ES2682929T3 - Medio de cultivo celular sin suero - Google Patents

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Abstract

Un medio de cultivo celular, que es sin suero, que comprende ornitina >= 0,09 mM ± 0,014 mM y putrescina >= 0,20 ± 0,03 mM.

Description

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DESCRIPCION
Medio de cultivo celular sin suero Campo
La invencion se refiere a medios para el cultivo de celulas y para la produccion de protefnas recombinantes. La invencion se refiere, en concreto, a medios sin suero para el cultivo de celulas CHO recombinantes para la produccion de agentes bioterapeuticos proteicos.
Antecedentes
Los medios de cultivo celular que comprenden suero o componentes hidrolizados proteicos (es decir, peptonas y triptonas) tienen una larga historia de uso en la produccion de protefnas recombinantes a partir de celulas cultivadas. Estos componentes contienen factores de crecimiento y una amplia variedad de otros elementos no caracterizados beneficiosos para el crecimiento y el cultivo celular. Sin embargo, tambien contienen elementos no caracterizados que reducen el crecimiento o tienen un impacto negativo por otra razon en la produccion de protefnas recombinantes. Tambien pueden ser una posible fuente de variabilidad no deseada. A pesar de sus inconvenientes, los beneficios del uso de sueros e hidrolizados han superado algunas de las desventajas y se han usado ampliamente en muchas aplicaciones de cultivo celular.
Los agentes terapeuticos biologicos humanos (productos biofarmaceuticos), en general, se producen en cultivos celulares de mamfferos, en particular, en cultivo de celulas CHO. La presencia de componentes no caracterizados o parcialmente caracterizados en esos cultivos celulares es altamente indeseable para la fabricacion de productos biofarmaceuticos para uso humano. El uso de dichos componentes no caracterizados o parcialmente caracterizados no solo introduce incoherencias en la produccion y la regulacion, sino que tambien plantea la posibilidad de una infeccion vfrica o fungica del cultivo de produccion.
La reduccion de la variabilidad de lote a lote en el rendimiento del producto farmacologico y la composicion es otro factor importante en la seleccion de un proceso de cultivo. Los sueros, los hidrolizados y otros elementos indefinidos introducen variabilidad en el rendimiento, la composicion y la calidad de los lotes de produccion biofarmaceuticos. La calidad y la pureza de los elementos de los medios tambien pueden afectar al rendimiento, ya que los tftulos de los farmacos se suelen basar, en parte, en el mantenimiento de un determinado equilibrio de los nutrientes. Cuando las cantidades relativas de los nutrientes varfan de un lote de medios a otro, el rendimiento del farmaco puede variar, y esta variacion puede ser inaceptable o poco rentable.
El uso de medios que contienen suero o a base de hidrolizados introduce desaffos de procesamiento aguas abajo. En general, la concentracion de un producto biofarmaceutico deseado en cultivo es del orden de los gramos por litro. La presencia de suero e hidrolizados en los medios puede anadir mas de 10 g/l de peptidos y protefnas no caracterizados, que deben eliminarse en las etapas de procesamiento posteriores. El suero y los hidrolizados tambien pueden introducir variabilidad en la cantidad de metales y otros oligoelementos en los medios. La eliminacion del suero y de los hidrolizados de los medios de cultivo elimina, por tanto, estas variaciones y posibles impedimentos para la produccion y el procesamiento de la sustancia farmacologica.
Entre otros, los beneficios de usar medio sin suero y sin hidrolizados incluyen la reduccion en el coste, la reduccion de la variabilidad entre lotes de farmaco, y la reduccion al mfnimo del riesgo de introducir agentes foraneos procedentes de componentes no definidos y sin refinar. Ademas, cuando los medios son definidos y uniformes entre las ejecuciones de lotes, tambien se reducen al mfnimo las ejecuciones de calificacion para probar lotes de medios nuevos con los medios actuales. Por lo tanto, existe la necesidad en la tecnica de medios para cultivar celulas de mamffero, de manera que los medios esten qufmicamente definidos y sin suero ni hidrolizados, o que esten sin suero y contengan niveles bajos manejables de hidrolizados, y que permitan a la vez el crecimiento y el mantenimiento de celulas sanas y robustas, y la produccion de un alto tftulo de sustancias farmacologicas biofarmaceuticas.
El documento US2010285533 se refiere a un medio de cultivo que contiene al menos una poliamina a una concentracion de al menos 20 mg/l y al menos una fuente de hierro a una concentracion de al menos 2 mg/l, en el que la poliamina es una de entre espermina, espermidina, norespermina, norespermina, norespermidina, homoespermina, homoespermidina o cadaverina.
El documento WO2007077217 se refiere a un medio de cultivo celular sin oligopeptidos, que comprende al menos 0,5 mg/l de una poliamina. El documento EP1321515 se refiere a un metodo para cultivar celulas de una estirpe celular, que comprende proporcionar celulas para cultivar, poner en contacto dichas celulas con un medio de cultivo celular sin suero en un receptaculo de cultivo celular en presencia de una matriz proteica, y cultivar dichas celulas en ausencia de suero. El documento US2011229933 describe un metodo para producir una protefna que comprende inocular un medio de crecimiento celular de mamffero inicial con celulas hospedadoras que expresan la protefna y anadir complementos que comprenden, entre otros, HCl de L-ornitina.
El documento US2012034674 describe medios de cultivo celular que, en ciertas realizaciones, contienen al menos una poliamina a una concentracion de o de entre aproximadamente 0,5 mg/l y 30 mg/l.
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Holtta et al., (1982) Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research, vol.721, n.° 4, 30 de diciembre de 1982, paginas 321-327 informa que la dependencia de la poliamina de las celulas CHO en el cultivo sin suero se debe a una actividad deficiente de la arginasa. Hawel et al., Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research, vol. 1222(1), 26 de mayo de 1994, paginas 15-26, informa que la exportacion selectiva de putrescina esta regulada por la insulina y la ornitina en las celulas de hepatoma Reuber H35.
Sumario
Los inventores han hecho el sorprendente descubrimiento de que la inclusion de ornitina, ya sea con o sin putrescina, en los medios de cultivo celular sin suero (medios "OS") aumenta la viabilidad y la densidad celular, reduce el tiempo de duplicacion celular y permite la produccion de protefna de alto tftulo por esas celulas. Los inventores tambien han descubierto que los medios OS que contienen cantidades bajas o traza de hidrolizados proteicos o que estan definidos qufmicamente (es decir, que no contienen hidrolizados proteicos) restablecen, en particular, la viabilidad y la densidad celulares, el tiempo de duplicacion celular y la produccion de protefna de alto tftulo.
En un aspecto, la invencion proporciona un medio de cultivo celular, que es sin suero y que comprende ornitina al menos 0,09 mM ± 0,014 mM. En una realizacion, la ornitina esta presente en el medio a una concentracion que varfa de 0,09 ± 0,014 mM a 0,9 ± 0,14 mM, tal como ornitina 0,09 ± 0,014 mM, 0,3 ± 0,05 mM, 0,6 ± 0,09 mM o 0,9 ± 0,14 mM. El medio tambien contiene putrescina al menos 0,20 ± 0,03 mM. En algunas realizaciones, la putrescina adicional esta a una concentracion que varfa de 0,20 ± 0,03 mM a 0,714 ± 0,11 mM, tal como putrescina 0,20 ± 0,03 mM, 0,35 ± 0,06 mM o 0,714 ± 0,11 mM. En algunas realizaciones, el medio contiene hidrolizado a < 7,5 g/l. En algunas realizaciones, el medio esta libre de cualquier hidrolizado.
En una realizacion, el medio contiene un medio base que esta definido qufmicamente, tal como una formulacion de encargo o un medio base disponible en el mercado. En una realizacion, el medio completo esta definido qufmicamente, y es sin suero y sin hidrolizado.
En algunas realizaciones, el medio, que esta a su concentracion util (es decir, x1) contiene al menos 40 ± 6 mM o al menos 70 ± 10,5 mM de una mezcla de aminoacidos o sales de aminoacidos. En una realizacion, el medio contiene al menos 40 mM de una mezcla de aminoacidos. En esta u otra realizacion, el medio contiene al menos 70 mM de una mezcla de aminoacidos. En una realizacion, la mezcla de aminoacidos (con la notable excepcion de la glutamina, que puede anadirse de nuevo al medio como una adicion en el momento de uso) contiene alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistefna, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina.
En algunas realizaciones, el medio contiene uno o mas acidos grasos. En una realizacion particular, el medio contiene una mezcla de acidos grasos (o derivados de acidos grasos) y alfa tocoferol. Los acidos grasos o derivados de acidos grasos se seleccionan del grupo que consiste en acido linoleico, acido linolenico, acido tioctico, acido oleico, acido palmftico, acido estearico, acido araqufdico, acido, acido laurico, acido behenico, acido decanoico, acido dodecanoico, acido hexanoico, acido lignocerico, acido mirfstico y acido octanoico.
En algunas realizaciones, el medio contiene una mezcla de nucleosidos. En una realizacion, el medio contiene adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina.
En algunas realizaciones, el medio contiene una mezcla de sales. Las sales incluyen cationes divalentes, tales como calcio y magnesio. En una realizacion, el medio contiene cloruro de calcio y sulfato de magnesio. Otras sales pueden incluir las de fosfato.
En una realizacion especffica, el medio (1) contiene < 7,5 g/l de un hidrolizado; (2) es sin suero; (3) contiene ornitina 0,09 ± 0,014 mM, 0,3 ± 0,05 mM, 0,6 ± 0,09 mM o 0,9 ± 0,14 mM; (4) ademas, contiene putrescina 0,20 ± 0,03 mM, 0,35 ± 0,06 mM o 0,714 ± 0,11 mM; (5) contiene al menos aproximadamente 40 mM o al menos aproximadamente 70 mM de una mezcla de amino acidos que incluyen alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistefna, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina; (6) contiene tocoferol y un mezcla de acidos grasos; (7) contiene una mezcla de nucleosidos que incluyen adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina; y (8) contiene sales de calcio, magnesio y fosfato.
En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para cultivar celulas en un medio de cultivo celular, tal como cualquier realizacion del medio descrito en el aspecto anterior, y propagar o mantener una celula en el medio de cultivo celular para formar un cultivo celular. En una realizacion, el metodo emplea las etapas de propagar o mantener una celula o celulas en un medio que (1) contiene hidrolizado a < 7,5 g/l o que no contiene hidrolizado; (2) es sin suero; (3) contiene ornitina a una concentracion de al menos 0,09 mM ± 0,014 mM; (4) y contiene putrescina a una concentracion de al menos 0,20 ± 0,03 mM.
En algunas realizaciones, la celula o las celulas son celulas de mamffero, celulas aviares, celulas de insecto, celulas
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de levadura o celulas de bacterias. En una realizacion, las celulas son celulas de mamffero utiles en la produccion de protefnas recombinantes, tales como celulas CHO o el derivado CHO-K1. En algunas realizaciones, las celulas expresan una protefna de interes, tal como una protefna bioterapeutica. La protefna bioterapeutica puede ser una protefna de union a antfgeno, que puede contener un dominio Fc. En algunas realizaciones, la protefna de interes es una protefna de fusion de receptor-Fc, tal como una molecula ScFv o una molecula TRAP. Las moleculas TRAP incluyen las protefnas VEGF TRAP e IL-1 TRAP. En algunas realizaciones, la protefna de interes es un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal humanizado, un anticuerpo biespecffico o un fragmento de anticuerpo.
