EA044302B1 - Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток - Google Patents
Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток Download PDFInfo
- Publication number
- EA044302B1 EA044302B1 EA202191602 EA044302B1 EA 044302 B1 EA044302 B1 EA 044302B1 EA 202191602 EA202191602 EA 202191602 EA 044302 B1 EA044302 B1 EA 044302B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- ornithine
- cells
- putrescine
- acid
- medium
- Prior art date
Links
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 title claims description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 185
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 169
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 122
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 122
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 122
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 claims description 122
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 92
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 claims description 84
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 74
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 73
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 62
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 62
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 35
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 25
- GGTYBZJRPHEQDG-WCCKRBBISA-N (2s)-2,5-diaminopentanoic acid hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC[C@H](N)C(O)=O GGTYBZJRPHEQDG-WCCKRBBISA-N 0.000 claims description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 21
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 15
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical class O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 13
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 13
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 12
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 11
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 11
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 11
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 10
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 10
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 9
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 8
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 7
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 7
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 7
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 7
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 7
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 7
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 7
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 7
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 6
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 6
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N docosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 6
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 6
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 claims description 6
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 6
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229940033355 lauric acid Drugs 0.000 claims description 6
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 6
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 claims description 6
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 6
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims description 6
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 claims description 6
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 6
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 6
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 6
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 6
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 4
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 claims description 4
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 claims description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 claims description 3
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000021357 Behenic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 claims description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 3
- 235000021353 Lignoceric acid Nutrition 0.000 claims description 3
- CQXMAMUUWHYSIY-UHFFFAOYSA-N Lignoceric acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCC1=CC=C(O)C=C1 CQXMAMUUWHYSIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 claims description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 108010081667 aflibercept Proteins 0.000 claims description 3
- 229960002833 aflibercept Drugs 0.000 claims description 3
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 claims description 3
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940116226 behenic acid Drugs 0.000 claims description 3
- GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N benzyl(trichloro)silane Chemical compound Cl[Si](Cl)(Cl)CC1=CC=CC=C1 GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FARYTWBWLZAXNK-WAYWQWQTSA-N ethyl (z)-3-(methylamino)but-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)\C=C(\C)NC FARYTWBWLZAXNK-WAYWQWQTSA-N 0.000 claims description 3
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 claims description 3
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N n-hexanoic acid Natural products CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 3
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 claims description 3
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 claims description 3
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 2
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 2
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 claims 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 claims 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 229960002969 oleic acid Drugs 0.000 claims 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims 1
- 229940098695 palmitic acid Drugs 0.000 claims 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims 1
- 229960004274 stearic acid Drugs 0.000 claims 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 25
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 21
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 21
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 20
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 14
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 14
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 14
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 14
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 14
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 13
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 12
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 9
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 9
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 8
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 8
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 239000006887 os medium Substances 0.000 description 8
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 8
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 7
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 7
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 7
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 7
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 7
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 7
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 7
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 7
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 7
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 7
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 7
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 7
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 6
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 6
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 6
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 6
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 6
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 6
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 6
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 6
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 5
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 5
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 5
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 5
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 4
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 4
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 4
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 3
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 3
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 3
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940053200 antiepileptics fatty acid derivative Drugs 0.000 description 3
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 3
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 3
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 3
- 229940083251 peripheral vasodilators purine derivative Drugs 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 3
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 3
- 229940083082 pyrimidine derivative acting on arteriolar smooth muscle Drugs 0.000 description 3
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 3
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 3
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 3
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 3
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 3
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 3
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 102000004858 Growth differentiation factor-9 Human genes 0.000 description 2
- 108090001086 Growth differentiation factor-9 Proteins 0.000 description 2
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100031000 Hepatoma-derived growth factor Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000044594 Interleukin-1 Receptor Accessory Human genes 0.000 description 2
- 101710180389 Interleukin-1 receptor accessory protein Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 2
- BNQSTAOJRULKNX-UHFFFAOYSA-N N-(6-acetamidohexyl)acetamide Chemical compound CC(=O)NCCCCCCNC(C)=O BNQSTAOJRULKNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000080590 Niso Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 2
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 2
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 102000016548 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- -1 amino acid salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 229940126587 biotherapeutics Drugs 0.000 description 2
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 2
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 2
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 2
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- 108010052188 hepatoma-derived growth factor Proteins 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L nickel sulfate Chemical compound [Ni+2].[O-]S([O-])(=O)=O LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000363 nickel(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 2
- 230000000065 osmolyte Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108010046141 rilonacept Proteins 0.000 description 2
- 229960001886 rilonacept Drugs 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 2
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 108010046845 tryptones Proteins 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 2
- QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LIVAPJSLWQXLJZ-RIOAMYLKSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid;(2s)-2-[[4-[(2-amino-4-oxo-1h-pteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21.C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 LIVAPJSLWQXLJZ-RIOAMYLKSA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000009840 Angiopoietins Human genes 0.000 description 1
- 108010009906 Angiopoietins Proteins 0.000 description 1
- KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N Arginine hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 235000001815 DL-alpha-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011627 DL-alpha-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N Isocaffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N(C)C=N2 LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005237 Isophane Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081368 Isophane Insulin Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N L-cysteine hydrochloride Chemical compound Cl.SC[C@H](N)C(O)=O IFQSXNOEEPCSLW-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 description 1
- VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N caffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1C=CN2C VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 150000001879 copper Chemical class 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N dehydroepiandrosterone Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 229960004232 linoleic acid Drugs 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005036 potential barrier Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Изобретение относится к средам для культивирования клеток и для получения рекомбинантных белков. Изобретение конкретно относится к не содержащим сыворотки средам для культивирования рекомбинантных клеток СНО для получения белковых биотерапевтических средств.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Среды для культивирования клеток, содержащие компоненты сыворотки или гидролизата белков (т.е., пептоны и триптоны) имеют длительную историю применения в получении рекомбинантных белков из культивируемых клеток. Эти компоненты содержат факторы роста и широкий спектр других неохарактеризованных элементов, благоприятных для роста и культуры клеток. Однако они также содержат ^охарактеризованные элементы, которые уменьшают рост или иным образом отрицательно воздействуют на продукцию рекомбинантного белка. Они также могут являться нежелательным потенциальным источником вариабельности. Несмотря на их недостатки, преимущества использования сывороток и гидролизатов перевешивают определенные недостатки и их широко использовали во многих применениях культур клеток.
Как правило, биологические терапевтические средства (биофармацевтические средства) для человека получают в культурах клеток млекопитающих, в частности в культуре клеток СНО. Присутствие неохарактеризованных или частично охарактеризованных компонентов в этих культурах клеток для получения биофармацевтических средств для применения для человека крайне нежелательно. Использование таких неохарактеризованных или частично охарактеризованных компонентов не только вносит производственные и нормативные несоответствия, но и повышает возможность вирусной или грибковой инфекции продуцирующей культуры.
Другим важным фактором при выборе с культивирования является снижение вариабельности состава и выхода лекарственного продукта от партии к партии. Сыворотки, гидролизаты и другие неопределенные элементы вносят вариабельность в выход, состав и качество партии биофармацевтических препаратов. Качество и чистота элементов среды также может влиять на выход, так как титры лекарственных средств часто частично зависят от поддержания конкретного баланса питательных веществ. Когда относительные количества питательных веществ варьируют от одной партии среды к другой, выход лекарственного средства может варьировать и эта вариабельность может являться неприемлемой или невыгодной.
Использование сред, содержащих сыворотку, или сред на основе гидролизатов вносит трудности в дальнейшую переработку. Концентрация желаемого биофармацевтического средства в культуре, как правило, составляет порядка нескольких грамм на литр. Присутствие сыворотки и гидролизатов в средах может добавлять более 10 г/л неохарактеризованных пептидов и белков, которые необходимо удалить на последующих этапах обработки. Также сыворотка и гидролизаты могут вносить вариабельность в количество металлов и других микроэлементах в средах. Таким образом, удаление сыворотки и гидролизатов из сред для культивирования устраняет эти вариации и потенциальные препятствия для получения и обработки лекарственного вещества.
Наряду с другими преимущества использования не содержащих сывороток и гидролизатов сред включают снижение стоимости, снижение вариабельности между партиями лекарственных средств и минимизация риска внесения непредусмотренных средств из неопределенных и неочищенных компонентов. Кроме того, когда среды при запуске разных партий являются определенными и одинаковыми, подобным образом можно минимизировать оценочные запуски для тестирования новых партий сред по отношению к используемым средам. Таким образом, в данной области существует необходимость в средах для культивирования клеток млекопитающих, где среды являются химически определенными и не содержат сывороток и гидролизатов, или среды не содержат сывороток и содержат низкие контролируемые уровни гидролизатов, и при этом обеспечивают значительный и активный рост и поддержание клеток и продукцию биофармацевтических лекарственных веществ с высокими титрами.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Авторы изобретения сделали неожиданное открытие, что добавление орнитина, с путресцином или без, в среды для культивирования клеток, которые не содержат сыворотки (OS среды) увеличивает жизнеспособность и плотность клеток, уменьшает время удвоения клеток и обеспечивает продукцию белка этими клетками с высокими титрами. Авторы изобретения также выявили, что OS среды, которые содержат низкие или следовые количества белковых гидролизатов или химически определены (например, не содержат белковых гидролизатов), в частности обеспечивают жизнеспособность и плотность восстановленных клеток, время удвоения клеток и продукцию белка с высоким титром.
В одном из аспектов изобретение относится к среде для культивирования клеток, которая не содержит сыворотки и содержит по меньшей мере 0,09±0,014 мМ орнитина. В одном из вариантов осуществления орнитин присутствует в среде в концентрации в диапазоне от 0,09±0,014 мМ до 0,9±0,14 мМ, такой как 0,09±0,014 мМ, 0,3±0,05 мМ, 0,6±0,09 мМ или 0,9±0,14 мМ орнитина. В определенных вариантах осуществления среда также содержит по меньшей мере 0,20±0,03 мМ путресцина. В определенных вариантах осуществления дополнительный путресцин содержится в концентрации в диапазоне от 0,20±0,03 мМ
- 1 044302 до 0,714±0,11 мМ, такой как 0,20±0,03 мМ, 0,35±0,06 или 0,714±0,11 мМ путресцина. В определенных вариантах осуществления среда содержит <7,5 г/л гидролизата. В определенных вариантах осуществления среда не содержит никакого гидролизата.
В одном из вариантов осуществления среда содержит основную среду, которая химически определена, такую как самостоятельно разработанный состав или коммерчески доступная основная среда. В одном из вариантов осуществления полная среда является химически определенной, не содержащей сыворотки и не содержащей гидролизата.
