JP2017516484A - タンパク質生産のための細胞培養工程 - Google Patents

Abstract

本発明は、モノクローナル抗体、および融合タンパク質の生産のための哺乳動物細胞培養工程を提供し、前記哺乳動物細胞は、単相性温度を特に維持する適切な細胞培養条件で培養される。【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

［発明の分野］
本発明は、糖タンパク質の生産のための、哺乳動物細胞における単相性の培養条件に関する。より特に、哺乳動物細胞において単相性温度条件を有する培養条件でのモノクローナル抗体、および融合タンパク質の生産に関する。より特に、本発明は、タンパク質、好ましくは糖タンパク質の生産のための適切な細胞培養条件で哺乳動物細胞を培養する工程に関する。より特に、糖タンパク質の生産のために、単相性温度を明確に維持する適切な細胞培養条件を用いて行う細胞培養工程にも関する。

［発明の背景］
バイオ医薬品用の治療用タンパク質の生産は、通常、高レベルの糖タンパク質を生成することが知られている哺乳動物の細胞培養の使用を含む。哺乳動物の細胞培養条件のコントロールおよび適切化は、糖タンパク質の成功裏の商業生産のために非常に重要である。従来、多くの糖タンパク質のための哺乳動物細胞培養工程は、二相性であり、初期成長相および続く生産相によって区別される。この二相の生産相は、高い細胞密度、およびより良い生産力価を提供する。

さらに、細胞培養条件をコントロールし、適切化することは、それらの条件が、細胞生存性、所望の生産収率、純度、および不均一性に大幅に影響を及ぼすので、大きな挑戦とされている。治療用タンパク質分子の生理化学、および薬物動態特性は、培養条件に依存する。

ＵＳ７２９４４８１は、融合タンパク質、すなわち、ＴＮＦＲ：Ｆｃの製造方法を開示する。生産相では、宿主細胞は、２５℃〜３４℃の温度で培養され、３７℃で行われた生産相と比較して、生産されたＴＮＦＲ：Ｆｃのジスルフィドスクランブルの減少を示した。さらに、ＵＳ７２９４４８１は、生産相が、アルカノン酸またはアルカノン酸の塩の存在下で行われることを開示する。

生産相の開始は、最も一般的である温度およびｐＨ変化を用いて、さまざまな方法で達成されてもよい。使用される他の方法は、誘導剤の添加、供給基質の変化、またはオスモル濃度変化である。

本発明は、培養中に適切な培養条件を維持することによる細胞培養工程に関する。特に、哺乳動物細胞は、約３４℃〜約３７℃で選択される単一温度で成長する。本発明は、培養中に適切な培養条件を維持することによる、フェドバッチモードでの細胞培養工程に関する。

［発明の要旨］
実施形態において、本発明は糖タンパク質を生産するための単相性哺乳動物細胞培養工程に関する。

他の実施形態において、本発明は糖タンパク質を生産するための単相性温度哺乳動物細胞培養工程に関する。
他の実施形態において、本発明は糖タンパク質を生産するための単相性温度哺乳動物細胞培養工程に関し、温度は、３４℃〜３７℃に設定される。

他の実施形態において、本発明は、融合タンパク質、およびモノクローナル抗体を生産するための単相性温度条件を有する哺乳動物細胞培養工程に関する。
さらに他の実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞培養のために単相性温度で糖たんぱく質を生産する方法に関し、細胞培養は、アルカノン酸またはアルカノン酸の塩を基本的に含まない。

他の実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞培養において糖タンパク質を生産する工程に関し、次のステップ：
ａ）種子発達中に適切な細胞濃度で接種材料を調製すること、
ｂ）生産バイオリアクターに適切な細胞濃度の前記接種材料を接種すること、
ｃ）適切な条件で生産バイオリアクター中で細胞培養すること、ここで前記適切な条件は単相性温度条件である；および
ｄ）前記細胞培養から糖タンパク質を得ること、
を含む工程。

他の実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞培養において糖タンパク質を生産する工程に関し、次のステップ：
ａ）種子発達中に適切な細胞濃度で接種材料を調製すること、
ｂ）生産バイオリアクターに適切な細胞濃度の前記接種材料を接種すること、
ｃ）適切な条件で生産バイオリアクター中で細胞培養すること、ここで前記適切な条件は単相性温度条件である；および
ｄ）前記細胞培養から糖タンパク質を得ること、
を含み、
ここで単相性温度はステップ（ｃ）中に温度変化を有さない、工程。

他の実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞培養において糖タンパク質を生産する工程に関し、次のステップ：
ａ）種子発達中に適切な細胞濃度で接種材料を調製すること、
ｂ）生産バイオリアクターに適切な細胞濃度の前記接種材料を接種すること、
ｃ）適切な条件で、生産バイオリアクター中で細胞培養すること、ここで前記適切な条件は単相性温度条件である；および
ｄ）前記細胞培養から糖タンパク質を得ること、
を含み、
ここでステップ（ｃ）における生産バイオリアクターは、任意の特有の成長相および生産相を有しない、工程。

他の実施形態において、本発明は糖タンパク質を生産するために単相性温度条件を用いて行われる細胞培養工程に関し、温度は、約３２℃〜約３７℃の設定値で維持される。
他の実施形態において、本発明は糖タンパク質を生産するために単相性温度条件を用いて行われる細胞培養工程に関し、温度は、約３４℃〜約３７℃の設定値で維持される。

ある実施形態において、本発明は糖タンパク質を生産するために単相性温度条件を用いて行われる細胞培養工程に関し、温度は、約３３℃で維持される。
ある実施形態において、本発明は糖タンパク質を生産するために単相性温度条件を用いて行われる細胞培養工程に関し、温度は、約３４℃で維持される。

ある実施形態において、本発明は糖タンパク質を生産するために単相性温度条件を用いて行われる細胞培養工程に関し、温度は、約３５℃で維持される。
ある実施形態において、本発明は糖タンパク質を生産するために単相性温度条件を用いて行われる細胞培養工程に関し、温度は、約３６℃で維持される。

本発明の工程によって生産される融合タンパク質、およびモノクローナル抗体は、バイオ医薬品に有用である。
以下に説明される本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、本来、実例となるだけであり、発明の範囲を制限することを目的としない。本発明の他の特徴、目的、および利点は、明細書から明白であるだろう。

図１は、エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）生産中に観測されたＣＨＯ細胞の相対的な成長傾向を示す。 図２は、エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）生産中に観測されたＣＨＯ細胞の相対的な生存傾向を示す。 図３は、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）生産中に観測されたＣＨＯ細胞の相対的な成長傾向を示す。 図４は、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）生産中に観測された種々の時点でのＣＨＯ細胞の相対的な生存傾向を示す。 図５は、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）生産中のＣＨＯ細胞の成長傾向を示す。 図６は、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）生産中のＣＨＯ細胞の生存傾向を示す。 図７は、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）生産中のＣＨＯ細胞の成長傾向を示す。 図８は、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）生産中のＣＨＯ細胞の生存傾向を示す。

