelo qual a quantidade de uma prote- ína de interesse produzida é realçada usando células CHO que têm um caráter particular e que apresentam um aumento na produtividade de uma proteína de interesse por célula em baixa temperatura (Docu- mento de Patente 3: JP H09-75077). Entretanto, não houve nenhuma sugestão sobre a modulação da heterogeneidade de uma proteína de interesse (preferivelmente, um anticorpo), em particular, a heteroge- neidade de carga de um anticorpo, desviando-se a temperatura de cul- tura para uma temperatura baixa.

LISTA DE CITAÇÃO DOCUMENTOS DE PATENTE

[006] Documento de Patente 1: Pedido de Patente Internacional n° WO 2008/131374

[007] Documento de Patente 2: Pedido de Patente Internacional n° WO 2008/109410

[008] Documento de Patente 3: Publicação de Pedido de Patente Não Examinado Japonesa n° 09-075077

SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[009] Um objetivo da presente invenção é modular a heteroge- neidade de uma proteína desejada que é gerada ao mesmo tempo em que a proteína é preparada cultivando-se células animais que produ- zem a proteína.

SOLUÇÃO PARA PROBLEMA

[0010] Os presentes inventores fizeram esforços intensivos para resolver os problemas acima mencionados e, como um resultado, des- cobriram que a heterogeneidade de uma proteína desejada pode ser modulada controlando-se as condições para cultura de célula. Especi- ficamente, os inventores descobriram que a heterogeneidade de uma proteína desejada pode ser modulada realizando-se cultura em uma temperatura de cultura normal durante certo período de tempo e em seguida continuando-se uma cultura em uma temperatura de cultura reduzida, e contemplaram a presente invenção com base na descober- ta observada acima.

[0011] Mais especificamente, a presente invenção fornece os se- guintes:

[0012] Um método de modulação do nível de componentes de homogeneidade de uma proteína desejada ao mesmo tempo em que a proteína é preparada cultivando-se uma célula animal que produz a proteína para fazer com que a proteína seja produzida, em que a cultu- ra é realizada em uma temperatura de cultura normal (36 a 38°C) du- rante certo período de tempo e em seguida a cultura é continuada em uma temperatura de cultura reduzida de 25 a 35°C;

[0013] O método apresentado em (1), em que a célula animal é uma célula tendo tal caráter que a produtividade da proteína desejada por célula não aumenta ou diminui em uma temperatura menor do que a temperatura de cultura normal (36 a 38 °C);

[0014] O método apresentado acima, em que a modulação do ní- vel dos componentes de homogeneidade da proteína desejada inclui redução de nível de picos acídicos;

[0015] O método apresentado acima, em que a cultura é realizada em uma temperatura de cultura normal até 3 a 7 dias após a data de início da cultura e em seguida a temperatura de cultura é diminuída;

[0016] O método apresentado acima, em que a cultura é realizada em uma temperatura de 36 a 38 °C durante certo período de tempo e em seguida a cultura é continuada em uma temperatura de cultura re- duzida de 32 a 35 °C;

[0017] O método apresentado acima, em que a célula é cultivada por cultura em batelada, cultura em batelada repetida, cultura de ali- mentação em batelada, cultura de alimentação em batelada repetida, cultura contínua, ou cultura de perfusão;

[0018] O método apresentado acima, em que a célula animal é cultivada por cultura de alimentação em batelada;

[0019] O método apresentado acima, em que a célula animal é uma célula em que um gene que codifica a proteína desejada foi intro- duzido;

[0020] O método apresentado acima, em que a proteína desejada é um anticorpo;

[0021] O método apresentado acima, em que a célula animal é uma célula de mamífero;

[0022] O método apresentado em (10), em que a célula de mamí- fero é uma célula CHO;

[0023] O método apresentado em (11), em que a célula de CHO é selecionada das linhagens de célula DG44, DXB-11, K-1 e CHO-S;

[0024] Um método para produzir uma proteína desejada, em que a proteína é preparada cultivando-se uma célula que produz a proteína usando o método apresentado acima;

[0025] O método apresentado em (13), que compreende a etapa de colher a proteína de uma solução de cultura após a célula que pro- duz a proteína desejada ser cultivada;

[0026] Um método de preparação de um medicamento compreen- dendo uma proteína preparada pelo método apresentado acima como um ingrediente ativo; e

[0027] O método apresentado acima, em que a proteína desejada é um anticorpo anti-glipican 3 ou um anticorpo anti-IL-31RA.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[0028] A presente invenção pode ser muito vantajosamente usada na produção de peptídeos ou proteínas biologicamente ativas. Esta invenção se caracteriza pelo fato de que ela pode modular a heteroge- neidade de uma proteína desejada que ocorra ao mesmo tempo em que a proteína é preparada cultivando-se células animais que produ- zem a proteína. Desse modo, a invenção tem um grande potencial de produzir proteínas mais homogêneas, simplifica as etapas de isola- mento e purificação, e é vantajosa para produção industrial. Especifi- camente, a invenção pode tipicamente fazer uma contribuição signifi- cante para fornecimento de massa de anticorpos farmacêuticos e simi- lares.

BREVE DESCRIÇÕES DAS FIGURAS

[0029] A FIG. 1 mostra os resultados do Exemplo (Exemplo 1) re- ferentes à redução de picos acídicos de um anticorpo por desvio de temperatura.

[0030] A FIG. 2 mostra os resultados do Exemplo (Exemplo 2) re- ferentes à redução de picos acídicos de um anticorpo por desvio de temperatura.