В определенных вариантах осуществления среда, которая находится в ее пригодной концентрации (например, 1 х), содержит по меньшей мере 40±6 мМ или по меньшей мере 70±10,5 мМ смеси аминокислот или солей аминокислот. В одном из вариантов осуществления среда содержит по меньшей мере 40 мМ смеси аминокислот. В этом или другом варианте осуществления среда содержит по меньшей мере 70 мМ смеси аминокислот. В одном из вариантов осуществления смесь аминокислот (с заметным исключением глутамина, который можно добавлять обратно в среду в качестве добавки в момент использования) содержит аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин.
В определенных вариантах осуществления среда содержит одну или несколько жирных кислот. В одном конкретном варианте осуществления среда содержит смесь жирных кислот (или производных жирных кислот) и альфа-токоферол. Жирные кислоты или производные жирных кислот выбраны из группы, состоящей из линолевой кислоты, линоленовой кислоты, липоевой кислоты, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, арахидиновой кислоты, кислоты, лауриновой кислоты, бегеновой кислоты, каприловой кислоты, лауриновой кислоты, гексановой кислоты, лигноцериновой кислоты, миристиновой кислоты, и октановой кислоты.
В определенных вариантах осуществления среда содержит смесь нуклеозидов. В одном из вариантов осуществления среда содержит аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин.
В определенных вариантах осуществления среда содержит смесь солей. Соли включают двухвалентные катионы, такие как кальций и магний. В одном из вариантов осуществления среда содержит хлорид кальция и сульфат магния. Другие соли могут включать соли фосфата.
В конкретном варианте осуществления среда (1) содержит <7,5 г/л гидролизата, (2) не содержит сыворотки, (3) содержит 0,09±0,014 мМ, 0,3±0,05 мМ, 0,6±0,09 мМ или 0,9±0,14 мМ орнитина, (4) необязательно дополнительно содержит 0,20±0,03 мМ, 0,35±0,06 или 0,714±0,11 мМ путресцина, (5) содержит по меньшей мере приблизительно 40 мМ или по меньшей мере приблизительно 70 мМ смеси аминокислот, включая аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин, (6) содержит токоферол и смесь жирных кислот, (7) содержит смесь нуклеозидов, включая аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин и (8) содержит соли кальция, магния и фосфата.
В другом аспекте изобретение относится к способу культивирования клеток в среде для культивирования клеток, такой как любой вариант осуществления среды, описанный в указанном выше аспекте. В одном из вариантов осуществления в способе используют этапы размножения или поддержания клетки или клеток в среде, которая (1) содержит <7,5 г/л гидролизата или не содержит гидролизата, (2) не содержит сыворотки, (3) содержит орнитин в концентрации по меньшей мере 0,09±0,014 мМ, (4) и необязательно содержит путресцин, например, по меньшей мере 0,20±0,03 мМ.
В определенных вариантах осуществления клетка или клетки представляют собой клетки млекопитающих, клетки птиц, клетки насекомых, клетки дрожжей или клетки бактерий. В одном из вариантов осуществления клетки представляют собой клетки млекопитающих, пригодные для получения рекомбинантных белков, такие как клетки СНО или производные СНО-К1. В определенных вариантах осуществления клетки экспрессируют представляющий интерес белок, такой как биотерапевтический белок. Биотерапевтический белок может представлять собой антигенсвязывающий белок, который может содержать Fc-домен. В определенных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой слитый белок рецептор-Fc, такой как молекула scFv или молекула-ловушка. Молекулы-ловушки включают белки ловушки VEGF и ловушки IL-1. В определенных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой антитело, такое как гуманизированное моноклональное антитело, биспецифическое антитело или фрагмент антитела.
Принимая во внимание положительное действие на рост клеток добавления в не содержащие сыворотки среды орнитина или комбинации орнитина и путресцина, время удвоения клеток, культивируемых этим способом, составляет не более 30 ч. В одном из вариантов осуществления время удвоения клеток составляет не более 24 ч. В одном из вариантов осуществления при сравнении роста клеток в средах, которые содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина (или менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина), время удвоения при росте клеток по этому способу составляет по меньшей мере одну треть от времени удвоения сравниваемой контрольной культуры.
- 2 044302
Подобным образом, добавление орнитина, отдельно или комбинации орнитина и путресцина, в не содержащие сыворотки среды позволяет культивируемым клеткам достигать более высокой плотности количества жизнеспособных клеток, чем без добавления орнитина или комбинации орнитина и путресцина. В одном из вариантов осуществления не содержащей сыворотки и не содержащей гидролизата OS среды культура клеток способна достигать плотности количества жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере на 15% выше, чем у сходной культуры клеток в сходной среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина (или менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина). В другом варианте осуществления не содержащей сыворотки и не содержащей гидролизата OS среды культура клеток способна достигать плотности количества жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере в 3 раза выше, чем у сходной культуры клеток в сходной среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина (или менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина).
В другом варианте осуществления способ включает этап добавления в среду для культивирования клеток одной или нескольких добавок в момент использования. В определенных вариантах осуществления добавка в момент использования представляет собой любое одно или несколько из NaHCO3, глутамина, инсулина, глюкозы, CuSO4, ZnSO4, FeCl3, NiSO4, Na4 ЭДТА и цитрата Na3. В одном из вариантов осуществления в способе используют этап добавления каждого из приведенных ниже химических веществ, добавляемых в момент использования в среду для культивирования клеток: NaHCO3, глутамин, инсулин, глюкоза, CuSO4, ZnSO4, FeCl3, NiSO4, Na4 ЭДТА и цитрат Na3. В определенных вариантах осуществления добавки в момент использования можно добавлять в среду изначально.
В конкретном варианте осуществления, в одном из аспектов предоставлен способ культивирования клеток в не содержащей сыворотки среде, которая содержит (1) орнитин в любой концентрации из 0,09±0,014 мМ, 0,3±0,05 мМ, 0,6±0,09 мМ или 0,9±0,14 мМ в среде для культивирования клеток; (2) необязательно дополнительно путресцин в любой концентрации из 0,20±0,03 мМ, 0,35±0,06 или О,714±О,11 мМ; (3) по меньшей мере приблизительно 40 мМ или по меньшей мере приблизительно 70 мМ смеси аминокислот, содержащей аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин; (4) токоферол и смесь жирных кислот; (6) смесь нуклеозидов, содержащую аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин, и (9) соли кальция, магния и фосфата, где среднее время удвоения клеток, культивируемых этим способом, составляет не более 24 ч или по меньшей мере одну треть время удвоения сравниваемой контрольной культуры; и культивируемые клетки способны к достижению плотность количества жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере на 15% выше или по меньшей мере в 3 раза выше, чем у сходной культуры клеток в сходной среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,015 мМ орнитина (или менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина). В другом варианте осуществления культура клеток способна достигать плотности количества жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере в 3 раза выше, чем у сходной культуры клеток в сходной среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина (или менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина). В одном из вариантов осуществления среда содержит <7,5 г/л гидролизата; а в другом варианте осуществления не содержит гидролизатов.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения представляющего интерес белка с использованием этапов (1) введения в клетку последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющей интерес белок; (2) отбора клеток, несущих эту последовательность нуклеиновой кислоты; (3) культивирования отобранных клеток в одном из вариантов осуществления не содержащей сыворотки среда для культивирования клеток, описанной в первом аспекте или по любому варианту осуществления способа, описанного во втором аспекте; и (4) экспрессия представляющего интерес белка в клетках, где представляющий интерес белок секретируется в среду. В определенных вариантах осуществления клетки, используемые для получения белка, представляют собой клетки млекопитающих, способные к продукции биотерапевтического средства, такие как клетки СНО, 293 и BHK или любое их производное. В одном из вариантов осуществления клетки представляют собой клетки СНО, такие как клетки СНО-К1.
В определенных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой антигенсвязывающий белок. В определенных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой белок, содержащий Fc-домен. В некоторых случаях, эти два представляющих интерес белка могут перекрываться, например, так как в случае слитого белка рецептор-Fc, антитела и белка ScFv. Таким образом, в определенных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой антитело, такое как антитело человека или гуманизированное антитело, фрагмент антитела, такой как Fab или F(ab')2, биспецифическое антитело, молекула-ловушка, такая как ловушка VEGF или ловушка IL-1, молекула ScFv, слитый белок растворимого TCR-Fc или т.п.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок способен продуцироваться при среднем семидневном титре, который по меньшей мере на 7% выше, по меньшей мере на 14% выше, по меньшей мере на 80% выше, по меньшей мере в два раза выше или по меньшей мере в три раза выше,
- 3 044302 чем средний семидневный титр, получаемый у сходных клеток в не содержащей сыворотки среде для культивирования клеток, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина (или менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцин) (не OS среды).
В конкретном варианте осуществления представляющий интерес белок продуцируют посредством (1) введения в клетку СНО последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес белок, такой как антитело или другой антигенсвязывающий белок; (2) отбора клеток, несущих эту последовательность нуклеиновой кислоты; (3) культивирования отобранных клеток в не содержащей сыворотки среде для культивирования клеток, которая содержит (а) орнитин в любой концентрации из 0,09±0,014, 0,3±0,05 мМ, 0,6±0,09 мМ или 0,9±0,14 мМ; (b) необязательно дополнительно путресцин в любой концентрации из 0,20±0,03 мМ, 0,35±0,06 или 0,714±0,11 мМ; (с) по меньшей мере 40 мМ или по меньшей мере 70 мМ смеси аминокислот, содержащей: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин; (d) токоферол и смесь жирных кислот; (е) смесь нуклеозидов, содержащую аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин, и (f) соли кальция, магния и фосфата; и (d) экспрессии представляющего интерес белка в клетках СНО, где представляющий интерес белок секретируется в среду. В определенных вариантах осуществления не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток может содержать <7,5 г/л гидролизатов или в других вариантах осуществления вообще не содержать гидролизатов.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Заявители сделали неожиданное открытие, что добавление орнитина или комбинации орнитина и путресцина (OS среда) улучшает плотность жизнеспособных клеток, время удвоения клеток и продукцию белка клетками в культуре клеток относительно не содержащей сыворотки среды, которая содержит очень мало или не содержит орнитина или очень мало или не содержит комбинации орнитина и путресцина (не OS среда).
