CN111373028B - 蛋白质的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，主要提供了糖基化修饰受调节的抗原结合蛋白的制备和生产方法，包括在细胞培养周期中向培养体系添加氨基酸。可用于调节抗原结合蛋白的糖基化修饰、提高蛋白稳定性，使蛋白的补体依赖的细胞毒性作用的相关功能发生改变，并提高生产工艺的可控性和蛋白的批间一致性。

Description

蛋白质的生产方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言涉及一种蛋白质的制备方法和生产方法，尤其是抗体的制备方法和生产方法。

背景技术

糖基化是治疗性抗体重要的翻译后修饰，糖基化最常见两种形式为O-糖(寡糖与含羟基氨基酸如Ser、Thr或Tyr连接)及N-糖(寡糖与Asn-X-Ser/Thr连接，X为除Pro外任何氨基酸)，对于CHO细胞，N-糖基化通常位于抗体重链Fc片段(CH2区)Asn297位点。蛋白糖基化起始于内质网及高尔基体，在糖基转移酶和糖苷酶及底物作用下切除葡萄糖(Glucose)及甘露糖(Mannose)残基并连接N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、唾液酸(Sialic Acid)、岩藻糖(Fucose)、半乳糖(Galactose)等糖基团形成复杂且多样的糖型结构，这些糖型基团分布直接影响着抗体免疫原性及生物学功能(Hossler P，Khattak SF，Li ZJ.Optimal andconsistent protein glycosylation in mammalian cell culture[J].Glycobiology，2009，19(9)：936-949；Zheng K，Yarmarkovich m，Bantog C，et al.Influence ofglycosylation pattern on the molecular properties of monoclonal antibodies[J].MAbs，2014，6(3)，649-658)。其中，半乳糖基化的建立是利用半乳糖作为半乳糖基化链式反应的组成单元，通过半乳糖基转移酶将半乳糖连接于紧邻的N-乙酰葡糖胺糖，半乳糖基化修饰通过影响抗体Fc片段空间构象，增加其与Clq受体结合能力，从而达到增强补体依赖的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity；CDC效应)(LIU LM.AntibodyGlycosylation and Its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics ofMonoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins[J].Journal of pharmaceuticalsciences，2015，104：1866-1884.)。

对于有补体依赖的细胞毒性(CDC)效应的抗体，增加半乳糖基化修饰可提高其CDC效应从而增强其对靶细胞杀伤作用。对于没有或不需要CDC效应(比如采用不同1gG亚型或Fc糖修饰位点改造的方式使其丧失Fc受体结合功能)的抗体，在工艺过程中控制半乳糖基化修饰同样非常重要。半乳糖基化修饰极易受上游工艺参数、培养规模、反应器材质、场地变更及原材料等多种因素影响，半乳糖基修饰的批间一致性也是衡量抗体药物生产工艺可控性及稳定性的重要指标。目前，可以通过调控上游工艺中pH、pCO2或金属离子添加剂等调节半乳糖基化修饰，但此类调控方式通常伴随其它蛋白质量及产量的降低。WO2012149197采用向完全培养基中添加锰或半乳糖的方法以调节重组表达抗体的半乳糖基化水平。抗体半乳糖基化修饰偏低及批次间不稳定在单克隆抗体药物开发中常有发生，需提供一种增加抗体半乳糖基化修饰的方法，使半乳糖基化修饰提升，同时增强工艺的可控性，提高抗体的质量。

发明内容

本发明目的至少在于提供一种制备和/或生产蛋白质的方法。在一个方面，本发明提供一种制备和/或生产糖基化受调节的蛋白方法。在另一个方面，本发明提供一种制备和/或生产糖基化受调节的抗原结合蛋白的方法，可选地，所述抗原结合蛋白是抗体或其片段。本发明的目的还在于提供一种调节蛋白质糖基化修饰的方法。在一个方面，本发明提供一种调节蛋白糖基化修饰的方法。在另一个方面，本发明提供一种调节抗原结合蛋白的糖基化修饰的方法。在又一个方面，本发明提供一种调节抗体或其片段的半乳糖基化修饰的方法。

本发明目的至少还在于提供氨基酸的应用，具体地，提供氨基酸在体外调节蛋白糖基化修饰的应用。在一个方面，本发明提供一种氨基酸体外调节抗原结合蛋白的糖基化修饰的应用。在另一个方面，本发明提供一种氨基酸在制备和/或生产抗原结合蛋白过程中调节抗原结合蛋白糖基化的应用，可选地，所述抗原结合蛋白是抗体或其片段。本发明的目的还在于提供一种调节蛋白质糖基化修饰的方法，包括但不限于半乳糖基化修饰的调节。在又一个方面，本发明提供一种氨基酸调节抗体或其片段的半乳糖基化修饰的应用。

本发明目的还在于提供氨基酸的应用，在一个方面，本发明提供氨基酸在增强抗原结合蛋白稳定性中的应用，在另一个方面，本发明提供氨基酸在提高抗原结合蛋白或抗体药物的生产工艺的可控性和/或批间一致性中的应用。可选地，所述抗原结合蛋白是抗体或其片段。

本发明目的至少还在于提供一种制备和/或生产引起补体依赖的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity；CDC效应)的功能发生改变的蛋白质的方法，所述功能发生改变可以是功能的降低或功能的加强。在一个方面，本发明提供一种制备和/或生产引起CDC效应的功能增强的蛋白方法。在另一个方面，本发明提供一种制备和/或生产引起或触发CDC效应的功能加强或提高的抗原结合蛋白的方法，可选地，所述抗原结合蛋白是抗体或其片段。

在一些方案中，所述调节是指上调或下调。在一些具体的实施方案中，所述糖基化的调节是指增加半乳糖基化修饰，在另一些具体的实施方式中，所述调节是减少半乳糖基化修饰。在一些具体的实施方案中，所述CDC效应的调节是指增强抗原结合蛋白引发CDC效应的功能，在另一些具体的实施方式中，所述CDC效应的调节是指降低抗原结合蛋白引发CDC效应的功能。

