EA037568B1 - Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток и способы ее применения - Google Patents

Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток и способы ее применения Download PDF

Info

Publication number
EA037568B1
EA037568B1 EA201591817A EA201591817A EA037568B1 EA 037568 B1 EA037568 B1 EA 037568B1 EA 201591817 A EA201591817 A EA 201591817A EA 201591817 A EA201591817 A EA 201591817A EA 037568 B1 EA037568 B1 EA 037568B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
cell
cells
ornithine
interest
Prior art date
Application number
EA201591817A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201591817A1 (ru
Inventor
Шадиа Ошоди
Эми Джонсон
Шаун Лоуренс
Original Assignee
Регенерон Фарматютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51528781&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA037568(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Регенерон Фарматютикалз, Инк. filed Critical Регенерон Фарматютикалз, Инк.
Publication of EA201591817A1 publication Critical patent/EA201591817A1/ru
Publication of EA037568B1 publication Critical patent/EA037568B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0031—Serum-free culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/005—Protein-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/22—Zinc; Zn chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

В описании описана улучшенная, не содержащая сыворотки и гидролизата белков среда для культивирования клеток животных, содержащая 0,60,09 мМ орнитина, 0,7140,11 мМ путресцина и смесь аминокислот или их солей, которая может быть использована в способе получения представляющего интерес белка. Использование указанной среды позволяет улучшить плотность жизнеспособных клеток, снизить время удвоения клеток и увеличить продукцию представляющего интерес белка.

Description

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Изобретение относится к средам для культивирования клеток и для получения рекомбинантных белков. Изобретение конкретно относится к не содержащим сыворотки средам для культивирования рекомбинантных клеток CHO для получения белковых биотерапевтических средств.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Среды для культивирования клеток, содержащие компоненты сыворотки или гидролизата белков (т.е., пептоны и триптоны) имеют длительную историю применения в получении рекомбинантных белков из культивируемых клеток. Эти компоненты содержат факторы роста и широкий спектр других неохарактеризованных элементов, благоприятных для роста и культуры клеток. Однако они также содержат ^охарактеризованные элементы, которые уменьшают рост или иным образом отрицательно воздействуют на продукцию рекомбинантного белка. Они также могут являться нежелательным потенциальным источником вариабельности. Несмотря на их недостатки, преимущества использования сывороток и гидролизатов перевешивают определенные недостатки и их широко использовали во многих применениях культур клеток.
Как правило, биологические терапевтические средства (биофармацевтические средства) для человека получают в культурах клеток млекопитающих, в частности в культуре клеток CHO. Присутствие неохарактеризованных или частично охарактеризованных компонентов в этих культурах клеток для получения биофармацевтических средств для применения для человека крайне нежелательно. Использование таких неохарактеризованных или частично охарактеризованных компонентов не только вносит производственные и нормативные несоответствия, но и повышает возможность вирусной или грибковой инфекции продуцирующей культуры.
Другим важным фактором при выборе с культивирования является снижение вариабельности состава и выхода лекарственного продукта от партии к партии. Сыворотки, гидролизаты и другие неопределенные элементы вносят вариабельность в выход, состав и качество партии биофармацевтических препаратов. Качество и чистота элементов среды также может влиять на выход, так как титры лекарственных средств часто частично зависят от поддержания конкретного баланса питательных веществ. Когда относительные количества питательных веществ варьируют от одной партии среды к другой, выход лекарственного средства может варьировать и эта вариабельность может являться неприемлемой или невыгодной.
Использование сред, содержащих сыворотку, или сред на основе гидролизатов вносит трудности в дальнейшую переработку. Концентрация желаемого биофармацевтического средства в культуре, как правило, составляет порядка нескольких грамм на литр. Присутствие сыворотки и гидролизатов в средах может добавлять более 10 г/л неохарактеризованных пептидов и белков, которые необходимо удалить на последующих этапах обработки. Также сыворотка и гидролизаты могут вносить вариабельность в количество металлов и других микроэлементах в средах. Таким образом, удаление сыворотки и гидролизатов из сред для культивирования устраняет эти вариации и потенциальные препятствия для получения и обработки лекарственного вещества.
Наряду с другими преимущества использования не содержащих сывороток и гидролизатов сред включают снижение стоимости, снижение вариабельности между партиями лекарственных средств и минимизация риска внесения непредусмотренных средств из неопределенных и неочищенных компонентов. Кроме того, когда среды при запуске разных партий являются определенными и одинаковыми, подобным образом можно минимизировать оценочные запуски для тестирования новых партий сред по отношению к используемым средам. Таким образом, в данной области существует необходимость в средах для культивирования клеток млекопитающих, где среды являются химически определенными и не содержат сывороток и гидролизатов, или среды не содержат сывороток и содержат низкие контролируемые уровни гидролизатов, и при этом обеспечивают значительный и активный рост и поддержание клеток и продукцию биофармацевтических лекарственных веществ с высокими титрами.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Авторы изобретения сделали неожиданное открытие, что добавление орнитина с путресцином в среды для культивирования клеток, которые не содержат сыворотки (OS среды), увеличивает жизнеспособность и плотность клеток, уменьшает время удвоения клеток и обеспечивает продукцию белка этими клетками с высокими титрами. Авторы изобретения также выявили, что OS среды, которые не содержат белковых гидролизатов, в частности, обеспечивают жизнеспособность и плотность восстановленных клеток, время удвоения клеток и продукцию белка с высоким титром.