［発明の詳細な説明］
［定義：］
本願に言及される用語「抗体」は、全抗体および任意の抗原結合断片、またはそれらの単一鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および少なくとも２つの軽（Ｌ）鎖、またはそれらの抗原結合断片を有する糖タンパク質に関する。各重鎖は、重鎖可変領域(本願ではＶＨと略す)、および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の ３つのドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本願ではＶＬと略す)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分されてもよく、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列が超可変可能であり、および／または抗原認識に関係し、および／または通常、構造的に定義されたループを形成し、フレームワーク領域（ＦＲまたはＦＷ）と呼ばれるより保存される領域が点在されている。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＷから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に次の順序；ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３，ＣＤＲ３、ＦＷ４で配置される。ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３、ＦＷ４のアミノ酸配列は、全て共に、本願で称されるＶＨまたはＶＬの「非ＣＤＲ領域」または「非伸長ＣＤＲ領域」を構成する。

「宿主細胞」は、遺伝子を上昇レベルでまたは低下レベルで発現するために、または遺伝子の変異型を発現するために、組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡを有する遺伝的工学手段である。言い換えると、宿主細胞は、組換え体ポリヌクレオチド分子を用いて、トランスフェクト、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）、または形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）されている細胞であることによって、細胞を所望のポリペプチドの発現に変更させるように変更されている。「遺伝子工学」の従来の方法は、先行技術で公知である。

「生産培地」は、生産相中の培養細胞に使用されるために設計された細胞培養培地を意味する。
本願に使用される「単相性」は、培養が維持される任意の培養条件に変化を与えない細胞培養方法に関する。培養条件は、温度、ｐＨ、オスモル濃度、化学的賦形剤を含むが制限されない。

本願に使用される「単相性温度」は生産バイオリアクター (継代「Ｎ」と称される)において単一の温度設定値の使用を伴って行われる細胞培養方法に関する。および、温度は、単相性の成長条件を得るために生産バイオリアクターの実行中に単一の設定値で維持される。単相性は、変化が抑えられる。単相性温度は約３４℃〜約３７℃である。

本願に使用される「糖たんぱく質」は、不連続単位として機能する一つ以上の哺乳類ポリペプチドに関する。「糖たんぱく質」は、バイオ医薬品用に使用される融合タンパク質、およびモノクローナル抗体を含む。融合タンパク質の例は、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、アバタセプト（ａｂａｔａｃｅｐｔ）、アレファセプト（ａｌｅｆａｃｅｐｔ）、リロナセプト（ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）、ベラタセプト（ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ）、アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）等を含むが制限されない。モノクローナル抗体の例は、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、パリビズマブ（ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、オマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、ナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）等を含むが制限されない。

本願に使用される「細胞密度」は、培地の与えられた容量に存在する細胞数に関する。
本願に使用される「哺乳動物細胞培養」は、細胞集団の生存および／または成長に適した条件下で、培地中に懸濁される細胞集団に関する。哺乳動物細胞培養は、多細胞生物または組織を除く哺乳動物細胞の成長および増殖に関する。哺乳動物細胞に対する適切な培養条件は、当該技術分野で公知である。哺乳動物細胞は、懸濁液中で培養されてもよいし、または固体基質に連結されながら培養されてもよい。

本願に使用される「フェド−バッチ培養」は、細胞培養方法に関し、付加的な要素が、培養工程の開始後に、いくつかの時間で培養に提供される。提供された要素は、通常、細胞のための栄養補給剤を含み、栄養補給剤は、培養工程中に枯渇している。

本願に使用される哺乳動物細胞培養工程は、ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＣＨＯ Ｓ、ＣＨＯ Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４のような組み換え体哺乳動物細胞系列の使用に関する。
本願に使用される、単相性生産バイオリアクターにおける種子接種後の開始ＶＣＣ（生菌数）は、０．１×１０^６細胞／ｍＬ〜１．０×１０^６細胞／ｍＬから選択され生存率は＞９０％であり、より好ましくは、０．３×１０^６細胞／ｍＬ〜５×１０^６細胞／ｍＬから選択され生存率は＞９０％であり、さらにより好ましくは、１×１０^６細胞／ｍＬ〜２×１０^６細胞／ｍＬから選択され生存率は＞９０％である。ＶＣＣは、適切な時間間隔で工程中に測定されてもよい。

本願に使用される温度に示される「約」は、温度値の偏差に関し、偏差においては±１℃を含み、例えば約３３度は、３２℃〜３４℃の温度を含む。
本願に使用されるｐＨに示される「約」は、ｐＨ値の偏差に関し、偏差においては±０．５を含み、例えば約ｐＨ６．７は、ｐＨ６．２〜ｐＨ７．２を含む。

他の実施形態において、本発明は、融合タンパク質およびモノクローナル抗体を生産するための単相性温度条件を用いて実施された哺乳動物細胞培養工程に関する。
更に他の実施形態において、本発明は、糖たんぱく質を生産するための単相性温度条件を用いて実施された哺乳動物細胞培養工程に関し、培養工程において、細胞培養は、アルカノン酸またはアルカノン酸の塩を実質的に含まない。

他の実施形態において、本発明は、糖タンパク質を生産するために、約３４℃〜約３７℃で単相性温度条件を用いて実施された細胞培養工程に関し、本発明は、糖タンパク質の所望の確認を改善する。

他の実施形態において、哺乳動物細胞培養は、発酵槽またはバイオリアクター中で、適切な培地で、バッチモード、フェド−バッチモード、および連続モードで、好ましくは、フェド−バッチモードで行われる。本発明は糖タンパク質の生産のための哺乳動物細胞の培養の工程に関する。特に、本発明は、哺乳動物細胞培養工程中に維持される特定の培養条件に関する。

哺乳動物細胞培養から糖タンパク質の生産のための多くの方法が開発され、文献で報告されているけれども、しかしながら、これらの方法は、通常、二相性であり、温度および／または溶解酸素および／またはｐＨのうちの２セットを必要とする。二相性細胞培養条件において、組換え体宿主細胞は、成長相と呼ばれる速い細胞増殖を促進する温度で最初に成長する。二相性細胞培養は、通常３４℃〜３７℃で細胞を成長させ、その後、生産相と呼ばれる組換え体タンパク質の生産を好んで行いながら細胞成長を低下させる２２℃〜３４℃に温度を下げることによって達成される。

細胞培養工程は、効果的および効率的な方法で細胞培養工程を実行するための種々のパラメーターが必要である。しかしながら、本発明の主な側面は、培養中の単相性温度の使用であり、単相性温度は、温度変化を有さず、重要な細胞生存性を伴って糖タンパク質の所望の質および量を生産する。

本発明は、当該技術分野で公知の技術を用いることによって、タンパク質の生産においての温度の影響、当該質および細胞生存性を研究する。温度は、３７℃、または３６度、または３５℃、または３４℃、または３３℃から選択される。

他の実施形態において、約３４℃〜約３７℃の単相性温度条件は、糖タンパク質の所望の確認を改善する。
他の実施形態において、本発明は、単相性細胞培養条件での糖タンパク質の生産のための細胞培養工程に関し、哺乳動物細胞は、約３２℃〜約３７℃で維持される温度で培養される。