[0031] A FIG. 3 mostra os resultados do Exemplo (Exemplo 3) re- ferentes à redução de picos acídicos de um anticorpo por desvio de temperatura.

DESCRIÇÕES DAS MODALIDADES

[0032] Os modos para realizar a presente invenção serão agora descritos aqui com maiores detalhes.

[0033] O método de acordo com a presente invenção é caracteri- zado modulando-se o nível de componentes de homogeneidade de uma proteína desejada ao mesmo tempo em que a proteína é prepa- rada cultivando-se uma célula animal que produz a proteína. Especifi- camente, o método inventivo é caracterizado por um método de prepa- rar a proteína cultivando-se uma célula animal que produz a proteína, em que a cultura é realizada em uma temperatura de cultura normal durante certo período de tempo e em seguida a cultura é continuada em uma temperatura de cultura reduzida de 25 a 35°C .

[0034] Em um aspecto da presente invenção, de acordo com o método de cultura desta invenção, a célula animal é uma célula tendo tal caráter que a produtividade da proteína desejada por célula não aumenta ou diminui em uma temperatura menor do que uma tempera- tura de cultura normal (36 a 38°C).

[0035] Com o propósito da presente especificação, a realização de cultura em uma temperatura de cultura normal durante certo período de tempo e em seguida a continuação da cultura em uma temperatura de cultura reduzida são referidas como "desvio de temperatura de cul- tura" ou "desvio de temperatura". A temperatura de cultura normal está comumente na faixa de 36 a 38 °C, que é adequada pa ra o desenvol- vimento de células derivadas de homeotermo, e é mais comumente 37 °C. A temperatura de cultura reduzida é referida co mo "temperatura desviada". A temperatura desviada é menor do que a temperatura de cultura normal e é menos do que 37 °C, por exemplo, na faixa de 25 a 35 °C, preferivelmente na faixa de 30 a 35 °C, e ma is preferivelmente na faixa de 32 a 35 °C.

[0036] Os presentes inventores investigaram os efeitos de um desvio de temperatura em linhagens de célula CHO que produzem um anticorpo humanizado recombinante, em termos de densidade celular, disponibilidade de célula, mudança em componentes de meio, concen- tração de uma proteína de anticorpo produzida, e mudança em com- ponentes de homogeneidade do anticorpo.

[0037] Como resultado, descobriu-se que em comparação com o controle que foi cultivado com a temperatura mantida a 37 °C durante todo o período de cultura, o consumo de glicose e o acúmulo de lacta- to foram reduzidos ao mesmo tempo em que a contagem de células viáveis e disponibilidade foram mantidas sob as condições de desvio de temperatura. Além disso, em relação às propriedades do anticorpo produzido, descobriu-se que o desvio de temperatura obteve um resul- tado desejado em termos da qualidade do produto de interesse, isto é, reduziu o nível de picos acídicos. Este fenômeno indica que o desvio de temperatura pode modular o nível de componentes de heterogenei- dade. Entretanto, a quantidade da proteína de anticorpo produzida li- geiramente aumentou em comparação com o caso da cultura sob as condições de temperatura normais.

[0038] Em outro aspecto da presente invenção, a modulação do nível de componentes de homogeneidade da proteína desejada inclui redução de heterogeneidade de carga. A "heterogeneidade de carga" refere-se a um fenômeno onde a carga elétrica de uma proteína torna- se heterogênea devido ao nível de componentes com um pl maior do que o componente principal (picos básicos) e componentes com um pl menor (picos acídicos), que é causado por diferenças em forma de- terminada, forma deletada- ou substituída por aminoácido, e estrutura de cadeia de açúcar.

[0039] Em ainda outro aspecto da presente invenção, a modulação do nível de componentes de homogeneidade da proteína desejada in- clui redução de nível de picos acídicos.

[0040] Os picos acídicos de uma proteína referem-se a componen- tes com um pl menor do que o componente principal e são tipicamente formados devido a diferenças em forma determinada e estrutura de cadeia de açúcar. Os picos acídicos são determinados por cromato- grafia de permuta de íon e calculados como uma proporção (%) ao componente principal.

[0041] O tempo de um desvio de temperatura varia com o tipo da célula animal a ser usado e as condições de cultura. Para a célula a- nimal a ser usada, o teste foi conduzido para otimização usando, como um indicador, o equilíbrio entre a produtividade de uma proteína de interesse e o nível de componentes de heterogeneidade.

[0042] Em geral, os processos de cultura de célula são classifica- dos em cultura em batelada, cultura contínua, e cultura de alimentação em batelada. A cultura em batelada é um processo de cultura pelo qual uma quantidade pequena de uma solução de cultura de semente é adicionada a um meio e as células são desenvolvidas sem adição de um meio adicional ou descarga de uma solução de cultura durante a cultura. A cultura contínua é um processo de cultura pelo qual um meio é continuamente adicionado e descarregado durante a cultura. A cultu- ra contínua também inclui cultura de perfusão. A cultura de alimenta- ção em batelada, que é um intermediário entre a cultura em batelada e a cultura contínua e também se refere como "cultura de semibatelada", é um processo de cultura pelo qual um meio é continuamente ou se- quencialmente adicionado durante a cultura, porém, diferente da cultu- ra contínua, uma solução de cultura não é continuamente descarrega- da.