Teniendo en cuenta los efectos positivos sobre el crecimiento celular mediante la inclusion de la ornitina o una combinacion de ornitina y putrescina en medios sin suero, las celulas cultivadas de acuerdo con este metodo tienen un tiempo medio de duplicacion que no es superior a 30 horas. En una realizacion, el tiempo de duplicacion de la celula no es superior a 24 horas. En una realizacion, cuando se compara con el crecimiento celular en medios que contienen ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM (u ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM y putrescina a menos de 0,2 ± 0,03 mM), las celulas cultivadas de acuerdo con este metodo tienen un tiempo de duplicacion medio que es al menos un tercio del tiempo de duplicacion del cultivo de control del comparador.
Asimismo, la inclusion de ornitina sola o de una combinacion de ornitina y putrescina en medios sin suero permite que las celulas cultivadas alcancen una densidad de recuento de celulas viables mayor que sin la inclusion de la ornitina o la combinacion de ornitina y putrescina. En una realizacion sin suero y sin hidrolizado del medio OS, el cultivo celular es capaz de alcanzar una densidad de recuento de celulas viables que es al menos un 15 % superior a la de un cultivo celular similar en un medio de cultivo celular similar que contiene ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM (u ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM y putrescina a menos de 0,2 ± 0,03 mM). En otra realizacion sin suero y sin hidrolizado del medio OS, el cultivo celular es capaz de alcanzar una densidad de recuento de celulas viables que es al menos 3 veces superior a la de un cultivo celular similar en un medio de cultivo celular similar que contiene ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM (u ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM y putrescina a menos de 0,2 ± 0,03 mM).
En otra realizacion, el metodo incluye la etapa de anadir una o mas adiciones en el momento de uso al medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, la adicion en el momento de uso es una cualquiera o mas de NaHCO3, glutamina, insulina, glucosa, CuSO4, ZnSO4, FeCb, NiSO4, EDTA de Na4 y citrato de Na3. En una realizacion, el metodo emplea la etapa de anadir cada uno de los siguientes productos qufmicos en el momento de uso al medio de cultivo celular: NaHCO3, glutamina, insulina, glucosa, CuSO4, ZnSO4, FeCb, NiSO4, EDTA de Na4 y citrato de Na3. En algunas realizaciones, las adiciones en el momento de uso pueden incluirse en el medio al comienzo.
En una realizacion especffica, el aspecto proporciona un metodo para el cultivo de celulas en un medio sin suero que contiene (1) ornitina bien a 0,09 ± 0,014 mM, 0,3 ± 0,05 mM, 0,6 ± 0,09 mM o 0,9 ± 0,14 mM de medio de cultivo celular; (2) ademas, putrescina bien a 0,20 ± 0,03 mM, 0,35 ± 0,06 mM o 0,714 ± 0,11 mM; (3) al menos aproximadamente 40 mM o al menos aproximadamente 70 mM de una mezcla de amino acidos que incluyen alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistefna, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina; (4) tocoferol y un mezcla de acidos grasos; (6) una mezcla de nucleosidos que incluyen adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina; y (9) sales de calcio, magnesio y fosfato, en el que las celulas cultivadas de acuerdo con este metodo tienen un tiempo de duplicacion medio que no es superior a 24 horas o que es al menos un tercio del tiempo de duplicacion del cultivo de control del comparador; y las celulas cultivadas son capaces de alcanzar una densidad de recuento de celulas viables que es al menos un 15 % superior o al menos 3 veces superior a la de un cultivo celular similar en un medio de cultivo celular similar que contiene ornitina a menos de 0,09 ± 0,015 mM (u ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM y putrescina a menos de 0,2 ± 0,03 mM). En otra realizacion, el cultivo celular es capaz de alcanzar una densidad de recuento de celulas viables que es al menos 3 veces superior a la de un cultivo celular similar en un medio de cultivo celular similar que contiene ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM (u ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM y putrescina a menos de 0,2 ± 0,03 mM). En una realizacion, el medio contiene hidrolizado a < 7,5 g/l; y en otra realizacion, es sin hidrolizados.
En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para producir una protefna de interes empleando las etapas de (1) introducir, en una celula, una secuencia de acido nucleico que codifique una protefna de interes; (2) seleccionar una celula que porte esa secuencia de acido nucleico; (3) cultivar la celula seleccionada en una realizacion del medio de cultivo celular sin suero descrito en el primer aspecto o de acuerdo con cualquier realizacion del metodo descrito en el segundo aspecto; y (4) expresar la protefna de interes en la celula, de modo que la protefna de interes se secrete en el medio. En algunas realizaciones, la celula usada en la produccion de la protefna es una celula de mamffero capaz de producir una celula bioterapeutica, tal como CHO, 293 y BHK, o cualquier derivado de las mismas. En una realizacion, la celula es una celula CHO, tal como una celula CHO-K1.
En algunas realizaciones, la protefna de interes es una protefna de union a antfgeno. En algunas realizaciones, la protefna de interes es una protefna que tiene un dominio Fc. En algunos casos, esas dos protefnas de interes pueden solaparse, tal como en el caso de una protefna de fusion de receptor-Fc, un anticuerpo y una protefna ScFv, por ejemplo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la protefna de interes es un anticuerpo, tal como un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab' o F(ab')2, un anticuerpo
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biespecffico, una molecula TRAP, tal como una VEGF TRAP o una IL-1 TRAP, una molecula scFv, una protefna de fusion de TCR-Fc soluble, o similares.
En una realizacion, la protefna de interes es capaz de producirse a un tftulo medio de siete dfas, que es al menos un 7 % superior, al menos un 14 % superior, al menos un 80 % superior, al menos dos veces superior o al menos tres veces superior al tftulo medio de siete dfas producido por una celula similar en un medio de cultivo celular sin suero que contiene ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM (u ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM y putrescina a menos de 0,2 ± 0,03 mM) (medios "no OS").
En una realizacion especffica, la protefna de interes se produce mediante (1) la introduccion, en una celula CHO, de una secuencia de acido nucleico que codifica una protefna de interes, tal como un anticuerpo u otra protefna de union a antfgeno; (2) la seleccion de una celula que porta esa secuencia de acido nucleico; (3) el cultivo de la celula seleccionada en un medio de cultivo celular sin suero que contiene (a) ornitina a 0,09 ± 0,014, 0,3 ± 0,05 mM, 0,6 ± 0,09 mM o 0,9 ± 0,14 mM; (b) ademas, putrescina bien a 0,20 ± 0,03 mM, 0,35 ± 0,06 mM o 0,714 ± 0,11 mM; (c) al menos 40 mM o al menos 70 mM de una mezcla de amino acidos que incluyen: alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistefna, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina; (d) tocoferol y un mezcla de acidos grasos; (e) una mezcla de nucleosidos que incluyen adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina; y (f) sales de calcio, magnesio y fosfato; y (d) la expresion de la protefna de interes en la celula CHO, de modo que la protefna de interes se secrete en el medio. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular sin suero puede incluir < 7,5 g/l de hidrolizados; o, en otras realizaciones, ningun hidrolizado en absoluto.
Descripcion detallada
Los solicitantes han hecho el sorprendente descubrimiento de que la adicion de ornitina, o una combinacion de ornitina y putrescina ("medio OS") mejora la densidad de celulas viables, el tiempo de duplicacion celular y la produccion de protefna por una celula en un cultivo celular en comparacion con un medio sin suero que contenga muy poca ornitina o que no contenga nada de ornitina, o poco o nada de una combinacion de ornitina y putrescina ("medio no OS").
Antes de describir los presentes cultivos celulares y metodos, se ha de entender que la presente invencion no se limita a los metodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos metodos y condiciones pueden variar. Tambien se comprende que la terminologfa usada en la presente memoria es unicamente con el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante.
Salvo que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente solicitud tienen el mismo significado comunmente entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invencion. Aunque tambien pueden usarse en la puesta en practica o el ensayo de la presente invencion cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en la presente solicitud, a continuacion, se describen determinados metodos y materiales especfficos. Las unidades, los prefijos y los sfmbolos se pueden denotar en su forma aceptada del SI. Los intervalos numericos enumerados en el presente documento estan entre corchetes, lo que significa que incluyen los numeros que definen el intervalo. A menos que se indique otra cosa, los terminos "un" o "una" deben interpretarse en el sentido de "al menos uno/a de". Los encabezados de seccion usados en el presente documento tienen fines organizativos solamente, y no deben considerarse como limitantes de la materia objeto descrita. los metodos y las tecnicas que se describen en el presente documento, en general, se realizan de acuerdo con metodos convencionales ya conocidos en la tecnica y como se describe en diversas referencias generales y mas especfficas que se mencionan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001) y Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing Associates (1992), Harlow y Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), y Julio E. Celis, “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, 2a ed., Academic Press, Nueva York, N.Y. (1998), y Dieffenbach y Dveksler, “PCR Primer: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1995).
Definiciones
Como se usa en el presente documento, “peptido”, "polipeptido" y "protefna" se usan indistintamente a lo largo del presente documento, y se refieren a una molecula que comprende dos o mas restos de aminoacidos unidos entre sf por un enlace peptfdico. Los peptidos, los polipeptidos y las protefnas tambien pueden incluir modificaciones tales como glicosilacion, union de lfpidos, sulfatacion, gamma-carboxilacion de restos de acido glutamico, alquilacion, hidroxilacion y ribosilacion de ADP. Los peptidos, los polipeptidos y las protefnas pueden ser de interes cientffico o comercial, incluyendo los farmacos a base de protefnas. Los peptidos, los polipeptidos y las protefnas incluyen, entre otros, anticuerpos y protefnas quimericas o de fusion. Los peptidos, los polipeptidos y las protefnas son producidos por estirpes de celulas animales recombinantes usando metodos de cultivo celular.
La expresion "secuencia polinucleotfdica heterologa", como se usa en el presente documento, se refiere a polfmeros
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de acido nucleico que codifican protefnas de interes, tales como protefnas quimericas (como moleculas TRAP), anticuerpos o partes de anticuerpo (por ejemplo, VH, VL, CDR3) que se producen como una sustancia farmacologica biofarmaceutica. La secuencia polinucleotfdica heterologa puede fabricarse mediante tecnicas de ingenierfa genetica (por ejemplo, tal como una secuencia que codifica una protefna quimerica o una secuencia optimizada por codones, una secuencia sin intrones, etc.) e introducirse en la celula, en la que puede residir como un episoma o integrarse en el genoma de la celula. La secuencia polinucleotfdica heterologa puede ser una secuencia natural que se introduce en un sitio ectopico dentro del genoma de la celula de produccion. La secuencia polipeptfdica heterologa puede ser una secuencia natural de otro organismo, tal como una secuencia que codifique un ortologo humano.
"Anticuerpo" se refiere a una molecula de inmunoglobulina que consiste en cuatro cadenas polipeptfdicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada tiene una region variable de cadena pesada (HCVR o VH) y una region constante de cadena pesada. La region constante de cadena pesada contiene tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera tiene una region variable de cadena ligera y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera consiste en un dominio (CL). Las regiones VH y VL se pueden subdividir ademas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones mas conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, Fr3, CDR3, FR4. El termino "anticuerpo" incluye la referencia a inmunoglobulinas tanto glicosiladas como no glicosiladas de cualquier isotipo o subclase. El termino "anticuerpo" incluye moleculas de anticuerpo preparadas, expresadas, creadas o aisladas por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una celula hospedadora transfectada para expresar el anticuerpo. El termino anticuerpo tambien incluye un anticuerpo biespecffico, que incluye una inmunoglobulina heterotetramerica que se puede unir a mas de un epftopo diferente. Los anticuerpos biespecfficos se describen en general en la publicacion de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2010/0331527.