他の実施形態において、本発明は、単相性細胞培養条件での糖タンパク質の生産のための細胞培養工程に関し、哺乳動物細胞は、約３４℃〜約３７℃で維持される温度で培養される。

本発明の一つの実施形態において、単相性温度は約３３℃に設定される。
本発明の一つの実施形態において、単相性温度は約３４℃に設定される。
本発明の一つの実施形態において、単相性温度は約３５℃に設定される。

本発明の一つの実施形態において、単相性温度は約３６℃に設定される。
本発明の他の実施形態において、単相性温度は約３７℃に設定される。
実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞培養において糖タンパク質を生産する工程に関し、次のステップ：
ａ）種子発達中に適切な細胞濃度で接種材料を調製すること、
ｂ）生産バイオリアクターに適切な細胞濃度の前記接種材料を接種すること、
ｃ）適切な条件で生産バイオリアクター中で細胞培養すること、ここで前記適切な条件は単相性温度条件である；および
ｄ）前記細胞培養から糖タンパク質を得ること、
を含む、工程。

実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞培養において糖タンパク質を生産する工程に関し、次のステップ：
ａ）種子発達中に適切な細胞濃度で接種材料を調製すること、
ｂ）生産バイオリアクターに適切な細胞濃度の前記接種材料を接種すること、
ｃ）適切な条件で、生産バイオリアクター中で細胞培養すること、ここで前記適切な条件は単相性温度条件である；および
ｄ）前記細胞培養から糖タンパク質を得ること、
を含む、工程であり、
ここで、単相性温度は、ステップ（ｃ）中に温度変化を有さない。

実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞培養において糖タンパク質を生産する工程に関し、次のステップ：
ａ）種子発達中に適切な細胞濃度で接種材料を調製すること、
ｂ）生産バイオリアクターに適切な細胞濃度の前記接種材料を接種すること、
ｃ）適切な条件で、生産バイオリアクター中で細胞培養すること、ここで前記適切な条件は単相性温度条件である；および
ｄ）前記細胞培養から糖タンパク質を得ること、
を含む、工程であり、
ここで、ステップ（ｃ）における生産バイオリアクターは、任意の特有の成長相および生産相を有さない。

他の実施形態において、種子発達ステップは、適切な細胞濃度を有する接種材料を発達させるために行った。所望の細胞濃度を有する接種材料を発達させるために少なくとも約７２時間必要とし、その後、接種材料を、更なるスケールアップおよびタンパク質の生産のために生産バイオリアクターに接種した。

他の実施形態において、細胞培養工程は、生産発酵槽または生産バイオリアクター中で行われる。細胞は、全期間９〜４０日で培養されてもよい。他の実施形態において、タンパク質は、少なくとも１５日前に、好ましくは１３日前に、より好ましくは１２日前に、最も好ましくは１１日前に、採取される。他の実施形態において、タンパク質は細胞生存率が９０％以下に達する前に採取される。他の実施形態において、タンパク質は細胞生存率が７０％以下に達する前に採取される。他の実施形態において、タンパク質は細胞生存率が５０％以下に達する前に採取される。好ましい実施形態において、適切な培養条件は温度変化を有しない単相性温度である。温度は、約３３℃〜約３７℃、好ましくは約３３℃〜約３６℃から選択される。

他の実施形態において、培養中の適切な条件は、ｐＨ、オスモル濃度、溶解酸素濃度、および細胞密度からさらに選択されてもよい。
種子調製は、適切な培地中で、０．１×１０^６細胞／ｍＬ〜０．５×１０^６細胞／ｍＬから選択される適切な細胞濃度で開始される。好ましい実施形態において、種子調製は、適切な培地中で、０．３×１０^６細胞で開始される。他の好ましい実施形態において、種子調製は、適切な培地中で、０．３×１０^６細胞で開始され、適切な濃度のグルタミンおよびメトトレキサートを用いてさらに栄養補給される。グルタミンおよびメトトレキサートの適切な濃度は、３ｍＭ〜６ｍＭ、好ましくは４ｍＭ、および７０ｎＭ〜１００ｎＭ、好ましくは８０ｎＭからそれぞれ選択される。

他の実施形態において、グルタミンの適切な濃度は６ｍＭである。
ある実施形態において、種子培養は、約３％〜８％ＣＯ_２、好ましくは、５％ＣＯ_２で維持され、溶解酸素濃度は、約３０％〜約７０％から選択され、好ましくは５０％であり、相対湿度は、約７０％〜約９０％から選択され、好ましくは８５％であり、撹拌速度は、約０．２ｍ／ｓ〜約０．４／ｓから選択され、好ましくは０．３ｍ／ｓであり、温度は、約３４℃〜約３７℃から選択され、好ましくは３７℃である。ある実施形態において、溶解酸素濃度は、空気を０．００〜０．０３ｖｖｍおよび酸素を０．００〜０．０９ｖｖｍで注入することによって維持される。ある実施形態において、種子培養は、継代し、希釈することによって、少なくとも０．１×１０^６細胞／ｍＬにさらに増幅される。希釈は、種子培養の間中に行われてもよい。他の実施形態において、希釈は、少なくとも３日目、または７２時間で行われる。

好ましい実施形態において、種子培養は、適切な細胞濃度に培養が成長するまで、栄養を供給することによってさらに増幅される。種子培養は適切な期間、適切な細胞濃度に培養が成長するまで、栄養を供給することによってさらに増幅される。種子培養は、少なくとも５日間、栄養を供給することによってさらに増幅されてもよく、細胞、すなわち接種材料の適切な濃度は、約４×１０^６細胞／ｍＬ〜約７×１０^６細胞／ｍＬから選択される濃度、好ましく５×１０^６細胞／ｍＬの濃度である。

実施形態において、栄養は、適切な培養条件において適切なバイオリアクター、または発酵槽中で培養する細胞に供給される。ある実施形態において、細胞は、適切な培養条件で培養され、適切な培養条件は、約３％〜６％ＣＯ_２から選択され、好ましくは、５％ＣＯ_２であり、溶解酸素濃度は、約３０％〜約７０％から選択され、好ましくは５０％であり、相対湿度は、約７０％〜約９０％から選択され、好ましくは８５％であり、撹拌速度は、約０．２ｍ／ｓ〜約０．４／ｓから選択され、好ましくは０．３ｍ／ｓであり、温度は、約３４℃〜約３７℃から選択され、好ましくは３７℃である。ある実施形態において、溶解酸素濃度は、空気を０．０３ｖｖｍ〜０．０９ｖｖｍで注入することによって維持される。