[0043] No método, de acordo com a presente invenção, qualquer processo de cultura pode ser usado, porém a cultura de alimentação em batelada ou a cultura contínua é preferivelmente usada, e a cultura de alimentação em batelada é particularmente preferivelmente usada. O meio a ser adicionado durante a cultura de alimentação em batelada (aqui a seguir referindo como "meio alimentado") não precisa necessa- riamente ser igual ao meio que já foi usado para cultura (aqui a seguir referido como "meio inicial"); um meio diferente pode ser adicionado ou apenas componentes particulares podem ser adicionados. Tipicamen- te, a formulação do meio de alimentação é ajustada de tal forma que os componentes consumidos durante a cultura são reabastecidos. Por exemplo, a glicose, uma fonte de energia principal para desenvolvi- mento de células animais, pode ser reabastecida pela estratégia de alimentação.

[0044] O tempo de um desvio de temperatura é determinado pelo equilíbrio entre a quantidade de uma proteína de interesse expressa e o nível de picos acídicos. Especificamente, o tempo de desvio de tem- peratura ideal pode ser conhecido conduzindo-se o teste fornecido no Exemplo 2. É preferido iniciar um desvio de temperatura em tal tempo que a densidade celular torna-se suficientemente alta, isto é, geral- mente na ordem de 106 células/mL a 108 células/mL, embora ela não possa ser limitada dentro de uma faixa estreita porque a densidade celular obtenível varia com o tipo da célula a ser usada e as condições de cultura.

[0045] Como componentes de solução de cultura para uso no mé- todo da presente invenção, vários componentes geralmente usados nos meios para cultivar células (preferivelmente, células animais) po- dem ser usados quando apropriado, e os exemplos incluem aminoáci- dos, vitaminas, fatores de lipídeo, fontes de energia, agentes de os- morregulação, fontes de ferro, e agentes de tamponamento de pH. A- lém dos componentes observados acima, elementos de metal de tra- ço, tensoativos, cofatores de crescimento, nucleotídeos e similares podem também ser adicionados.

[0046] Outros componentes de solução de cultura podem ser es- pecificamente exemplificados por aminoácidos tais como L-alanina, L- arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâ- mico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L-treonina, L-triptofano, e L-valina, preferivelmente tal como L-alanina, L-arginina, L-asparagina , ácido L- aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâmico, glicina, L-histidina, L- isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L- treonina, L-triptofano, e L-balina; vitaminas tal como i-inositol, biotina, ácido fólico, ácido lipoico, nicotinamida, ácido nicotínico, ácido p- aminobenzoico, pantotenato de cálcio, cloridrato piridoxal, cloridrato piridoxina, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina B12, e ácido as- córbico, preferivelmente tais como biotina, ácido fólico, ácido lipoico, nicotinamida, pantotenato de cálcio, cloridrato piridoxal, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina B12, e ácido ascórbico; fatores de lipí- deo tais como cloreto de colina, tartrato de colina, ácido linoleico, áci- dos oleicos, e colesterol, preferivelmente tal como cloreto de colina; fontes de energia tais como glicose, galactose, manose, e frutose, pre- ferivelmente tal como glicose; agentes de osmorregulação tal como cloreto de sódio, cloreto de potássio, e nitrato de potássio, preferivel- mente tais como cloreto de sódio; fontes de ferro tal como EDTA de ferro, citrato de ferro, cloreto ferroso, cloreto férrico, sulfato ferroso, sulfato férrico, e nitrato férrico, preferivelmente tal como cloreto férrico, EDTA de ferro, e citrato férrico; e agentes de tamponamento de pH tais como carbonato de hidrogênio de sódio, cloreto de cálcio, fosfato de diidrogênio de sódio, HEPES, e MOPS, preferivelmente tal como carbonato de hidrogênio de sódio.

[0047] Os componentes que podem ser adicionados além dos componentes acima mencionados incluem, porém não são limitados a, elementos de metal de traço tais como sulfato de cobre, sulfato de manganês, sulfato de zinco, sulfato de magnésio, cloreto de níquel, cloreto de estanho, cloreto de magnésio, e silicato de sódio, preferi- velmente tais como sulfato de cobre, sulfato de zinco, e sulfato de magnésio; tensoativos tais como Tween 80 e Plurônico F68; cofatores de crescimento tais como insulina recombinante, IGF recombinante, EGF recombinante, FGF recombinante, PDGF recombinante, TGF-α recombinante, cloridrato de etanolamina, selenita de sódio, ácido reti- noico, e cloridrato de putrescina, preferivelmente tais como selenita de sódio, cloridrato de etanolamina, IGF recombinante, e cloridrato de pu- trescina; e nucleotídeos tais como desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina, adenosina, citidina, guanosina, e uridina. Em exem- plos preferidos da presente invenção como descrito acima, antibióticos tais como estreptomicina, potássio de penicilina G e gentamicina, e indicadores de pH tal como vermelho fenol podem ser contidos.

[0048] É adequado que a solução de cultura continha outros com- ponentes nas seguintes quantidades: 0,05 a 1500 mg/L de aminoáci- dos, 0,001 a 10 mg/L de vitaminas, 0 a 200 mg/L de fatores de lipídeo, 1 a 20 g/L de fontes de energia, 0,1 a 10000 mg/L de agentes de os- morregulação, 0,1 a 500 mg/L de fontes de ferro, 1 a 10000 mg/L de agentes de tamponamento de pH, 0,00001 a 200 mg/L de elementos de metal de traço, 0 a 5000 mg/L de tensoativos, 0,05 a 10000 μg/L de cofatores de crescimento, e 0,001 a 50 mg/L de nucleosídeos, porém estes teores podem ser determinados quando apropriado dependendo do tipo da célula a ser cultivada, do tipo da proteína desejada, e simila- res.