在一些方案中，所述方法在细胞培养过程中调节培养介质中氨基酸的含量。在一些具体的实施方案中，所述培养介质是培养基。

在一些方案中，所述氨基酸选自组成蛋白质的氨基酸。在一些方案中，所述氨基酸是赖氨酸(Lysine)，可选地，所述氨基酸是L-和/或D-赖氨酸，优选L-赖氨酸。

抗体半乳糖基化修饰偏低及批次间不稳定在单克隆抗体药物开发中常有发生。在一个方面，本发明提供一种制备或生产抗体或其片段的方法，所述方法包括在细胞培养条件下，向培养体系中加入添加剂。例如，在细胞培养条件下，向培养基中加入添加剂或补料。在另一个方面，本发明提供一种增加抗体或其片段的半乳糖基化修饰的方法，尤其是提供一种通过培养基添加剂或补料来增加抗体或其片段的半乳糖基化修饰的方法。可选地，在细胞培养条件下，在培养周期内一次或多次等量或不等量地向培养基中补料添加一种氨基酸。

在一个具体实施方案中，以w/v计算，补加氨基酸总量为大约0-40g/L培养基，任选地，补加氨基酸总量为约1g/L、约2g/L、约3g/L、约4g/L、约5g/L、约6g/L、约7g/L、约8g/L、约9g/L、约10g/L、约11g/L、约12g/L、约13g/L、约14g/L、约15g/L、约20g/L、约25g/L、约30g/L、约35g/L或约40g/L。

在一个具体实施方案中，补加的氨基酸总量为约2-12g/L培养基；优选地，补加的氨基酸总量为约4-10g/L；更优地，补加的氨基酸总量为约8g/L培养基。

在一些方案中，补加的氨基酸选自组成蛋白质的氨基酸。

在一些方案中，补加的氨基酸选自赖氨酸，可选地，所述氨基酸是L-和/或D-赖氨酸，优选L-赖氨酸。

在一个具体实施方案中，以w/v计算，补加赖氨酸总量为大约0-40g/L培养基，任选地，补加赖氨酸总量为约1g/L、约2g/L、约3g/L、约4g/L、约5g/L、约6g/L、约7g/L、约8g/L、约9g/L、约10g/L、约11g/L、约12g/L、约13g/L、约14g/L、约15g/L、约20g/L、约25g/L、约30g/L、约35g/L或约40g/L培养基。

在一个具体实施方案中，补加的赖氨酸总量为4-10g/L培养基；优选地，补加的赖氨酸总量为，4-8g/L；更优地，补加的赖氨酸总量为8g/L培养基。

在一些方案中，在培养周期内补加氨基酸1-8次，优选2次、3次或4次。

在一个具体实施方案中，在培养周期的特定时间补加赖氨酸。任选地，在培养周期的任意两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天或十一天补加2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次或更多次。在一个具体实施方案中，所述补加可以是每次等量的补加，或每次不等量的补加。

在一些方案中，在培养周期的第N天、第N+2天、第N+4天及第N+6天中任意的一天补加氨基酸1次；在一个具体实施方案中，在培养周期的第N天、第N+2天、第N+4天及第N+6天中任意的两天补加氨基酸2次；在另一个具体实施方案中，在培养周期的第N天、第N+2天、第N+4天及第N+6天中任意的三天补加氨基酸3次。其中N为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数，优选为3、4或5，更优选为4。氨基酸选自赖氨酸，可选地，所述氨基酸是L-和/或D-赖氨酸，优选L-赖氨酸。

在一些具体实施方案中，在培养周期的第N天、第N+2天、第N+4天及第N+6天中任意的一天补加氨基酸1次，每次每升培养基中添加约4-10g氨基酸，总量为约4-10g/L培养基，其中优选每次每升培养基中添加约8g氨基酸，总量为约8g/L培养基；在培养周期的第N天、第N+2天、第N+4天及第N+6天中任意的两天，补加氨基酸2次，每次每升培养基中添加约2-5g氨基酸，总量为约4-10g/L培养基，其中优选每次每升培养基中添加约4g氨基酸，总量为约8g/L培养基；在另一个具体实施方案中，在培养周期的第N天、第N+2天、第N+4天及第N+6天中任意的三天补加氨基酸3次，总量为约4-10g/L培养基，优选总量为约8g/L培养基；在另一个具体实施方案中，在培养周期的第N天、第N+2天、第N+4天及第N+6天补加氨基酸4次，总量为约4-10g/L培养基，优选总量为约8g/L培养基。其中N为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数，优选为3、4或5，更优选为4。氨基酸选自赖氨酸，可选地，所述氨基酸是L-和/或D-赖氨酸，优选L-赖氨酸。

在一些具体实施方案中，在培养周期的第4天、第6天、第8天及第10天中任意的一天补加氨基酸1次，每次每升培养基中添加约4-10g氨基酸，总量为约4-10g/L培养基，其中优选每次每升培养基中添加约8g氨基酸，总量为约8g/L培养基；在培养周期的第4天、第6天、第8天及第10天中任意的两天，补加氨基酸2次，每次每升培养基中添加约2-5g氨基酸，总量为约4-10g/L培养基，其中优选每次每升培养基中添加约4g氨基酸，总量为约8g/L培养基；在另一个具体实施方案中，在培养周期的第4天、第6天、第8天及第10天中任意的三天补加氨基酸3次，总量为约4-10g/L培养基，优选总量为约8g/L培养基；在另一个具体实施方案中，在培养周期的第4天、第6天、第8天及第10天补加氨基酸4次，总量为约4-10g/L培养基，优选总量为约8g/L培养基。氨基酸选自赖氨酸，可选地，所述氨基酸是L-和/或D-赖氨酸，优选L-赖氨酸。