Перед описанием культур клеток и способов по настоящему изобретению, следует понять, что это изобретение не ограничено описанными конкретными способами и экспериментальными условия, так как такие способы и условия могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, которое обычно понимает специалист в области, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем изобретении, далее описаны определенные конкретные способы и материалы. Единицы, префиксы и символы могут быть указаны в их принятых в СИ формах. Числовые диапазоны, указываемые в настоящем документе, являются открытыми, что означает, что они включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иначе, формы единственного числа следует понимать, как означающие по меньшей мере один из. Заглавия разделов, используемые в настоящем документе, предназначены только для организационных целей, и их не следует рассматривать, как ограничивающие описанный объект изобретения. Способы и указания, описываемые в настоящем документе, как правило, осуществляют общепринятыми известными в данной области способами и как описано в различных общих и более специализированных ссылках, которые цитированы и описаны на всем протяжении настоящего описания, если не указано иначе. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001), и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), и Julio E. Celis, Cell Biology: A Laboratory Handbook, 2nd ed., Academic Press, New York, N.Y. (1998) и Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1995). Все публикации, указанные на всем протяжении этого описания, полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.
Определения
Как используют в настоящем документе пептид, полипептид и белок на всем протяжении описания используют взаимозаменяемо, и они означают молекулу, содержащую два или более аминокислотных остатка, связанные друг с другом пептидной связью. Пептиды, полипептиды и белки также могут включать модификации, такие как гликозилирование, присоединение липидов, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, алкилирование, гидроксилирование и АДФрибозилирование. Пептиды, полипептиды и белки могут представлять научный или коммерческий интерес, включая основанные на белках лекарственные средства. В частности, пептиды, полипептиды и белки включают антитела и химерные или слитые белки. Пептиды, полипептиды и белки получают посредством рекомбинантных линий клеток животных с использованием способов культивирования клеток.
Как используют в настоящем документе, термин гетерологичная полинуклеотидная последова- 4 044302 тельность относится к полимерам нуклеиновых кислот, кодирующих представляющие интерес белки, такие как химерные белки (такие как молекулы-ловушки), антитела или части антител (например, VH, VL, CDR3), которые получают в качестве биофармацевтического лекарственного вещества. Гетерологичную полинуклеотидную последовательность (например, такую как последовательность, кодирующую химерный белок или последовательность с оптимизированными кодонами, не содержащая интронов последовательность и т.д.) можно получать способами генетической инженерии и вводить в клетку, где она может находиться в качестве эписомы или интегрироваться в геном клетки. Гетерологичная полинуклеотидная последовательность может представлять собой природную последовательность, которую вводят в эктопическую область в геноме продуцирующей клетки. Гетерологичная полипептидная последовательность может представлять собой природную последовательность другого организма, такую как последовательность, кодирующая ортолог человека.
Антитело относится к молекуле иммуноглобулина, состоящей из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, связанных между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена (CL). Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), чередуемыми с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Термин антитело включает указание на гликозилированные и негликозилированные иммуноглобулины любого изотипа или подкласса. Термин антитело включает молекулы антител, получаемые, экспрессируемые, производимые или выделяемые рекомбинантными способами, такие как антитела, выделяемые из клеток-хозяев, трансфицированных для экспрессии антитела. Термин антитело также включает биспецифическое антитело, которое включает гетеротетрамерный иммуноглобулин, который может связываться более чем с одним различными эпитопами.
Биспецифические антитела в основном описаны в публикации патентной заявки США № 2010/0331527, которая включена в настоящее изобретение в качестве ссылки.
Термин антигенсвязывающая часть антитела (или фрагмент антитела) относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию антигена. Примеры связывающих фрагментов, включаемых в термин антигенсвязывающая часть антитела, включают (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), который состоит из домена VH, (vi) выделенная CDR и (vii) scFv, который состоит из двух доменов фрагмента Fv, VL и VH, соединенных синтетическим линкером с формированием одной белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с формированием одновалентных молекул. В термин антитела также включены другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела (см. например, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).
Кроме того, антитело или его антигенсвязывающая часть могут быть частью более крупной молекулы иммуноадгезии, формируемой посредством ковалентной или нековалентной ассоциации антитела или части антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают использование области сердцевины стрептавидина с получением тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки с получением двухвалентной и биотинилированной молекулы scFv (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Части антител, такие как фрагменты Fab и F(ab')2, можно получать из целых антител общепринятыми способами, такими как расщепление целых антител папаином или пепсином. Кроме того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии можно получать с использованием стандартных технологий рекомбинантной ДНК, широко известных в данной области (см. Sambrook et al., 1989).
Термин антитело человека предназначен для включения антител с вариабельными и константными областями, происходящими из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Антитела человека по изобретению могут включать остатки аминокислот, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линией человека (например, мутации, вносимые посредством случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или посредством соматических мутаций in vivo), например, в CDR и в частности CDR3. Однако, как используют в настоящем документе, термин антитело человека не предназначен для включения антител, в которых на каркасные последовательности человека привиты последовательности CDR, происходящие из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мышь.
Как используют в настоящем документе, термин рекомбинантное антитело человека предназначен для включения всех антител человека, которые получают, экспрессируют, производят или выделяют
- 5 044302 рекомбинантными способами, такие как антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфицируемого в клетки-хозяева, антитела, выделяемые из библиотеки рекомбинантных, комбинаторных антител человека, антитела, выделяемые у животных (например, мышей), которые являются трансгенными по генам иммуноглобулинов человека (см. например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела получаемые, экспрессируемые, производимые или выделяемые любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинант антитела человека содержит вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Однако в определенных вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу in vitro (или, когда используют животного, трансгенного по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, последовательности аминокислот областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и получены из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и родственны им, в природе могут не присутствовать в репертуаре зародышевой линии антител человека in vivo.
Слитые с Fc белки содержат часть или целиком два или более белков, один из которых представляет собой часть Fc молекулы иммуноглобулина, которые иначе в природе вместе не встречаются. Получение слитых белков, содержащих определенные гетерологичные полипептиды, слитые с различными частями полученных из антител полипептидов (включая домен Fc), описано, например, в Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; и Hollenbaugh et al., Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins, в Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10,19,1 - 10,19,11, 1992. Слитые белки рецептора и Fc содержат один или несколько внеклеточных доменов рецептора, связанные с молекулой Fc, которая в определенных вариантах осуществления содержит шарнирную область с последующими доменами иммуноглобулина СН2 и CH3. В определенных вариантах осуществления слитый с Fc белок содержит две или более цепей различных рецепторов, которые связываются с одним или несколькими лигандами. Например, слитый с Fc белок представляет собой ловушку, такую как, например, ловушка IL-1 (например, рилонацепт, который содержит связывающую лиганд IL-1RAcP область, слитую с внеклеточной областью IL-1R1, слитую с Fc hIgG1; см. патент США № 6927004), или ловушка VEGF (например, афлиберцепт, который содержит домен 2 Ig рецептора VEGF Flt1, слитый с доменом 3 Ig рецептора VEGF Flk1, слитый с Fc hIgG1; см. патенты США №№ 7087411 и 7279159).
Среды
Настоящее изобретение относится к не содержащей сыворотки среде, которая пригодна для культивирования клеток и продукции биофармацевтического лекарственного вещества. Не содержащая сыворотки используют для среды для культивирования клеток, которая не содержит сывороток животных, таких как эмбриональная телячья сыворотка. Не содержащие сыворотки среды могут содержать <7,5 г/л гидролизатов, таких как соевый гидролизат. Настоящее изобретение также относится к химическим средам определенного состава, которые не только не содержат сывороток, но также не содержат и гидролизата. Не содержащие гидролизата используют для сред для культивирования клеток, которые не содержат экзогенных белковых гидролизатов, таких как гидролизаты животных или растительных белков, например, такие как пептоны, триптоны и т.п.
Удаление сыворотки и уменьшение количества или удаление гидролизатов из среды для культивирования клеток при снижении вариабельности от партии к партии и улучшении последующих этапов обработки к сожалению ослабляет рост, жизнеспособность клеток и экспрессию ими белка. Таким образом, химически определенные не содержащие сыворотки и содержащие мало или не содержащие гидролизатов среды для улучшения роста клеток и продукции белка нуждаются в дополнительных ингредиентах. Среды для культивирования клеток по изобретению можно обогащать дополнительными ингредиентами, такими как полиамины или увеличенными концентрациями таких компонентов, как аминокислоты, соли, сахара, витамины, гормоны, факторы роста, буферы, антибиотики, липиды, микроэлементы и т.п., в зависимости от требований культивируемых клеток или желаемых параметров культуры клеток. Например, среда для культивирования клеток по настоящему документу для улучшения роста клеток, жизнеспособности клеток и продукции рекомбинантного белка обогащена орнитином, путресцином или обоими (OS среды).
В определенных вариантах осуществления OS среда содержит орнитин в концентрации (выражаемой в микромолях на литр) по меньшей мере приблизительно 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400,450,
500, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 568, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579,580,
581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601,602,
603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 620, 625, 630, 635, 640,645,
650, 700, 750, 800, 850 или 900 мкМ.
В определенных вариантах осуществления среды содержит орнитин в концентрации приблизительно 85, 90, 95, 100, 105, 110, 113 или 115 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 100±15 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 15±2,25 мг/л орнитина -HCl.
- 6 044302
В определенных вариантах осуществления среды содержит орнитин в концентрации приблизительно 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340 или 345 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 300±45 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 50±7,5 мг/л орнитина -HCl.
В определенных вариантах осуществления среды содержит орнитин в концентрации приблизительно 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685 или 690 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 600±90 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 100±15 мг/л орнитина -HCl.
В определенных вариантах осуществления среды содержит орнитин в концентрации 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, 1000, 1005, 1010, 1015, 1020, 1025, 1030 или 1035 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 900±135 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 150±22,5 мг/л орнитина -HCl.
В обогащенные орнитином среды необязательно можно добавлять путресцин. Путресцин в очень низких концентрациях включали в качестве компонента в определенные составы сред для культивирования клеток; см. например, WO 2005/028626, в котором описаны 0,02-0,08 мг/л путресцина; патент США № 5426699 (0,08 мг/л); патент США № RE30,985 (0,16 мг/л); патент США № 5811299 (0,27 мг/л); патент США № 5122469 (0,5635 мг/л); патент США № 5063157 (1 мг/1); WO 2008/154014 (»100 мкМ - »1000 мкМ); патентную заявку США № 2007/0212770 (0,5-30 мг/л полиамина; 2 мг/л путресцина; 2 мг/л путресцина + 2 мг/л орнитина; 2 мг/л путресцина + 10 мг/л орнитина).
В определенных вариантах осуществления среды содержат комбинацию орнитина и путресцина, где путресцин может находиться в комбинации по меньшей мере приблизительно 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 260, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405 или 410 мкМ.
В определенных вариантах осуществления среды содержат путресцин в концентрации приблизительно 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 или 230 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 200±30 мкМ путресцина в дополнение к >90±14 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 30±4,5 мг/л путресцина -2HCl в дополнение к >15±2,25 мг/л орнитина -HCl.
В определенных вариантах осуществления среды содержат путресцин в концентрации приблизительно 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400 или 405 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 350±52,5 мкМ путресцина в дополнение к >90±14 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 57±8,55 мг/л путресцина -2HCl в дополнение к >15±2,25 мг/л орнитина -HCl.