[0049] O pH da solução de cultura varia com o tipo da célula a ser cultivada, porém o pH adequado é geralmente na faixa de pH 6,8 a 7,6 em muitos casos na faixa de pH 7,0 a 7,4.

[0050] Na presente invenção, as células podem ser cultivadas u- sando um meio quimicamente definido tendo os componentes anterio- res dissolvidos aqui. Alternativamente, é também possível usar uma cultura de célula animal convencionalmente conhecida como um meio basal e suplementá-la com outros componentes dependendo da ne- cessidade. Os exemplos de meios basais comercialmente disponíveis que podem ser usados como um meio de cultura de célula animal in- cluem, porém não são limitados a, D-MEM (Meio de Eagle Modificado de Dulbeco), Mistura de 1:1 de D-MEM/F-12 (Mistura de Meio de Ea- gle Modificado de Dulbeco: Nutriente F-12), RPMI1640, CHO-S-SFMII (Invitrogen), CHO-SF (Sigma-Aldrich), EX-CELL 301 (JRH bioscien- ces), CD-CHO (Invitrogen), IS CHO-V (Irvine Scientific), e PF-ACF- CHO (Sigma-Aldrich). Nos casos onde as células são cultivadas por cultura de alimentação em batelada, tais meios comercialmente dispo- níveis podem ser usados como um meio inicial que deve ser usado em um estágio inicial de cultura de célula.

[0051] Um modo preferido da presente invenção é um método de modular o nível de componentes de homogeneidade de uma proteína desejada ao mesmo tempo em que cultivando células animais tais co- mo células de COS e células CHO, em que um gene que codifica a proteína desejada foi incorporado por manipulação de engenharia ge- nética, ou células fundidas tipificadas por hibridomas tal como camun- dongo-humano, camundongo-camundongo, camundongo-rato, e ou- tras células híbridas. O método desta invenção pode também ser usa- do para cultivar células animais para tentar obter uma proteína nativa produzida pelas células.

[0052] As células animais a serem usadas na presente invenção para expressar uma proteína desejada não são particularmente limita- das, porém as células de mamífero são preferidas. As células de ma- mífero a serem usadas podem ser células derivadas de qualquer ma- mífero incluindo primatas tais como humanos e chimpanzés, e roedo- res tais como camundongos, ratos e hamsters, porém as células ani- mais comumente usadas tais como células CHO, COS, 3T3, mieloma, BHK, HeLa e Vero são preferidas, e as células CHO são particular- mente preferidas com o propósito de alta expressão. Com o propósito de preparar uma proteína desejada, as células adequadas para intro- duzir um gene desejado são particularmente preferidas, tais como cé- lulas de dhfr-CHO que são células CHO deficientes no gene de DHFR (Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos da América (1980) 77, 4216- 4220) e células CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275).

[0053] Como as células CHO anteriores, as linhagens celulares DG44, DXB-11, K-1, e CHO-S são preferidas, e as linhagens celulares DG44 e DXB-11 são particularmente preferidas.

[0054] A introdução de vetores em células hospedeiras pode ser realizada por vários métodos, incluindo um método de fosfato de cál- cio, um método de DEAE-dextrano, um método que usa ribossomas catiônicas de DOTAP (Boehringer Mannheim), eletroporação, e lipo- fecção.

[0055] As células animais particularmente preferidas na presente invenção são células CHO em que um gene que codifica uma proteína desejada foi introduzido. A proteína desejada não está particularmente limitada e pode ser qualquer proteína, incluindo anticorpos tais como anticorpos naturais, fragmentos de anticorpos, minicorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos bi-específicos (por exemplo, anticorpos de receptor anti-IL-6, anticorpos anti-IL-6, anticor- pos anti-glipican-3, anticorpos anti-CD3, anticorpos anti-CD20, anticor- pos anti-GPIIb/IIIa, anticorpos anti-TNF, anticorpos anti-CD25, anticor- pos anti-EGFR, anticorpos anti-Her2/neu, anticorpos anti-RSV, anti- corpos anti-CD33, anticorpos anti-CD52, anticorpos anti-IgE, anticor- pos anti-CD11a, anticorpos anti-VEGF, anticorpos anti-VLA4, anticor- pos anti-NR10 (IL-31RA), anticorpos anti-gangliosídeo GM3, anticor- pos agonistas de receptor anti-TPO, anticorpos de substituição de fator VIII de coagulação, anticorpos de receptor anti-IL-31, anticorpos anti- HLA, anticorpos anti-AXL, anticorpos anti-CXCR4, anticorpos bi- específicos para fatores IX e X) e proteínas fisiologicamente ativas (por exemplo, fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF), fator de estimulação de colônia de macrófago de granulócito (GM- CSF), eritropoietina, interferon, interleucinas tal como IL-1 e IL-6, t-PA, urocinase, albuminas de soro, fatores de coagulação sanguínea), po- rém os anticorpos são particularmente preferidos.