在一个具体实施方案中，在培养周期内的第4天、第6天、第8天及第10天，等量补加赖氨酸，即每次添加约2g每升培养基，总量为约8g/L培养基。

在一些方案中，本发明的氨基酸可以以固体形式或制备的浓缩液的形式加入培养基或培养体系。

在一些方案中，细胞培养基可以包含无血清和/或无动物来源的产物或成分。在一些具体实施方案中，细胞培养基可以是化学成分确定的，其中已知所有化学组分。如本领域技术人员所了解的，在适于所培养的具体细胞的前提下，可以由本领域技术人员在不进行过度实验的情况下在确定的培养基中培养动物或哺乳动物细胞。可以利用市售培养基，包括但不限于：CD OptiCHO、Hycell、CD CHO、GrowthA、Dynamis、伊斯科夫氏改良的杜尔贝科氏培养基(Iscove’s Modified Dulbecco′s Medium)、RPMI 1640和最低基础培养基-α(MEM-α)、杜尔贝科氏改良的伊格尔氏培养基(Dulbecco’s Modification of Eagle’sMedium，DMEM)、DME/F12、αMEM、具有厄尔BSS的厄尔基础培养基(Basal Medium Eagle withEarle’s BSS)、具有谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM、无谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM、无谷氨酰胺的低葡萄糖DMEM、具有谷氨酰胺的DMEM∶F12 1∶1、GMEM(格拉斯哥氏MEM(Glasgow’s MEM))、具有谷氨酰胺的GMEM、格雷斯完全昆虫培养基(Grace’s Complete Insect Medium)、无FBS的格雷斯昆虫培养基、具有谷氨酰胺的Ham’s F-10、具有谷氨酰胺的Ham’s F-12、具有HEPES和谷氨酰胺的IMDM、具有HEPES且无谷氨酰胺的IMDM、无谷氨酰胺或酚红的15(Leibovitz)(2X)、无谷氨酰胺的15(Leibovitz)、麦考伊氏改良培养基(McCoy′s 5A ModifiedMedium)、培养基199、无谷氨酰胺或酚红的伊格尔氏MEM(2X)、具有谷氨酰胺的伊格尔氏MEM-厄尔BSS、无谷氨酰胺的伊格尔氏MEM-厄尔BSS、无谷氨酰胺的伊格尔氏MEM-汉克斯BSS、具有谷氨酰胺的NCTC-109、具有谷氨酰胺的黎克特CM培养基(Richter’s CM Medium)、具有HEPES、谷氨酰胺和/或青霉素-链霉素的RPMI 1640、具有谷氨酰胺的RPMI 1640、无谷氨酰胺的RPMI 1640、施奈德昆虫培养基(Schneider’s Insect Medium)或本领域技术人员已知的针对具体细胞类型而配制的任何其它培养基。可以根据需要或需要时且如本领域的技术人员使用常规技能所知和实施，向上述示例性培养基添加适当浓度或量的补充组分或成分，包括任选的组分。

在一些方案中，细胞培养物还可以补充难以配制的或在细胞培养中快速消耗的具体营养素的补料。此类营养素可以为氨基酸，例如酪氨酸、半胱氨酸和/或胱氨酸。举例来说，浓缩酪氨酸溶液可以独立地补料至在含有酪氨酸的细胞培养基中生长的细胞培养物中。酪氨酸和胱氨酸的浓缩溶液也可以独立地补料至在缺乏酪氨酸、胱氨酸和/或半胱氨酸的细胞培养基中生长的细胞培养物。独立补料可以在制备或生产期前或制备或生产期开始时开始。可以使用方法或装置处理细胞培养基以在添加至生物反应器和/或细胞培养物前将培养基杀菌或消毒。

在一些方案中，用于本发明的细胞系或宿主细胞进行基因工程改造，以表达商业或科学关注的蛋白质。细胞系典型地来源于由可以维持培养无限时间的原始培养物产生的谱系。细胞可以含有例如经由转化、转染、感染或注射引入的表达载体(构建体)，例如质粒等，所述表达载体具有编码在培养方法中表达和生产的蛋白质的编码序列或其部分。此类表达载体含有插入编码序列转录和翻译所必需的元件。可以用众所周知并易于实施的方法构建含有编码所生产的蛋白质和多肽的序列，以及适用于转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。此类技术描述于J.Sambrook等人，2012，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第4版Cold SpringHarbor Press，Plainview，N.Y或任何在前版本；F.M.Ausubel等人，2013，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，N.Y或任何在前版本；Kaufman，R.J.，Large Scale Mammalian Cell Culture，1990，都以引用的方式并入本文中以达成任何目的。

在本发明中，动物细胞、哺乳动物细胞、培养细胞、动物或哺乳动物宿主细胞、宿主细胞、重组细胞、重组宿主细胞等等都是可以根据本发明的方法培养的细胞的术语。这些细胞是获自或来源于哺乳动物的细胞系，并能够在置于含有适当营养素和/或其它因子的培养基中进行单层培养或悬浮培养时生长和存活。典型地选择可以表达和分泌蛋白质，或可以在分子层面上进行工程化以表达和分泌大量具体蛋白质、更尤其是相关糖蛋白至培养基中的细胞。应当了解，由宿主细胞生产的蛋白质可以是宿主细胞内源性的或与其同源，或者蛋白质为与宿主细胞异源的(即外来的)，举例而言，人类蛋白质可以由中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞生产和分泌。此外，哺乳动物蛋白质或原始获自或来源于哺乳动物生物体的蛋白质可以通过本发明的方法获得并在一些方案可以被细胞分泌至培养基中。

本发明的方法可以用于培养多种细胞。在一个实施方案中，培养细胞为真核细胞，例如植物和/或动物细胞。细胞可以为哺乳动物细胞、鱼类细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞或鸟类细胞。适于培养生长的多种哺乳动物细胞系可得自存放机构以及商业供应商。可以用于本发明的方法中的细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，CHO-S细胞，CHO-DG44细胞，或本领域技术人员已知的任何其他细胞类型。