В одном из аспектов изобретение относится к среде для культивирования клеток, которая не содержит сыворотки и гидролизата белков, содержащая 0,6±0,09 мМ орнитина, 0,714±0,11 мМ путресцина и смесь аминокислот или их солей.
В одном из вариантов осуществления указанная среда содержит не менее 40±6 мМ смеси аминокислот или их солей.
В одном из вариантов осуществления указанная смесь аминокислот или их солей состоит из аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина,
- 1 037568 изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина.
В одном из вариантов осуществления указанная среда дополнительно содержит одну или несколько жирных кислот.
В одном из вариантов осуществления в указанной среде одна или несколько жирных кислот выбраны из линолевой кислоты, липоевой кислоты, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, арахидиновой кислоты, арахидоновой кислоты, лауриновой кислоты, бегеновой кислоты, каприловой кислоты, лауриновой кислоты, гексановой кислоты, лигноцериновой кислоты, миристиновой кислоты и октановой кислоты.
В одном из вариантов осуществления указанная среда дополнительно содержит смесь нуклеозидов.
В одном из вариантов осуществления в указанной среде смесь нуклеозидов включает аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин.
В одном из вариантов осуществления указанная среда дополнительно содержит один или несколько двухвалентных катионов.
В одном из вариантов осуществления в указанной среде один или несколько двухвалентных катионов выбраны из магния и кальция.
В другом аспекте изобретение относится к способу культивирования клеток, включающий этапы:
(а) предоставление среды для культивирования клеток по любому из предшествующих пунктов и (b) размножение или поддержание клеток в указанной среде с получением культуры клеток.
В одном из вариантов осуществления в указанном способе клетка выбрана из клетки млекопитающего, клетки птицы, клетки насекомых, клетки бактерий и клетки дрожжей.
В одном из вариантов осуществления клетка представляет собой клетку CHO.
В одном из вариантов осуществления клетка экспрессирует представляющий интерес белок.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок представляет собой антигенсвязывающий белок.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок содержит домен Fc.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок представляет собой слитый белок рецептор-Fc.
В одном из вариантов осуществления слитый белок рецептор-Fc представляет собой белокловушку.
В одном из вариантов осуществления белок-ловушка представляет собой антагонист IL-1 или антагонист VEGF.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок представляет собой антитело или фрагмент антитела.
В одном из вариантов осуществления антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантное антитело человека или его фрагмент.
В одном из вариантов осуществления среднее время удвоения клеток составляет не более 30 ч.
В одном из вариантов осуществления среднее время удвоения клеток составляет не более 24 ч.
В одном из вариантов осуществления культура клеток способна достигать плотности жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере на 15% больше, чем у культуры клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина
В одном из вариантов осуществления культура клеток способна достигать плотности жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере в 3 раза больше, чем у культуры клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.
В одном из вариантов осуществления указанный способ дополнительно включает добавление одной или нескольких добавок, которые выбраны из NaHCO3, глутамина, инсулина, глюкозы, CuSO4, ZnSO4, FeCl3, NiSO4, Na4 ЭДТА и цитрата Na3.
В еще одном аспекте изобретение относится к способу получения белка, представляющего интерес, включающий этапы:
(a) введение в клетку нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую представляющий интерес белок;
(b) отбор клетки, несущей эту нуклеиновую кислоту;
(c) культивирование отобранной клетки в указанной среде для культивирования клеток и (d) экспрессия представляющего интерес белка в клетке, причем представляющий интерес белок секретируется в среду.
В одном из вариантов осуществления клетка представляет собой клетку CHO, клетку HEK293 или клетку BHK.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок представляет собой антигенсвязывающий белок.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок содержит домен Fc.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок выбран из антитела; слитого
- 2 037568 с Fc белка и белка ScFv.
В одном из вариантов осуществления слитый с Fc белок представляет собой слитый белок растворимого TCR-Fc или слитый белок рецептор-Fc (TRAP).
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок получают со средним 7суточным титром, который по меньшей мере на 7% больше, чем средний 7-суточный титр, получаемый при культивировании клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок получают со средним 7суточным титром, который по меньшей мере на 14% больше, чем средний 7-суточный титр, получаемый при культивировании клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок получают со средним 7суточным титром, который по меньшей мере на 80% больше, чем средний 7-суточный титр, получаемый при культивировании клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок получают со средним 7суточным титром, который по меньшей мере в 2 раза больше, чем средний 7-суточный титр, получаемый при культивировании клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок получают со средним 7суточным титром, который по меньшей мере в 3 раза больше, чем средний 7-суточный титр, получаемый при культивировании клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок представляет собой рекомбинантное антитело человека.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Заявители сделали неожиданное открытие, что добавление орнитина или комбинации орнитина и путресцина (OS среда) улучшает плотность жизнеспособных клеток, время удвоения клеток и продукцию белка клетками в культуре клеток относительно не содержащей сыворотки среды, которая содержит очень мало или не содержит орнитина или очень мало или не содержит комбинации орнитина и путресцина (не OS среда).