[0056] Os anticorpos incluem não apenas anticorpos monoclonais derivados de animais tais como seres humanos, camundongos, ratos, hamsters, coelhos, e macacos, porém também anticorpos genetica- mente recombinantes artificialmente modificados tais como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, e anticorpos biespecíficos. A classe de imunoglobulina dos anticorpos não é particularmente limita- da e pode ser qualquer classe, incluindo IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), IgA, IgD, IgE e IgM, porém IgG e IgM são referi- das para uso farmacêutico. Os anticorpos da presente invenção inclu- em não apenas anticorpos integrais, porém também fragmentos de anticopo tais como Fv, Fab e F(ab)2, e os minicorpos consistem em Fv de cadeia única (por exemplo, scFv, sc(Fv)2) de mono-, di- ou valência superior em que as regiões variáveis de anticorpo são conectadas por ligadores tais como ligadores de peptídeo.

[0057] Em uma modalidade preferida, a presente invenção é um método de modular o nível de picos acídicos de um anticorpo no mo- mento do cultivo de células CHO em que um gene que codifica o anti- corpo foi introduzido com o propósito de preparar o anticorpo, em que a cultura é realizada em uma temperatura de cultura normal até 3 a 7 dias após a data de início da cultura e em seguida a temperatura de cultura é diminuída. Mais especificamente, após a cultura ser realizada em uma temperatura de cultura normal, por exemplo, até 3, 4, 5, 6 ou 7 dias após o início da cultura, um desvio de temperatura é feito e de- pois a cultura é continuada em uma temperatura desviada.

[0058] O período após o desvio da temperatura para uma tempe- ratura baixa e até o final da cultura geralmente varia de 1 a 50 dias, preferivelmente de 5 a 15 dias, e mais preferivelmente de 7 a 12 dias.

[0059] As condições de cultura variam com o tipo das células a serem usadas, e desse modo as condições adequadas podem ser de- terminadas quando apropriado. Por exemplo, as células CHO podem ser geralmente cultivadas em uma atmosfera de gás de CO2 em uma concentração de 0 a 40 %, preferivelmente de 2 a 10 %, durante 1 a 50 dias, preferivelmente de 1 a 14 dias.

[0060] A cultura pode ser realizada usando vários sistemas de cul- tura de célula animal tais como sistemas de cultura de tanque tipo fer- mentador, sistemas de cultura de elevação, sistemas de cultura tipo frasco de cultura, sistemas de cultura de frasco giratório, sistemas de cultura de microtransportador, sistemas de cultura de leito fluidificado, sistemas de cultura de fibra oca, sistemas de cultura de garrafa rolan- te, e sistemas de cultura de leito acondicionado.

[0061] As condições de cultura preferidas selecionadas na presen- te invenção são aquelas condições sob as quais o nível de componen- tes de homogeneidade de uma proteína de interesse produzida por células animais é modulado para obter uma pequena queda na produ- tividade. De fato, os presentes inventores reconheceram que, de acor- do com o presente pedido, a quantidade de um anticorpo produzida por célula ligeiramente diminuiu devido ao desvio de temperatura, po- rém ajustando uma temperatura desviada e o tempo torna-se possível minimizar o decréscimo na quantidade de uma proteína de interesse expressa bem como modular o nível de componentes de heterogenei- dade.

[0062] Para produzir uma proteína usando células animais, algu- mas células precisam apenas ser cultivadas ou algumas podem reque- rer manipulações especiais, e as populações, condições de cultura, ou similares podem ser determinadas quando apropriado dependendo do tipo de células animais a ser usado. Por exemplo, no caso onde as cé- lulas CHO transformadas por manipulação de engenharia genética com um vetor contendo um gene que codifica um anticorpo tal como anticorpo quimérico camundongo-humano ou anticorpo humanizado, ou qualquer outra proteína, são cultivadas sob as condições anterio- res, a proteína desejada pode ser produzida em um meio em torno de 1 a 50 dias, preferivelmente em torno de 5 a 21 dias, e mais preferi- velmente em torno de 7 a 14 dias. A proteína resultante é isolada e purificada por métodos convencionais (por exemplo, refere-se a: Ko- taikogakunyumon (Introduction to Antibody Engineering), Chijin Sho- kan Co. Ltd., (1994) p. 102-104; e cromatografia de afinidade Princi- ples & Methods, GE Healthcare, (2003) p. 56-60), de modo que a pro- teína desejada possa ser produzida.

[0063] A proteína secretada de células animais cultivadas em um meio pode ser colhida da solução de cultura por um método conven- cional. Alternativamente, a proteína pode também ser colhida de um lisado de célula hospedeira por um método convencional. Para ser mais específico, a proteína desejada pode ser colhida removendo-se células e fragmentos de célula da solução de cultura celular ou do li- sado de célula tipicamente por centrifugação e em seguida aplicando- se técnicas de purificação e isolamento de proteína comuns tal como precipitação por saturação (por exemplo, fracionamento de sulfato de amônio), precipitação de álcool (por exemplo, precipitação de etanol), PEG, eletroforese, cromatografia de permuta de íon, ultracentrifuga- ção, filtração em gel, cromatografia hidrofóbica, e cromatografia de afi- nidade. Nos casos onde a proteína desejada é um anticorpo, a croma- tografia de proteína A é usada vantajosamente, porém este não é o único exemplo. Além disso, usando-se vários métodos de fraciona- mento ou separação com base em afinidade, os anticorpos podem ser separados de acordo com sua classe de imunoglobulina ou fraciona- dos com base em sua afinidade de antígeno.