La expresion "parte de union a antfgeno" de un anticuerpo (o "fragmento del anticuerpo"), se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse especfficamente a un antfgeno). Los ejemplos de los fragmentos de union abarcados en la expresion "parte de union a antfgeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la region de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un unico brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento de dAb (Ward et al., (1989) Nature 241:544546), que consiste en un dominio VH; (vi) una CDR aislada; y (vii) un scFv, que consiste en los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, unidos por un enlazador sintetico para formar una sola cadena de protefna en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moleculas monovalentes. Otras formas de anticuerpos monocatenarios, tales como diacuerpos, tambien estan abarcados por el termino "anticuerpo» (vease, por ejemplo, Holliger et al. (1993) PNAS EE.UU., 90:6444-6448; Poljak et al., (1994) Structure 2:1121-1123).
Ademas, un anticuerpo o una parte de union a antfgeno del mismo puede formar parte de una molecula de inmunoadhesion mayor, formada por la asociacion covalente o no covalente del anticuerpo o de la parte de anticuerpo con una o mas de otras protefnas o peptidos. Los ejemplos de dichas moleculas de inmunoadhesion incluyen el uso de la region del nucleo de estreptavidina para formar una molecula scFv tetramerica (Kipriyanov et al., (1995) “Human Antibodies and Hybridomas” 6:93-101) y el uso de un resto de cistefna, un peptido marcador y un marcador de polihistidina C-terminal para producir moleculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov et al., (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Las partes de anticuerpo, tales como los fragmentos Fab y F(ab')2, pueden prepararse a partir de anticuerpos completos usando tecnicas convencionales, tales como la digestion con papafna o pepsina de anticuerpos completos. Ademas, los anticuerpos, las partes de anticuerpos y las moleculas de inmunoadhesion se pueden obtener usando tecnicas de ADN recombinante convencionales comunmente conocidas en la materia (vease Sambrook et al., 1989).
La expresion "anticuerpo humano" pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de lfnea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invencion pueden incluir restos de aminoacidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la lfnea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria y de sitio in vitro o mediante mutacion somatica in vivo), por ejemplo, en las CDR y, en particular, en CDR3. Sin embargo, la expresion "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la lfnea germinal de otra especie de mamffero, tal como de un raton, se han injertado en secuencias marco humanas.
La expresion "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tales como los anticuerpos expresados usando un vector de expresion recombinante transfectado en una celula hospedadora, anticuerpos aislados de un banco combinatorio de anticuerpos humanos recombinantes, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico para los genes de inmunoglobulina humana (vease, por ejemplo, Taylor et al., (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias genicas de inmunoglobulinas humanas con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y
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constantes que provienen de las secuencias de inmunoglobulinas de la linea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagenesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgenico para secuencias de Ig humanas, mutagenesis somatica in vivo) y, por lo tanto, las secuencias de aminoacidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de y estan relacionadas con secuencias de VH y VL de linea germinal humanas, no pueden existir de manera natural en el repertorio de anticuerpos de la linea germinal humana in vivo.
Las "protefnas de fusion Fc" comprenden parte o la totalidad de dos o mas protefnas, una de las cuales es una parte Fc de una molecula de inmunoglobulina, que, en cambio, no se encuentran juntas en la naturaleza. La preparacion de protefnas de fusion que comprenden ciertos polipeptidos heterologos fusionados a diversas partes de polipeptidos derivados de anticuerpos (que incluyen el dominio Fc) se ha descrito, por ejemplo, por Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL EE.U. 88: l0535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; y Hollenbaugh et al., "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, Supl. 4, paginas 10.19.1 - 10.19.11, 1992. "Las protefnas de fusion de receptor y Fc" comprenden uno o mas dominios extracelulares de un receptor acoplado a una fraccion Fc, que, en algunas realizaciones, comprende una region de bisagra seguida de un dominio CH2 y CH3 de una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la protefna de fusion Fc contiene dos o mas cadenas de receptor distintas que se unen a uno o mas ligandos. Por ejemplo, una protefna de fusion Fc es una TRAP, tal como, por ejemplo, una lL-1 TRAP (por ejemplo, rilonacept, que contiene la region de union al ligando IL-1RAcP fusionada a la region extracelular de IL-1R1 fusionada a Fc de hIgG1; Vease la patente de EE.UU. n.° 6.927.004) o una VEGF TRAP (por ejemplo, aflibercept, que contiene el dominio de Ig 2 del receptor Flt1 de VEGF fusionado al dominio de Ig 3 del receptor Flk1 de VEGF fusionado a Fc de hlgG1; Veanse las patentes de EE.UU. n.° 7.087.411 y 7.279.159).
MEDIOS
La presente invencion proporciona un medio sin suero que es util en el cultivo de celulas y la produccion de una sustancia farmacologica biofarmaceutica. "Sin suero" se aplica a un medio de cultivo celular que no contiene suero animal, tal como suero bovino fetal. Los medios sin suero pueden contener < 7,5 g/l de hidrolizados, tales como hidrolizado de soja. La presente invencion tambien proporciona medios definidos qufmicamente, que no solo son sin suero, sino tambien sin hidrolizados. "Libre de hidrolizados" se aplica al medio de cultivo celular que no contiene hidrolizados proteicos exogenos tales como hidrolizados proteicos animales o vegetales tales como, por ejemplo, peptonas, triptonas y similares.
La eliminacion del suero, y la reduccion o eliminacion de los hidrolizados de los medios de cultivo celular, aunque reduce la variabilidad de lote a lote y mejora las etapas de procesamiento aguas abajo, por desgracia, disminuye el crecimiento celular, la viabilidad celular y la expresion de protefnas. Por lo tanto, los medios qufmicamente definidos sin suero y de bajo a nulo contenido de hidrolizados requieren ingredientes adicionales para mejorar el crecimiento celular y la produccion de protefnas. Los medios de cultivo celular de la invencion se pueden complementar con ingredientes adicionales tales como poliaminas o mayores concentraciones de componentes como aminoacidos, sales, azucares, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, tampones, antibioticos, lfpidos, oligoelementos y similares, dependiendo de las necesidades de las celulas que se vayan a cultivar o de los parametros de cultivo celular deseados. En concreto, el medio de cultivo celular se complementa con ornitina, putrescina o ambas ("medio OS") para mejorar el crecimiento celular, la viabilidad celular y la produccion de protefna recombinante.
En algunas realizaciones, el medio OS contiene ornitina a una concentracion (expresada en micromoles por litro) de al menos aproximadamente 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 568, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590,
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En algunas realizaciones, el medio contiene ornitina a una concentracion de aproximadamente 85, 90, 95, 100, 105, 110, 113 o 115 pM. En una realizacion, el medio contiene ornitina a 100 pM ± 15 pM. En una realizacion, el medio contiene HCl de ornitina a 15 mg/l ± 2,25 mg/l.
En algunas realizaciones, los medios contienen ornitina a una concentracion de aproximadamente 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340 o 345 pM. En una realizacion, el medio contiene ornitina a 300 pM ± 45 pM. En una realizacion, el medio contiene HCl de ornitina a 50 mg/l ± 7,5 mg/l.
En algunas realizaciones, los medios contienen ornitina a una concentracion de aproximadamente 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635,
640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685 o 690 pM. En una realizacion, el medio contiene ornitina a 600 pM
± 90 pM. En una realizacion, el medio contiene HCl de ornitina a 100 mg/l ± 15 mg/l.
En algunas realizaciones, los medios contienen ornitina a una concentracion de 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, 1.000, 1.005, 1.010, 1.015, 1.020, 1.025, 1.030 o 1.035 pM. En una realizacion, el medio contiene ornitina a 900 pM ± 135 pM. En una
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realizacion, el medio contiene HCl de ornitina a 150 mg/l ± 22,5 mg/l.
Los medios complementados con ornitina tambien comprenden putrescina. La putrescina se ha incluido, a concentraciones muy bajas, como componente en algunas formulaciones de medios de cultivo celular; vease, por ejemplo, el documento WO 2005/028626, que describe putrescina a 0,02-0,08 mg/l; la patente de EE.UU. n.° 5.426.699 (0,08 mg/l); la patente de EE.UU. n.° RE30,985 (0,16 mg/l); la patente de EE.UU. n.° 5.811.299 (0,27 mg/l); la patente de EE.UU. n.° 5.122.469 (0,5635 mg/l); la patente de EE.UU. n.° 5.063.157 (1 mg/l); el documento wO 2008/154014 (-100 pM —1.000 pM); La publicacion de solicitud de patente n.° 2007/0212770 (poliamina a 0,5-30 mg/l; putrescina a 2 mg/l; putrescina a 2 mg/l + ornitina a 2 mg/l; putrescina a 2 mg/l + ornitina a 10 mg/l).
En algunas realizaciones, los medios contienen una combinacion de ornitina y putrescina, en la que la putrescina puede estar a una concentracion de al menos aproximadamente 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 260, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405 o 410 pM.
En algunas realizaciones, los medios contienen putrescina a una concentracion de aproximadamente 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 o 230 pM. En una realizacion, el medio contiene putrescina a 200 pM ± 30 pM ademas de ornitina a > 90 pM ± 14 pM. En una realizacion, el medio contiene 2HCl de putrescina a 30 mg/l ± 4,5 mg/l, ademas de HCl de ornitina a > 15 mg/l ± 2,25 mg/l.
En algunas realizaciones, los medios contienen putrescina a una concentracion de aproximadamente 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400 o 405 pM. En una realizacion, el medio contiene putrescina a 350 pM ± 52,5 pM ademas de ornitina a > 90 pM ± 14 pM. En una realizacion, el medio contiene 2HCl de putrescina a 57 mg/l ± 8,55 mg/l, ademas de HCl de ornitina a > 15 mg/l ± 2,25 mg/l.
En algunas realizaciones, los medios contienen putrescina a una concentracion de aproximadamente 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800 o 805 pM. En una realizacion, el medio contiene putrescina a 714 pM ± 105 pM ademas de ornitina a > 90 pM ± 14 pM. En una realizacion, el medio contiene 2HCl de putrescina a 115 mg/l ± 17,25 mg/l, ademas de HCl de ornitina a > 15 mg/l ± 2,25 mg/l.
En algunas realizaciones, los medios contienen una combinacion de dos de cualquiera de las concentraciones de putrescina y ornitina enumeradas anteriormente. En algunas realizaciones, los medios contienen cualquier combinacion de dos de putrescina a aproximadamente 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650,
655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765,
770, 775, 780, 785, 790, 795, 800 o 805 pM, y ornitina a aproximadamente 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545,
550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660,
665, 670, 675, 680, 685 o 690 pM. Por ejemplo, los medios, en una realizacion, contienen putrescina a aproximadamente 700 pM mas ornitina a una cualquiera de 510, 511, 512 pM, et sequens; o putrescina a 701 pM mas ornitina a una cualquiera de 510, 511, 512 pM, et sequens; etcetera. Ademas, por ejemplo, los medios, en una realizacion, contienen ornitina a aproximadamente 600 pM mas putrescina a una cualquiera de 700, 701, 702 pM, et sequens; u ornitina a 601 pM mas putrescina a una cualquiera de 700, 701, 702 pM, et sequens; etcetera. En algunas realizaciones, los medios contienen putrescina a 702 pM ± 106 pM + ornitina a 593 pM ± 89 pM. En una realizacion particular, los medios contienen putrescina a aproximadamente 714 pM y ornitina a 593 pM. En una realizacion, los medios contienen 2HCl de putrescina a 115 mg/l ± 17 mg/l y HCl de ornitina a 100 mg/l ± 15 mg/l. En una realizacion particular, los medios contienen 2HCl de putrescina a 115 mg/l y HCl de ornitina a 100 mg/l.