Перед описанием культур клеток и способов по настоящему изобретению следует понять, что это изобретение не ограничено описанными конкретными способами и экспериментальными условиями, так как такие способы и условия могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, которое обычно понимает специалист в области, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящей заявке, далее описаны определенные конкретные способы и материалы. Единицы, префиксы и символы могут быть указаны в их принятых в СИ формах. Числовые диапазоны, указываемые в настоящем документе, являются открытыми, что означает, что они включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иначе, формы единственного числа следует понимать, как означающие по меньшей мере один из. Заглавия разделов, используемые в настоящем документе, предназначены только для организационных целей, и их не следует рассматривать, как ограничивающие описанный объект изобретения. Способы и указания, описываемые в настоящем документе, как правило, осуществляют общепринятыми известными в данной области способами и как описано в различных общих и более специализированных ссылках, которые цитированы и описаны на всем протяжении настоящего описания, если не указано иначе. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001), и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) и Julio E. Celis, Cell Biology: A Laboratory Handbook, 2nd ed., Academic Press, New York, N.Y. (1998) и Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1995). Все публикации, указанные на всем протяжении этого описания, полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.
Определения
Как используют в настоящем документе пептид, полипептид и белок на всем протяжении описания используют взаимозаменяемо, и они означают молекулу, содержащую два или более аминокислотных остатка, связанные друг с другом пептидной связью. Пептиды, полипептиды и белки также
- 3 037568 могут включать модификации, такие как гликозилирование, присоединение липидов, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, алкилирование, гидроксилирование и АДФрибозилирование. Пептиды, полипептиды и белки могут представлять научный или коммерческий интерес, включая основанные на белках лекарственные средства. В частности, пептиды, полипептиды и белки включают антитела и химерные или слитые белки. Пептиды, полипептиды и белки получают посредством рекомбинантных линий клеток животных с использованием способов культивирования клеток.
Как используют в настоящем документе, термин гетерологичная полинуклеотидная последовательность относится к полимерам нуклеиновых кислот, кодирующих представляющие интерес белки, такие как химерные белки (такие как молекулы-ловушки), антитела или части антител (например, VH, VL, CDR3), которые получают в качестве биофармацевтического лекарственного вещества. Гетерологичную полинуклеотидную последовательность (например, такую как последовательность, кодирующую химерный белок или последовательность с оптимизированными кодонами, не содержащая интронов последовательность и т.д.) можно получать способами генетической инженерии и вводить в клетку, где она может находиться в качестве эписомы или интегрироваться в геном клетки. Гетерологичная полинуклеотидная последовательность может представлять собой природную последовательность, которую вводят в эктопическую область в геноме продуцирующей клетки. Гетерологичная полипептидная последовательность может представлять собой природную последовательность другого организма, такую как последовательность, кодирующая ортолог человека.
Антитело относится к молекуле иммуноглобулина, состоящей из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей, связанных между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена (CL). Области VH и VL можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), чередуемыми с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Термин антитело включает указание на гликозилированные и негликозилированные иммуноглобулины любого изотипа или подкласса. Термин антитело включает молекулы антител, получаемые, экспрессируемые, производимые или выделяемые рекомбинантными способами, такие как антитела, выделяемые из клеток-хозяев, трансфицированных для экспрессии антитела. Термин антитело также включает биспецифическое антитело, которое включает гетеротетрамерный иммуноглобулин, который может связываться более чем с одним различными эпитопами. Биспецифические антитела в основном описаны в публикации патентной заявки США № 2010/0331527, которая включена в настоящую заявку в качестве ссылки.
Термин антигенсвязывающая часть антитела (или фрагмент антитела) относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию антигена. Примеры связывающих фрагментов, включаемых в термин антигенсвязывающая часть антитела, включают (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241: 544-546), который состоит из домена VH, (vi) выделенная CDR и (vii) scFv, который состоит из двух доменов фрагмента Fv, VL и VH, соединенных синтетическим линкером с формированием одной белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с формированием одновалентных молекул. В термин антитела также включены другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела (см. например, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).
Кроме того, антитело или его антигенсвязывающая часть могут быть частью более крупной молекулы иммуноадгезии, формируемой посредством ковалентной или нековалентной ассоциации антитела или части антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают использование области сердцевины стрептавидина с получением тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки с получением двухвалентной и биотинилированной молекулы scFv (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058). Части антител, такие как фрагменты Fab и F(ab')2, можно получать из целых антител общепринятыми способами, такими как расщепление целых антител папаином или пепсином. Кроме того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии можно получать с использованием стандартных технологий рекомбинантной ДНК, широко известных в данной области (см. Sambrook et al., 1989).
Термин антитело человека предназначен для включения антител с вариабельными и константными областями, происходящими из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Антитела человека по изобретению могут включать остатки аминокислот, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линией человека (например, мутации, вносимые посред- 4 037568 ством случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или посредством соматических мутаций in vivo), например, в CDR и в частности CDR3. Однако, как используют в настоящем документе, термин антитело человека не предназначен для включения антител, в которых на каркасные последовательности человека привиты последовательности CDR, происходящие из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мышь.