本发明可用于培养微型反应系统，也可用于中试小型生物反应器，例如培养1L、2L及3L等生物反应器，还可用于生产用的大型生物反应器，例如10L、50L等生物反应器。

在一个方面，本发明提供一种制备和/或生产糖基化受调节的抗原结合蛋白的方法，在另一个方面，本发明提供一种调节抗原结合蛋白的糖基化修饰的方法，在又一个方面，本发明提供一种调节抗体或其片段的半乳糖基化修饰的方法，所述抗原结合蛋白包括但不限于如下抗体或其片段：阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、阿克托克单抗(Actoxumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatumumab)、阿杜卡尼单抗(Aducanumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、阿夫土珠(Afutuzumab)、培化阿珠单抗(Alacizumab pegol)、ALD518、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿力罗克单抗(Alirocumab)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomabpentetate)、阿姆土西单抗(Amatuximab)、麻安莫单抗(Anatumomabmafenatox)、阿尼富路单抗(Anifrolumab)、安芦珠单抗(Anrukinzumab)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿缇努单抗(Atinumab)、阿特立单抗(Atlizumab)、阿托木单抗(Atorolimumab)、巴匹珠单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴土昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝利木单抗(Belimumab)、Benralizumab、柏替莫单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、贝茨罗特斯单抗(Bezlotoxumab)、比西单抗(Biciromab)、比玛格鲁单抗(Bimagrumab)、比伐单抗(Bivatuzumab mertansine)、兰妥莫单抗(Blinatumomab)、布鲁宗津单抗(Blosozumab)、布妥昔单抗(Brentuximabvedotin)、贝伐珠单抗(Briakinumab)、布达路单抗(Brodalumab)、卡那单抗(Canakinumab)、美坎珠单抗(Cantuzumab mertansine)、莫坎妥珠单抗(Cantuzumabravtansine)、卡普兰珠单抗(Caplacizumab)、卡罗单抗喷地妆(Capromabpendetide)、卡鲁单抗(Carlumab)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、cBR96-多柔比星免疫偶联物(doxorubicinimmunoconjugate)、西利珠单抗(Cedelizumab)、培舍珠单抗(Certolizumabpegol)、西妥昔单抗(Cetuximab)、泊西他珠单抗(Citatuzumabbogatox)、西妥木单抗(Cixutumumab)、克莱赞珠单抗(Clazakizumab)、克立昔单抗(Clenoliximab)、克莱维足单抗(Clivatuzumabtetraxetan)、可那木单抗(Conatumumab)、可那足单抗(Concizumab)、克雷内治单抗(Crenezumab)、达西珠单抗(Dacetuzumab)、达克珠单抗(Daclizumab)、达罗土珠单抗(D alotuzumab)、达拉土姆单抗(Daratumumab)、地莫米佐单抗(Demcizumab)、地舒单抗(Denosumab)、地莫单抗(Detumomab)、阿托度单抗(Dorlimomabaritox)、德罗图单抗(Drozitumab)、杜力戈图单抗(Duligotumab)、杜丕璐单抗(Dupilumab)、杜氏图单抗(Dusigitumab)、依美昔单抗(Ecromeximab)、依库珠单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依决洛单抗(Edrecolomab)、依法珠单抗(Efalizumab)、依夫单抗(Efungumab)、依德鲁单抗(Eldelumab)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、艾西莫单抗(Elsilimomab)、埃文单抗(Enavatuzumab)、培戈赖莫单抗(Enlimomab pegol)、艾诺克单抗(Enokizumab)、艾诺提克单抗(Enoticumab)、埃斯托西单抗(Ensituximab)、西依匹莫单抗(Epitumomabcituxetan)、依帕珠单抗(Epratuzumab)、厄利珠单抗(Erlizumab)、厄马索单抗(Ertumaxomab)、埃达珠单抗(Etaracizumab)、埃图力珠单抗(Etrolizumab)、艾沃单抗(Evolocumab)、艾韦单抗(Exbivirumab)、法索单抗(Fanolesomab)、法拉莫单抗(Faralimomab)、法拉图组单抗(Farletuzumab)、法希姆单抗(Fasinumab)、FBTA05、非维珠单抗(Felvizumab)、非扎奴单抗(Fezakinumab)、费希腊妥单抗(Ficlatuzumab)、芬妥木单抗(Figitumumab)、弗兰托单抗(Flanvotumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、弗罗鲁单抗(Foralumab)、福拉韦单抗(Foravirumab)、夫苏木单抗(Fresolimumab)、弗兰单抗(Fulranumab)、弗图希单抗(Futuximab)、加利昔单抗(Galiximab)、盖尼塔单抗(Ganitumab)、盖坦德单抗(Gantenerumab)、加维莫单抗(Gavilimomab)、吉妥珠单抗奥佐米星(Gemtuzumabozogamicin)、吉妥单抗(Gemtuzumab)、加沃坦珠单抗(Gevokizumab)、吉仁土希单抗(Girentuximab)、维德汀单抗(Glembatumumabvedotin)、戈利木单抗(Golimumab)、戈利昔单抗(Gomiliximab)、古谢夫单抗(Guselkumab)、替伊立珠单抗(Ibalizumab)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、依库单抗(Icrucumab)、伊戈伏单抗(Igovomab)、IMAB362、英西单抗(Imciromab)、英戈土珠单抗(Imgatuzumab)、英克拉库单抗(Inclacumab)、依坦希单抗(Indatuximabravtansine)、英利昔单抗(Infliximab)、伊诺莫单抗(Inolimomab)、伊珠单抗奥佐米星(Inotuzumab ozogamicin)、英妥木单抗(Intetumumab)、英妥木单抗(Ipilimumab)、英妥木单抗(Iratumumab)、依拓珠单抗(Itolizumab)、希凯珠单抗(Ixekizumab)、凯利昔单抗(Keliximab)、拉贝珠单抗(Labetuzumab)、拉姆布罗力珠单抗(Lambrolizumab)、拉姆帕力珠单抗(Lampalizumab)、来金珠单抗(Lebrikizumab)、来马索单抗(Lemalesomab)、乐地单抗(Lerdelimumab)、来沙木单抗(Lexatumumab)、利韦单抗(Libivirumab)、Ligelizumab、林妥珠单抗(Lintuzumab)、立鲁单抗(Lirilumab)、罗德希珠单抗(Lodelcizumab)、劳乌土珠单抗(Lorvotuzumabmertansine)、鲁卡木单抗(Lucatumumab)、鲁昔单抗(Lumiliximab)、马帕木单抗(Mapatumumab)、马格土希单抗(Margetuximab)、马司莫单抗(Maslimomab)、马妥珠单抗(Matuzumab)、美力姆单抗(Mavrilimumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、美替木单抗(Metelimumab)、米拉珠单抗(Milatuzumab)、明瑞莫单抗(Minretumomab)、米妥莫单抗(Mitumomab)、莫格穆里单抗(Mogamulizumab)、莫罗木单抗(Morolimumab)、莫他珠单抗(Motavizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫希土姆单抗(Moxetumomabpasudotox)、莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3)、他那可单抗(Nacolomabtafenatox)、纳米路单抗(Namilumab)、他那莫单抗(Naptumomabestafenatox)、纳瑞特单抗(Narnatumab)、那他珠单抗(Natalizumab)、奈巴库单抗(Nebacumab)、奈昔木单抗(Necitumumab)、奈瑞莫单抗(Nerelimomab)、耐西维单抗(Nesvacumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、妮威禄单抗(Nivolumab)、巯诺莫单抗(Nofetumomabmerpentan)、奥卡土珠单抗(Ocaratuzumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、奥度莫单抗(Odulimomab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥拉图单抗(Olaratumab)、奥鲁凯珠单抗(Olokizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、欧那土珠单抗(Onartuzumab)、欧土希珠单抗(Ontuxizumab)、莫奥珠单抗(Oportuzumabmonatox)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、奥泰单抗(Orticumab)、奥昔珠单抗(Otelixizumab)、奥特乐土珠单抗(Otlertuzumab)、欧西鲁单抗(Oxelumab)、欧赞尼珠单抗(Ozanezumab)、欧咗立珠单抗(Ozoralizumab)、帕昔单抗(Pagibaximab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕利珠单抗(Panitumumab)、帕尼库单抗(Pankomab)、帕诺库单抗(Panobacumab)、帕萨土珠单抗(Parsatuzumab)、帕考珠单抗(Pascolizumab)、帕特立珠单抗(Pateclizumab)、帕图单抗(Patritumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕尼单抗(Pemtumomab)、培拉凯珠单抗(Perakizumab)、培妥珠单抗(Pertuzumab)、培克珠单抗(Pexelizumab)、皮地利珠单抗(Pidilizumab)、平尼土珠单抗(Pinatuzumabvedotin)、平妥莫单抗(Pintumomab)、普拉库鲁单抗(Placulumab)、普拉土珠单抗(Polatuzumabvedotin)、珀珠单抗(Ponezumab)、普立昔单抗(Priliximab)、普陀希单抗(Pritoxaximab)、普立木单抗(Pritumumab)、PRO140、坤立珠单抗(Quilizumab)、雷库图单抗(Racotumomab)、雷德图单抗(Radretumab)、雷韦单抗(Rafivirumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、雷昔库单抗(Raxibacumab)、瑞加韦单抗(Regavirumab)、瑞利珠单抗(Reslizumab)、利妥木单抗(Rilotumumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、罗妥木单抗(Robatumumab)、罗勒杜单抗(Roledumab)、罗姆苏珠单抗(Romosozumab)、罗利珠单抗(Rontalizumab)、罗维珠单抗(Rovelizumab)、鲁利珠单抗(Ruplizumab)、沙玛立珠单抗(Samalizumab)、沙鲁单抗(Sarilumab)、沙妥莫单抗(Satumomabpendetide)、司库钦单抗(Secukinumab)、司瑞斑图单抗(Seribantumab)、斯图希单抗(Setoxaximab)、司韦单抗(Sevirumab)、SGN-CD19A、SGN-CD33A、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)、西法木单抗(Sifalimumab)、西图希单抗(Siltuximab)、西姆土珠单抗(Simtuzumab)、西利珠单抗(Siplizumab)、希瑞库单抗(Sirukumab)、苏兰珠单抗(Solanezumab)、苏力图单抗(Solitomab)、松普希珠单抗(Sonepcizumab)、松妥珠单抗(Sontuzumab)、司他芦单抗(Stamulumab)、硫索单抗(Sulesomab)、索维单抗(Suvizumab)、他贝鲁单抗(Tabalumab)、他珠单抗(Tacatuzumabtetraxetan)、他度珠单抗(Tadocizumab)、他利珠单抗(Talizumab)、他尼珠单抗(Tanezumab)、帕他莫单抗(Taplitumomabpaptox)、替非珠单抗(Tefibazumab)、阿替莫单抗(Telimomabaritox)、替妥莫单抗(Tenatumomab)、替奈昔单抗(Teneliximab)、替利珠单抗(Teplizumab)、替普单抗(Teprotumumab)、TGN1412、替西木单抗(Ticilimumab)(曲美木单抗(tremelimumab))、替加珠单抗(Tigatuzumab Tildrakizumab)、TNX-650、托珠单抗(Tocilizumab)(atlizumab)、托利珠单抗(Toralizumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、托维图单抗(Tovetumab)、曲洛青木单抗(Tralokinumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、TRBS07、曲加立珠(Tregalizumab)、曲美木单抗(Tremelimumab)、西莫白介素单抗(Tucotuzumabcelmoleukin)、妥韦单抗(Tuvirumab)、乌波利土西单抗(Ublituximab)、乌瑞鲁单抗(Urelumab)、乌珠单抗(Urtoxazumab)、优特克单抗(Ustekinumab)、伐提克图单抗(Vantictumab)、伐利昔单抗(Vapaliximab)、维特立珠单抗(Vatelizumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、维帕莫单抗(Vepalimomab)、维西库单抗(Vesencumab)、维西珠单抗(Visilizumab)、伏洛昔单抗(Volociximab)、伏妥土珠单抗(Vorsetuzumabmafodotin)、伏妥昔单抗(Votumumab)、扎芦木单抗(Zalutumumab)、扎木单抗(Zanolimumab)、扎土希单抗(Zatuximab)、齐拉木单抗(Ziralimumab)、阿佐莫单抗(Zolimomab aritox)，以及PCT/US2015/043723和CN201580042278.8的发明专利申请公布的任何抗体或其片段，包括但不限于：人源化的hu13C5-hIgG1、hu13C5-hIgG4、hu5G11-hIgG1、hu5G11-hIgG4，和/或嵌合的ch13C5-hIgG1、ch13C5-hIgG4、ch5G11-hIgG1、ch5G11-hIgG4，和/或杂交瘤抗体13C5、5G9、5G11、8C6、7B4、4D1、4A8、8H4、8H3、15F1等等(参见WO2016022630和CN107001463A)。所述抗原结合蛋白还可以包括与如下抗体或其片段有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的抗原结合蛋白：重链CDR1序列为Thr-Tyr-Gly-Val-His(SEQ ID NO：1)、CDR2序列为Val-Ile-Trp-Arg-Gly-Val-Thr-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-Met-Ser(SEQ ID NO：2)，CDR3序列为Leu-Gly-Phe-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr(SEQ ID NO：3)，和/或轻链CDR1序列为Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Asn-Asp-Val-Ala(SEQ ID NO：4)、CDR2序列为Tyr-Ala-Ala-Asn-Arg-Tyr-Thr(SEQ ID NO：5)，CDR3序列为Gln-Gln-Asp-Tyr-Thr-Ser-Pro-Tyr-Thr(SEQ ID NO：6)的抗体或抗体的片段。