En una realizacion, y ademas de la inclusion de ornitina y putrescina, los medios contienen una mezcla de nucleosidos a una concentracion acumulada de al menos 50 pM, al menos 60 pM, al menos 70 pM, al menos 80 pM, al menos 90 pM, al menos 100 pM, al menos 110 pM, al menos 115 pM, al menos 120 pM, al menos 125 pM, al menos 130 pM, al menos 135 pM, al menos 140 pM, al menos 145 pM, al menos 150 pM, al menos 155 pM, al menos 160 pM, al menos 165 pM o al menos 170 pM. En una realizacion, los medios contienen nucleosido a aproximadamente 174 pM ± 26 pM. En una realizacion, los medios contienen derivados de purina a una concentracion acumulada de al menos 40 pM, al menos 45 pM, al menos 50 pM, al menos 55 pM, al menos 60 pM, al menos 65 pM, al menos 70 pM, al menos 75 pM, al menos 80 pM, al menos 85 pM, al menos 90 pM, al menos 95 pM, al menos 100 pM o al menos 105 pM. En una realizacion, los medios contienen derivados de purina a aproximadamente 106 pM ± 5 pM. Los derivados de purina incluyen hipoxantina y los nucleosidos adenosina y guanosina. En una realizacion, los medios contienen derivados de pirimidina a una concentracion acumulada de al menos 30 pM, al menos 35 pM, al menos 40 pM, al menos 45 pM, al menos 50 pM, al menos 55 pM, al menos 60 pM o al menos 65 pM. En una realizacion, los medios contienen derivados de pirimidina a aproximadamente 68 pM ± 5 pM. Los derivados de pirimidina incluyen los nucleosidos timidina, uridina y citidina. En una realizacion particular, los medios contienen adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina.
Ademas de la inclusion de ornitina y putrescina, en una realizacion, los medios tambien contienen aminoacidos a
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una concentracion acumulada de al menos 40 mM, en los que la cantidad de glutamina no esta incluido en el calculo del total acumulado. En una realizacion, la glutamina no se incluye en el medio, pero puede suministrarse como una "adicion en el momento de uso" a los medios durante el cultivo celular, tal como durante la produccion de protefna. Por lo tanto, en algunas realizaciones, tales como en el metodo para cultivar celulas o el metodo para producir una protefna de interes, los medios se pueden complementar con glutamina como una adicion en el momento de uso. En una de dichas realizaciones, la glutamina se anade en una cantidad inferior a aproximadamente 40 mM, inferior a aproximadamente 35 mM, inferior a aproximadamente 30 mM, inferior a aproximadamente 25 mM, inferior a

aproximadamente 20 mM, inferior a aproximadamente 15 mM, inferior a aproximadamente 10 mM, inferior a

aproximadamente 8 mM, inferior a aproximadamente 7 mM, inferior a aproximadamente 6 mM, inferior a

aproximadamente 5 mM, inferior a aproximadamente 4 mM, inferior a aproximadamente 3 mM o inferior a
aproximadamente 2,5 nM. En una realizacion, la cantidad de glutamina en los medios que se complemento con glutamina es de aproximadamente 2 mM ± 0,5 mM.
En una realizacion, ademas de la inclusion de una combinacion tanto de ornitina como de putrescina, los medios tambien contienen aminoacidos que tienen un grupo lateral no polar a una concentracion de al menos 15 mM, al menos 24 mM, al menos 25 mM, al menos 26 mM, al menos 27 mM, al menos 28 mM, al menos 29 mM o al menos 30 mM. En una realizacion, los medios contienen aproximadamente 30 mM de aminoacidos que tienen un grupo lateral no polar. En una realizacion, de la cantidad total de aminoacidos por mol contenida dentro de los medios, al menos el 32 %, al menos el 33 %, al menos el 34 %, al menos el 35 %, al menos el 36 %, al menos el 37 %, al menos el 38 %, al menos el 39 %, al menos el 40 % o al menos el 41 % son aminoacidos que tienen grupos laterales no polares. En una realizacion, aproximadamente el 42 % ± 1 % por mol de los aminoacidos de los medios son aminoacidos que tienen un grupo lateral no polar. Los aminoacidos que tienen un grupo lateral no polar incluyen alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina.
En una realizacion, ademas de la inclusion de una combinacion tanto de ornitina como de putrescina, los medios tambien contienen aminoacidos que tienen un grupo lateral polar sin carga a una concentracion de aproximadamente 10 mM a 34 mM, de aproximadamente 11 mM a 33 mM, de aproximadamente 12 mM a 32 mM, de aproximadamente 13 mM a 31 mM, de aproximadamente 14 mM a 30 mM, de aproximadamente 15 mM a 29 mM, de aproximadamente 16 mM a 28 mM, de aproximadamente 17 mM a 27 mM, de aproximadamente 18 mM a 26 mM, de aproximadamente 19 mM a 25 mM, de aproximadamente 20 mM a 24 mM, de aproximadamente 21 mM a 23 mM o aproximadamente 22 mM. En una realizacion, el medio contiene aproximadamente 22 mM de aminoacidos que tienen un grupo lateral polar sin carga. En otra realizacion, el medio contiene aproximadamente 12 mM de aminoacidos que tienen un grupo lateral polar sin carga. En una realizacion, de la cantidad total por mol de aminoacidos contenidos dentro de los medios, aproximadamente del 14 % al 46 %, aproximadamente del 15 % al 45 %, aproximadamente del 16 % al 44 %, aproximadamente del 17 % al 43 %, aproximadamente del 18 % al 42 %,
aproximadamente del 19 % al 41 %, aproximadamente del 20 % al 40 %, aproximadamente del 21 % al 39 %,
aproximadamente del 22 % al 38 %, aproximadamente del 23 % al 37 %, aproximadamente del 24 % al 36 %,
aproximadamente del 25 % al 35 %, aproximadamente del 26 % al 34 %, aproximadamente del 27 % al 33 %,
aproximadamente del 28 % al 32 %, aproximadamente del 29 % al 31 % o aproximadamente el 30 % son aminoacidos que tienen grupos laterales polares sin carga. En una realizacion, aproximadamente el 30 % ± 3 % por mol de los aminoacidos de los medios son aminoacidos que tienen un grupo lateral polar sin carga. Los aminoacidos que tienen un grupo lateral polar sin carga incluyen glicina, serina, treonina, cistefna, tirosina, asparagina y glutamina.
En una realizacion, ademas de la inclusion de una combinacion tanto de ornitina como de putrescina, los medios tambien contienen aminoacidos que tienen una carga negativa a pH 6 (es decir, aminoacidos acidos) a una concentracion de aproximadamente 4 mM a 14 mM, de aproximadamente 5 mM a 13 mM, de aproximadamente 6 mM a 12 mM, de aproximadamente 7 mM a 11 mM, de aproximadamente 8 mM a 10 mM, aproximadamente 9 mM o aproximadamente 4 mM. En una realizacion, los medios contienen aproximadamente 9 mM de aminoacidos acidos. En una realizacion, los medios contienen 9 mM ± 1 mM de aminoacidos acidos. En una realizacion, de la cantidad total por mol de aminoacidos contenidos dentro de los medios, aproximadamente del 8 % al 18 %, aproximadamente del 9 % al 17 %, aproximadamente del 10 % al 16 %, aproximadamente del 11 % al 15 %, aproximadamente del 12 % al 14 % o aproximadamente el 13 % de aminoacidos acidos. En una realizacion, aproximadamente el 12,6 % ± 1 % por mol de los aminoacidos de los medios son aminoacidos acidos. Los aminoacidos acidos acido aspartico y acido glutamico.
En una realizacion, ademas de la inclusion de una combinacion tanto de ornitina como de putrescina, los medios tambien contienen aminoacidos que tienen una carga positiva a pH 6 (es decir, aminoacidos basicos) a una concentracion de al menos 3,5 mM, al menos 4 mM, al menos 5 mM, al menos 6 mM, al menos 7 mM, al menos
8 mM, al menos 9 mM, al menos 10 mM o al menos 11 mM. En una realizacion, los medios contienen aproximadamente 11 mM de aminoacidos basicos. En una realizacion, los medios contienen aproximadamente 11,42 mM ± 1 mM de aminoacidos basicos. En una realizacion, de la cantidad total por mol de aminoacidos contenidos dentro de los medios, al menos el 5 %, al menos el 6%, al menos el 7 %, al menos el 8 %, al menos el
9 %, al menos el 10 %, al menos el 11 %, al menos el 12 %, al menos el 13 %, al menos el 14 % o al menos el 15 % son aminoacidos basicos. En una realizacion, aproximadamente el 16 % por mol de los aminoacidos de los medios son aminoacidos basicos. En una realizacion, aproximadamente el 15,8 % ± 2,4 % por mol de los aminoacidos de
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los medios son aminoacidos basicos. En una realizacion, aproximadamente el 21 % ± 3,2 % por mol de los aminoacidos de los medios son aminoacidos basicos. Los aminoacidos basicos incluyen lisina, arginina e histidina.
En una realizacion, ademas de la inclusion de una combinacion tanto de ornitina como de putrescina, los medios tambien contienen aminoacidos no polares a aproximadamente 30 mM, aminoacidos polares sin carga a aproximadamente 22 mM, aminoacidos acidos a aproximadamente 9 mM y aminoacidos basicos a aproximadamente 11 mM. En una realizacion, de los aminoacidos de los medios, aproximadamente el 42 % por mol son aminoacidos no polares, aproximadamente el 30 % por mol son aminoacidos polares sin carga, aproximadamente el 13 % por mol son aminoacidos acidos y aproximadamente el 16 % por mol son aminoacidos basicos.
Ademas de la inclusion de una combinacion tanto de ornitina como de putrescina, en una realizacion, los medios contienen cantidades micromolares de acidos grasos (o derivados de acidos grasos) y tocoferol. En una realizacion, los acidos grasos incluyen uno o mas de acido linoleico, acido linolenico, acido tioctico, acido oleico, acido palmftico, acido estearico, acido araqufdico, acido araquidonico, acido laurico, acido behenico, acido decanoico, acido dodecanoico, acido hexanoico, acido lignocerico, acido mirfstico y acido octanoico. En una realizacion, los medios contienen tocoferol, acido linoleico y acido tioctico.
En una realizacion, los medios tambien contienen una mezcla de vitaminas, que incluye otros nutrientes y nutrientes esenciales, a una concentracion acumulada de al menos aproximadamente 700 pM o al menos aproximadamente 2 mM. En una realizacion, la mezcla de vitaminas contiene uno o mas de D-biotina, cloruro de colina, acido folico, mio-inositol, niacinamida, HCl de piridoxina, acido D-pantotenico (hemiCa), riboflavina, HCI de tiamina, vitamina B12 y similares. En una realizacion, la mezcla de vitaminas incluye D-biotina, cloruro de colina, acido folico, mio-inositol, niacinamida, HCl de piridoxina, acido D-pantotenico (hemiCa), riboflavina, HCI de tiamina y vitamina B12.
Diversas realizaciones de los medios de la invencion incluyen cualquiera de las combinaciones de las realizaciones, incluyendo medios qufmicamente definidos, sin hidrolizados y sin suero que comprenden ornitina o putrescina en las cantidades indicadas, mas, entre otros, (a) aminoacidos; (b) opcionalmente, nucleosidos; (c) sales de cationes divalentes; (d) acidos grasos y tocoferol; y (e) vitaminas. En algunas realizaciones, todas las pequenas cantidades de hidrolizados se pueden anadir a los medios OS.