実施形態において、種子培養中の細胞の生存率は、少なくとも７０％を超える、好ましくは８０％を超える、より好ましくは９０％を超える生存率で維持される。
好ましい実施形態において、細胞は、細胞バンクから採取され、初期の生存細胞密度（ＶＣＣ）が０．３×１０^６細胞／ｍＬになるようにメトトレキサートを有する、または有しない成長培地を含む振とうフラスコ中で培養された。種子培養フラスコを、その後、設定温度３７℃、５％ＣＯ_２濃度、１２０ｒｐｍ、および約８５％相対湿度で維持した。種子体積を、７２時間おき後に０．３×１０^６細胞／ｍＬに希釈することによる連続的な継代培養中に体積的に増幅させた。Ｎ−１種子を、バイオリアクター（またはフラスコ）中に、１日目、および３日目に１０％の栄養と共にさらに供給し、１２０時間インキュベートした。２〜２．５×１０^６細胞／ｍＬのＶＣＣで、生存率が９０％を超えるＮ−２バイオリアクター（またはフラスコ）からの対数期の細胞を、Ｎ−１バイオリアクター（またはフラスコ）に接種するために使用した。Ｎ−１バイオリアクターは、空気を０．００〜０．０３ｖｖｍおよび酸素を０．００〜０．０９ｖｖｍでそれぞれ注入することによって約５０％溶解酸素飽和度での溶解酸素を用いて０．３ｍ／ｓを越えない先端速度で維持され、最終ＶＣＣが２〜１０×１０^６細胞／ｍＬおよび、９０％を超える生存率に、より好ましくは最終ＶＣＣが４〜８×１０^６細胞／ｍＬおよび、９０％を超える生存率に、さらにより好ましくは最終ＶＣＣが５〜６×１０^６細胞／ｍＬおよび、９０％を超える生存率に達した。

種子培養から得られる適切な濃度の細胞は、接種材料と呼ばれ、高密度で培養を開始するためにバイオリアクターまたは発酵槽に移される。ある実施形態において、接種材料の適切な濃度は、約４×１０^６細胞／ｍＬ〜約７×１０^６細胞／ｍＬから選択される濃度、好ましく５×１０^６細胞／ｍＬの濃度である。

バッチまたは生産バイオリアクターは、適切な培地で４×１０^６細胞／ｍＬ〜７×１０^６細胞／ｍＬから選択される適切な細胞濃度を有する接種材料を用いて開始される。好ましい実施形態において、種子濃度は１．２×１０^６細胞／ｍＬである（その種子濃度は、種子調製を通して得られる５×１０^６細胞／ｍＬ、または６×１０^６細胞／ｍＬの細胞を希釈することによって達成されてもよい）。他の好ましい実施形態において、種子濃度は１×１０^６細胞／ｍＬである。ある好ましい実施形態において、細胞は、適切な培地中で培養され、グルタミンを適切な濃度でさらに供給される。グルタミンの適切な濃度は、３ｍＭ〜６ｍＭから選択され、好ましくは４ｍＭである。

ある実施形態において、生産バイオリアクターは、ｐＨを約６〜約８、好ましくは約６．７〜７．４、より好ましくは７に、３％〜６％ＣＯ_２、好ましくは、５％ＣＯ_２に維持され、溶解酸素濃度は、約３０％〜約７０％から選択され、好ましくは５０％であり、撹拌速度は、約０．２ｍ／ｓ〜約０．４／ｓから選択され、好ましくは０．３ｍ／ｓであり、温度は、約３４℃〜約３７℃から選択され、好ましくは３４℃である。ある実施形態において、溶解酸素濃度は、空気を０．０３ｖｖｍ〜０．０９ｖｖｍで注入することによって維持される。
炭酸水素ナトリウムおよびＣＯ_２ガスは、培養のｐＨをコントロールするために使用される。

実施形態において、栄養は、残存グルコースレベルに基づいてバッチ／バイオリアクター培養中に供給される。グルコースレベルは、少なくとも２ｇ／Ｌに調節され、グルコースレベルが２ｇ／Ｌより下になると、栄養は、適切なグルコースレベルを維持するために供給される。培養のグルコース濃度は、１２時間、１８時間、２４時間毎に観察される。

実施形態において、栄養は、グルコースを約３０〜約３５ｇ／Ｌ含んでもよい。
他の実施形態において、栄養は、Ｌ−グルタミン溶液を約１８０〜約２２０ｍＭ、好ましくは、２００ｍＭ含んでもよい。一つの実施形態において、Ｌ−グルタミン溶液は、初期体積の１％で２日目に、その後、１１日目まで２日毎に続けて培養に添加される。他の実施形態において、Ｌ−グルタミン溶液は、初期体積の１％で４日目に、その後、７日目、および９日目に培養に添加される。

他の実施形態において、Ｄ−グルコースは、培養に栄養として供給される。Ｄ−グルコースの濃度は、約６０ｇ〜約９０ｇ、好ましくは、８０ｇから選択される。ある実施形態において、Ｄ−グルコースは、少なくとも９日後、または少なくとも１０日後に栄養として供給される。

他の実施形態において、所望のタンパク質を、少なくとも１０日後、または１１日後、または１２日後、または１３日後に採取する。
他の実施形態において、培養の採取は、生存率が４０％〜７０％より下に、好ましくは５０％より下に落ちる時行われる。

他の実施形態において、生産バイオリアクターは、０．１〜１０×１０^６細胞／ｍＬの開始ＶＣＣ（種子接種後）で生存率が９０％を超える、より好ましくは０．３〜５×１０^６細胞／ｍＬのＶＣＣで生存率が９０％を超える、さらにより好ましくは１〜２×１０^６細胞／ｍＬのＶＣＣで生存率が９０％を超える単相性生産バイオリアクター中に、最終バッチ体積の約５５％で成長培地を含むバイオリアクターにＮ−１種子を接種することによって開始された。培養ｐＨを、８％の炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）またはＣＯ_２ガスを添加することによってｐＨ６．７〜７．４の範囲に維持した。撹拌スピードを、０．３〜０．５ｍ／ｓの範囲の先端スピードに設定し、溶解酸素濃度を、空気を０．００〜０．０３ｖｖｍ、酸素を０．００〜０．０９ｖｖｍで注入することによってコントロールされた５０％溶解酸素飽和度で維持した。温度を、生産バイオリアクター工程（単相性）の間ずっと３４℃〜３７℃、好ましくは３４℃の単一設定点で設定した。リアクターへの栄養補給を、残存グルコースレベルに基づいて行った。培養のグルコース濃度を２４時間毎に観察し、グルコースレベルが２ｇ／Ｌより下になると栄養を添加して３ｇ／Ｌに調節した。栄養は、３３．５ｇ／ｌグルコースを含む。２００ｍＭのＬ−グルタミン溶液を、開始量の１％で、４８時間の培養に、４８時間ごとで、そのうえ、２４０時間まで添加した。培養の採取を２６４時間、または培養生存率が９０％より下に落ちると行い、どちらにしても初回で達成される。

細胞培養工程を、約１×１０^６細胞／ｍＬ〜２×１０^６細胞／ｍＬから選択される、好ましくは１．２×１０^６細胞／ｍＬである生存細胞濃度で、バイオリアクター中で開始した。他の実施形態において、生存細胞濃度は、１×１０^６細胞／ｍＬである。ある実施形態において、細胞を培養するための適切な条件は、ｐＨ６．７〜７．４、好ましくは７．０から選択される。他の実施形態において、オスモル濃度は、約２５０〜約５５０ｍＯＳｍ／Ｋｇから選択される。他の実施形態において、溶解酸素は、約３０％〜約７０％から選択される、好ましくは５０％設定点である。