Как используют в настоящем документе, термин рекомбинантное антитело человека предназначен для включения всех антител человека, которые получают, экспрессируют, производят или выделяют рекомбинантными способами, такие как антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфицируемого в клетки-хозяева, антитела, выделяемые из библиотеки рекомбинантных, комбинаторных антител человека, антитела, выделяемые у животных (например, мышей), которые являются трансгенными по генам иммуноглобулинов человека (см. например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела получаемые, экспрессируемые, производимые или выделяемые любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такой рекомбинант антитела человека содержит вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Однако в определенных вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу in vitro (или, когда используют животного, трансгенного по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, последовательности аминокислот областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и получены из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и родственны им, в природе могут не присутствовать в репертуаре зародышевой линии антител человека in vivo.
Слитые с Fc белки содержат часть или целиком два или более белков, один из которых представляет собой часть Fc молекулы иммуноглобулина, которые иначе в природе вместе не встречаются. Получение слитых белков, содержащих определенные гетерологичные полипептиды, слитые с различными частями полученных из антител полипептидов (включая домен Fc), описано, например, в Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; и Hollenbaugh et al., Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins, в Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10, 19, 1 - 10, 19, 11, 1992. Слитые белки рецептора и Fc содержат один или несколько внеклеточных доменов рецептора, связанные с молекулой Fc, которая в определенных вариантах осуществления содержит шарнирную область с последующими доменами иммуноглобулина СН2 и CH3. В определенных вариантах осуществления слитый с Fc белок содержит две или более цепей различных рецепторов, которые связываются с одним или несколькими лигандами. Например, слитый с Fc белок представляет собой ловушку, такую как, например, ловушка IL-1 (например, рилонацепт, который содержит связывающую лиганд IL-1RAcP область, слитую с внеклеточной областью IL-1R1, слитую с Fc hIgG1; см. патент США № 6927004), или ловушка VEGF (например, афлиберцепт, который содержит домен 2 Ig рецептора VEGF Flt1, слитый с доменом 3 Ig рецептора VEGF Flk1, слитый с Fc hIgG1; см. патенты США №№ 7087411 и 7279159).
Среды
Настоящее изобретение относится к не содержащей сыворотки среде, которая пригодна для культивирования клеток и продукции биофармацевтического лекарственного вещества. Не содержащая сыворотки используют для среды для культивирования клеток, которая не содержит сывороток животных, таких как эмбриональная телячья сыворотка. Не содержащие сыворотки среды могут содержать < 7,5 г/л гидролизатов, таких как соевый гидролизат. Настоящее изобретение также относится к химическим средам определенного состава, которые не только не содержат сывороток, но также не содержат и гидролизата. Не содержащие гидролизата используют для сред для культивирования клеток, которые не содержат экзогенных белковых гидролизатов, таких как гидролизаты животных или растительных белков, например, такие как пептоны, триптоны и т.п.
Удаление сыворотки и уменьшение количества или удаление гидролизатов из среды для культивирования клеток при снижении вариабельности от партии к партии и улучшении последующих этапов обработки к сожалению ослабляет рост, жизнеспособность клеток и экспрессию ими белка. Таким образом, химически определенные не содержащие сыворотки и содержащие мало или не содержащие гидролизатов среды для улучшения роста клеток и продукции белка нуждаются в дополнительных ингредиентах. Среды для культивирования клеток по изобретению можно обогащать дополнительными ингредиентами, такими как полиамины, или увеличенными концентрациями таких компонентов, как аминокислоты, соли, сахара, витамины, гормоны, факторы роста, буферы, антибиотики, липиды, микроэлементы и т.п., в зависимости от требований культивируемых клеток или желаемых параметров культуры клеток. Например, среда для культивирования клеток по настоящему документу для улучшения роста клеток, жизнеспособности клеток и продукции рекомбинантного белка обогащена орнитином, путресцином или обоими (OS среды).
В определенных вариантах осуществления OS среда содержит орнитин в концентрации (выражаемой в микромолях на литр) по меньшей мере приблизительно 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 568, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580,
- 5 037568
581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602,
603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 620, 625, 630, 635, 640, 645,
650, 700, 750, 800, 850 или 900 мкМ.
В определенных вариантах осуществления среда содержит орнитин в концентрации приблизительно 85, 90, 95, 100, 105, 110, 113 или 115 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 100 мкМ±15 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 15 мг/л±2,25 мг/л орнитина-HCl.
В определенных вариантах осуществления среды содержит орнитин в концентрации приблизительно 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340 или 345 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 300 мкМ±45 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 50 мг/л±7,5 мг/л орнитина-HCl.
В определенных вариантах осуществления среды содержит орнитин в концентрации приблизительно 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685 или 690 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 600 мкМ±90 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 100 мг/л±15 мг/л орнитина-HCl.
В определенных вариантах осуществления среды содержит орнитин в концентрации 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, 1000, 1005, 1010, 1015, 1020, 1025, 1030 или 1035 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 900 мкМ±135 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 150 мг/л±22,5 мг/л орнитина-HCl.