Los solicitantes preven que, en la practica de la presente invencion, se pueden usar uno cualquiera o mas de una variedad de medios base o combinaciones de los mismos, a los que se anade la combinacion tanto de ornitina como de putrescina. Los medios base son conocidos en general en la tecnica, e incluyen, entre otros, MEME de Eagle (medios esenciales mfnimos) (Eagle, Science, 1955, 112(3168):501-504), F12 de Ham (Ham, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU., 1965, 53:288-293), medio F-12 K, medio de Dulbecco, medio de Eagle modificado por Dulbecco (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., agosto de 1952; 38(8): 747-752), DMEM/F12 de Ham a 1:1, T8 de Trowell, medios A2 de Holmes y Wolf, Biophys. Biochem. Cytol., 1961, 10:389-401), medios de Waymouth (Davidson y Waymouth, Biochem. J., 1945, 39(2):188-199), medios E de Williams (William's et al., Exp. Cell Res., 1971, 69:105 et seq.), RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc., 1967, 199:519-524), medios MCDB 104/110 (Bettger et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU., 1981, 78(9):5588-5592), medios Ventrex HL-1, medios de albumina-globulina (Orr et al., Appl. Microbiol., 1973, 25(1):49-54), medio RPMI-1640, medio RPMI-1641, medio de Dulbecco modificado por Iscove, medio 5 A de McCoy, medio L-15 de Leibovitz, y medios sin suero tales como la serie EX-CELL™ 300 (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), medios de protamina-cinc-insulina (Weiss et al., 1974, documento US 4.072.565), medios de biotina-folato (Cartaya, 1978, US Re30,985), medios de transferrina-acidos grasos (Baker, 1982, documento US 4.560.655), medios de transferrina-EGF (Hasegawa, 1982, documento US 4.615.977; Chessebeuf, 1984, documento US 4.786.599) y otras permutaciones de medios (vease Inlow, documento US 6.048.728; Drapeau, documento US 7.294.484; Mather, documento US 5.122.469; Furukawa, documento US 5.976.833; Chen, documento US 6.180.401; Chen, documento US 5.856.179; Etcheverry, documento US 5.705.364; Etcheverry, documento US 7.666.416; Ryll, documento US 6.528.286; Singh, documento US 6.924.124; Luan, documento US 7.429.491; y similares).
En una realizacion particular, los medios estan definidos qufmicamente y contienen, ademas de la combinacion tanto de ornitina como de putrescina: CaCh 2H2O; tampon de HEPES, KCI; MgSO4; NaCl; Na2HPO4 u otras sales de fosfato; piruvato; L-alanina; HCl de L-arginina; H2O de L-asparagina; acido L-aspartico; HCI H2O de L-cistefna; acido L-glutamico; glicina; HCI H2O de L-histidina; L-isoleucina; L-leucina; HCl de L-lisina; L-metionina; HCl de L-ornitina; L-fenilalanina; L-prolina; L-serina; L-treonina; L-triptofano; 2Na 2 H2O de L-tirosina; L-valina; D-biotina; cloruro de colina; acido folico; mio-inositol; niacinamida; HCl de piridoxina; acido D-pantotenico; riboflavina; HCl de tiamina; vitamina B12; acido p-aminobenzoico; HCl de etanolamina; Pluronic F68; fosfato de DL-a-tocoferol; acido linoleico; Na2SeO3; acido tioctico; y glucosa; y, opcionalmente, adenosina; guanosina; citidina; uridina; timidina; e hipoxantina 2Na.
En una realizacion, la osmolaridad de partida de los medios de la invencion es de 200-500, 250-400, 275-350 o de aproximadamente 300 mOsm. Durante el crecimiento de las celulas en el medio de la invencion y, en particular, despues de cualquier alimentacion de acuerdo con un protocolo de alimentacion discontinua, la osmolaridad del cultivo puede aumentar hasta aproximadamente 350, 400, 450 o tanto como 500 mOsm.
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En algunas realizaciones en las que la osmolaridad del medio definido es inferior a aproximadamente 300, la osmolaridad se llevo a aproximadamente 300 con la adicion de una o mas sales en exceso de la cantidad especificada. En una realizacion, la osmolaridad se aumenta hasta un nivel deseado mediante la adicion de uno o mas de un osmolito seleccionado entre cloruro de sodio, cloruro de potasio, una sal de magnesio, una sal de calcio, una sal de aminoacido, una sal de un acido graso, bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, carbonato de potasio, un quelante que sea una sal, un azucar (por ejemplo, galactosa, glucosa, sacarosa, fructosa, fucosa, etc.) y una combinacion de los mismos. En una realizacion, el osmolito se anade por encima y mas alla de su concentracion en un componente ya presente en el medio definido (por ejemplo, se anade un azucar por encima y mas alla de la concentracion especificada para un componente de azucar).
Todas y cada una de las realizaciones de los medios descritos anteriormente, asf como cualquier otro medio sin suero que contenga ornitina a al menos aproximadamente 90 pM (o que contenga una combinacion de ornitina a al menos aproximadamente 100 pM, mas putrescina a al menos aproximadamente 200 pM) se denominaran de aquf en adelante medios complementados con ornitina ("OS"). Por el contrario, los medios que no contienen ornitina (o ninguna combinacion de ornitina/putrescina) o los medios que contienen ornitina a menos de 100 pM (o los medios que contienen ornitina a menos de 100 pM y putrescina a menos de 200 pM), se denominan de aquf en adelante medios no complementados con ornitina ( medios "no OS").
CULTIVO CELULAR
La presente invencion proporciona un cultivo celular que comprende una estirpe celular que expresa una protefna de interes en un medio Os como se ha descrito anteriormente y como se define en las reivindicaciones. En una realizacion, el cultivo celular contiene insulina, que puede anadirse como ingrediente en el momento de uso a los medios, o puede incluirse en la formulacion de los medios. En una realizacion, la estirpe celular comprende celulas capaces de producir una protefna bioterapeutica. Los ejemplos de estirpes celulares que se usan rutinariamente para producir protefnas bioterapeuticas incluyen, entre otras, celulas primarias, celulas BSC, celulas HeLa, celulas HepG2, celulas LLC-MK, celulas CV-1, celulas COS, celulas VERO, celulas MDBK, celulas MDCK, celulas CRFK, celulas RAF, celulas RK, celulas TCMK-1, celulas LLCPK, celulas PK15, celulas LLC-RK, celulas MDOK, celulas BHK, celulas BHK-21, celulas CHO, celulas CHO-K1, celulas NS-1, celulas MRC-5, celulas WI-38, celulas BHK, celulas 3T3, celulas 293, celulas RK, celulas Per.C6 celulas de embrion de pollo. En una realizacion, la estirpe celular es una estirpe de celulas CHO, o una o mas de varias variantes especfficas de celulas CHO optimizadas para la produccion de protefnas a gran escala, por ejemplo, CHO-K1.
"Cultivo celular" o "cultivo" significa el crecimiento y la propagacion de celulas fuera de un organismo o tejido multicelular. Las condiciones de cultivo adecuadas para las celulas de mamffero son conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, “Animal cell culture: A Practical Approach”, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, Nueva York (1992). Las celulas de mamffero se pueden cultivar en suspension o mientras estan unidas a un sustrato solido. Los biorreactores de lecho fluidizado, los biorreactores de fibra hueca, los botes de rodillo, los matraces de agitacion o los biorreactores de tanque agitado, con o sin microvehfculos, y operados de modo discontinuo, de alimentacion discontinua, continuo, semicontinuo o de perfusion estan disponibles para el cultivo de celulas de mamffero. Se pueden anadir medios de cultivo celular o medios de alimentacion concentrados al cultivo de forma continua o a intervalos durante el cultivo. Por ejemplo, un cultivo puede ser alimentado una vez al dfa, en dfas alternos, cada tres dfas, o puede ser alimentado cuando la concentracion de un componente de medio especffico, que se este controlando, Este fuera de un intervalo deseado.
Las celulas animales, tales como las celulas CHO, pueden cultivarse en cultivos a pequena escala, tal como en recipientes de 125 ml que tienen aproximadamente 25 ml de medio, recipientes de 250 ml que tienen de aproximadamente 50 a 100 ml de medios, recipientes de 500 ml que tienen de aproximadamente 100 a 200 ml de medio. Como alternativa, los cultivos pueden ser a gran escala, tales como, por ejemplo, recipientes de 1.000 ml que tienen de aproximadamente 300 a 1.000 ml de medios, recipientes de 3.000 ml que tienen de aproximadamente 500 a 3.000 ml de medios, recipientes de 8.000 ml que tienen de aproximadamente 2.000 ml a 8.000 ml de medios, y recipientes de 15.000 ml que tienen de aproximadamente 4.000 ml a 15.000 ml de medios. Las cultivos para la fabricacion pueden contener 10.000 l de medios o mas. Los cultivos celulares a gran escala, tales como la fabricacion clfnica de productos terapeuticos proteicos, normalmente se mantienen durante dfas, o incluso semanas, mientras que las celulas producen la/s protefna/s deseada/s. Durante este tiempo, el cultivo se puede complementar con un medio de alimentacion concentrado que contenga componentes, tales como nutrientes y aminoacidos, que se consumen en el transcurso del cultivo. El medio de alimentacion concentrado puede basarse en cualquier formulacion de medios de cultivo celular. Dicho medio de alimentacion concentrado puede contener la mayorfa de los componentes del medio de cultivo celular a, por ejemplo, aproximadamente x5, x6, x7, x8, x9, x10, x12, x14, x16, x20, x30, x50, x100, x200, x400, x600, x800, o incluso aproximadamente x1.000 de su cantidad util normal. Los medios de alimentacion concentrados se suelen usar en procesos de cultivo discontinuos alimentados.
En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular se complementa con "adiciones en el momento de uso", tambien conocidas como adiciones, ingredientes del momento de uso o productos qufmicos del momento de uso, en el transcurso del crecimiento celular o de la produccion de protefnas. Las adiciones en el momento de uso incluyen uno o mas de un factor de crecimiento u otras protefnas, un tampon, una fuente de energfa, una sal, un aminoacido,
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un metal y un quelante. Otras protefnas incluyen transferrina y albumina. Los factores de crecimiento, que incluyen citocinas y quimiocinas, se conocen, en general, en la tecnica, y se sabe que estimulan el crecimiento celular o, en algunos casos, la diferenciacion celular. Un factor de crecimiento suele ser una protefna (por ejemplo, insulina), un peptido pequeno o una hormona esteroidea, tal como estrogeno, DHEA, testosterona y similares. En algunos casos, un factor de crecimiento puede ser un producto qufmico no natural que potencie la proliferacion celular o la produccion de protefnas, tales como, por ejemplo, tetrahidrofolato (THF), metotrexato y similares. Los ejemplos no limitantes de factores de crecimiento de protefnas y peptidos incluyen angiopoyetinas, protefnas morfogeneticas oseas (BMP), factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento epidermico (EGF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor neurotrofico derivado de estirpe celular glial (GDNF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de las colonias de macrofagos de granulocitos (GM-CSF), factor de diferenciacion del crecimiento 9 (GDF9), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento derivado de hepatoma (HDGF), insulina, factor de crecimiento insulfnico (IGF), factor estimulante de la migracion, miostatina (GDF-8), factor de crecimiento nervioso (NGF) y otras neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento transformante alfa (TGF- a), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), agonistas de la via de senalizacion wnt, factor de crecimiento placentario (PIGF), somatotropina bovina fetal (FBS), interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 y similares. En una realizacion, el medio de cultivo celular se complementa con la adicion en el momento de uso del factor de crecimiento insulina. En una realizacion, la concentracion de insulina en los medios, es decir, la cantidad de insulina en los medios de cultivo celular tras la adicion, es de aproximadamente 0,1 pM a 10 pM. Tambien se pueden incluir una o mas adiciones en el momento de uso en la formulacion de los medios de algunas realizaciones.