好ましい実施形態において、成長相および生産相は、生産バイオリアクターに特有でない。
他の実施形態において、生産相はバッチ、またはフェド−バッチであってもよい。

実施形態において、採取されたタンパク質は、当業者に公知の技術によって、精製される。好ましい実施形態において、採取されたタンパク質は、バイオリアクター、または発酵槽から得られて両方に存在している。ＥＤＴＡ溶液を、適切な濃度で添加され、適切な濃度は５ｍＭであり得、その後、精製をＰＯＤシステムを用いて深層ろ過で行う。

培地組成は、培養寿命および生産性を改善するために非常に重要である。基本的な細胞培養培地製剤は、当該技術分野に公知である。これらの基本的な培養培地製剤に、当業者は、培養される宿主細胞の必要性に依存して、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、成長因子、バッファー、抗生物質、脂質、微量元素などのような要素を添加するだろう。培養培地は、血清および／またはタンパク質を含んでもよいし、または含まなくてもよい。様々な組織培養培地は、無血清、および／または定義された培養培地を含み、細胞培養のために市販されている。本発明の目的のために、組織培養培地は、インビトロ細胞培養において、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞の成長に適切な培地として、定義される。通常、組織培養培地は、バッファー、塩、エネルギー源、アミノ酸、ビタミン、および微量必須要素を含む。培養において、適切な真核細胞の成長を補助することが可能な任意の培地を使用する。本発明は、培養において、真核細胞、特に哺乳動物細胞に広く適用することができ、培地の選択は、本発明にとって重要でない。本発明に使用するのに適切な組織培養培地は、ＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州）などから市販されている。例えば、次の培地の任意の一つ、または組み合わせを使用する：ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＲＰＭＩ−１６４１培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地イーグル、Ｆ−１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イソコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ−１５培地、およびＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズのような無血清培地。好ましい実施形態において、培地は、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３０２培地である。

他の好ましい実施形態において、ミックスフィード培地は、ＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯフィード２、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２粉末培地、ＮａＨＣＯ３、Ｌ−グルタミン粉末、ＭＥＭ アミノ酸（５０Ｘ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（１００Ｘ）、ＭＥＭビタミン溶液（１００Ｘ）を含む。

本発明の方法および組成物において、細胞は無血清、無タンパク質、無成長因子、および／または無ペプトン培地で成長されてもよい。培地に適用される用語「無血清」は、ウシ胎児血清のような血清を含まない任意の哺乳動物細胞培養培地を含む。

当業者は、特定の培養宿主細胞において細胞成長、細胞生存率および/または組換え体ペプチド生産を最大化するために開発されている多くの個別化した培地製剤の一つを使用することができる。本発明に係る方法は、市販の細胞培養培地と組み合わせて、または特定の細胞系列で用いるために個別に製剤化されている細胞培養培地と組み合わせて使用されてもよい。

好ましい実施形態において、培地は、無血清である。他の好ましい実施形態において、培地は、アルカノン酸、またはアルカノン酸の塩を基本的に含まない。アルカノン酸およびアルカノン酸の塩は、酪酸、酪酸ナトリウム、ジブチルｃＡＭＰから選択される。

実施形態において、糖タンパク質は、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）；アバタセプト（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）；アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）；アブリルマブ（Ａｂｒｉｌｕｍａｂ）；アフツヅマブ（Ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）；アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）；アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）；アレファセプト（Ａｌｅｆａｃｅｐｔ）；アラシズマブ ぺゴール（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）；アナキンラ（Ａｎａｋｉｎｒａ）；アルシツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）；アタシセプト（Ａｔａｃｉｃｅｐｔ）；アトリズマブ（Ａｔｌｉｚｕｍａｂ）；アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）；バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）；バミネルセプト（Ｂａｍｉｎｅｒｃｅｐｔ）；ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）；ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）；ベシレソマブ（Ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ）；ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）；ビシロマブ（Ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）；ベラタセプト（Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ）；ブレンツキシマブ ベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）；ブロダルマブ（Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）；カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）；カプロマブ ペンデチド（Ｃａｐｒｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）；カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）；セルトリズマブ ぺゴール（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）；セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）；クリバツズマブ テトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）；ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）；デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）；エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）；エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）；エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）；エフングマブ（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）；イロクテイト（Ｅｌｏｃｔａｔｅ）；エルツマクソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）；エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）；エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）；ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）；ファーレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）；フォントリズマブ（Ｆｏｎｔｏｌｉｚｕｍａｂ）；ゲムツズマブ オゾガミチン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）；ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）；ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）；イブリツモマブ チウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）；イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）；イムシクロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）；インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）；イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）；ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）；メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）；モタビズマブ（Ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ）；ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３；ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）；ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）；ノフェツモマブ メルペンタン（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）; オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）；オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）；オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）；オレゴボマブ（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）；パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）；パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）；ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）；ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）；ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）；ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）；ラクシバクマブ（Ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）；リツクシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）；リロナセプト（Ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）；ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）；ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）；スレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）；タカツズマブ テトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）；テフィバズマブ（Ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）；トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）；トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）；アド（Ａｄｏ）−トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ） エムタンシン（Ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）；トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）；ＴＲＢＳ０７；ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）；ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）；ビシリズマブ（Ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）；ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）；ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）；ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）から選択される。

ポリぺプチドの精製は、ポリペプチドに結合するだろう物質を含むアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）（東洋ソーダ製造株式会社（Ｔｏｙｏ Ｓｏｄａ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ））、またはシバクロンブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｍ ｂｌｕｅ）３ＧＡ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）（ファルマシア ファイン ケミカルズ インク． ニューヨーク）のようなアフィニティー樹脂上での一つ以上のカラムステップ；溶出を含む一つ以上のステップ；および／または免疫アフィニティークロマトグラフィーを含んでもよい。ポリペプチドは、精製を容易にする形態で発現されてもよい。たとえば、それらのマルトース結合ポリペプチド （ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはチオレドキシン（ＴＲＸ）のような融合ポリペプチドとして発現されてもよい。当該融合ポリペプチドの発現および精製のためのキットは、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ）(ビバリー、マサチューセッツ州)、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）(ピスカタウェイ、ニュージャージー州)、インビトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）からそれぞれ市販されている。ポリペプチドは、エピトープと共に標識化され、続いて、当該エピトープに直接的な特異的抗体を用いて精製されてもよい。当該エピトープの一つ（ＦＬＡＧ（登録商標）) はコダック（Ｋｏｄａｋ）(ニューヘブン、コネチカット州)から市販されている。発現されたポリペプチドをアフィニティー精製するために、組換え体ポリペプチドに対するモノクローナル抗体などのようなポリペプチド結合タンパク質を含むアフィニティーカラムを利用することも可能である。他の型のアフィニティー精製ステップは、（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）タンパク質Ａ、またはタンパク質Ｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）カラムであってもよく、それらのアフィニティー物質は、Ｆｃドメインを含むタンパク質に結合する。ポリペプチドは、例えば高塩溶出バッファー中で、その後、使用のために低塩バッファーに透析される、または、利用されるアフィニティーマトリックスに依存してｐＨもしくは他の要素を変更することによってなど、従来の技術を使用して、アフィニティーカラムから除去されてもよく、またはアフィニティー部分の自然に発生する基質を用いて競争的に除去されてもよい。