В определенных вариантах осуществления среды содержат путресцин в концентрации приблизительно 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800 или 805 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 714±105 мкМ путресцина в дополнение к >90±14 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 115±17,25 мг/л путресцина -2HCl в дополнение к >15±2,25 мг/л орнитина -HCl.
В определенных вариантах осуществления среды содержат попарную комбинацию любых концентраций путресцина и орнитина, перечисленных выше. В определенных вариантах осуществления среды содержат любую попарную комбинацию приблизительно 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800 или 805 мкМ путресцина и приблизительно 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685 или 690 мкМ орнитина. Например, в одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 700 мкМ путресцина и любую одну из 510, 511, 512 мкМ и последующие орнитина; или 701 мкМ путресцина и любую одну из 510, 511, 512 мкМ и последующие орнитин и т.д. Также, например, среды в одном из вариантов осуществления содержит приблизительно 600 мкМ орнитина и любую одну из 700, 701, 702 мкМ и последующие путресцина; или 601 мкМ орнитина и любую одну из 700, 701, 702 мкМ и последующие путресцина и т.д. В определенных вариантах осуществления среды содержат 702±106 мкМ путресцина +593±89 мкМ орнитина. В одном конкретном варианте осуществления среды содержат приблизительно 714 мкМ путресцина и 593 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среды содержат 115±17 мг/л путресцина -2HCl и 100±15 мг/л орнитина -HCl. В одном конкретном варианте осуществления среды содержат 115 мг/л путресцина -2HCl и 100 мг/л орнитина -HCl.
- 7 044302
В одном из вариантов осуществления и в дополнение к добавлению орнитина или путресцина среды содержат смесь нуклеозидов в суммарной концентрации по меньшей мере 50 мкМ, по меньшей мере 60 мкМ, по меньшей мере 70 мкМ, по меньшей мере 80 мкМ, по меньшей мере 90 мкМ, по меньшей мере 100 мкМ, по меньшей мере 110 мкМ, по меньшей мере 115 мкМ, по меньшей мере 120 мкМ, по меньшей мере 125 мкМ, по меньшей мере 130 мкМ, по меньшей мере 135 мкМ, по меньшей мере 140 мкМ, по меньшей мере 145 мкМ, по меньшей мере 150 мкМ, по меньшей мере 155 мкМ, по меньшей мере 160 мкМ, по меньшей мере 165 мкМ или по меньшей мере 170 мкМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 174±26 мкМ нуклеозидов. В одном из вариантов осуществления среды содержат пуриновые производные в суммарной концентрации по меньшей мере 40 мкМ, по меньшей мере 45 мкМ, по меньшей мере 50 мкМ, по меньшей мере 55 мкМ, по меньшей мере 60 мкМ, по меньшей мере 65 мкМ, по меньшей мере 70 мкМ, по меньшей мере 75 мкМ, по меньшей мере 80 мкМ, по меньшей мере 85 мкМ, по меньшей мере 90 мкМ, по меньшей мере 95 мкМ, по меньшей мере 100 мкМ или по меньшей мере 105 мкМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 106±5 мкМ пуриновых производных. Пуриновые производные включают нуклеозиды гипоксантин и аденозин и гуанозин. В одном из вариантов осуществления среды содержат пиримидиновые производные в суммарной концентрации по меньшей мере 30 мкМ, по меньшей мере 35 мкМ, по меньшей мере 40 мкМ, по меньшей мере 45 мкМ, по меньшей мере 50 мкМ, по меньшей мере 55 мкМ, по меньшей мере 60 мкМ или по меньшей мере 65 мкМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 68±5 мкМ пиримидиновых производных. Пиримидиновые производные включают нуклеозиды тимидин, уридин и цитидин. В одном конкретном варианте осуществления среды содержат аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин.
В дополнение к добавлению орнитина или путресцина в одном из вариантов осуществления среды также содержат аминокислоты в суммарной концентрации по меньшей мере 40 мМ, где в расчет общ сумма не включено количество глутамина. В одном из вариантов осуществления глутамин в среды не добавлен, но его можно добавить в среды в качестве добавки в момент использования при культивировании клеток, например, при продукции белка. Таким образом, в определенных вариантах осуществления, таких как в способе культивирования клеток или способе получения представляющего интерес белка, среды можно обогащать глутамином в качестве добавки в момент использования. В одном из таких вариантов осуществления глутамин добавляют в количестве менее чем приблизительно 40 мМ, менее чем приблизительно 35 мМ, менее чем приблизительно 30 мМ, менее чем приблизительно 25 мМ, менее чем приблизительно 20 мМ, менее чем приблизительно 15 мМ, менее чем приблизительно 10 мМ, менее чем приблизительно 8 мМ, менее чем приблизительно 7 мМ, менее чем приблизительно 6 мМ, менее чем приблизительно 5 мМ, менее чем приблизительно 4 мМ, менее чем приблизительно 3 мМ или менее чем приблизительно 2,5 мМ. В одном из вариантов осуществления количество глутамина в средах, которые обогащали глутамином, составляет приблизительно 2±0,5 мМ.
В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат аминокислоты с неполярными боковыми группами в концентрации по меньшей мере 15 мМ, по меньшей мере 24 мМ, по меньшей мере 25 мМ, по меньшей мере 26 мМ, по меньшей мере 27 мМ, по меньшей мере 28 мМ, по меньшей мере 29 мМ или по меньшей мере 30 мМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 30 мМ аминокислот с неполярными боковыми группами. В одном из вариантов осуществления на моль общего количества аминокислот, содержащегося в средах, по меньшей мере 32%, по меньшей мере 33%, по меньшей мере 34%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 36%, по меньшей мере 37%, по меньшей мере 38%, по меньшей мере 39%, по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 41% представляют собой аминокислоты с неполярными боковыми группами. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 42±1% представляют собой аминокислоты с неполярными боковыми группами. Аминокислоты с неполярными боковыми группами включают аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин.
В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат аминокислоты с незаряженными полярными боковыми группами в концентрации приблизительно от 10 до 34 мМ, приблизительно от 11 до 33 мМ, приблизительно от 12 до 32 мМ, приблизительно от 13 до 31 мМ, приблизительно от 14 до 30 мМ, приблизительно от 15 до 29 мМ, приблизительно от 16 до 28 мМ, приблизительно от 17 до 27 мМ, приблизительно от 18 до 26 мМ, приблизительно от 19 до 25 мМ, приблизительно от 20 до 24 мМ, приблизительно от 21 до 23 мМ или приблизительно 22 мМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит приблизительно 22 мМ аминокислот с незаряженными полярными боковыми группами. В другом варианте осуществления среда содержит приблизительно 12 мМ аминокислот с незаряженными полярными боковыми группами. В одном из вариантов осуществления на моль общего количества аминокислот, содержащегося в средах приблизительно от 14 до 46%, приблизительно от 15 до 45%, приблизительно от 16 до 44%, приблизительно от 17 до 43%, приблизительно от 18 до 42%, приблизительно от 19 до 41%, приблизительно от 20 до 40%, приблизительно от 21 до 39%, приблизительно от 22 до 38%, приблизительно от 23 до 37%, при
- 8 044302 близительно от 24 до 36%, приблизительно от 25 до 35%, приблизительно от 26 до 34%, приблизительно от 27 до 33%, приблизительно от 28 до 32%, приблизительно от 29 до 31% или приблизительно 30% представляют собой аминокислоты с незаряженными полярными боковыми группами. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 30±3% представляют собой аминокислоты с незаряженными полярными боковыми группами. Аминокислоты с незаряженными полярными боковыми группами включают глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин.
В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат аминокислоты с отрицательным зарядом при рН 6 (например, кислые аминокислоты) в концентрации приблизительно от 4 до 14 мМ, приблизительно от 5 до 13 мМ, приблизительно от 6 до 12 мМ, приблизительно от 7 до 11 мМ, приблизительно от 8 до 10 мМ, приблизительно 9 мМ или приблизительно 4 мМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 9 мМ кислых аминокислот. В одном из вариантов осуществления среды содержат 9±1 мМ кислых аминокислот. В одном из вариантов осуществления на моль общего количества аминокислот, содержащихся в средах приблизительно от 8 до 18%, приблизительно от 9 до 17%, приблизительно от 10 до 16%, приблизительно от 11 до 15%, приблизительно от 12 до 14% или приблизительно 13% представляют собой кислые аминокислоты. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 12,6±1% представляют собой кислые аминокислоты. Кислые аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.
В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат аминокислоты с положительным зарядом при рН 6 (например, основные аминокислоты) в концентрации по меньшей мере 3,5 мМ, по меньшей мере 4 мМ, по меньшей мере 5 мМ, по меньшей мере 6 мМ, по меньшей мере 7 мМ, по меньшей мере 8 мМ, по меньшей мере 9 мМ, по меньшей мере 10 мМ или по меньшей мере 11 мМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 11 мМ основных аминокислот. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 11,42±1 мМ основных аминокислот. В одном из вариантов осуществления на моль общего количества аминокислот, содержащихся в средах по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 13%, по меньшей мере 14% или по меньшей мере 15% представляют собой основные аминокислоты. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 16% представляют собой основные аминокислоты. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 15,8±2,4% представляют собой основные аминокислоты. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 21 ±3,2% представляют собой основные аминокислоты. Основные аминокислоты включают лизин, аргинин и гистидин.
В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат приблизительно 30 мМ неполярных аминокислот, приблизительно 22 мМ незаряженных полярных аминокислот, приблизительно 9 мМ кислых аминокислот и приблизительно 11 мМ основных аминокислот. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 42% представляют собой неполярные аминокислоты, приблизительно 30% представляют собой незаряженные полярные аминокислоты, приблизительно 13% представляют собой кислые аминокислоты и приблизительно 16% представляют собой основные аминокислоты.
В дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина в одном из вариантов осуществления среды содержат микромолярные количества жирных кислот (или производных жирных кислот) и токоферол. В одном из вариантов осуществления жирные кислоты включают любую одну или несколько из линолевой кислоты, линоленовой кислоты, липоевой кислоты, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, арахидиновой кислоты, арахидоновой кислоты, лауриновой кислоты, бегеновой кислоты, каприловой кислоты, лауриновой кислоты, гексановой кислоты, лигноцериновой кислоты, миристиновой кислоты и октановой кислоты. В одном из вариантов осуществления среды содержат токоферол, линолевую кислоту и липоевую кислоту.