[0064] A presente invenção torna possível preparar os anticorpos recombinantes (por exemplo, anticorpos naturais, fragmentos de anti- corpo, minicorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos biespecíficos), proteínas geneticamente recombinantes (por exemplo, fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF), fator de estimulação de colônia de macrófago de granulócito (GM-CSF), eri- tropoietina, interferon, interleucinas tais como IL-1 e IL-6, t-PA, uroci- nase, albuminas de soro, fatores de coagulação sanguínea), e simila- res ao mesmo tempo em que a alta produtividade e homogeneidade são mantidas.

[0065] Nos casos onde a proteína ou peptídeo preparado pelo mé- todo da presente invenção (também referido como "a proteína inventi- va") tem atividade biológica farmaceuticamente aplicável, um medica- mento pode ser preparado misturando-se a proteína ou peptídeo com veículos ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis para formar uma formulação. A proteína inventiva e o medicamento que compreende a proteína inventiva como um ingrediente ativo também se incluem no escopo da presente invenção.

[0066] Os exemplos dos veículos e aditivos farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não são limitados a, água, solventes orgâni- cos farmaceuticamente aceitáveis, colágeno, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, polímero de carboxilvinila, carboximetil celulose de sódio, poliacrilato de sódio, alginato de sódio, dextrana solúvel em água, car- boximetil amido de sódio, pectina, metil celulose, etil celulose, goma xantan, goma arábica, caseína, ágar, polietileno glicol, diglicerol, glice- rol, propileno glicol, vaselina, parafina, álcool estearílico, ácido esteári- co, albumina de soro humana (HSA), manitol, sorbitol, lactose, e ten- soativos que são aceitáveis como aditivos farmacêuticos.

[0067] Em aplicações reais, os aditivos são selecionados indepen- dentemente ou opcionalmente na combinação daqueles listados acima dependendo da forma de dosagem de um agente terapêutico, isto é, do medicamento da presente invenção, porém estes certamente não são os únicos exemplos. Por exemplo, no caso de uso do medicamen- to da invenção como uma formulação para injeção, um produto prepa- rado dissolvendo-se o peptídeo purificado em um solvente tal como salina fisiológica, uma solução de tampão, ou uma solução de glicose e adição de um agente antiabsorção tal como Tween 80, Tween 20, gelatina, ou albumina de soro humano, podem ser usados. Alternati- vamente, a secagem por congelamento pode também ser realizada para fornecer uma forma de dosagem que permite dissolução para re- constituição antes do uso, e os excipientes exemplares que podem ser usados para secagem por congelamento incluem álcoois de açúcar tal como manitol e açúcares tais como glicose.

[0068] A dose eficaz do polipeptídeo é selecionada quando apro- priado dependendo dos vários fatores incluindo o tipo do polipeptídeo, do tipo da doença a ser tratada ou prevenida, da idade do paciente, e da gravidade da doença. Por exemplo, nos casos onde a proteína in- ventiva é um anticorpo tal como anticorpo antiglipican, a dose eficaz é selecionada da faixa de 0,001 a 1000 mg por kg de peso corporal por dose. Alternativamente, a dose pode ser selecionada da faixa de 0,01 a 100000 mg/corpo por paciente. Entretanto, a dose eficaz não está limitada às faixas de dose anteriores.

[0069] O medicamento da presente invenção pode ser administra- do tanto oralmente quanto parenteralmente, porém a administração parenteral é preferida, e os exemplos específicos incluem injeção (por exemplo, administração local ou geral por injeção intravenosa, intra- muscular, intraperitoneal, subcutânea ou outra), administração trans- nasal, administração transpulmonar, e administração percutânea.

EXEMPLOS

[0070] A presente invenção agora será especificamente descrita por meio de exemplos e exemplos de referência. Deve-se observar que estes exemplos são destinados a ilustrar a presente invenção e não a limitar o escopo da invenção. [Exemplo 1] Redução de picos acídicos de um anticorpo por desvio de temperatura (Investigação de temperatura desviada) Meio inicial

[0071] Um hidrolisado derivado de planta foi adicionado a um meio de cultura de célula animal livre de soro comercialmente disponível, a mistura foi dissolvida, e em seguida a solução foi filtrada e esterilizada.

Meio de alimentação

[0072] A glicose foi adicionada a um meio de cultura de célula a- nimal livre de soro comercialmente disponível e dissolvida aqui, e a solução foi filtrada e esterilizada.

Células

[0073] A linhagem de célula CHO (DXB-11; G. Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1980; comercialmente disponível de ATCC) que produz um anticorpo humanizado anti-glipican-3 (GPC- 3) recombinante (um anticorpo de GC33 humanizado da classe IgG1 que foi preparado realizando-se humanização pelo procedimento des- crito no Exemplo 24 no WO 2006/006693 e modificando-se cadeias de L pelo procedimento descrito no Exemplo 25 aqui).

Procedimento de Cultura

[0074] Cada um dos sistemas de cultura de célula tipo jarra de 1 L (5 unidades) foi carregado com o meio inicial, a linhagem de célula CHO foi semeada neles a fim de fornecer uma densidade de 2105 células/mL, e a cultura foi iniciada a 37°C. O desv io de temperatura foi feito a partir do dia 5 após o início da cultura. As temperaturas desvia- das nos tanques de cultura 1 a 5 foram 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, e 37 °C (nenhum desvio), respectivamente, e a cultura subsequente foi con- tinuada em cada destas temperaturas desviadas. DO e pH foram con- trolados a 40 % e 6,9, respectivamente. O meio de alimentação em batelada foi injetado em uma taxa de fluxo fixada a partir do dia 3.