PCT国际申请的公布数据WO2016022630公开了一类新的抗PD-L1抗体，对PD-L1具有较高的亲和力，能够显著抑制细胞表面的PD-L1和PD-1的相互作用，并显著促进T细胞分泌IL-2和IFN-γ，该国际申请公布的全部内容以及其中国同族专利申请公布(CN107001463A)的全部内容以引用的方式并入本文。

半乳糖基化修饰是单克隆抗体重要的翻译后修饰，例如影响抗体药物可控性、稳定性、批间一致性，此外，其可增加抗体CDC效应，然而半乳糖基化在培养工艺中较难调控，培养规模不同及工艺参数细微差异均较大程度地影响抗体半乳糖基化水平。令人吃惊的是，发明人发现可以通过培养基添加剂对半乳糖基化修饰进行调节，使半乳糖基化修饰发生明显提升，同时增强了工艺的可控性及重现性，保证蛋白质量批次间一致性；在达到调节半乳糖基化修饰的同时，其他抗体质量如酸区变体及聚体含量也有明显下降，提高了抗体的质量。

术语解释：

本文所用的术语“抗体”是指具有至少一个抗原结合结构域的结合蛋白。本发明的抗体和其片段可以是整个抗体或其任何片段。因此，本发明的抗体和片段包括单克隆抗体或其片段和抗体变体或其片段，以及免疫缀合物。抗体片段的实例包括Fab片段、Fab′片段、F(ab)′片段、Fv片段、分离的CDR区、单链Fv分子(scFv)和本领域已知的其他抗体片段。抗体和其片段还可以包括重组多肽、融合蛋白和双特异性抗体。本文公开的抗体和其片段可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体种类。本发明的抗体和其片段可以衍生自任何物种，其包括但不限于小鼠、大鼠、兔、灵长类动物、美洲驼和人。抗体和其片段可以是嵌合抗体、人源化抗体或完整的人抗体。在一个实施方案中，抗体是由源自小鼠的杂交瘤细胞系产生的抗体。在一个实施方案中，抗体是鼠类抗体。在另一个实施方案中，抗体是嵌合抗体。在另一个实施方案中，嵌合抗体是小鼠-人嵌合抗体。在另一个实施方案中，抗体是人源化抗体。在另一个实施方案中，抗体衍生自鼠类抗体并且是人源化的。

本文所用的术语“嵌合抗体”是下述抗体：所述抗体具有衍生自一种物种的重链可变区的至少一部分和轻链可变区的至少一部分；以及衍生自另一物种的恒定区的至少一部分。例如，在一个实施方案中，嵌合抗体可以包含鼠类可变区和人恒定区。

本文所用的术语“人源化抗体”是下述抗体：所述抗体含有衍生自非人抗体的互补决定区(CDR)；和衍生自人抗体的框架区以及恒定区。

本文所用的术语“衍生的”当用于指相对于参考抗体或其他结合蛋白的分子或多肽时，意指能够与参考抗体或其他结合蛋白特异性地结合相同表位的分子或多肽。

本文所用的术语“细胞培养基”或“培养基”是指细胞在人工体外环境中(多细胞机体或组织的外部)，用于维持、生长、增殖或扩增的营养物溶液。例如，可为支持细胞生长而制备的基础培养基，可为培养特定细胞优化细胞，或为促进单克隆抗体产生而制备的生产培养基，和通过高浓度地浓缩营养物而制备的浓缩培养基。营养物和培养基组分是指构成细胞培养基的组分，在本发明中它们可以互换使用。

本文所用术语“细胞周期”是指细胞接种至反应器培养的周期，以反应器培养的第0日为培养的起始日，可以记作培养周期的第一天。

本文所用的术语“抗原结合蛋白生产细胞”，是指用于生产抗原结合蛋白的细胞。

本文所用的术语“补料培养基”和“加料培养基”可以是指特定的营养物或多种营养物构成的培养基，它们均是基础培养基的浓缩组分。可以根据待培养的细胞，制备各异的补料培养基组分和浓度。

本文所用的术语“补体依赖的细胞毒作用(CDC)”是指补体参与的细胞毒作用，即通过特异性抗体与细胞膜表面相应抗原结合，形成复合物而激活补体经典途径，所形成的攻膜复合物对靶细胞发挥裂解效应。