上記詳細における特定の実施形態および本発明は、以下の実施例として示されてもよく、多くの変更がその教示から逸脱することなく、実施形態および実施例において可能であることを、当業者は、明確に理解されるだろう。

ＣＨＯ細胞系列を、ジヒドロ葉酸還元酵素 （ｄｈｆｒ）のコトランスフェクションによって設立し、ｄｈｆｒ−欠損ＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）にトランスフェクトされた関心のある遺伝子を、続いてｄｈｆｒ／ＭＴＸ媒介遺伝子増幅した。クローンを、組換えｒ−ＤＮＡ技術に関連する当該技術分野で周知の方法に従って調製した。

実施例１：単相性工程によるエタネルセプトの産生
種子発展工程
種子発展を、ＭＴＸと共に４ｍＭ Ｌ−グルタミンを追加した成長培地で、０．３×１０^６細胞／ｍＬで、細胞バンクからの試料瓶の再生後に開始した。ＭＴＸの濃度を、種子発展段階を通して８０ｎＭで維持した。種子培養を、振とうフラスコで、３７℃、５％ＣＯ２濃度、１２０ｒｐｍ、および約８０％の相対湿度で維持した。

対数期で７２時間毎後に、０．３×１０^６細胞／ｍＬに希釈することによって、続く継代毎に種子量を十分に増幅した。Ｎ−２種子を０．３×１０^６細胞／ｍＬで開始し、さらに（開始量の）１０％の配合飼料を、２４時間、および７２時間で追加し、１２０時間培養した。

５．５×１０^６細胞／ｍＬのＶＣＣで、生存率９５％を超えるＮ−２フラスコからの対数期細胞を、１．２×１０^６細胞／ｍＬの初期種子密度を有するＮ−１フラスコをインキュベートするために使用した。

Ｎ−１種子フラスコを、６．６×１０^６細胞／ｍＬの生存細胞密度、９５％を超える生存率を得るために、（開始量の）１０％の配合飼料を、２４時間、および７２時間で供給し、１２０時間培養した。
生産バイオリアクター工程
バッチ工程を、単相性生産バイオリアクターにおいて、最終バッチ量の約５５％で成長培地を含むバイオリアクターに、１．２×１０^６細胞／ｍＬの（種子の接種後）開始ＶＣＣで、９８％を超える生存率で、Ｎ−１種子を接種することによって開始した。培養ｐＨを、８％の炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、またはＣＯ_２ガスの添加によってｐＨ６．７〜ｐＨ７．４の範囲のｐＨに維持した。撹拌スピードを、０．３〜０．５ｍ／ｓの範囲の先端スピードに設定し、溶解酸素濃度を、空気を０．００〜０．０３ｖｖｍ、酸素を０．００〜０．０９ｖｖｍで注入することによって５０％溶解酸素飽和度で維持した。温度を、生産バイオリアクター工程（単相性）の間ずっと３４℃の単一設定点で設定した。リアクターへの栄養補給を、残存グルコースレベルに基づいて行った。培養のグルコース濃度を２４時間毎に観察し、残存グルコースレベルが２ｇ／Ｌより下になると栄養（栄養は、３３．５ｇ／ｌグルコースを含む。）を添加して２４時間毎に３ｇ／Ｌに調節した。２００ｍＭのＬ−グルタミン溶液を、開始量の１％で、４８時間の培養に、４８時間ごとで、そのうえ、２４０時間まで添加した。培養は約１１×１０^６細胞／ｍＬのピークＶＣＣを達成した。培養の採取を２６４時間で行った。

実施例２：単相性工程によるベバシズマブの産生
種子発展工程
種子発展を、６ｍＭ Ｌ−グルタミンを追加した成長培地で、０．４×１０^６細胞／ｍＬで、細胞バンクからの試料瓶の再生後に開始した。種子培養を、振とうフラスコで、３７℃、８％ＣＯ_２濃度、１５０ｒｐｍ、および約８０％の相対湿度で維持した。

対数期で７２時間毎後に、０．４×１０^６細胞／ｍＬに希釈することによって、続く継代毎に種子量を十分に増幅した。
Ｎ−１種子フラスコを、５．５×１０^６細胞／ｍＬの生存細胞密度、９５％を超える生存率を得るために、７２時間培養した。

生産バイオリアクター工程
バッチ工程を、単相性生産バイオリアクターにおいて、最終バッチ量の約６９％で成長培地を含むバイオリアクターに、１×１０^６細胞／ｍＬの（種子の接種後）開始ＶＣＣで、９８％を超える生存率で、Ｎ−１種子を接種することによって開始した。培養ｐＨを、８％の炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、またはＣＯ_２ガスの添加によってｐＨ６．８〜ｐＨ７．４の範囲のｐＨに維持した。撹拌スピードを、０．３〜０．５ｍ／ｓの範囲の先端スピードに設定し、溶解酸素濃度を、空気を０．００〜０．０３ｖｖｍ、酸素を０．００〜０．０９ｖｖｍで注入することによってコントロールされた５０％溶解酸素飽和度で維持した。温度を、生産バイオリアクター工程（単相性）の間ずっと３４℃の単一設定点で設定した。リアクターへの栄養補給を、残存グルコースレベルに基づいて行った。培養のグルコース濃度を２４時間毎に観察し、残存グルコースレベルが２ｇ／Ｌより下になると栄養（栄養は、３３．５ｇ／ｌグルコースを含む。）を添加して２４時間毎に４ｇ／Ｌに調節した。２００ｍＭのＬ−グルタミン溶液を、開始量の１％で、９６時間、１６８時間、２１６時間の培養に添加した。培養は約１１×１０^６細胞／ｍＬのピークＶＣＣを達成した。培養の採取を２６４時間で行った。

実施例３：単相性工程によるリツキシマブの産生
種子発展工程
液体窒素からリツキシマブの試料瓶を解凍し、細胞を、成長培地を含む１２５ｍＬ振とうフラスコ中に接種し、ＣＯ_２インキュベーター振とう器で３７℃、１２０ｒｐｍで培養した。細胞を、生産バイオリアクターに接種するのに適切な培養量の増加を伴って、７２時間±２４時間毎に継代した。各継代において、種子密度は、０．３×１０^６細胞／ｍＬで維持し、最終ＶＣＣが３．０±１．０×１０^６細胞／ｍＬとなることを目標にした。
生産バイオリアクター工程
バッチ工程を、単相性生産バイオリアクターにおいて、最終バッチ量の約４０±５％で成長培地を含むバイオリアクターに、０．５±０．２×１０^６細胞／ｍＬの（種子の接種後）開始ＶＣＣで、９０％を超える生存率で、より好ましくは、０．５×１０^６細胞／ｍＬのＶＣＣで、９５％を超える生存率でＮ−１種子を接種することによって開始した。撹拌スピードを、０．４〜０．６ｍ／ｓの範囲の先端スピードに設定した。温度を、生産バイオリアクター工程の間ずっと単一設定点、すなわち３６℃で設定した。生産バイオリアクターへの栄養補給を、細胞培養維持、生産性、および生産品質特性のために、２日、３日、５日、６日、７日、および８日目に行った。グルタミンおよびグルコースを、細胞培養維持のために、細胞培養の間ずっと、それぞれ約２ｍＭおよび２ｇ／Ｌに維持した。培養の採取を３１２時間以下で、または細胞生存率が５０％より低くなる、のどちらか早い方で行った。