В обогащенные орнитином среды необязательно можно добавлять путресцин. Путресцин в очень низких концентрациях включали в качестве компонента в определенные составы сред для культивирования клеток; см. например, WO 2005/028626, в котором описаны 0,02-0,08 мг/л путресцина; патент США № 5426699 (0,08 мг/л); патент США № RE 30985 (0,16 мг/л); патент США № 5811299 (0,27 мг/л); патент США № 5122469 (0,5635 мг/л); патент США № 5063157 (1 мг/1); WO 2008/154014 (-100 мкМ - -1000 мкМ); патентную заявку США № 2007/0212770 (0,5 - 30 мг/л полиамина; 2 мг/л путресцина; 2 мг/л путресцина + 2 мг/л орнитина; 2 мг/л путресцина +10 мг/л орнитина).
В определенных вариантах осуществления среды содержат комбинацию орнитина и путресцина, где путресцин может находиться в комбинации по меньшей мере приблизительно 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 260, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405 или 410 мкМ.
В определенных вариантах осуществления среды содержат путресцин в концентрации приблизительно 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 или 230 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 200 мкМ±30 мкМ путресцина в дополнение к > 90 мкМ±14 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 30 мг/л±4,5 мг/л путресцина-2HCl в дополнение к > 15 мг/л±2,25 мг/л орнитина-HCl.
В определенных вариантах осуществления среды содержат путресцин в концентрации приблизительно 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400 или 405 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 350 мкМ±52,5 мкМ путресцина в дополнение к > 90 мкМ±14 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 57 мг/л±8,55 мг/л путресцина-2HCl в дополнение к > 15 мг/л±2,25 мг/л орнитина-HCl.
В определенных вариантах осуществления среды содержат путресцин в концентрации приблизительно 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800 или 805 мкМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит 714 мкМ±105 мкМ путресцина в дополнение к > 90 мкМ±14 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среда содержит 115 мг/л±17,25 мг/л путресцина-2HCl в дополнение к > 15 мг/л±2,25 мг/л орнитина-HCl.
В определенных вариантах осуществления среды содержат попарную комбинацию любых концентраций путресцина и орнитина, перечисленных выше. В определенных вариантах осуществления среды содержат любую попарную комбинацию приблизительно 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800 или 805 мкМ путресцина и приблизительно 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685 или 690 мкМ орнитина. Например, в одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 700 мкМ путресцина и любую одну из 510, 511, 512 мкМ и последующие орнитина; или 701 мкМ путресцина и любую одну из 510, 511, 512 мкМ и последующие орнитин и т.д. Также, например, среда в одном из вариантов осуществления содержит прибли- 6 037568 зительно 600 мкМ орнитина и любую одну из 700, 701, 702 мкМ и последующие путресцина; или 601 мкМ орнитина и любую одну из 700, 701, 702 мкМ и последующие путресцина и т.д. В определенных вариантах осуществления среды содержат 702 мкМ±106 мкМ путресцина + 593 мкМ±89 мкМ орнитина. В одном конкретном варианте осуществления среды содержат приблизительно 714 мкМ путресцина и 593 мкМ орнитина. В одном из вариантов осуществления среды содержат 115 мг/л±17 мг/л путресцина·2HCl и 100 мг/л±15 мг/л орнитина· HCl. В одном конкретном варианте осуществления среды содержат 115 мг/л путресцина· 2HCl и 100 мг/л орнитинаПО.
В одном из вариантов осуществления и в дополнение к добавлению орнитина или путресцина среды содержат смесь нуклеозидов в суммарной концентрации по меньшей мере 50 мкМ, по меньшей мере 60 мкМ, по меньшей мере 70 мкМ, по меньшей мере 80 мкМ, по меньшей мере 90 мкМ, по меньшей мере 100 мкМ, по меньшей мере 110 мкМ, по меньшей мере 115 мкМ, по меньшей мере 120 мкМ, по меньшей мере 125 мкМ, по меньшей мере 130 мкМ, по меньшей мере 135 мкМ, по меньшей мере 140 мкМ, по меньшей мере 145 мкМ, по меньшей мере 150 мкМ, по меньшей мере 155 мкМ, по меньшей мере 160 мкМ, по меньшей мере 165 мкМ или по меньшей мере 170 мкМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 174 мкМ±26 мкМ нуклеозидов. В одном из вариантов осуществления среды содержат пуриновые производные в суммарной концентрации по меньшей мере 40 мкМ, по меньшей мере 45 мкМ, по меньшей мере 50 мкМ, по меньшей мере 55 мкМ, по меньшей мере 60 мкМ, по меньшей мере 65 мкМ, по меньшей мере 70 мкМ, по меньшей мере 75 мкМ, по меньшей мере 80 мкМ, по меньшей мере 85 мкМ, по меньшей мере 90 мкМ, по меньшей мере 95 мкМ, по меньшей мере 100 мкМ или по меньшей мере 105 мкМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 106 мкМ±5 мкМ пуриновых производных. Пуриновые производные включают нуклеозиды гипоксантин и аденозин и гуанозин. В одном из вариантов осуществления среды содержат пиримидиновые производные в суммарной концентрации по меньшей мере 30 мкМ, по меньшей мере 35 мкМ, по меньшей мере 40 мкМ, по меньшей мере 45 мкМ, по меньшей мере 50 мкМ, по меньшей мере 55 мкМ, по меньшей мере 60 мкМ или по меньшей мере 65 мкМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 68 мкМ±5 мкМ пиримидиновых производных. Пиримидиновые производные включают нуклеозиды тимидин, уридин и цитидин. В одном конкретном варианте осуществления среды содержат аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин.