В одном из вариантов осуществления среды также содержат смесь витаминов, которая включает другие питательные вещества и незаменимые питательные вещества, в суммарной концентрации по меньшей мере приблизительно 700 мкМ или по меньшей мере приблизительно 2 мМ. В одном из вариантов осуществления смесь витаминов содержит один или несколько из D-биотина, хлорида холина, фолиевой кислоты, миоинозитола, амида никотиновой кислоты, пиридоксина HCl, D-пантотеновой кислоты (hemiCa), рибофлавина, тиамина HCl, витамина В12 и т.п. В одном из вариантов осуществления смесь витаминов включает все из D-биотина, хлорида холина, фолиевой кислота, миоинозитола, амида никотиновой кислоты, пиридоксина HCl, D-пантотеновой кислоты (hemiCa), рибофлавина, тиамина HCl и витамина В12.
Различные варианты осуществления сред по изобретению включают любую из комбинаций описанных выше вариантов осуществления, включая химически определенные, не содержащие гидролизатов, не содержащие сывороток среды, содержащие орнитин или путресцин в указанных количествах и, в числе прочего, (а) аминокислоты; (b) необязательно нуклеозиды; (с) соли двухвалентных катионов; (d) жирные
- 9 044302 кислоты и токоферол и (е) витамины. В определенных вариантах осуществления во все OS среды можно добавлять небольшие количества гидролизатов.
Заявители полагают, что в практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать любые одну или несколько из множества основных сред или их сочетаний, в которые добавляют орнитин или комбинацию орнитина и путресцина. Основные среды общеизвестны в данной области и в числе прочего включают МЕМЕ (минимальную поддерживающую среду) Игла (Eagle, Science, 1955, 112(3168):501-504), F12 Хэма (Ham, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1965, 53:288-293), среду F-12 K, среду Дульбекко, модифицированную Дульбекко среду Игла (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1952 August; 38(8): 747-752), среды DMEM/Хэма F12 1:1, T8 Троуэла, среды А2 Холмса и Вольфа, Biophys. Biochem. Cytol., 1961, 10:389-401), среды Вэймота (Davidson and Waymouth, Biochem. J., 1945, 39(2): 188-199), среды Е Вильямса (William's et al., Exp. Cell Res., 1971, 69:105 et seq.), RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc, 1967, 199:519-524), среды MCDB 104/110 (Bettger et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1981, 78(9):5588-5592), среды Вентре HL-1, среды с альбумином-глобулином (Orr et al., Appl. Microbiol., 1973, 25(l):49-54), среду RPMI-1640, среду RPMI-1641, модифицированную Исков среду Дульбекко, среду Маккоя 5 А, среду Лейбовица L-15 и не содержащие сыворотки среды, такие как EX-CELL™ 300 Series (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), среды с протамином-цинком-инсулином (Weiss et al., 1974, US 4072565), среды с биотином-фолатом (Cartaya, 1978, US Re30,985), среды с трансферрином-жирными кислотами (Baker, 1982, US 4560655), среды с трансферрином-EGF (Hasegawa, 1982, US 4615977; Chessebeuf, 1984, US 4786599) и другие комбинации сред (см. Inlow, US 6048728; Drapeau, US 7294484; Mather, US 5122469; Furukawa, US 5976833; Chen, US 6180401; Chen, US 5856179; Etcheverry, US 5705364; Etcheverry, US 7666416; Ryll, US 6528286; Singh, US 6924124; Luan, US 7429491 и т.п.).
В конкретном варианте осуществления среда является химически определенной и в дополнение к орнитину или комбинации орнитина и путресцина содержит: CaCl2 2Н2О; буфер HEPES, KCl; MgSO4; NaCl; Na2HPO4 или другие фосфатные соли; пируват; L-аланин; L-аргинин HCl; L-аспарагин Н2О; L-аспарагиновую кислоту; L-цистеин HCl H2O; L-глутаминовую кислоту; глицин; L-гистидин HCl H2O; L-изолейцин; L-лейцин; L-лизин HCl; L-метионин; L-орнитин HCl; L-фенилаланин; L-пролин; L-серин; L-треонин; L-триптофан; L-тирозин 2Na 2H2O; L-валин; D-биотин; хлорид холина; фолиевую кислоту; миоинозитол; амид никотиновой кислоты; пиридоксин HCl; D-пантотеновую кислоту; рибофлавин; тиамин HCl; витамин В12; ρ-аминобензойную кислоту; этаноламин HCl; плюроник F68; DL-a-токоферола фосфат; линолевую кислоту; Na2SeO3; липоевую кислоту и глюкозу и необязательно аденозин; гуанозин; цитидин; уридин; тимидин и гипоксантин 2Na.
В одном из вариантов осуществления исходная осмолярность сред по изобретению составляет 200-500, 250-400, 275-350 или приблизительно 300 мОсм. В течение роста клеток в средах по изобретению и, в частности, после любой подачи питательных веществ по протоколу периодической подпитки, осмолярность культуры может увеличиваться приблизительно до 350, 400, 450 или до 500 мОсм.
В определенных вариантах осуществления, где осмолярность среды определенного состава составляет менее чем приблизительно 300, осмолярность доводят приблизительно до 300, добавляя одну или несколько солей свыше указанного количества. В одном из вариантов осуществления осмолярность увеличивают до желаемого уровня, добавляя один или несколько осмолитов, выбранных из хлорида натрия, хлорида калия, соли магния, соли кальция, кислой соли амина, соли жирной кислоты, бикарбоната натрия, карбоната натрия, карбоната калия, хелатора, который представляет собой соль, сахар (например, галактозу, глюкозу, сахарозу, фруктозу, фукозу и т.д.) и их сочетания. В одном из вариантов осуществления осмолит добавляют в дополнение к его концентрации в компоненте, уже присутствующем в среде определенного состава (например, сахар добавляют в дополнение к концентрации, указанной для компонента сахара).
Любой и каждый из вариантов осуществления сред, описанных выше, а также любых других не содержащих сыворотки сред, содержащих по меньшей мере приблизительно 90 мкМ орнитина (или содержащих комбинацию по меньшей мере приблизительно 100 мкМ орнитина и по меньшей мере приблизительно 200 мкМ путресцина) далее в настоящем изобретении обозначают как обогащенные орнитином (OS) среды. И наоборот, среды, не содержащие орнитина (или не содержащие комбинации орнитина/путресцина), или среды, содержащие менее 100 мкМ орнитина (или среды, содержащие менее 100 мкМ орнитина и менее 200 мкМ путресцина), далее в настоящем документе обозначают как не обогащенные орнитином (не OS) среды.
Культура клеток
Настоящее изобретение относится к культуре клеток, содержащей линию клеток, экспрессирующую представляющий интерес белок в OS среде, как описано выше. В одном из вариантов осуществления культура клеток содержит инсулин, который можно добавлять в среды в качестве ингредиента в момент использования или можно включать в составы сред. В одном из вариантов осуществления линия клеток содержит клетки, способные к продукции биотерапевтического белка. Примеры линий клеток, которые как правило используют для продукции белковых биотерапевтических средств, включают в числе прочего первичные клетки, клетки BSC, клетки HeLa, клетки HepG2, клетки LLC-MK, клетки
- 10 044302
CV-1, клетки COS, клетки VERO, клетки MDBK, клетки MDCK, клетки CRFK, клетки RAF, клетки RK, клетки TCMK-1, клетки LLCPK, клетки PK15, клетки LLC-RK, клетки MDOK, клетки BHK, клетки BHK-21, клетки СНО, клетки СНО-К1, клетки NS-1, клетки MRC-5, клетки WI-38, клетки BHK, клетки 3T3, клетки 293, клетки RK, клетки Ptr.C6 и клетки куриных эмбрионов. В одном из вариантов осуществления линия клеток представляет собой линию клеток СНО или одну или несколько из нескольких конкретных вариантов клеток СНО, оптимизированных для продукции белка в большом масштабе, например, СНО-Ki.
Культура клеток или культура означает рост и размножение клеток вне многоклеточного организма или ткани. Подходящие условия культивирования для клеток млекопитающих известны в данной области. См. например. Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992). Клетки млекопитающих можно культивировать в суспензии или прикрепленными к твердому субстрату. Для культур клеток млекопитающих доступны биореакторы с псевдоожиженным слоем, биореакторы с пористыми волокнами, биореакторы с роллерными флаконами, встряхиваемыми колбами или смесительными баками с микроносителями или без и функционирующие в периодическом режиме, в периодическом режиме с подпиткой, непрерывном, полунепрерывном режиме или режиме с орошением. В течение культивирования в культуру непрерывно или с интервалами можно добавлять среды для культивирования клеток или концентрированные питательные среды. Например, культуру можно подпитывать раз в сутки, через сутки, каждые трое суток или можно подпитывать, когда концентрация конкретного компонента среда, который подвергают контролю, падает ниже желаемого диапазона.
Животные клетки, такие как клетки СНО, можно культивировать в культурах малого масштаба, например, в 125 мл контейнерах, содержащих приблизительно 25 мл среды, 250 мл контейнерах, содержащих приблизительно от 50 до 100 мл среды, 500 мл контейнерах, содержащих приблизительно от 100 до 200 мл среды. Альтернативно, культуры могут быть крупномасштабными, такими как, например, 1000 мл контейнеры, содержащие приблизительно от 300 до 1000 мл среды, 3000 мл контейнеры, содержащие приблизительно от 500 мл до 3000 мл среды, 8000 мл контейнеры, содержащие приблизительно от 2000 до 8000 мл среды и 15000 мл контейнеры, содержащие от 4000 до 15000 мл среды. Культуры для производства могут содержать 10000 л среды или более. Крупномасштабные культуры клеток, такие как для клинического производства белковых терапевтических средства, как правило, поддерживают в течение нескольких суток или даже недель, при этом клетки продуцируют желаемый белок(ки). В течение этого времени культуру можно обогащать концентрированной питательной средой, содержащей такие компоненты, как питательные вещества и аминокислоты, которые расходуются в течение культивирования. Концентрированная питательная среда может быть основана на любых составах сред для культивирования клеток. Такая концентрированная питательная среда может содержать большинство компонентов среды для культивирования клеток, например, приблизительно в количестве 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 12х, 14х, 16х, 20х, 30х, 50х, 100х, 200х, 400х, 600х, 800х или даже приблизительно 1000х от их нормального пригодного количества. Концентрированные питательные среды часто используют в процессах культивирования с периодической подпиткой.