実施例４：単相性工程によるアダリムマブの産生
種子発展工程
液体窒素からアダリムマブの試料瓶を解凍し、細胞を、成長培地を含む１２５ｍＬ振とうフラスコ中に接種し、ＣＯ_２インキュベーター振とう器で３７℃、１２０ｒｐｍで培養した。細胞を、生産バイオリアクターに接種するのに適切な培養量の増加を伴って、７２時間±２４時間毎に継代した。各継代において、種子密度は、０．３×１０^６細胞／ｍＬで維持し、最終ＶＣＣが３．０±１．０×１０^６細胞／ｍＬとなることを目標にした。
生産バイオリアクター工程
バッチ工程を、単相性生産バイオリアクターにおいて、最終バッチ量の約６０±１０％で成長培地を含むバイオリアクターに、０．５±０．２×１０^６細胞／ｍＬの（種子の接種後）開始ＶＣＣで、９０％を超える生存率で、より好ましくは０．５×１０^６細胞／ｍＬのＶＣＣで、９５％を超える生存率で、Ｎ−１種子を接種することによって開始した。撹拌スピードを、０．６±０．２ｍ／ｓの範囲の先端スピードに設定した。温度を、生産バイオリアクター工程の間ずっと３６℃で、単一設定点で設定した。栄養補給を、細胞培養維持、生産性、および生産品質特性のために、３日、６日、９日、および１１日目に行った。グルタミンおよびグルコースを、細胞培養維持のために、細胞培養の間ずっと、それぞれ約２ｍＭおよび２ｇ／Ｌに維持した。採取基準を、細胞生存率が５０％以下、または２８８時間±１２時間、のどちらか早い方に設定した。

実施例５：単相性工程によるトラスツズマブの産生
種子発展工程
液体窒素からトラスツズマブの試料瓶を解凍し、細胞を、成長培地を含む１２５ｍＬ振とうフラスコ中に接種し、ＣＯ_２インキュベーター振とう器で３７℃、１２０ｒｐｍ、５％ＣＯ_２、８５％相対湿度で培養した。細胞を、生産バイオリアクターに接種するための培養量の増加を伴って、７２時間±２４時間毎に継代した。各継代において、種子密度は、０．３×１０^６細胞／ｍＬで維持し、最終ＶＣＣが３．０±１．０×１０^６細胞／ｍＬとなることを目標にした。
生産バイオリアクター工程
バッチ工程を、単相性生産バイオリアクターにおいて、最終バッチ量の約４０±５％で成長培地を含むバイオリアクターに、０．５±０．２×１０^６細胞／ｍＬの（種子の接種後）開始ＶＣＣで、９０％を超える生存率で、より好ましくは０．５×１０^６細胞／ｍＬのＶＣＣで、９５％を超える生存率でＮ−１種子を接種することによって開始した。撹拌スピードを、０．４〜０．６ｍ／ｓの範囲の先端スピードに設定した。温度を、生産バイオリアクター工程の間ずっと３４℃で設定した。リアクターへの栄養補給を、細胞培養寿命、生産性、および生産品質特性を維持するために、２日、４日、６日、８日、および１０日目に行った。グルタミンおよびグルコースを、細胞培養維持のために、細胞培養の間ずっと、それぞれ約２ｍＭおよび２ｇ／Ｌで維持した。培養の採取を３１２時間以下で、または細胞生存率が５０％より低く落ちる、のどちらか早い方で行った。

すべての特許、特許出願および本願出願において引用された出版物は、各個々の特許、特許出願または出版物が個々に示されたのと同程度に、全ての目的のために当該全体の参照によって本願に組み込まれる。

Claims (38)