附图说明

图1培养过程中细胞密度变化趋势，横坐标表示培养周期的天数(如D1表示培养周期的第一天)，纵坐标VCD表示每毫升培养液中细胞密度(×106cells)；

图2培养过程中细胞活率变化趋势，横坐标表示培养周期的天数(如D1表示培养周期的第一天)，纵坐标VA表示细胞活率百分比(％)；

图3蛋白表达量；

图4纯化后的抗体糖型分布，横坐标表示不同糖型，纵坐标表示各糖型的百分含量(％)；

图5模型分析：模型拟合(Summary of fit)；

图6模型分析：系数图(Scaled&Centered Coefficients)；

图7模型分析：等高线图(4D Contour of G0F、G1Fa、G1Fb及G2F)。

具体实施方式

本发明提供制备半乳糖基化修饰增加的抗原结合蛋白的方法，包括在抗原结合蛋白的生产细胞的培养周期中的特定时间加入氨基酸。氨基酸可以选自赖氨酸、赖氨酸浓缩液或含赖氨酸的培养基，可选地，所述氨基酸是L-和/或D-赖氨酸，优选L-赖氨酸。生产细胞培养周期中的特定时间可以是在培养周期的任意2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天补加2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次或更多次氨基酸。可以在生产细胞培养周期中的第N天、第N+2天、第N+4天及第N+6天中任意的1天、2天、3天或4天补加氨基酸1次、2次、3次或4次氨基酸，其中N为1-10的任一整数，优选为3、4或5，更优选为4。补加氨基酸总量可以为大约0-40g/L培养基，任选地，补加氨基酸总量为约1g/L、约2g/L、约3g/L、约4g/L、约5g/L、约6g/L、约7g/L、约8g/L、约9g/L、约10g/L、约11g/L、约12g/L、约13g/L、约14g/L、约15g/L、约20g/L、约25g/L、约30g/L、约35g/L或约40g/L培养基，任选地，所述补加为分次等量加入。

本发明提供提高抗原结合蛋白的稳定性方法，包括在抗原结合蛋白的生产细胞的培养周期中的特定时间加入氨基酸。氨基酸可以选自赖氨酸、赖氨酸浓缩液或含赖氨酸的培养基，可选地，所述氨基酸是L-和/或D-赖氨酸，优选L-赖氨酸。生产细胞培养周期中的特定时间可以是在培养周期的任意2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天补加2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次或更多次氨基酸。可以在生产细胞培养周期中的第N天、第N+2天、第N+4天及第N+6天中任意的1天、2天、3天或4天补加氨基酸1次、2次、3次或4次氨基酸，其中N为1-10的任一整数，优选为3、4或5，更优选为4。补加氨基酸总量可以为大约0-40g/L培养基，任选地，补加氨基酸总量为约1g/L、约2g/L、约3g/L、约4g/L、约5g/L、约6g/L、约7g/L、约8g/L、约9g/L、约10g/L、约11g/L、约12g/L、约13g/L、约14g/L、约15g/L、约20g/L、约25g/L、约30g/L、约35g/L或约40g/L培养基，任选地，所述补加为分次等量加入。

在本发明中，氨基酸可以用于体外调节抗原结合蛋白的糖基化修饰，包括在抗原结合蛋白生产细胞的培养周期中的特定时间加入适量氨基酸。氨基酸可以选自赖氨酸，可选地，所述氨基酸是L-和/或D-赖氨酸，优选L-赖氨酸，所述糖基化是蛋白的半乳糖基化。

在本发明中，氨基酸还可以用于提高抗原结合蛋白的稳定性，包括在抗原结合蛋白生产细胞的培养周期中的特定时间加入适量氨基酸。氨基酸可以选自赖氨酸，可选地，所述氨基酸是L-和/或D-赖氨酸，优选L-赖氨酸，所述糖基化是蛋白的半乳糖基化。

在本发明中，赖氨酸可以用于制备引起补体依赖的细胞毒性的功能发生改变的抗原结合蛋白，包括，调节在抗原结合蛋白生产细胞的培养介质中的赖氨酸的含量，以降低或加强抗原结合蛋白的引起补体依赖的细胞毒性的功能。

在一些方案中，所述抗原结合蛋白的生产细胞的培养周期可以是反应器培养周期，以反应器培养的第0日为培养的起始日，其可以被记作培养周期的第一天。

在一些方案中，所述抗原结合蛋白包括但不限于抗体或其衍生物，优选单克隆抗体或其衍生物。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，然而，本发明中这些实施例仅用于阐明而不限制本发明的范围。同样，本发明不限于本文描述的任何具体优选的实施方案。本领域技术人员应该理解，对本发明技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。除特别说明的以外，以下实施例采用的试剂均为市售产品，溶液的配制可以采用本领域常规技术。实施例中抗PD-L1人源化单克隆抗体根据WO2016022630中所述方法获得。

实施例1种子液制备

液氮罐中取PD-L1人源化单克隆抗体冻存工作细胞库细胞(GS CHO细胞系)一支(装量1ml)，37℃水浴解冻，转移至含种子培养基Dynamis(Thermofisher公司)的细胞培养摇瓶中，放置于二氧化碳恒温培养箱(Thermo公司)中培养。细胞密度约3.0～4.0×10⁶cells/ml时传代培养，传代后密度约为0.8+0.2×10⁶cells/ml，传代培养基为Dynamis(含100μg/ml MSX(Sigma公司))，摇瓶培养条件为：36.5℃、8％CO₂、130rpm。获取处于对数生长期且细胞状态良好的培养液为种子液。

实施例2反应器培养

将种子液接种于AMBR反应器(Sartorius-stedim，型号Ambr15-24)，基础培养基为Dynamis(Thermofisher公司)，温度初始设定为36.5℃，；转速设定为900rpm；DO(DissolvedOxygen；溶解氧)关联O₂自控初始设定为40％；pH值关联CO₂及0.5mol/L碳酸氢钠溶液自控，初始设定为7.00±0.20；空气Sparger持续恒通，通气量为0.02cm³/min(ccm)；培养周期11天。通过DOE实验设计(MODDE软件)对培养工艺参数pH、DO、降温温度及补料浓度进行条件优化，筛选因子为pH、DO、Arg(Sigma公司)、Lys(Sigma公司)及补料Feed2(Irvine Scientific公司)，pH设定值为6.7、7.2等多个水平，因子类型为Quantitative；DO设定值为20％、90％等多个水平，因子类型为Quantitative；Arg(argmine；精氨酸)设定值为每升培养基总加入量0、8g等多个水平，因子类型为Quantitative；Lys(lysine；赖氨酸)设定值为每升培养基总加入量0、8g等多个水平，因子类型为Quantitative；Feed2浓度设定值为18％、30％等多个水平，因子类型为Quantitative；响应值为G0F、G1Fa、G1Fb及G2F，采用Frac Fac Res V+设计模型模型。实验设计如表1，Arg、Lys及Feed2分别于D4、D6、D8及D10天等量补加，例如等量补加赖氨酸，即每次添加赖氨酸约2g每升培养基，总量为约8g/L培养基，pH及DO均于D5天调节。