В определенных вариантах осуществления среды для культивирования клеток в течение роста клеток или продукции белка обогащают добавками в момент использования, также известными как добавки, ингредиенты, добавляемые в момент использования, или химические вещества, добавляемые в момент использования. Добавки в момент использования включают один или несколько из факторов роста или других белков, буферов, источников энергии, солей, аминокислот, металлов и хелаторов. Другие белки включают трансферрин и альбумин. Факторы роста, которые включают цитокины и хемокины, в основном известны в данной области и известно, что они стимулируют рост клеток или, в некоторых случаях, дифференцировку клеток. Как правило, фактор роста представляет собой белок (например, инсулин), небольшой пептид или стероидный гормон, такой как эстроген, DHEA, тестостерон и т.п. В некоторых случаях, фактор роста может представляет собой искусственное химическое вещество, которое стимулирует клеточную пролиферацию или продукцию белка, такое как, например, тетрагидрофолат (THF), метотрексат и т.п. Неограничивающие примеры белковых и пептидных факторов роста включают ангиопоэтины, морфогенетические белки кости (BMP), выделенный из головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), эпидермальный фактор роста (EGF), эритропоэтин (ЕРО), фактор роста фибробластов (FGF), выделенный из линий глиальных клеток нейротрофический фактор (GDNF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), ростовой фактор дифференцировки 9 (GDF9), фактор роста гепатоцитов (HGF), выделенный из гепатомы фактор роста (HDGF), инсулин, инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор стимуляции миграции, миостатин (GDF-8), фактор роста нервов (NGF) и другие нейротрофины, выделенный из тромбоцитов фактор роста (PDGF), тромбопоэтин (ТРО), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), агонисты путь передачи сигнала wnt, плацентарный фактор роста (PlGF), эмбриональный телячий соматотрофин (FBS), интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 и т.п. В одном из вариантов осуществления среду для культивирования клеток обогащают до- 11 044302 бавляемым в момент использования фактором роста инсулином. В одном из вариантов осуществления концентрация инсулина в средах, например, количество инсулина в средах для культивирования клеток после добавления, составляет приблизительно от 0,1 до 10 мкМ. Также в составы сред по определенным вариантам осуществления можно включать одну или несколько добавок в момент использования.
Буферы общеизвестны в данной области. Изобретение не ограничено каким-либо конкретным буфером или буферами, и любой специалист в данной области может выбрать соответствующие буфер или буферную систему для использования с конкретной линией клеток, продуцирующей конкретный белок. В одном из вариантов осуществления буфер, добавляемый в момент использования, представляет собой NaHCO3. В одном из вариантов осуществления буфер, добавляемый в момент использования, содержит NaHCO3. В другом варианте осуществления буфер представляет собой HEPES.
Источники энергии для применения в качестве добавки в момент использования в культуре клеток также хорошо известны в данной области. Без ограничения в одном из вариантов осуществления источник энергии, добавляемый в момент использования, представляет собой глюкозу. Учитывая конкретные и определенные требования конкретных линии клеток и продуцируемого белка, в одном из вариантов осуществления глюкозу в среды можно добавлять в концентрации приблизительно от 1 до 20 мМ. В определенных случаях глюкозу можно добавлять на высоких уровнях вплоть до 10 г/л.
Также в области культуры клеток и продукции белка хорошо известны хелаторы. Двумя стандартными хелаторами, используемыми в данной области, являются дигидрат ЭДТА натрия и цитрат, хотя в практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать другие хелаторы. В одном из вариантов осуществления хелатор, добавляемый в момент использования, представляет собой дигидрат ЭДТА натрия. В одном из вариантов осуществления хелатор, добавляемый в момент использования, представляет собой цитрат, такой как Na3C6H5O7.
В одном из вариантов осуществления культуру клеток можно обогащать одной или несколькими аминокислотами, добавляемыми в момент использования, например, такими как глутамин. В одном из вариантов осуществления среда для культивирования клеток обогащена глутамином, добавляемым в момент использования в конечной концентрации приблизительно от 1 до 13 мМ.
Другие добавки в момент использования включают одну или несколько из различных солей металлов, такие как соли железа, никеля, цинка и меди. В одном из вариантов осуществления среды для культивирования клеток обогащают любым одним или несколькими из сульфата меди, сульфата цинка, хлорида железа и сульфата никеля.
В одном из вариантов осуществления среды для культивирования клеток обогащают любой одной или несколькими или всеми из указанных ниже добавок в момент использования: приблизительно 29,8 мМ NaHCO3, приблизительно 2 мМ глутамин, приблизительно 0,86 мкМ инсулин, приблизительно 11,1 мМ глюкоза, приблизительно 6,54 мкМ сульфат цинка, приблизительно 0,168 мкМ сульфат меди, приблизительно 75 мкМ хлорид железа, приблизительно 0,639 мкМ сульфат никеля, приблизительно 85 мкМ ЭДТА и приблизительно 50 мкМ цитрат.
В одном из вариантов осуществления среды обогащают с интервалами в течение культивирования клеток в соответствии с процессом с периодической подпиткой. Культивирование с периодической подпиткой общеизвестно в данной области и применяется для оптимизированной продукции белка (см. Y.M. Huang et al., Biotechnol Prog. 2010 Sep-Oct;26(5):1400-10).
Относительно роста клеток в культуре без орнитина или путресцина жизнеспособность клеток, плотность жизнеспособных клеток и удвоение клеток улучшены. Относительно жизнеспособности клеток, клетки, растущие в OS средах демонстрирует жизнеспособность, которая по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере, 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 100% или по меньшей мере в 3 раза выше, чем жизнеспособность сходных или идентичных клеток, растущих не в OS средах.
В определенных вариантах осуществления скорость удвоения жизнеспособных клеток млекопитающих в OS средах по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 6%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 9%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 11%, по меньшей мере на 12%, по меньшей мере на 13%, по меньшей мере на 14%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 16%, по меньшей мере на 17%, по меньшей мере на 18%, по меньшей мере на 19%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 21%, по меньшей мере на 22%, по меньшей мере на 23%, по меньшей мере на 24%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 26%, по меньшей мере на 27%, по меньшей мере на 28%, по меньшей мере на 29%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 100% или по меньшей мере в 3 раза выше, чем скорость удвоения клеток млекопитающих, культивируемых не в OS средах. В определенных вариантах осуществления скорость удвоения жизнеспособных клеток млекопитающих в OS средах приблизительно на 10%, 11%, 12%, 13%, 14%,
- 12 044302
15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% или 30% выше, чем скорость удвоения клеток млекопитающих не в OS средах.
В определенных вариантах осуществления время удвоения активно проходящих цикл клеток млекопитающих в OS средах составляет менее 30 ч, менее 29 ч, менее 28 ч, менее 27 ч, менее 26 ч, менее 25 ч, менее 24 ч, менее 23 ч, менее 22 ч, менее 21 ч, менее 20 ч, менее 19 ч или менее 18 ч. В определенных вариантах осуществления время удвоения активно растущих клеток млекопитающих в OS средах составляет менее 28 ч. В определенных вариантах осуществления время удвоения клеток млекопитающих в OS средах составляет приблизительно 27±1 ч, приблизительно 26±1 ч, приблизительно 25±1 ч, приблизительно 24±1 ч, приблизительно 23±1 ч, приблизительно 22±1 ч или приблизительно 21±1 ч. В определенных вариантах осуществления время удвоения активно проходящих цикл клеток млекопитающих в OS средах составляет приблизительно 24±1 ч. В определенных вариантах осуществления время удвоения активно делящихся клеток, культивируемых в OS средах по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 16%, по меньшей мере на 17%, по меньшей мере на 18%, по меньшей мере на 19%, по меньшей мере на 20% или по меньшей мере на 25% меньше, чем время удвоения активно проходящих цикл клеток, культивируемых не в OS средах.
Продукция белка
В дополнение к химически определенным OS средам и способам культивирования клеток в OS средах, настоящее изобретение относится к способам продукции белков, таких как терапевтически эффективное антитело или другое биофармацевтическое лекарственное вещество, в клетках, культивируемых в OS средах.
В определенных вариантах осуществления скорость продукции белка клетками млекопитающих, культивируемыми в OS средах, по меньшей мере на 5%, 10%, 15% или 20% выше, чем скорость продукции белка идентичными клетками млекопитающих, культивируемыми не в OS средах. В определенных вариантах осуществления скорость продукции белка в клетках, культивируемых в OS средах, составляет по меньшей мере 1 пкг/клетку/сутки (PCD), по меньшей мере 2 PCD, по меньшей мере 3 PCD, по меньшей мере 4 PCD, по меньшей мере 5 PCD, по меньшей мере 6 PCD, по меньшей мере 7 PCD, по меньшей мере 8 PCD, по меньшей мере 9 PCD, по меньшей мере 10 PCD, по меньшей мере 15 PCD, по меньшей мере 20 PCD, по меньшей мере 25 PCD, по меньшей мере 30 PCD, по меньшей мере 35 PCD, по меньшей мере 40 PCD, по меньшей мере 45 PCD, по меньшей мере 50 PCD, по меньшей мере 75 PCD или по меньшей мере 100 PCD.
В определенных вариантах осуществления выход или титр продукции белка, которые можно выражать в граммах белкового продукта на литр среды для культивирования, из клеток, культивируемых в OS средах, составляет по меньшей мере 100 мг/л, по меньшей мере 1 г/л, по меньшей мере 1,2 г/л, по меньшей мере 1,4 г/л, по меньшей мере 1,6 г/л, по меньшей мере 1,8 г/л, по меньшей мере 2 г/л, по меньшей мере 2,5 г/л, по меньшей мере 3 г/л, по меньшей мере, 3,5 г/л, по меньшей мере 4 г/л, по меньшей мере 4,5 г/л, по меньшей мере 5 г/л, по меньшей мере 5,5 г/л, по меньшей мере 6 г/л, по меньшей мере 6,5 г/л, по меньшей мере 7 г/л, по меньшей мере 7,5 г/л, по меньшей мере 8 г/л, по меньшей мере 8,5 г/л, по меньшей мере 9 г/л, по меньшей мере 9,5 г/л, по меньшей мере 10 г/л или по меньшей мере 20 г/л.
В определенных вариантах осуществления белковый продукт (представляющий интерес белок) представляет собой антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, моноклональное антитело, полиспецифическое антитело, биспецифическое антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, одноцепочечное антитело, диатело, триотело или тетратело, фрагмент Fab или фрагмент F(ab')2, антитело IgD, антитело IgE, антитело IgM, антитело IgG, антитело IgG1, антитело IgG2, антитело IgG3 или антитело IgG4. В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело IgG1. В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело IgG2. В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело IgG4.
В определенных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой рекомбинантный белок, который содержит молекулу Fc и другой домен (например, слитый с Fc белок). В определенных вариантах осуществления слитый с Fc белок представляет собой слитый белок рецептор-Fc, который содержит один или несколько из одного или нескольких внеклеточных доменов рецептора, связанных с молекулой Fc. В определенных вариантах осуществления молекула Fc содержит шарнирную область с последующими доменами СН2 и CH3 IgG. В определенных вариантах осуществления слитый белок рецептор-Fc содержит два или более различных рецепторных цепи, которые связываются с одним лигандом или несколькими лигандами. Например, слитый с Fc белок представляет собой ловушку, например, такую как ловушка IL-1 (например, рилонацепт, который содержит связывающую лиганд IL-1RAcP область, слитую с внеклеточной областью IL-1R1, слитую с Fc hIgG1; см. патент США № 6927004, который полностью включен в настоящий документ в качестве ссылки) ловушка VEGF (например, афлиберцепт, который содержит домен 2 Ig рецептора VEGF Flt1, слитый с доменом 3 Ig рецептора VEGF Flk1, слитый с Fc hIgG1; см. патенты США №№ 7087411 и 7279159).