Los tampones son conocidos en la tecnica en general. La invencion no se limita a uno ni a varios tampones en particular, y cualquier experto habitual en la materia puede seleccionar un tampon o sistema tampon apropiado para su uso con una determinada estirpe celular productora de una protefna en particular. En una realizacion, un tampon de adicion en el momento de uso es NaHCO3. En una realizacion, el tampon de adicion en el momento de uso comprende NaHCO3. En otra realizacion, el tampon es HEPES.
Las fuentes de energfa para su uso como una adicion en el momento de uso en el cultivo celular son bien conocidas en la tecnica. Sin limitacion, en una realizacion, la fuente de energfa de adicion en el momento de uso es glucosa. Dados los requisitos particulares y especfficos de una determinada estirpe celular y la protefna que se vaya a producir, en una realizacion, la glucosa se puede anadir a una concentracion de aproximadamente 1 a 20 mM en el medio. En algunos casos, la glucosa se puede anadir a niveles altos de hasta 10 g/l.
Los quelantes son asimismo bien conocidos en la tecnica de cultivo celular y produccion de protefnas. El EDTA tetrasodico deshidratado y el citrato son dos quelantes comunes usados en la tecnica, aunque, en la practica de la presente invencion, se pueden emplear otros quelantes. En una realizacion, un quelante de adicion en el momento de uso es EDTA tetrasodico dihidratado. En una realizacion, un quelante de adicion en el momento de uso es citrato, tal como Na3C6H5O7.
En una realizacion, el cultivo celular puede ser complementado con uno o mas aminoacidos mediante adicion en el momento de uso, tales como, por ejemplo, glutamina. En una realizacion, los medios de cultivo celular se complementan con la adicion de glutamina en el momento de uso a una concentracion final de aproximadamente 1 mM a 13 mM.
Otras adiciones en el momento de uso incluyen una o mas de diversas sales metalicas, tales como sales de hierro, nfquel, cinc y cobre. En una realizacion, el medio de cultivo celular se complementa con uno o mas de entre sulfato de cobre, sulfato de cinc, cloro ferrico; y sulfato de nfquel.
En una realizacion, el medio de cultivo celular se complementa con una cualquiera o mas, o todas, las siguientes adiciones en el momento de uso: NaHCO3 a aproximadamente 29,8 mM, glutamina aproximadamente 2 mM, insulina aproximadamente 0,86 pM, glucosa aproximadamente 11,1 mM, sulfato de cinc aproximadamente 6,54 pM, sulfato de cobre aproximadamente 0,168 pM, cloruro ferrico aproximadamente 75 pM, sulfato de nfquel aproximadamente 0,639 pM, EDTA aproximadamente 85 pM y citrato aproximadamente 50 pM.
En una realizacion, el medio se complementa a intervalos durante el cultivo celular de acuerdo con un procedimiento de alimentacion discontinua. El cultivo de alimentacion discontinua se conoce en general en la tecnica, y se emplea para optimizar la produccion de protefna (vease Y. M. Huang et al., Biotechnol Prog. Sep-Oct de 2010; 26(5): 140010).
La viabilidad celular, la densidad de celulas viables y la duplicacion celular se mejoran con relacion a las celulas cultivadas en cultivo sin ornitina o putrescina. Con respecto a la viabilidad celular, las celulas cultivadas en medio OS muestran una viabilidad que es al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al

menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al

menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al

menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 99 %, al menos un 100 % o al menos 3 veces superior a la
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viabilidad de celulas similares o identicas cultivadas en medios no OS.
En algunas realizaciones, la velocidad de duplicacion de celulas de mamffero viables en los medios OS es al menos un 5 %, al menos un 6 %, al menos un 7 %, al menos un 8 %, al menos un 9 %, al menos un 10 %, al menos un 11 %, al menos un 12 %, al menos un 13 %, al menos un 14 %, al menos un 15 %, al menos un 16 %, al menos un
17 %, al menos un 18 %, al menos un 19 %, al menos un 20 %, al menos un 21 %, al menos un 22 %, al menos un
23 %, al menos un 24%, al menos un 25 %, al menos un 26 %, al menos un 27 %, al menos un 28 %, al menos un
29%, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45%, al menos un 50 %, al menos un
55 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 % o al menos 3 veces superior a la velocidad de duplicacion de celulas de mamffero cultivadas en medios no OS. En algunas realizaciones, la velocidad de duplicacion de celulas de mamffero viables en los medios OS es aproximadamente un 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 % o 30 % superior a la velocidad de duplicacion de celulas de mamffero de medios no OS.
En algunas realizaciones, el tiempo de duplicacion de celulas de mamffero en ciclo activo es inferior a 30 horas, inferior a 29 horas, inferior a 28 horas, inferior a 27 horas, inferior a 26 horas, inferior a 25 horas, inferior a 24 horas, inferior a 23 horas, inferior a 22 horas, inferior a 21 horas, inferior a 20 horas, inferior a 19 horas o inferior a 18 horas en medios OS. En algunas realizaciones, el tiempo de duplicacion de celulas de mamffero que crecen activamente es inferior a 28 horas en medios OS. En algunas realizaciones, el tiempo de duplicacion de las celulas de mamffero es de aproximadamente 27 ± 1 horas, aproximadamente 26 ± 1 horas, aproximadamente 25 ± 1 horas, aproximadamente 24 ± 1 horas, aproximadamente 23 ± 1 horas, aproximadamente 22 ± 1 horas o aproximadamente 21 ± 1 horas en medios OS. En algunas realizaciones, el tiempo de duplicacion de celulas de mamffero en ciclo activo es de aproximadamente 24 ± 1 horas en medios OS. En algunas realizaciones, el tiempo de duplicacion de celulas que se dividen de forma activa en los medios OS es al menos un 15 %, al menos un 16 %, al menos un 17 %, al menos un 18 %, al menos un 19 %, al menos un 20 % o al menos un 25 % inferior al tiempo de duplicacion de celulas en ciclo activo cultivadas en medios no OS.
PRODUCCION DE PROTEINAS
Ademas de los medios OS definidos qufmicamente y los metodos de cultivo de celulas en medios OS, la presente invencion proporciona metodos de produccion de una protefna, tal como un anticuerpo terapeuticamente eficaz u otra sustancia farmacologica biofarmaceutica, en una celula cultivada en medios Os y como se define en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, la velocidad de produccion de protefna por celulas de mamffero cultivadas en medios OS es al menos un 5 %, 10 %, 15 % o 20 % superior a la velocidad de produccion de la protefna por una celula de mamffero identica cultivada en medios no OS. En algunas realizaciones, la velocidad de produccion de protefna en celulas cultivadas en medio OS es de al menos 1 pg/celula/dfa ("PCD"), al menos 2 PCD, al menos 3 PCD, al menos 4 PCD, al menos 5 PCD, al menos 6 PCD, al menos 7 PCD, al menos 8 PCD, al menos 9 PCD, al menos 10 PCD, al menos 15 PCD, al menos 20 PCD, al menos 25 PCD, al menos 30 PCD, al menos 35 PCD, al menos 40 PCD, al menos 45 PCD, al menos 50 PCD, al menos 75 PCD o al menos 100 PCD.
En algunas realizaciones, el rendimiento de la produccion o tftulo de protefna, que se puede expresar en gramos de producto de protefna por litro de medio de cultivo, de las celulas cultivadas en medios OS es de al menos 100 mg/l, al menos 1 g/l, al menos 1,2 g/l, al menos 1,4 g/l, al menos 1,6 g/l, al menos 1,8 g/l, al menos 2 g/l, al menos 2,5 g/l, al menos 3 g/l, al menos 3,5 g/l, al menos 4 g/l, al menos 4,5 g/l, al menos 5 g/l, al menos 5,5 g/l, al menos 6 g/l, al menos 6,5 g/l, al menos 7 g/l, al menos 7,5 g/l, al menos 8 g/l, al menos 8,5 g/l, al menos 9 g/l, al menos 9,5 g/l, al menos 10 g/l o al menos 20 g/l.
En algunas realizaciones, el producto proteico (la protefna de interes) es un anticuerpo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo multiespecffico, un anticuerpo biespecffico, un fragmento de anticuerpo de union al antfgeno, un anticuerpo monocatenario, un diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo, un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2, un anticuerpo IgD, un anticuerpo IgE, un anticuerpo IgM, un anticuerpo IgG, un anticuerpo IgG1, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG3 o un anticuerpo IgG4. En una realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1. En una realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2. En una realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo IgG4.
En algunas realizaciones, la protefna de interes es una protefna recombinante que contiene una fraccion Fc y otro dominio, (por ejemplo, una protefna de fusion Fc). En algunas realizaciones, una protefna de fusion Fc es una protefna de fusion de receptor y Fc, "Las protefnas de fusion del receptor y Fc" comprenden uno o mas dominios extracelulares de un receptor acoplado a una fraccion Fc. En algunas realizaciones, la fraccion Fc comprende una region bisagra seguida de un dominio CH2 y CH3 de una IgG. En algunas realizaciones, la protefna de fusion de receptor y Fc contiene dos o mas cadenas de receptor distintas que se unen bien a un solo ligando o a multiples ligandos. Por ejemplo, una protefna de fusion Fc es una TRAP, tal como, por ejemplo, una IL-1 TRAP (por ejemplo, rilonacept, que contiene la region de union al ligando IL-1RAcP fusionada a la region extracelular de II-1R1 fusionada a Fc de hlgG1; vease la patente de EE.UU. n.° 6.927.004, o una VEGF TRAP (por ejemplo, aflibercept, que contiene
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el dominio de Ig 2 del receptor Flt1 de VEGF fusionado al dominio de Ig 3 del receptor Flk1 de VEGF fusionado a Fc de hIgG1; Veanse las patentes de EE.UU. n.° 7.087.411 y 7.279.159).
La presente invencion no se limita a ningun tipo particular de celula para la produccion de protefnas. Los ejemplos de tipos de celulas adecuados para la produccion de protefnas incluyen celulas de mamffero, celulas de insecto, celulas aviares, celulas bacterianas y celulas de levadura. Las celulas pueden ser celulas madre o celulas recombinantes transformadas con un vector para la expresion genica recombinante, o celulas transfectadas con un virus para producir productos vfricos. Las celulas pueden contener una construccion de polinucleotido heterologo recombinante codificante de una protefna de interes. Esa construccion puede ser un episoma o puede ser un elemento que este ffsicamente integrado en el genoma de la celula. Las celulas tambien pueden producir una protefna de interes sin tener esa protefna codificada en una construccion polipeptfdica heterologa. En otras palabras, la celula puede codificar de forma natural la protefna de interes, tal como un linfocito B productor de un anticuerpo. Las celulas tambien pueden ser celulas primarias, tales como celulas embrionarias de pollo o estirpes celulares primarias. Los ejemplos de celulas utiles incluyen celulas BSC, celulas LLC-MK, celulas cV-1, celulas COS, celulas VERO, celulas MDBK, celulas MDCK, celulas CRFK, celulas RAF, celulas RK, celulas TCMK-1, celulas LLCPK, celulas PK15, celulas LLC-RK, celulas MDOK, celulas BHK-21, celulas embrionarias de pollo, celulas NS-1, celulas MRC-5, celulas WI-38, celulas BHK, celulas 293, celulas RK, celulas Per.C6 y celulas CHO. En diversas realizaciones, la estirpe celular es un derivado de celulas CHO, tal como las estirpes mutantes CHO-K1, CHO DUX B-11, CHO DG-44, Veggie-CHO, GS-CHO, S-CHO o CHO lec.