В дополнение к добавлению орнитина или путресцина в одном из вариантов осуществления среды также содержат аминокислоты в суммарной концентрации по меньшей мере 40 мМ, где в расчет общ сумма не включено количество глутамина. В одном из вариантов осуществления глутамин в среды не добавлен, но его можно добавить в среды в качестве добавки в момент использования при культивировании клеток, например при продукции белка. Таким образом, в определенных вариантах осуществления, таких как в способе культивирования клеток или способе получения представляющего интерес белка, среды можно обогащать глутамином в качестве добавки в момент использования. В одном из таких вариантов осуществления глутамин добавляют в количестве менее чем приблизительно 40 мМ, менее чем приблизительно 35 мМ, менее чем приблизительно 30 мМ, менее чем приблизительно 25 мМ, менее чем приблизительно 20 мМ, менее чем приблизительно 15 мМ, менее чем приблизительно 10 мМ, менее чем приблизительно 8 мМ, менее чем приблизительно 7 мМ, менее чем приблизительно 6 мМ, менее чем приблизительно 5 мМ, менее чем приблизительно 4 мМ, менее чем приблизительно 3 мМ или менее чем приблизительно 2,5 мМ. В одном из вариантов осуществления количество глутамина в средах, которые обогащали глутамином, составляет приблизительно 2 мМ±0,5 мМ.
В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат аминокислоты с неполярными боковыми группами в концентрации по меньшей мере 15 мМ, по меньшей мере 24 мМ, по меньшей мере 25 мМ, по меньшей мере 26 мМ, по меньшей мере 27 мМ, по меньшей мере 28 мМ, по меньшей мере 29 мМ или по меньшей мере 30 мМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 30 мМ аминокислот с неполярными боковыми группами. В одном из вариантов осуществления на моль общего количества аминокислот, содержащегося в средах, по меньшей мере 32%, по меньшей мере 33%, по меньшей мере 34%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 36%, по меньшей мере 37%, по меньшей мере 38%, по меньшей мере 39%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 41% представляют собой аминокислоты с неполярными боковыми группами. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 42%±1% представляют собой аминокислоты с неполярными боковыми группами. Аминокислоты с неполярными боковыми группами включают аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин.
В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат аминокислоты с незаряженными полярными боковыми группами в концентрации приблизительно от 10 до 34 мМ, приблизительно от 11 до 33 мМ, приблизительно от 12 до 32 мМ, приблизительно от 13 до 31 мМ, приблизительно от 14 до 30 мМ, приблизительно от 15 о 29 мМ, приблизительно от 16 до 28 мМ, приблизительно от 17 до 27 мМ, приблизительно от 18 до 26 мМ, приблизительно от 19 до 25 мМ, приблизительно от 20 до 24 мМ, приблизительно от 21 до 23 мМ
- 7 037568 или приблизительно 22 мМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит приблизительно 22 мМ аминокислот с незаряженными полярными боковыми группами. В другом варианте осуществления среда содержит приблизительно 12 мМ аминокислот с незаряженными полярными боковыми группами. В одном из вариантов осуществления на моль общего количества аминокислот, содержащегося в средах приблизительно от 14 до 46%, приблизительно от 15 до 45%, приблизительно от 16 до 44%, приблизительно от 17 до 43%, приблизительно от 18 до 42%, приблизительно от 19 до 41%, приблизительно от 20 до 40%, приблизительно от 21 до 39%, приблизительно от 22 до 38%, приблизительно от 23 до 37%, приблизительно от 24 до 36%, приблизительно от 25 до 35%, приблизительно от 26 до 34%, приблизительно от 27 до 33%, приблизительно от 28 до 32%, приблизительно от 29 до 31% или приблизительно 30% представляют собой аминокислоты с незаряженными полярными боковыми группами. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 30%±3% представляют собой аминокислоты с незаряженными полярными боковыми группами. Аминокислоты с незаряженными полярными боковыми группами включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин.
В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат аминокислоты с отрицательным зарядом при pH 6 (например, кислые аминокислоты) в концентрации приблизительно от 4 до 14 мМ, приблизительно от 5 до 13 мМ, приблизительно от 6 до 12 мМ, приблизительно от 7 до 11 мМ, приблизительно от 8 до 10 мМ, приблизительно 9 или приблизительно 4 мМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 9 мМ кислых аминокислот. В одном из вариантов осуществления среды содержат 9 мМ±1 мМ кислых аминокислот. В одном из вариантов осуществления на моль общего количества аминокислот, содержащихся в средах приблизительно от 8 до 18%, приблизительно от 9 до 17%, приблизительно от 10 до 16%, приблизительно от 11 до 15%, приблизительно от 12 до 14% или приблизительно 13% представляют собой кислые аминокислоты. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 12,6%±1% представляют собой кислые аминокислоты. Кислые аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.