Настоящее изобретение для продукции белка не ограничено конкретным типом клеток. Примеры типов клеток, подходящих для продукции белка, включают клетки млекопитающих, клетки насекомых,
- 13 044302 клетки птиц, клетки бактерий и клетки дрожжей. Клетки могут представлять собой стволовые клетки или рекомбинантные клетки, трансформированные вектором для рекомбинантной экспрессии генов, или клетки, трансфицированные вирусом для продукции вирусных продуктов. Клетки могут содержать рекомбинантную гетерологичную полинуклеотидную конструкцию, кодирующую представляющий интерес белок. Эта конструкция может представлять собой эписому, или она может представлять собой элемент, который физически интегрирован в геном клетки. Также клетки могут продуцировать представляющий интерес белок без кодирования этого белка гетерологичной полипептидной конструкцией. Другими словами, клетка может кодировать представляющий интерес белок в природе, например, В-клетка, продуцирующая антитело. Клетки также могут являться первичными клетками, такими как клетки куриного эмбриона или первичными линиями клеток. Примеры пригодных клеток включают клетки BSC, клетки LLC-MK, клетки CV-1, клетки COS, клетки VERO, клетки MDBK, клетки MDCK, клетки CRFK, клетки RAF, клетки RK, клетки TCMK-1, клетки LLCPK, клетки PK15, клетки LLC-RK, клетки MDOK, клетки BHK-21, курица embryo клетки, клетки NS-1, клетки MRC-5, клетки WI-38, клетки BHK, клетки 293, клетки RK, клетки Per.C6 и клетки СНО. В различных вариантах осуществления линия клеток представляет собой производное клеток СНО, такое как мутантные линии СНО-Ki, СНО DUX В-11, СНО DG-44, Veggie-CHO, GS-CHO, S-CHO или СНО lec.
В одном из вариантов осуществления клетка, которая представляет собой клетку СНО, экспрессирует белок эктопически. В одном из вариантов осуществления белок содержит область тяжелой цепи иммуноглобулина, такую как область CH1, CH2 или CH3. В одном из вариантов осуществления белок содержит область СН2 и CH3 иммуноглобулина человека или грызуна. В одном из вариантов осуществления белок содержит область CH1, CH2 и CH3 иммуноглобулина человека или грызуна. В одном из вариантов осуществления белок содержит шарнирную область и область CH1, CH2 и CH3. В конкретном варианте осуществления белок содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления белок содержит вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления белок содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления белок представляет собой антитело, такое как антитело человека, антитело грызуна или химерное антитело человека/грызуна (например, человека/мыши, человека/крысы или человека/хомяка).
Фазу продукции можно проводить в культуре любого масштаба от отдельных колб и колб на шейкере или одноразовых реакторов Wave bags, до однолитровых биореакторов и до крупномасштабных промышленных биореакторы. Крупномасштабный процесс можно проводить в объеме приблизительно от 100 до 20000 л или более. Для контроля продукции белка можно использовать одно или несколько средств, таких как температурный сдвиг или химическая индукция. Фаза роста может происходить при более высокой температуре, чем фаза продукции. Например, фаза роста может происходить при одной температуре приблизительно от 35 до 38°C, а фаза продукции может происходить при другой температуре приблизительно от 29 до 37°C, необязательно приблизительно от 30 до 36°C или приблизительно от 30 до 34°C. Кроме того, вместе, до или после температурного сдвига можно добавлять химические индукторы продукции белка, такие как кофеин, бутират, тамоксифен, эстроген, тетрациклин, доксициклин и бисацетамид гексаметилена (НМВА). Если индукторы добавляют после температурного сдвига, их можно добавлять в пределах от одного часа доя пяти суток после температурного сдвига, например, в пределах от одних до двух суток после температурного сдвига. Продуцирующие культуры клеток можно запускать в качестве непрерывной подпитываемой системы культивирования, как в хемостате (см. С. Altamirano et al., Biotechnol Prog. 2001 Nov-Dec; 17(6): 1032-41), или в соответствии с процессом с периодической подпиткой (Huang, 2010).
Изобретение пригодно для улучшения продукции белка способами культивирования клеток. Линии клеток, используемые по изобретению, можно генетически конструировать для экспрессии полипептида, представляющего коммерческий или научный интерес. Генетическая инженерия линий клеток включает трансфекцию, трансформацию или трансдукцию клеток рекомбинантной полинуклеотидной молекулой или иной способ изменения (например, посредством гомологичной рекомбинации и активации генов или слияния рекомбинантной клетки с нерекомбинантной клеткой) для того, чтобы вызвать экспрессию клеткой-хозяином желаемого рекомбинантного полипептида. Способы и векторы для генетической инженерии клеток или линий клеток для экспрессии представляющего интерес полипептида хорошо известны специалистам в данной области; например, различные способы проиллюстрированы в Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988 и ежеквартальные обновления); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69. Широкий спектр линий клеток, подходящий для выращивания в культуре, доступен в American Type Culture Collection (Manassas, Va.) и у коммерческих поставщиков. Примеры линий клеток, широко используемых в промышленности, включают клетки VERO, BHK, HeLa, CVl (включая Cos), MDCK, 293, 3T3, клетки миеломных линий (например, NSO, NSl), PC12, клетки WI38 и клетки яичника китайского хомяка (СНО). Клетки СНО широко используют для получения комплексных рекомбинантных белков, таких как цитокины, факторы свертывания крови и антитела (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al. (1988), J.Biol Chem
- 14 044302
263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol 6:231-239; Wood et al. (1990), J Immunol. 145:3011-3016). Желательными линиями клеток-хозяев СНО являются мутантные линии клеток с дефицитом дигидрофолатредуктазы (DHFR) (Urlaub et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220), DXBl 1 и DG-44, так как эффективная система селекции и амплификации экспрессии гена на основе DHFR обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка в этих клетках (Kaufman RJ. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). Кроме того, с этими клетками легко обращаться в качестве адгезивных или суспензионных культур, и они демонстрируют относительно хорошую генетическую стабильность. Клетки СНО и белки, рекомбинантно экспрессируемые ими, всесторонне охарактеризованы и одобрены для применения в клиническом и коммерческом производстве органами регулирования. В определенных вариантах осуществления линии клеток СНО представляют собой линии клеток, как описано в публикациях патентных заявок США №№ 2010/0304436 А1, 2009/0162901 А1 и 2009/0137416 А1 и патентах США №№ 7455988 В2, 7435553 В2 и 7105348 В2.
Настоящее изобретение не ограничено объемом указанных вариантов осуществления, описываемых в настоящем документе, которые предназначены для иллюстрации отдельных аспектов или вариантов осуществления изобретения. В объем изобретения входят функционально эквивалентные способы и компоненты.
Специалистам в данной области из приведенного выше описания и сопровождающих фигур в дополнение к описанному в настоящем документе очевидны различные модификации изобретения. Такие модификации находятся в объеме изобретения.
Изобретение частично основано на открытии, что добавление орнитина или комбинации орнитина и путресцина в не содержащие сыворотки среды для культивирования клеток приводит к увеличенным росту клеток, жизнеспособности и продукции полипептидов в рекомбинантно сконструированных линиях клеток животных (или природных клеток), экспрессирующих представляющий интерес белок, таким образом, увеличивая надежность культуры, улучшая выход представляющего интерес полипептида.
Пример 1. Увеличенная плотность культуры жизнеспособных клеток.
В 250 мл встряхиваемую колбу проводили инокуляцию из затравочной культуры линии рекомбинантных продуцирующих антитела клеток, происходящих из СНО K1. Инокулированные клетки выращивали при 36,5°С в течение семи суток и подпитывали глюкозой на сутки три и пять. Клетки выращивали в каждой из двух раздельных химически определенных (не содержащих гидролизата и не содержащих сыворотки) средах. Первая среда содержала приблизительно 75 мМ аминокислот (среда 1), вторая среда содержала приблизительно 40 мМ аминокислот (среда 2), и оба состава содержали не более 2,5 мкМ (0,4 мг/л) путресцина. Другую группу условий среды получали, добавляя в среду 2 соевый гидролизат в концентрации 7,5 г/л. В каждую из трех контрольных сред добавляли приблизительно 593 мкМ орнитина (в виде 100 мг/л L-орнитина -HCl) или комбинация приблизительно 593 мкМ орнитина (в виде 100 мг/л L-орнитина -HCl) и приблизительно 714 мкМ путресцина (в виде 115 мг/л путресцина -2HCl). На сутки 3, 5 и 7 отбирали аликвоты по 3 мл культур и подсчет количества жизнеспособных клеток проводили с использованием исключения трипанового синего на устройстве BioProfile FLEX™ (Nova Biomedical). В начальные сутки все культуры содержали 0,8х106 жизнеспособных клеток на мл. Для данных сред (среда 1, среда 2 или среда 2+ соя) количества жизнеспособных клеток через период семь суток продемонстрировали, что у клеток СНО, растущих в средах, дополненных орнитином или орнитином и путресцином, повышена плотность жизнеспособных клеток. Эффект в течение семисуточного периода был особенно выражен в не содержащих гидролизатов средах (например, от 2-кратного до 4-кратного или более возрастание плотности жизнеспособных клеток). Не содержащая гидролизата OS среда 2 действовала сравнимо с содержащей сою не OS средой 2, что указывает на то, что преимущество соевого гидролизата для роста клеток можно воспроизвести посредством замены на орнитин. Также наблюдали увеличенную плотность клеток при добавлении орнитина или орнитина и путресцин в среду 2+ соя. Результаты представлены в табл. 1.
- 15 044302
Таблица 1 средняя плотность жизнеспособных клеток в культуре (106 клеток на миллилитр) и кратность увеличения ______________по сравнению с исходным уровнем*______________
Добавка: | Время | Без добавок | Орнитин | Орнитин + путресцин |
Среда 1 | 3 суток | 2,4/ 1х | 6,1 /2,5х | 5,0/2Дх |
5 суток | 3,4/ Iх | 12,6/3,7х | 12,4 /3,6х | |
7 суток | 3,6/ 1х | 7,0/ 1,9х | 6,8/ 1,9х | |
Среда 2 | 3 суток | 1,7/ 1х | 5,1 /3,Οχ | 5,2/ЗДх |
5 суток | 2,0/ 1х | 7,6/3,8χ | 8,0/4,Οχ | |
7 суток | 1,6/ 1х | 5,9/3,7х | 5,8 / 3,6х | |
Среда 2 + соевый гидролизат | 3 суток | 5,2/ 1х | 5,4/ 1х | 4,7 / 0,9χ |
5 суток | 7,7/ 1х | 9,3 / 1,2х | 9,3 / 1,2х | |
7 суток | н.д. | 9,6 / н.д. | 9,1 / н.д. |
*Исходный уровень представляет собой среды без добавок для данного состава среда на данные сутки.