Procedimento de análise

[0075] A contagem e a disponibilidade de célula viável foram me- didas por manchamento de azul tripano. 1 mL de cada das suspen- sões de célula foi colocado no analisador de célula automático Cedex para determinar a contagem de células viáveis e mortas. A determina- ção de contagem de células viáveis e mortas e o cálculo de densidade celular viável (105 células/mL) e disponibilidade (%) foram realizados automaticamente usando o software de análise de dados Cedex Loa- der (Ver. 1.51 ou posterior; Innovatis).

[0076] As concentrações de glicose e ácido lático foram determi- nadas por um analisador de bioquímica (modelo 2700; YSI) usando os sobrenadantes obtidos centrifugando-se as soluções de cultura amos- tradas (1000 rpm, 5 min).

[0077] A concentração de anticorpo foi determinada por Proteína A-HPLC usando os sobrenadantes obtidos centrifugando-se as solu- ções de cultura amostradas (1000 rpm, 5 min).

[0078] A cromatografia de permuta de íon (IEC) foi realizada u- sando colunas de permuta de cátion (ProPac WCX-10).

Resultados

[0079] Os resultados são mostrados na FIG. 1.

[0080] Quanto à densidade celular de pico, a amostra cultivada a 37 °C sem um desvio de temperatura obteve o valor mais elevado, e as outras amostras que foram submetidas a um desvio de temperatura mostraram crescimento de célula reduzida. Entretanto, houve uma tendência de que quanto menor era a temperatura desviada, melhor a disponibilidade era mantida e maior era a contagem de células viáveis mantida mesmo em um estágio posterior da cultura. Quanto à quanti- dade do anticorpo produzida, a amostra cultivada a 37 °C sem um desvio de temperatura mostrou o valor mais elevado de 3,61 g/L, ao mesmo tempo em que todas as outras amostras que foram submeti- das a um desvio de temperatura fornecem um valor não maior do que 3,2 g/L; este resultado indica que o desvio de temperatura reduziu a quantidade do anticorpo produzida. Isto pode ser porque o desvio de temperatura reduziu a atividade das células por si só. Quanto aos comportamentos de glicose e ácido lático durante a cultura, descobriu- se que quanto menor era a temperatura desviada, menor era a produ- ção de consumo de glicose e ácido lático. Isto pode também ser por- que o desvio de temperatura reduziu a atividade das células por si só. As incidências de pico acídico determinadas por IEC foram 47,5 % pa- ra nenhum desvio de temperatura, 29,1 % para o desvio de 35°C, 18,7 % para o desvio de 34°C, 19,4 % para o desvio de 33 °C, e 14,7 % pa- ra o desvio de 32°C; este resultado indica que o de svio de temperatura reduziu o nível de picos acídicos, e que quanto menor era a tempera- tura desviada, menor era a incidência de pico acídico. [Exemplo 2] Redução de picos acídicos de um anticorpo por desvio de temperatura (Investigação de tempo de desvio -- 1)

Meio inicial

[0081] Um hidrolisado derivado de planta foi adicionado a um meio de cultura de célula animal livre de soro comercialmente disponível, a mistura foi dissolvida, e em seguida a solução foi filtrada e esterilizada. Meio de alimentação

[0082] A glicose foi adicionada a um meio de cultura de célula a- nimal livre de soro comercialmente disponível e dissolvida aqui, e a solução foi filtrada e esterilizada.

Células

[0083] A linhagem de célula CHO que produz um anticorpo huma- nizado anti-glipican-3 (GPC-3) recombinante.

Procedimento de cultura

[0084] Cada um dos sistemas de cultura tipo jarra de 1 L (5 unida- des) foi carregado com o meio inicial, a linhagem de célula CHO foi semeada neles a fim de fornecer uma densidade de 2105 células/mL, e a cultura foi iniciada a 37°C. A temperatura desv iada foi estabelecida em 33°C, e as temporizações de desvio nos tanques d e cultura 1 a 5 foram estabelecidas nos dias 3, 4, 5 e 6 após o início da cultura, sem nenhum desvio, respectivamente. A cultura subsequente foi continua- da na temperatura desviada. DO e pH foram controlados a 40 % e 6,9, respectivamente. O meio de alimentação em batelada foi injetado em uma taxa de fluxo fixada a partir do dia 3.

Procedimento de análise

[0085] A contagem e a disponibilidade de células viáveis foram medidas por manchamento de azul tripano. 1 mL de cada das suspen- sões de célula foi colocado no analisador de célula automático Cedex para determinar a contagem de células viáveis e mortas. A determina- ção de contagem de células viáveis e mortas e o cálculo de densidade celular viável (105 células/mL) e disponibilidade (%) foram realizados automaticamente usando o software de análise de dados Cedex Loa- der (Ver. 1.51 ou posterior; Innovatis).

[0086] As concentrações de glicose e ácido lático foram determi- nadas por um analisador de bioquímica (modelo 2700; YSI) usando os sobrenadantes obtidos centrifugando-se as soluções de cultura amos- tradas (1000 rpm, 5 minutos).

[0087] A concentração de anticorpo foi determinada por proteína A-HPLC usando os sobrenadantes obtidos centrifugando-se as solu- ções de cultura amostradas (1000 rpm, 5 min).

[0088] A cromatografia de permuta de íon (IEC) foi realizada u- sando colunas de permuta de cátion (ProPac WCX-10).