В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат аминокислоты с положительным зарядом при pH 6 (например, основные аминокислоты) в концентрации по меньшей мере 3,5 мМ, по меньшей мере 4 мМ, по меньшей мере 5 мМ, по меньшей мере 6 мМ, по меньшей мере 7 мМ, по меньшей мере 8 мМ, по меньшей мере 9 мМ, по меньшей мере 10 мМ или по меньшей мере 11 мМ. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 11 мМ основных аминокислот. В одном из вариантов осуществления среды содержат приблизительно 11,42 мМ±1 мМ основных аминокислот. В одном из вариантов осуществления на моль общего количества аминокислот, содержащихся в средах по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 13%, по меньшей мере 14% или по меньшей мере 15% представляют собой основные аминокислоты. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 16% представляют собой основные аминокислоты. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 15,8%±2,4% представляют собой основные аминокислоты. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 21%±3,2% представляют собой основные аминокислоты. Основные аминокислоты включают лизин, аргинин и гистидин.
В одном из вариантов осуществления в дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина среды также содержат приблизительно 30 мМ неполярных аминокислот, приблизительно 22 мМ незаряженных полярных аминокислот, приблизительно 9 мМ кислых аминокислот и приблизительно 11 мМ основных аминокислот. В одном из вариантов осуществления на моль аминокислот в средах приблизительно 42% представляют собой неполярные аминокислоты, приблизительно 30% представляют собой незаряженные полярные аминокислоты, приблизительно 13% представляют собой кислые аминокислоты и приблизительно 16% представляют собой основные аминокислоты.
В дополнение к добавлению орнитина или комбинации орнитина и путресцина в одном из вариантов осуществления среды содержат микромолярные количества жирных кислот (или производных жирных кислот) и токоферол. В одном из вариантов осуществления жирные кислоты включают любую одну или несколько из линолевой кислоты, линоленовой кислоты, липоевой кислоты, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, арахидиновой кислоты, арахидоновой кислоты, лауриновой кислоты, бегеновой кислоты, каприловой кислоты, лауриновой кислоты, гексановой кислоты, лигноцериновой кислоты, миристиновой кислоты и октановой кислоты. В одном из вариантов осуществления среды содержат токоферол, линолевую кислоту и липоевую кислоту.
В одном из вариантов осуществления среды также содержат смесь витаминов, которая включает другие питательные вещества и незаменимые питательные вещества, в суммарной концентрации по меньшей мере приблизительно 700 мкМ или по меньшей мере приблизительно 2 мМ. В одном из вариантов осуществления смесь витаминов содержит один или несколько из D-биотина, хлорида холина, фолиевой кислоты, миоинозитола, амида никотиновой кислоты, пиридоксина HCl, D-пантотеновой кислоты
- 8 037568 (hemiCa), рибофлавина, тиамина HCl, витамина В12 и т.п. В одном из вариантов осуществления смесь витаминов включает все из D-биотина, хлорида холина, фолиевой кислота, миоинозитола, амида никотиновой кислоты, пиридоксина HCl, D-пантотеновой кислоты (hemiCa), рибофлавина, тиамина HCl и витамина В12.
Различные варианты осуществления сред по изобретению включают любую из комбинаций описанных выше вариантов осуществления, включая химически определенные, не содержащие гидролизатов, не содержащие сывороток среды, содержащие орнитин или путресцин в указанных количествах и, в числе прочего, (а) аминокислоты; (b) необязательно нуклеозиды; (с) соли двухвалентных катионов; (d) жирные кислоты и токоферол и (е) витамины. В определенных вариантах осуществления во все OS среды можно добавлять небольшие количества гидролизатов.
Заявители полагают, что в практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать любые одну или несколько из множества основных сред или их сочетаний, в которые добавляют орнитин или комбинацию орнитина и путресцина. Основные среды общеизвестны в данной области и в числе прочего включают МЕМЕ (минимальную поддерживающую среду) Игла (Eagle, Science, 1955, 112(3168):501-504), F12 Хэма (Ham, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1965, 53:288-293), среду F-12 К, среду Дульбекко, модифицированную Дульбекко среду Игла (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1952 August; 38(8): 747-752), среды DMEM/Хэма F12 1:1, T8 Троуэла, среды А2 Холмса и Вольфа, Biophys. Biochem. Cytol., 1961, 10:389-401), среды Вэймота (Davidson and Waymouth, Biochem. 1, 1945, 39(2): 188-199), среды Е Вильямса (William's et al., Exp. Cell Res., 1971, 69:105 et seq.), RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc, 1967, 199:519-524), среды MCDB 104/110 (Bettger et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1981, 78(9):55885592), среды Вентре HL-1, среды с альбумином-глобулином (Orr et al., Appl. Microbiol., 1973, 25(1):4954), среду RPMI-1640, среду RPMI-1641, модифицированную Исков среду Дульбекко, среду Маккоя 5 А, среду Лейбовица L-15 и не содержащие сыворотки среды, такие как EX-CELL™ 300 Series (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), среды с протамином-цинком-инсулином (Weiss et al., 1974, US 4072565), среды с биотином-фолатом (Cartaya, 1978, US Re30,985), среды с трансферрином-жирными кислотами (Baker, 1982, US 4560655), среды с трансферрином-EGF (Hasegawa, 1982, US 4615977; Chessebeuf, 1984, US 4786599) и другие комбинации сред (см. Inlow, US 6048728; Drapeau, US 7294484; Mather, US 5122469; Furukawa, US 5976833; Chen, US 6180401; Chen, US 5856179; Etcheverry, US 5705364; Etcheverry, US 7666416; Ryll, US 6528286; Singh, US 6924124; Luan, US 7429491 и т.п.).