Авторы также изучили действие различных количеств орнитина -HCl (например, 50 мг/мл, 100 мг/мл и 150 мг/мл) на плотность жизнеспособных клеток в среде 3, которая содержит приблизительно 75 мМ аминокислот и 0,4 мг/л путресцина HCl (среда 3). Для инокуляции 50 мл биореакторов TubeSpin® (ТРР) при 0,4х106 клеток/мл в рабочем объеме 15 мл использовали одну культуру из системы посевных ферментеров линии рекомбинантных продуцирующих антитела клеток, происходящих из СНО K1. Клетки выращивали в инкубаторе при 37°С в течение трех суток. На сутки 3 отбирали аликвоты по 3 мл культур и определение количеств жизнеспособных клеток проводили с использованием исключения трипанового синего на устройстве BioProfile FLEX™ (Nova Biomedical). Все три уровня орнитина улучшали плотность клеток в среднем (N=3) немногим более чем в два раза. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2 плотность жизнеспособных клеток в культуре (106 клеток на миллилитр) и кратность увеличения по сравнению с исходным уровнем*
Контроль | Орнитин НС1 | |||
Концентрация (мг/мл) | 0 | 50 | 100 | 150 |
Плотность жизнеспособных клеток (106 клетки/мл) | 1,3 | 3,2 | 3,1 | 3,1 |
Кратность увеличения по сравнению с контролем | 1х | 2,5х | 2,4х | 2,4х |
*Исходный уровень представляет собой среду 3 без добавок.
Пример 2. Улучшенное время удвоения культуры клеток.
В условиях различных сред для культивирования клеток определяли время удвоения линии рекомбинантных продуцирующих антитела клеток, происходящих из клеток СНО K1, в логарифмической фазе роста. Культуры из системы посевных ферментеров пересевали при 36,5°С в 250 мл встряхиваемые колбы в течение периода 14 суток в каждой из трех отдельных сред: в среде 1, среде 2 и среде 2, содержащей соевый гидролизат (среда 2+ соя). На сутки 0 и во время пересева в системе посевных ферментеров (каждые 2 или 3 суток) для каждого условия отбирали аликвоты по 1 мл и определение количеств жизнеспо собных клеток проводили с использованием исключения трипанового синего на устройстве CDV™ (Nova
Biomedical). Среду 1 тестировали без добавок или обогащенную орнитином -HCl в концентрации 100 мг/л или путресцином -2HCl в концентрации 115 мг/л и орнитином -HCl в концентрации 100 мг/л. Среду 2 с низким содержанием путресцина -2HCl (0,4 мг/л) тестировали без добавок или обогащенную орнитином -HCl в концентрации 100 мг/л или путресцином -2HCl в концентрации 115 мг/л и орнитином -HCl в концентрации 100 мг/л. Результаты приведены в табл. 3 и 4. Для достижения значительного роста было необходимо обогащение среды 1 орнитином с путресцином или без. Обогащение не содержащей гидролизата среды 2 орнитином или орнитином + путресцин уменьшало время удвоения клеток приблизительно на величину от 25 до 30%. Также времена удвоения уменьшались после добавления орнитина или орнитина + путресцин в содержащую гидролизат среду 2 хоть и в меньшей степени.
Таблица 3 время удвоения клеток (часы) и приблизительный процент уменьшения времени удвоения относительно исходного уровня* в среде 1
Добавка | Среда 1 | |
* Отсутствует | 75 | |
Орнитин | 23 | 69% |
Путресцин + орнитин | 21 | 72% |
*Исходный уровень представляет собой среду 1 без добавок.
-
Claims (13)
- Таблица 4 время удвоения клеток (часы) и приблизительный процент уменьшения времени удвоения относительно ____________________исходного уровня* в среде 2____________________Добавка Среда 2 Среда 2 + соя *Без добавок 27 22,5Орнитин 21 22% 20,5 8,9%Путресцин + орнитин 19,5 28% 21 6,7% *Исходный уровень представляет собой среду 2 без добавок.Пример 3. Увеличенные титры антител.После установления того, что добавление орнитина или орнитина + путресцин улучшает клеточную пролиферацию и плотность жизнеспособных клеток в культуре авторы дополнительно исследовали влияние этих условий на титры продуцируемых рекомбинантных белков. Авторы исследовали экспрессию и секрецию рекомбинантного IgG происходящей из СНО-Ki линией клеток. В этом эксперименте средний титр антител в культуре определяли на сутки семь в различных форматах сред. Как указано выше, тестировали среду 1 с низким содержанием путресцина (0,4 мг/л путресцина -2HCl), орнитина (100 мг/л орнитина -HCl) и с орнитином и путресцином (100 мг/л орнитина -HCl /115 мг/л путресцина -2HCl). Также тестировали среду 2 и среду 2+ соя с низким уровнем путресцина (0,4 мг/л путресцина -2HCl), орнитина (100 мг/л орнитина -HCl) и с орнитином и путресцином (100 мг/л орнитина -HCl /115 мг/л путресцина -2HCl). Во всех случаях добавление орнитина или орнитин и путресцин на уровне выше 0,4 мг/л приводило к значительно более высоким титрам белка, например, по меньшей мере приблизительно в два раза более высоким титрам. Результаты представлены в табл. 5.Таблица 5 средние семисуточные титры антител и приблизительная кратность увеличения (х) титров относительно исходного уровня*Добавка среда 1 среда 2 среда 2 + сояБез добавок* 0,31 г/л 1х 0,29 г/л 1х 0,54 г/л 1хОрнитин 0,94 г/л 3,0х 0,65 г/л 2,2χ 0,98 г/л 1,8хПутресцин + орнитин 0,95 г/л 3,1х 0,64 г/л 2,2χ 1,07 г/л 2хИсходный уровень установлен на титр в средах каждого типа без добавок.Авторы также исследовали влияние различных количеств орнитина -HCl (например, 50 мг/мл, 100 мг/мл и 150 мг/мл) в среде 3 на продукцию антител. Для инокуляции 50 мл биореакторов TubeSpin® (ТРР) при 0,4х106 клеток/мл в рабочем объеме 15 мл использовали одну культуру из системы посевных ферментеров линии рекомбинантных продуцирующих антитела клеток, происходящих из СНО K1. Клетки выращивали в инкубаторе при 37°C в течение трех суток. Все три уровня добавляемого орнитина улучшали титры антител в среднем (N=3) немногим более 50%. Результаты приведены в табл. 6.Таблица 6 титры антител (грамм на литр) и кратность увеличения титров по сравнению с исходным уровнем*Контроль Орнитин НС1Концентрация добавки (мг/мл) 0 50 100 150Титр антитела (мг/мл) 79 120 127 124Кратность увеличения относительно контроля 1х 1,5χ 1,6х 1,6х *Исходный уровень представляет собой среду 3 без добавок.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ культивирования СНО-Ki клеток, включающий этапы:(a) размножения или поддержания клеток СНО-Ki в среде для культивирования клеток с получением культуры клеток, где указанная среда для культивирования клеток не содержит сыворотки и содержит гидролизаты и полиамины, причем культура клеток поддерживается при одной температуре приблизительно от 35 до 38°C в течение фазы роста; и (b) размножения или поддержания культуры клеток в среде для культивирования клеток при другой температуре приблизительно от 29 до 37°C в течение фазы продукции, причем клетки СНО-К1 экспрессируют слитый белок-ловушку VEGF.
- 2. Способ по п.1 где этап (b) включает культивирование культуры клеток при температуре приблизительно от 30 до 34°C в течение фазы продукции.
- 3. Способ по п.1 или 2, где среда для культивирования клеток содержит орнитин или комбинацию орнитина и путресцина.
- 4. Способ по любому из пп.1-3, где среда для культивирования клеток содержит >0,09+0,014 мМ- 17 044302 орнитина.
- 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что среда для культивирования клеток содержит орнитин в концентрации от 0,09+0,014 мМ до 0,9+0,14 мМ.
- 6. Способ по любому из пп.1-5, где среда для культивирования клеток содержит 0,6+0,09 мМ орнитина и 0,714+0,11 мМ путресцина.
- 7. Способ по любому из пп.1-6, где белок-ловушка VEGF продуцируется с титром по меньшей мере 100 мг/л.
- 8. Способ по любому из пп.1-6, где белок-ловушка VEGF продуцируется с титром по меньшей мере 1 г/л.
- 9. Способ по любому из пп.1-8, где среда для культивирования содержит количество гидролизата сои менее или равное 7,5 г/л.
- 10. Способ по любому из пп.1-9, где среда для культивирования клеток содержит:(а) >40±6 мМ смеси аминокислот или их солей;(Ь) одну или несколько жирных кислот;(с) смесь нуклеозидов; или (с) один или несколько двухвалентных катионов.
- 11. Способ по п.10, в котором:(а) смесь аминокислот или их солей включает аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин;(Ь) одна или несколько жирных кислот выбраны из группы, состоящей из линолевой кислоты, линоленовой кислоты, липоевой кислоты, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, арахидиновой кислоты, арахидоновой кислоты, лауриновой кислоты, бегеновой кислоты, каприловой кислоты, лауриновой кислоты, гексановой кислоты, лигноцериновой кислоты, миристиновой кислоты и октановой кислоты.(с) смесь нуклеозидов содержит один или несколько аденозинов, гуанозинов, цитидинов, уридинов, тимидинов или гипоксантинов; или (с) двухвалентный катион представляет собой Са2+, Mg2+ или оба.
- 12. Способ по любому из пп.1-11, где способ включает культивирвание клеток в периодическом режиме с подпиткой, непрерывном, полунепрерывном режиме или режиме с орошением.
- 13. Способ по любому из пп.1-12, где белок-ловушка VEGF представляет собой афлиберцепт.- 18Евразийская патентная организация, ЕАПВРоссия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61/790,136 | 2013-03-15 | ||
US14/211,245 | 2014-03-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA044302B1 true EA044302B1 (ru) | 2023-08-15 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11970724B2 (en) | Serum-free cell culture medium | |
EA044302B1 (ru) | Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток | |
EA045169B1 (ru) | Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток | |
EA047026B1 (ru) | Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток | |
NZ711935B2 (en) | Serum-free cell culture medium |