表1实验设计(共17组实验)

实施例3抗体糖型检测方法

样品经PNGase-F酶切去除N-糖苷，加入冰乙醇沉淀蛋白，离心后取含有N-糖苷的上清液，干燥后进行2-AB(Sigma公司)标记，标记的2-AB Glycan通过超高效液相色谱法(UPLC)检测。

结果与分析：

本次实验对培养过程中pH、DO、Arg添加浓度、Lys及Feed2补料浓度进行条件筛选。培养过程中细胞密度及细胞活率变化趋势如图1及图2，收获后蛋白表达量如图3，图中看出培养过程中细胞生长状态均良好，添加赖氨酸的各组在平台期细胞密度均维持在8×10⁶cells/ml以上，细胞活率均维持在96％以上，与未添加组细胞密度及细胞活率相当；添加赖氨酸的各组细胞蛋白表达量均大于2.5g/L。

细胞收获液进行一步纯化后测定抗体糖型分布，如图4，中心点CS2-5、CS2-6及CS2-7的半乳糖基化修饰G0F、G1Fa、G1Fb及G2F的含量分别较稳定的维持在约33％、30％、13％以及17％，批间差异较小。

模型分析：

模型拟合(Summary of fit)：图5中响应值G0F、G1Fa、G2Fb及G2F的R2值、Q2值、Model Validity及Reproducibility均较高，说明模型与数据拟合度、模型预测性、模型有效性及可重复性均良好。

系数(Scaled&Centered Coefficients)：由图6可以看出，Lys、pH及DO为响应值G0F显著项，且均与G0F呈负相关；Lys及pH为响应值G1Fa显著项，且均与G1Fa呈负相关；Lys及pH为响应值G1Fb显著项，且均与G1Fb呈正相关；Lys、pH、Feed2及DO为响应值G2F显著项，Lys、pH、Feed2均与G2F呈正相关，DO与G2F呈负相关；另外模型还存在交互作用pH*Lys、DO*Feed2及Arg*Feed2等。

G0F、G1Fa、G1Fb及G2F等高线图：由图7可知，Lys及pH为响应值G0F、G1Fa、G1Fb及G2F显著项，其余因子及因子间交互效应微弱不列入考虑范围，Lys添加量由0增加至8g/L，G0F可降低20％；pH由7.25降低至6.75，G0F可降低30％；G0F与G1Fa、G1Fb及G2F为相互转换关系，降低G0F即可增加抗体半乳糖基化水平。

结论：添加Lys可有效增加半乳糖基化修饰，添加总量至8g/L培养基，G0F含量由未添加Lys的45％降低至25％，G1Fa、G1Fb及G2F含量均增加。另外，从中心点CS2-5、CS2-6及CS2-7的半乳糖基化修饰可以看出添加Lys可增加半乳糖基化修饰的批间一致性，从而增加了工艺的稳定性及可控性。

实施例4利妥昔单抗和曲妥珠单抗细胞培养

根据实施例1-3的相应的方法，依次进行利妥昔单抗和曲妥珠单抗生产细胞的种子液制备，反应器培养，抗体糖型检测，并进行结果分析和模型分析。结果显示，培养过程中添加Lys可有效增加单克隆抗体的半乳糖基化修饰，添加Lys的总量达到8g/L后，抗体G0F含量显著降低。

实施例5化学成分确定的培养基细胞培养

根据实施例1-3的相应的方法，将培养基置换为化学成分确定的典型的CHO培养基(确定的化学成分同CN103773732B的权利要求1的记载)，依次进行PD-L1人源化单克隆抗体冻存工作细胞库细胞(GS CHO细胞系)的种子液制备，反应器培养，抗体糖型检测，并进行结果分析和模型分析。结果显示，培养过程中添加Lys可有效增加单克隆抗体的半乳糖基化修饰，添加Lys的总量达到8g/L后，抗体G0F含量显著降低。

根据本发明所公开的内容，虽然根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但对本领域技术人员而言，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对在此所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。

本文所引用的所有文献的公开内容通过引用结合于此，引用程度为，他们提供示例性的、程序上和其他的细节补充本文所述内容。

Claims (7)

1.一种制备半乳糖基化修饰增加的抗原结合蛋白的方法，其特征在于，在抗原结合蛋白的生产细胞的培养周期中的特定时间加入氨基酸，其中，所述氨基酸选自赖氨酸、赖氨酸浓缩液或含赖氨酸的培养基，所述生产细胞的培养周期中的特定时间加入氨基酸是在生产细胞培养周期中的第4天、第6天、第8天及第10天等量补加赖氨酸4次，补加赖氨酸总量为8g/L培养基，并在生产细胞的培养周期中的第5天将初始pH 7.00 ± 0.20 调节至7.2。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述赖氨酸是L-赖氨酸。

3.权利要求1或2所述的方法在具有补体依赖的细胞毒性作用的抗原结合蛋白中加强所述抗原结合蛋白的引起补体依赖的细胞毒性的功能的应用。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述抗原结合蛋白的生产细胞的培养周期是反应器培养周期，以反应器培养的第0日为培养的起始日，记作培养周期的第一天。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体或其衍生物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述单克隆抗体选自抗PD-L1单克隆抗体、抗HER2单克隆抗体和抗CD20单克隆抗体。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述单克隆抗体为重链CDR1序列为Thr-Tyr-Gly-Val-His，重链CDR2序列为Val-Ile-Trp-Arg-Gly-Val-Thr-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-Met-Ser，重链CDR3序列为Leu-Gly-Phe-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr，和轻链CDR1序列为Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Asn-Asp-Val-Ala，轻链CDR2序列为Tyr-Ala-Ala-Asn-Arg-Tyr-Thr，以及轻链CDR3序列为Gln-Gln-Asp-Tyr-Thr-Ser-Pro-Tyr-Thr的单克隆抗体。

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