Resultados

[0089] Os resultados são mostrados na FIG. 2.

[0090] Quanto à densidade celular de pico, a amostra cultivada sem um desvio de temperatura obteve o valor mais elevado, e as ou- tras amostras que foram submetidas a um desvio de temperatura mos- traram crescimento de célula reduzida. Houve uma tendência de que quanto mais precoce era o tempo de desvio de temperatura, menor era a densidade celular de pico, porém a disponibilidade foi mantida. Quanto à quantidade do anticorpo produzida, a amostra cultivada sem um desvio de temperatura mostrou o valor mais elevado de 3,61 g/L, aquela que foi submetida a um desvio de temperatura no dia 6 mos- trou um valor de 3,57 g/L, e aquelas que foram submetidas a um des- vio de temperatura nos dias 5, 4 e 3 mostraram valores de 2,91, 2,13 e 1,61 g/L, respectivamente; o resultado indica que quanto mais precoce era o tempo de desvio de temperatura, menor era a quantidade do an- ticorpo produzida. Quanto à concentração de glicose, quanto mais precoce era o tempo de desvio, maior era a quantidade de glicose a- cumulada. Quanto à quantidade de ácido lático produzida, apenas a amostra cultivada sem um desvio de temperatura mostrou um acúmulo de ácido lático em um estágio posterior da cultura, ao mesmo tempo em que todas aquelas que foram submetidas a um desvio de tempera- tura tinham a concentração não maior do que de 0,5 g/L. As incidên- cias de pico acídico determinadas por IEC foram 47,5 % para nenhum desvio de temperatura, 21,9 % para o desvio no dia 6, e não mais do que 20 % para os desvios nos dias 3, 4 e 5; o nível de picos acídicos como determinado por IEC foi reduzido mesmo no caso da cultura feita no dia 6. [Exemplo 3] Redução de picos acídicos de um anticorpo por desvio de temperatura (Investigação de tempo de desvio -- 2)

Meio inicial

[0091] Um meio de cultura de célula animal livre de soro comerci- almente disponível foi dissolvido, e em seguida a solução foi filtrada e esterilizada.

Meio de alimentação

[0092] A glicose foi adicionada a um meio de cultura de célula a- nimal livre de soro comercialmente disponível e dissolvida aqui, e a solução foi filtrada e esterilizada.

Células

[0093] Linhagem de célula CHO (DXB-11; G. Urlaub e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos da América 77: 4216-4220, 1980; co- mercialmente disponível de ATCC) produzindo um anticorpo humani- zado anti-NR10 (IL-31RA) (um anticorpo de NS22 humanizado prepa- rado pelo procedimento descrito no Exemplo 12 no WO 2009/072604). O anticorpo anti-NR10 humanizado foi da classe de anticorpo IgG2. Procedimento de cultura

[0094] A cultura foi realizada pelo mesmo procedimento que no Exemplo 2. Mais especificamente, a cultura foi iniciada a 37°C, a tem- peratura desviada foi estabelecida em 33°C, os temp os de desvio fo- ram estabelecidos nos dias 5 e 7 após o início da cultura, sem nenhum desvio, e cultura subsequente foi continuada na temperatura desviada. Procedimento de análise

[0095] A análise foi feita pelo mesmo procedimento que no Exem- plo 2.

Resultados

[0096] Como no Exemplo 2, o nível de picos acídicos do anticorpo foi significativamente reduzido quando o desvio de temperatura foi feito (FIG. 3).

Claims

1. Método para reduzir o nível de picos ácidos de um anti- corpo desejado enquanto o anticorpo é preparado cultivando-se uma célula animal que produz o anticorpo para fazer com que o anticorpo seja produzido, caracterizado pelo fato de que a célula animal é uma célula apresentando um caráter tal que a produtividade do anticorpo desejado por célula não aumenta ou diminui em uma temperatura mais baixa do que a temperatura normal de cultura, e que a cultura é realizada em uma temperatura de cultura normal durante um certo período de tempo e em seguida a cultura é continuada em uma temperatura de cultura reduzida de 25 a 35°C.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cultura é realizada na temperatura de cultura normal até 3 a 7 dias após a data de início da cultura e em seguida a temperatura de cultura é diminuída.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cultura é realizada em uma temperatura de 36 a 38 °C durante um certo período de tempo e em seguida a cultura é continuada em uma temperatura de cultura reduzida de 32 a 35°C.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula é cultivada por cultura em batelada, cultura em batelada repetida, cultura de alimentação em batelada, cultura de alimentação em batelada repetida, cultura contínua ou cultura de perfusão.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula animal é cultivada por cultura de alimentação em batelada.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a célula animal é uma célula em que um gene que codifica o anticorpo desejado foi introduzido.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a célula animal é uma célula de mamífero.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula de CHO.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a célula de CHO é selecionada das linhagens de célula DG44, DXB-11, K-1 e CHO-S.

10. Método para produzir um anticorpo desejado, caracteri- zado pelo fato de que o anticorpo é preparado cultivando-se uma célula que produz o anticorpo utilizando o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de colher o anticorpo de uma solução de cultura após a célula que produz o anticorpo desejado ser cultivado.

12. Método para preparar um medicamento, caracterizado pelo fato de que compreende a mistura de um anticorpo preparado pelo método como definido na reivindicação 10 ou 11 com veículos ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo desejado é um anticorpo anti-glipican 3 ou um anticorpo anti-IL-31RA.