1. 哺乳動物細胞において糖タンパク質を生産する工程であって、次のステップ：
   ａ）種子発達中に適切な細胞濃度で接種材料を調製すること、
   ｂ）生産バイオリアクターに適切な細胞濃度の前記接種材料を接種すること、
   ｃ）適切な条件で生産バイオリアクター中で細胞培養すること、ここで前記適切な条件は単相性温度条件である；および
   ｄ）前記細胞培養から糖タンパク質を得ること、
   を含む、工程。
2. 前記単相性温度は、約３２℃〜約３７℃の範囲から選択される、請求項１に記載の工程。
3. 前記単相性温度は、約３４℃〜約３７℃の範囲から選択される、請求項１に記載の工程。
4. 前記単相性温度は、約３３℃である、請求項２または請求項３に記載の工程。
5. 前記単相性温度は、約３４℃である、請求項２または請求項３に記載の工程。
6. 前記単相性温度は、約３５℃である、請求項２または請求項３に記載の工程。
7. 前記単相性温度は、約３６℃である、請求項２または請求項３に記載の工程。
8. 前記単相性温度は温度変化を含まない、請求項１に記載の工程。
9. 前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞から選択される、請求項１に記載の工程。
10. 前記ＣＨＯ細胞は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞である、請求項９に記載の工程。
11. 前記哺乳動物細胞は、生産パイオリアクター中でフェド−バッチモードで培養される、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の工程。
12. 前記細胞培養は、特有の成長相および生産相を有しない、請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載の工程。
13. 前記適切な条件は、ｐＨ６．７〜ｐＨ７．４から選択されるｐＨをさらに含む、請求項１に記載の工程。
14. 前記適切な条件は、約ｐＨ７をさらに含む、請求項１３に記載の工程。
15. 前記適切な条件は、約２５０ｍＯＳｍ／Ｋｇ〜約５５０ｍＯＳｍ／Ｋｇのオスモル濃度をさらに含む、請求項１に記載の工程。
16. 前記オスモル濃度は、約２７０ｍＯＳｍ／Ｋｇである、請求項１５に記載の工程。
17. 前記哺乳動物細胞は、血清添加培地、または無血清培地中で培養される、請求項１〜請求項１６のいずれか一項に記載の工程。
18. 前記哺乳動物細胞は、無血清培地中で培養される、請求項１７に記載の工程。
19. 前記哺乳動物細胞は、アルカノン酸またはアルカノン酸の塩を基本的に含まない培地中で培養される、請求項１〜請求項１８のいずれか一項に記載の工程。
20. 前記アルカノン酸またはアルカノン酸の塩は、酪酸、酪酸ナトリウム、またはジブチルｃＡＭＰから選択される、請求項１９に記載の工程。
21. 前記適切な条件は、約３０％〜約７０％の溶解酸素濃度をさらに含む、請求項１に記載の工程。
22. 前記接種材料の適切な濃度は、約４×１０^６細胞／ｍＬ〜約７×１０^６細胞／ｍＬから選択される、請求項１に記載の工程。
23. 前記接種材料の適切な濃度は、少なくとも７２時間で得られる、請求項１に記載の工程。
24. 前記タンパク質は、融合タンパク質、およびモノクローナル抗体、並びにそれらの断片から選択される、請求項１に記載の工程。
25. 前記融合タンパク質、およびモノクローナル抗体、並びにそれらの断片は、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）；アバタセプト（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）；アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）；アブリルマブ（Ａｂｒｉｌｕｍａｂ）；アフツヅマブ（Ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）；アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）；アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）；アレファセプト（Ａｌｅｆａｃｅｐｔ）；アラシズマブ ぺゴール（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）；アナキンラ（Ａｎａｋｉｎｒａ）；アルシツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）；アタシセプト（Ａｔａｃｉｃｅｐｔ）；アトリズマブ（Ａｔｌｉｚｕｍａｂ）；アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）；バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）；バミネルセプト（Ｂａｍｉｎｅｒｃｅｐｔ）；ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）；ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）；ベシレソマブ（Ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ）；ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）；ビシロマブ（Ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）；ベラタセプト（Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ）；ブレンツキシマブ ベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）；ブロダルマブ（Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）；カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）；カプロマブ ペンデチド（Ｃａｐｒｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）；カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）；セルトリズマブ ぺゴール（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）；セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）；クリバツズマブ テトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）；ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）；デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）；エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）；エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）；エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）；エフングマブ（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）；イロクテイト（Ｅｌｏｃｔａｔｅ）；エルツマクソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）；エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）；エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）；ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）；ファーレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）；フォントリズマブ（Ｆｏｎｔｏｌｉｚｕｍａｂ）；ゲムツズマブ オゾガミチン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）；ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）；ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）；イブリツモマブ チウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）；イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）；イムシクロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）；インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）；イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）；ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）；メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）；モタビズマブ（Ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ）；ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３；ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）；ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）；ノフェツモマブ メルペンタン（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）; オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）；オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）；オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）；オレゴボマブ（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）；パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）；パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）；ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）；ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）；ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）；ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）；ラクシバクマブ（Ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）；リツクシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）；リロナセプト（Ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）；ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）；ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）；スレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）；タカツズマブ テトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）；テフィバズマブ（Ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）；トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）；トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）；アド（Ａｄｏ）−トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ） エムタンシン（Ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）；トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）；ＴＲＢＳ０７；ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）；ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）；ビシリズマブ（Ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）；ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）；ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）；ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）
    から選択される、請求項２４に記載の工程。
26. 前記融合タンパク質は、エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）である、請求項２４または請求項２５に記載の工程。
27. 前記培養条件は、高い生細胞数を維持する、請求項１に記載の工程。
28. 前記生細胞数は、約５×１０^６細胞／ｍＬ〜約１３×１０^６細胞／ｍＬから選択される、請求項２７に記載の工程。
29. 前記生細胞数は、約１１×１０^６細胞／ｍＬである、請求項２８に記載の工程。
30. 前記糖たんぱく質の所望の確認を改善する、請求項１〜請求項２９のいずれか一項に記載の工程。
31. 前記エタネルセプトのようなＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の所望の確認を改善する、請求項１〜請求項３０のいずれか一項に記載の工程。
32. 前記哺乳動物細胞は、少なくとも約１０日間〜約１３日間、生産パイオリアクター中で培養される、請求項１に記載の工程。
33. 前記哺乳動物細胞は、少なくとも約１１日間、生産パイオリアクター中で培養される、請求項３２に記載の工程。
34. 哺乳動物細胞において融合タンパク質、モノクローナル抗体、並びにそれらの断片を生産する工程であって、次のステップ：
    ａ）種子発達中に適切な細胞濃度で接種材料を調製すること、
    ｂ）生産バイオリアクターに適切な細胞濃度の前記接種材料を接種すること、
    ｃ）適切な条件で生産バイオリアクター中で細胞培養すること、ここで前記適切な条件は単相性温度条件である；および
    ｄ）前記細胞培養から糖タンパク質を得ること、
    を含み、
    ここで、前記適切な条件は、
    ｉ）単相性温度条件は、約３４℃〜約３７℃から選択され、
    ｉｉ）ｐＨはｐＨ６．７〜７．４から選択され、
    ｉｉｉ）オスモル濃度は、約２５０ｍＯＳｍ／Ｋｇ〜約５５０ｍＯＳｍ／Ｋｇである、工程。
35. 哺乳動物細胞において融合タンパク質、モノクローナル抗体、並びにそれらの断片を生産する工程であって、次のステップ：
    ａ）種子発達中に適切な細胞濃度で接種材料を調製すること、
    ｂ）生産バイオリアクターに適切な細胞濃度の前記接種材料を接種すること、
    ｃ）適切な条件で生産バイオリアクター中で細胞培養すること、ここで前記適切な条件は単相性温度条件である；および
    ｄ）前記細胞培養から糖タンパク質を得ること、
    を含み、
    ここで、前記適切な条件は、
    ｉ）単相性温度条件は、約３４℃〜約３７℃から選択され、
    ｉｉ）ｐＨはｐＨ６．７〜７．４から選択され、
    ｉｉｉ）オスモル濃度は、約２５０ｍＯＳｍ／Ｋｇ〜約５５０ｍＯＳｍ／Ｋｇであり、
    ここで、アルカノン酸またはアルカノン酸の塩を基本的に含まない培地で培養され、
    ここで、前記細胞培養は、特有の成長相および生産相を有しない、
    、工程。
36. 哺乳動物細胞においてＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質を生産する工程であって、次のステップ：
    ａ）種子発達中に適切な細胞濃度で接種材料を調製すること、
    ｂ）生産バイオリアクターに適切な細胞濃度の前記接種材料を接種すること、
    ｃ）適切な条件で生産バイオリアクター中で細胞培養すること、ここで前記適切な条件は単相性温度条件である；および
    ｄ）前記細胞培養から糖タンパク質を得ること、
    を含み、
    ここで、前記適切な条件は、
    ｉ）単相性温度条件は、約３４℃〜約３７℃から選択され、
    ｉｉ）ｐＨはｐＨ６．７〜７．４から選択され、
    ｉｉｉ）オスモル濃度は、約２５０ｍＯＳｍ／Ｋｇ〜約５５０ｍＯＳｍ／Ｋｇである、工程。
37. 前記細胞は、ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＣＨＯ Ｓ、ＣＨＯ Ｋ１、またはＣＨＯ ＤＧ４４から選択される、請求項１〜請求項３６のいずれか一項に記載の工程。
38. 請求項１〜請求項３７のいずれか一項に記載の工程から得られる融合タンパク質、またはモノクローナル抗体、およびそれらの断片。