En una realizacion, la celula, que es una celula CHO, expresa ectopicamente una protefna. En una realizacion, la protefna comprende una region de cadena pesada de inmunoglobulina, tal como la region CH1, CH2 o CH3. En una realizacion, la protefna comprende una region CH2 y CH3 de inmunoglobulina humana o de roedor. En una realizacion, la protefna comprende una region de CH1, CH2 y CH3 de inmunoglobulina humana o de roedor. En una realizacion, la protefna comprende una region de bisagra y una region CH1, CH2 y CH3. En una realizacion especffica, la protefna comprende un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina. En una realizacion especffica, la protefna comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina. En una realizacion especffica, la protefna comprende un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina. En una realizacion especffica, la protefna es un anticuerpo, tal como un anticuerpo humano, un anticuerpo de roedor o un anticuerpo quimerico humano/de roedor (por ejemplo, humano/de raton, humano/de rata o humano/de hamster).
Una fase de produccion puede realizarse a cualquier escala del cultivo, desde matraces individuales y matraces de agitacion o bolsas de onda, a biorreactores de un litro y a biorreactores industriales a gran escala. Se puede realizar un proceso a gran escala en un volumen de aproximadamente 100 litros a 20.000 litros o mas. Se pueden usar uno o mas de varios medios para controlar la produccion de protefna, tal como el cambio de temperatura o la induccion qufmica. Una fase de crecimiento se puede producir a una temperatura mas alta que una fase de produccion. Por ejemplo, una fase de crecimiento puede producirse a una primera temperatura de aproximadamente 35 °C a 38 °C, y una fase de produccion puede producirse a una segunda temperatura de aproximadamente 29 °C a 37 °C, opcionalmente, de aproximadamente 30 °C a 36 °C o de aproximadamente 30 °C a 34 °C. Ademas, se pueden anadir inductores qufmicos de la produccion de protefnas, tales como cafefna, butirato, tamoxifeno, estrogeno, tetraciclina, doxiciclina y hexametilen-bisacetamida (HMBA), simultaneamente, antes o despues de un cambio de temperatura. Si se anaden inductores despues de un cambio de temperatura, se pueden anadir de una hora a cinco dfas despues del cambio de temperatura, tal como de uno a dos dfas despues del cambio de temperatura. Los cultivos de celulas de produccion pueden realizarse como un sistema de cultivo de alimentacion continua, como en un quimiostato (vease C. Altamirano et al., Biotechnol Prog. nov-dic de 2001; 17(6): 1032-41), o de acuerdo con un proceso de alimentacion discontinua (Huang, 2010).
La invencion es util para mejorar la produccion de protefnas a traves de los procesos de cultivo celular. Las estirpes celulares usadas en la invencion pueden modificarse geneticamente para expresar un polipeptido de interes comercial o cientffico. La ingenierfa genetica de la estirpe celular implica transfectar, transformar o transducir las celulas con una molecula de polinucleotido recombinante, o modificarla de otra manera (por ejemplo, mediante recombinacion homologa y activacion genica, o fusion de una celula recombinante con una celula no recombinante) para hacer que la celula hospedadora exprese un polipeptido recombinante deseado. Los metodos y vectores para disenar geneticamente celulas o estirpes celulares para que expresen un polipeptido de interes son bien conocidos por los expertos en la tecnica; por ejemplo, diversas tecnicas se ilustran en “Current Protocols in Molecular Biology”. Ausubel et al., ed. (Wiley & Sons, Nueva York, 1988, y actualizaciones trimestrales); Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R. J., “Large Scale Mammalian Cell Culture”, 1990, pag. 15-69. Hay una amplia variedad de estirpes celulares adecuadas para el crecimiento en cultivo disponible en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA) y en proveedores comerciales. Los ejemplos de estirpes celulares comunmente usadas en la industria incluyen VERO, BHK, HeLa, CVI (incluyendo Cos), MDCK, 293, 3T3, estirpes celulares de mieloma (por ejemplo, NSO, NSI), PC12, celulas WI38 y celulas de ovario de hamster chino (CHO). Las celulas CHO se usan ampliamente para la produccion de protefnas recombinantes complejas, tales como citocinas, factores de coagulacion y anticuerpos (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al. (1988), J.Biol Chem 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol 6:231-239; Wood et al. (1990), J Immunol. 145:3011-3016). Las estirpes celulares mutantes deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR)
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(Urlaub et al. (1980), Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 77: 4216-4220), DXBI 1 y DG-44, son estirpes de celulas hospedadoras deseables CHO, porque el sistema de expresion genica seleccionable y amplificable eficiente en DHFR permite la expresion de protefnas recombinantes de alto nivel en estas celulas (Kaufman R. J. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). Ademas, estas celulas son faciles de manipular como cultivos adherentes o en suspension, y presentan una estabilidad genetica relativamente buena. Las celulas CHO y las protefnas expresadas de forma recombinante por las mismas se han caracterizado ampliamente y han sido aprobadas para su uso en la fabricacion clfnica y comercial por agencias reguladoras. En algunas realizaciones, las estirpes celulares CHO son estirpes celulares como las descritas en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2010/0304436 A1, 2009/0162901 A1 y 2009/0137416 A1, y las patentes de EE.UU. n.° 7.455.988 B2, 7.435.553 B2 y 7.105.348 B2.
La presente invencion no esta limitada en su alcance por las realizaciones especfficas descritas en el presente documento, que pretenden ser ilustraciones de aspectos o realizaciones individuales de la invencion segun lo definido en las reivindicaciones.
La invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de que la adicion de ornitina o de una combinacion de ornitina y putrescina a medios de cultivo celular sin suero produce un aumento del crecimiento celular, de la viabilidad celular y de la produccion de polipeptido a partir de una estirpe celular animal disenada de forma recombinante (o celula natural) que exprese una protefna de interes, potenciando de este modo la solidez del cultivo, mejorando el rendimiento del polipeptido de interes.
Ejemplo 1: Mejora de la densidad del cultivo celular viable
Se inoculo un matraz de agitacion de 250 ml de un cultivo de siembra de una estirpe celular productora de anticuerpo recombinante derivada de CHO K1. Las celulas inoculadas se cultivaron a 36,5 °C durante siete dfas y se alimentaron con glucosa los dfas tres y cinco. Se cultivaron celulas en cada uno de dos medios separados qufmicamente definidos (sin hidrolizados y sin suero). El primer medio contenfa aminoacidos aproximadamente 75 mM (Medio 1), el segundo medio contenfa aminoacidos aproximadamente 40 mM (Medio 2), y ambas formulaciones contenfan putrescina a no mas de 2,5 pM (0,4 mg/l). Se genero otro grupo de condiciones de medio anadiendo hidrolizado de soja a una concentracion de 7,5 g/l al Medio 2. A cada uno de los tres medios de control, se anadieron ornitina aproximadamente 593 pM (en forma de HCl de L-ornitina a 100 mg/l) o una combinacion de ornitina aproximadamente 593 pM (en forma de HCl de L-ornitina a 100 mg/l) y putrescina aproximadamente 714 pM (en forma de 2HCl de putrescina a 115 mg/l). Se extrajeron alfcuotas de 3 ml de cultivo los dfas 3, 5 y 7, y se realizaron los recuentos de celulas viables usando exclusion con azul de tripano en un instrumento BioProfile FLEX ™ (Nova Biomedical). El dfa cero, todos los cultivos contenfan 0,8 x 106 celulas viables por ml. Para un medio dado (Medio 1, Medio 2 o Medio 2 + Soja), los recuentos de celulas viables durante un perfodo de siete dfas revelaron que las celulas CHO crecidas en medios suplementados con ornitina u ornitina mas putrescina tenfan mayores densidades de celulas viables. El efecto fue especialmente destacado en los medios sin hidrolizado (es decir, aumento de 2 veces a 4 veces o mas en la densidad de celulas viables) durante el perfodo de siete dfas. El Medio 2 OS sin hidrolizados fue comparable al Medio 2 no OS que contenfa soja, lo que indica que el beneficio en el crecimiento celular del hidrolizado de soja puede replicarse mediante el reemplazo de la ornitina. Tambien se observo una mayor densidad celular al anadir ornitina u ornitina y putrescina al Medio 2 + soja. Los resultados se presentan en la tabla 1.
TABLA 1: DENSIDAD MEDIA DE CELULAS VIABLES DEL CULTIVO (106 CELULAS POR MILILITRO) Y AUMENTO CON RESPECTO AL MOMENTO BASAL*
Complemento:
Tiempo Sin complementos Ornitina Ornitina + putrescina
3 dfas 2,4 / x1 6,1 / x2,5 5,0 / x2,1
Medio 1
5 dfas 3,4 / x1 12,6 / x3,7 12,4 / x3,6
7 dfas 3,6 / x1 7,0 / x1,9 6,8 / x1,9
3 dfas 1,7 / x1 5,1 / x3,0 5,2 / x3,1
Medio 2
5 dfas 2,0 / x1 7,6 / x3,8 8,0 / x4,0
7 dfas 1,6 / x1 5,9 / x3,7 5,8 / x3,6
3 dfas 5,2 / x1 5,4 / x1 4,7 / x0,9
Medio 2 + hidrolizado de soja
5 dfas 7,7 / x1 9,3 / x1,2 9,3 / x1,2
7 dfas ND 9,6 / ND 9,1 / ND
*El momento basal es medios sin complementar para una formulacion de medio dada en un dfa dado.
Tambien se examino el efecto de diversas cantidades de HCl de ornitina (es decir, 50 mg/l, 100 mg/l y 150 mg/l) sobre la densidad de celulas viables en el Medio 3, que contiene aminoacidos aproximadamente 75 mM y HCl de putrescina a 0,4 mg/l ("Medio 3"). Se uso un solo cultivo de tren de siembra de una estirpe celular productora de anticuerpos recombinante derivada de CHO K1 para inocular biorreactores TubeSpin® (TPP) de 50 ml a 0,4 x 106 celulas/ml a un volumen de trabajo de 15 ml. Las celulas se cultivaron en una incubadora a 37 °C durante tres dfas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Se extrajeron alfcuotas de 3 ml de cultivo el dfa 3, y se realizaron los recuentos de celulas viables usando exclusion con azul de tripano en un instrumento BioProfile FLEX ™ (Nova Biomedical). Los tres niveles de ornitina mejoraron la densidad celular como media (N = 3) en algo mas del doble. Los resultados se presentan en la Tabla 2.
TABLA 2: DENSIDAD DE CELULAS VIABLES DEL CULTIVO (106 CELULAS POR MILILITRO) Y AUMENTO CON
RESPECTO AL MOMENTO BASAL*
Control HCl de L-ornitina
Concentracion (mg/l)
0 50 100 150
Densidad de celulas viables (106 celulas/ml)
1,3 3,2 3,1 3,1
Aumento frente al control
x1 x2,5 x2,4 x2,4
*El momento basal es el Medio 3 sin complementos.
Ejemplo 2: Mejora del tiempo de duplicacion del cultivo celular
Se determino el tiempo de duplicacion de una estirpe celular productora de anticuerpos recombinante derivada de celulas CHO K1 en fase de crecimiento logarftmico en diversas condiciones de medios de cultivo celular. Se pasaron cultivos de tren de siembra a 36,5 °C en matraces de agitacion de 250 ml durante un perfodo de 14 dfas en cada uno de tres medios separados: Medio 1, Medio 2 y Medio 2 que contenfa hidrolizado de soja (Medio 2 + Soja). Se retiraron alfcuotas de 1 ml de cada condicion en el dfa 0 y en el momento de la pasada del tren de siembra (cada 2 o 3 dfas), y se realizaron los recuentos de las celulas viables usando exclusion con azul tripano en un instrumento CDV™ (Nova Biomedical). El Medio 1 se ensayo sin complementos o complementado con HCl de ornitina a 100 mg/l o tanto 2HCl de putrescina a 115 mg/l como HCl de ornitina a 100 mg/l. El Medio 2 con poco 2HCl de putrescina (0,4 mg/l) se ensayo sin complementos o complementado con HCl de ornitina a 100 mg/l o tanto con 2HCl de putrescina a 115 mg/l como con HCl de ornitina a 100 mg/l. Los resultados se presentan en las Tablas 3 y 4. Se requirio la administracion de complemento de ornitina, con o sin putrescina, al Medio 1 para lograr un crecimiento significativo. La administracion del complemento de ornitina o de ornitina + putrescina al Medio 2 sin hidrolizados disminuyo el tiempo de duplicacion celular en de aproximadamente un 25 % a un 30 %. Los tiempos de duplicacion tambien se redujeron en menor medida con la adicion de ornitina u ornitina + putrescina al Medio 2 que contenfa hidrolizados.
TABLA 3: TIEMPO DE DUPLICACION CELULAR (HORAS) Y PORCENTAJE APROXIMADO DE REDUCCION DEL TIEMPO DE DUPLICACION CON RESPECTO AL MOMENTO BASAL* EN EL MEDIO 1
Complemento
Medio 1
*Ninguno
75
Ornitina
23 69 %
Putrescina + ornitina
21 72 %
*El momento basal es el Medio 1 sin complementos.
TABLA 4: TIEMPO DE DUPLICACION CELULAR (HORAS) Y PORCENTAJE APROXIMADO DE REDUCCION DEL TIEMPO DE DUPLICACION CON RESPECTO AL MOMENTO BASAL* EN EL MEDIO 2
Complemento
Medio 2 Medio 2 + soja
*Sin complementos
27 22,5
Ornitina
21 22 % 20,5 8,9 %
Putrescina + ornitina
19,5 28 % 21 6,7 %
*El momento basal es el Medio 2 sin complementos.
Ejemplo 3: Mejora de los tftulos de anticuerpos
Habiendose establecido que la inclusion de ornitina u ornitina + putrescina mejora la proliferacion celular y la densidad de las celulas viables en cultivo, se investigo ademas el efecto de esas condiciones en los tftulos de produccion de protefnas recombinantes. Se examino la expresion y secrecion de IgG recombinante por una estirpe celular derivada de CHO-K1. En este experimento, el tftulo medio de anticuerpos se determino el dfa siete en cultivo en diversos formatos de medios. Al igual que en el caso anterior, Se ensayaron el Medio 1 con bajo contenido de putrescina (2HCl de putrescina a 0,4 mg/l), con ornitina (HCl de ornitina a 100 mg/l, y tanto con ornitina como con putrescina (HCl de ornitina a 100 mg/l/2HCl de putrescina a 115 mg/l). Tambien se ensayaron el Medio 2 y el Medio 2 + soja con bajo contenido de putrescina (2HCl de putrescina a 0,4 mg/l) con ornitina (HCl de ornitina a 100 mg/l), y tanto con ornitina como con putrescina (HCl de ornitina a 100 mg/l/2HCl de putrescina a 115 mg/l). En todos los casos, la inclusion de ornitina u ornitina y putrescina a un nivel superior a 0,4 mg/l produjo un tftulo de protefna significativamente mayor, es decir, tftulos de al menos aproximadamente el doble. Los resultados se presentan en la Tabla 5.
TABLA 5: TITULOS MEDIOS DE ANTICUERPOS DE SIETE DIAS Y AUMENTO APROXIMADO (X) EN EL TITULO
CON RESPECTO AL MOMENTO BASAL*
Complemento
Medio 1 Medio 2 Medio 2 + soja
Sin complementos*
0,31 g/l x1 0,29 g/l x1 0,54 g/l x1
Ornitina
0,94 g/l x3,0 0,65 g/l x2,2 0,98 g/l x1,8
Putrescina + ornitina
0,95 g/l x3,1 0,64 g/l x2,2 1,07 g/l x2
*El momento basal se establece en el tftulo para los medios sin complementos de cada tipo.
Tambien se examino el efecto de diversas cantidades de HCl de ornitina (es decir, 50 mg/l, 100 mg/l y 150 mg/l) en 5 el Medio 3 sobre la produccion de anticuerpos. Se uso un solo cultivo de tren de siembra de una estirpe celular productora de anticuerpos recombinante derivada de CHO K1 para sembrar biorreactores TubeSpin® (TPP) de 50 ml a 0,4 x 106 celulas/ml a un volumen de trabajo de 15 ml. Las celulas se cultivaron en una incubadora a 37 °C durante tres dfas. Los tres niveles de complementos de ornitina mejoraron el tftulo de anticuerpos como media (N = 3) en algo mas del 50 %. Los resultados se presentan en la Tabla 6.
10
TABLA 6: TITULOS DE ANTICUERPOS (GRAMOS POR LITRO) Y AUMENTO EN EL TITULO FRENTE AL
MOMENTO BASAL*
Control HCl de ornitina
Concentracion de complemento (mg/l)
0 50 100 150
Tftulo de anticuerpos (g/l)
79 120 127 124
Aumento frente al control
x1 x1,5 x1,6 x1,6
*El momento basal es el Medio 3 sin complementos.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un medio de cultivo celular, que es sin suero, que comprende ornitina > 0,09 mM ± 0,014 mM y putrescina > 0,20 ± 0,03 mM.
  2. 2. El medio de cultivo celular de la reivindicacion 1 que comprende ornitina 0,3 ± 0,05 mM a 0,9 ± 0,14 mM.
  3. 3. El medio de cultivo celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que comprende:
    (a) ornitina a 0,6 ± 0,09 mM; y/o
    (b) putrescina a 0,714 ± 0,11 mM.
  4. 4. El medio de cultivo celular de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
    (a) el medio es sin hidrolizados o esta qufmicamente definido;
    (b) el medio comprende > 40 ± 6 mM de una mezcla de aminoacidos o sales de los mismos, preferentemente, en el que la mezcla de aminoacidos consiste en alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistefna, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina;
    (c) el medio comprende uno o mas acidos grasos, preferentemente, en el que el uno o mas acidos grasos se seleccionan del grupo que consiste en acido linoleico, acido linolenico, acido tioctico, acido oleico, acido palmftico, acido estearico, acido araqufdico, acido araquidonico, acido laurico, acido behenico, acido decanoico, acido dodecanoico, acido hexanoico, acido lignocerico, acido mirfstico y acido octanoico;
    (d) el medio comprende una mezcla de nucleosidos, preferentemente, en el que la mezcla de nucleosidos comprende uno o mas de adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina;
    (e) el medio comprende adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina;
    (f) el medio comprende uno o mas cationes divalentes, preferentemente, en el que el cation divalente es magnesio, calcio o ambos; y/o
    (g) el medio de cultivo comprende Ca2+ y Mg2+.
  5. 5. Un metodo para cultivar celulas, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo celular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores; y (b) propagar o mantener una celula en el medio de cultivo celular para formar un cultivo celular.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que:
    (a) la celula se selecciona del grupo que consiste en una celula de mamffero, celula aviar, celula de insecto, celula bacteriana y celula de levadura, preferentemente, en el que la celula es una celula CHO; y/o
    (b) la celula expresa una protefna de interes.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que la celula expresa una protefna de interes, en el que:
    (a) la protefna de interes es una protefna de union a antfgeno;
    (b) la protefna de interes comprende un dominio Fc; y/o
    (c) la protefna de interes es una protefna de fusion de receptor-Fc, preferentemente, en el que la protefna de fusion de receptor-Fc es una protefna Trap.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que la protefna de interes es una protefna de fusion de receptor-Fc que es una protefna Trap, en el que la protefna Trap es un antagonista de IL-1 o un antagonista de VEGF.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 6, en el que la protefna de interes es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, preferentemente, en el que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo.
  10. 10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que:
    (a) las celulas tienen un tiempo medio de duplicacion de < 30 horas;
    (b) las celulas tienen un tiempo medio de duplicacion de < 24 horas;
    (c) las celulas tienen un tiempo medio de duplicacion que es al menos un tercio del de las celulas cultivadas en un medio de cultivo celular que contiene ornitina < 0,3 ± 0,045 mM y putrescina < 0,2 ± 0,03 mM;
    (d) el cultivo celular es capaz de alcanzar una densidad de recuento de celulas viables que es al menos un 15 % superior a la de un cultivo celular similar en un medio que contiene ornitina < 0,09 ± 0,014 mM y putrescina < 0,2 ± 0,03 mM;
    (e) el cultivo celular es capaz de alcanzar una densidad de recuento de celulas viables que es al menos 3 veces superior a la de un cultivo celular similar en un medio de cultivo celular similar que contiene ornitina < 0,09 ± 0,014 mM y putrescina < 0,2 ± 0,03 mM; y/o
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    (f) el metodo que comprende la etapa de anadir una o mas adiciones en el momento de uso al medio de cultivo celular, preferentemente, en el que las adiciones en el momento de uso comprenden una de mas de NaHCO3, glutamina, insulina, glucosa, CuSO4, ZnSO4, FeCb, NiSO4, EDTA de Na4 y citrato de Na3 y/o cada uno de NaHCO3, glutamina, insulina, glucosa, CuSO4, ZnSO4, FeCb, NiSO4, EDTA de Na4 y citrato de Na3 se anaden al medio como adiciones en el momento de uso.
  11. 11. Un metodo de produccion de una protefna que comprende las etapas de:
    (a) introducir, en una celula, un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica una protefna de interes;
    (b) seleccionar una celula que porte el acido nucleico;
    (c) cultivar la celula seleccionada en un medio de cultivo celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o de acuerdo con el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 5-10; y
    (d) expresar la protefna de interes en la celula, de modo que la protefna de interes se secrete en el medio.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en el que la celula es una celula CHO, celula 293 o celula BHK.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 11 o 12, en el que:
    (a) la protefna de interes es una protefna de union a antfgeno;
    (b) la protefna de interes comprende un dominio Fc; y/o
    (c) la protefna de interes se selecciona del grupo que consiste en protefna de fusion de receptor-Fc (TRAP), protefna de fusion de TCR-Fc soluble, anticuerpo, protefna de fusion Fc y protefna ScFv.
  14. 14. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que:
    (a) la protefna de interes se produce a un tftulo medio de 7 dfas que es al menos un 7 % superior al tftulo medio de 7 dfas producido por una celula similar en un medio de cultivo celular que contiene ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM y putrescina a menos de 0,2 ± 0,03 mM;
    (b) la protefna de interes se produce a un tftulo medio de 7 dfas que es al menos un 14 % superior al tftulo medio de 7 dfas producido por una celula similar en un medio de cultivo celular que contiene ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM y putrescina a menos de 0,2 ± 0,03 mM;
    (c) la protefna de interes se produce a un tftulo medio de 7 dfas que es al menos un 80 % superior al tftulo medio de 7 dfas producido por una celula similar en un medio de cultivo celular que contiene ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM y putrescina a menos de 0,2 ± 0,03 mM;
    (d) la protefna de interes se produce a un tftulo medio de 7 dfas que es al menos 2 veces superior al tftulo medio de 7 dfas producido por una celula similar en un medio de cultivo celular que contiene ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM y putrescina a menos de 0,2 ± 0,03 mM; y/o
    (e) la protefna de interes se produce a un tftulo medio de 7 dfas que es al menos 3 veces superior al tftulo medio de 7 dfas producido por una celula similar en un medio de cultivo celular que contiene ornitina a menos de 0,09 ± 0,014 mM y putrescina a menos de 0,2 ± 0,03 mM.
  15. 15. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que la protefna de interes es un anticuerpo humano recombinante.
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