В конкретном варианте осуществления среда является химически определенной и в дополнение к орнитину или комбинации орнитина и путресцина содержит: CaCl2 2Н2О; буфер HEPES, KCl; MgSO4; NaCl; Na2HPO4 или другие фосфатные соли; пируват; L-аланин; L-аргинин HCl; L-аспарагин H2O; Lаспарагиновую кислоту; L-цистеин HCl H2O; L-глутаминовую кислоту; глицин; L-гистидин HCl H2O; Lизолейцин; L-лейцин; L-лизин HCl; L-метионин; L-орнитин HCl; L-фенилаланин; L-пролин; L-серин; Lтреонин; L-триптофан; L-тирозин 2Na 2H2O; L-валин; D-биотин; хлорид холина; фолиевую кислоту; миоинозитол; амид никотиновой кислоты; пиридоксин HCl; D-пантотеновую кислоту; рибофлавин; тиамин HCl; витамин В12; ρ-аминобензойную кислоту; этаноламин HCl; плюроник F68; DL-α-токоферола фосфат; линолевую кислоту; Na2SeO3; липоевую кислоту и глюкозу и необязательно аденозин; гуанозин; цитидин; уридин; тимидин и гипоксантин 2Na.
В одном из вариантов осуществления исходная осмолярность сред по изобретению составляет 200500, 250-400, 275-350 или приблизительно 300 мОсм. В течение роста клеток в средах по изобретению и, в частности, после любой подачи питательных веществ по протоколу периодической подпитки, осмолярность культуры может увеличиваться приблизительно до 350, 400, 450 или до 500 мОсм.
В определенных вариантах осуществления, где осмолярность среды определенного состава составляет менее чем приблизительно 300, осмолярность доводят приблизительно до 300, добавляя одну или несколько солей свыше указанного количества. В одном из вариантов осуществления осмолярность увеличивают до желаемого уровня, добавляя один или несколько осмолитов, выбранных из хлорида натрия, хлорида калия, соли магния, соли кальция, кислой соли амина, соли жирной кислоты, бикарбоната натрия, карбоната натрия, карбоната калия, хелатора, который представляет собой соль, сахар (например, галактозу, глюкозу, сахарозу, фруктозу, фукозу и т.д.) и их сочетания. В одном из вариантов осуществления осмолит добавляют в дополнение к его концентрации в компоненте, уже присутствующем в среде определенного состава (например, сахар добавляют в дополнение к концентрации, указанной для компонента сахара).
Любой и каждый из вариантов осуществления сред, описанных выше, а также любых других не содержащих сыворотки сред, содержащих по меньшей мере приблизительно 90 мкМ орнитина (или содержащих комбинацию по меньшей мере приблизительно 100 мкМ орнитина и по меньшей мере приблизительно 200 мкМ путресцина) далее в настоящем изобретении обозначают как обогащенные орнитином (OS) среды. И наоборот, среды, не содержащие орнитина (или не содержащие комбинации орнитина/путресцина), или среды, содержащие менее 100 мкМ орнитина (или среды, содержащие менее 100 мкМ орнитина и менее 200 мкМ путресцина), далее в настоящем документе обозначают как не обогащенные орнитином (не OS) среды.
- 9 037568
Культура клеток
Настоящее изобретение относится к культуре клеток, содержащей линию клеток, экспрессирующую представляющий интерес белок в OS среде, как описано выше. В одном из вариантов осуществления культура клеток содержит инсулин, который можно добавлять в среды в качестве ингредиента в момент использования или можно включать в составы сред. В одном из вариантов осуществления линия клеток содержит клетки, способные к продукции биотерапевтического белка. Примеры линий клеток, которые как правило используют для продукции белковых биотерапевтических средств, включают в числе прочего первичные клетки, клетки BSC, клетки HeLa, клетки HepG2, клетки LLC-MK, клетки CV1, клетки COS, клетки VERO, клетки MDBK, клетки MDCK, клетки CRFK, клетки RAF, клетки RK, клетки ТСМК-1, клетки LLCPK, клетки РК15, клетки LLC-RK, клетки MDOK, клетки BHK, клетки BHK21, клетки CHO, клетки CHO-K1, клетки NS-1, клетки MRC-5, клетки WI-38, клетки BHK, клетки 3T3, клетки 293, клетки RK, клетки Per.C6 и клетки куриных эмбрионов. В одном из вариантов осуществления линия клеток представляет собой линию клеток CHO или одну или несколько из нескольких конкретных вариантов клеток CHO, оптимизированных для продукции белка в большом масштабе, например, CHO-K1.
Культура клеток или культура означает рост и размножение клеток вне многоклеточного организма или ткани. Подходящие условия культивирования для клеток млекопитающих известны в данной области. См. например. Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992). Клетки млекопитающих можно культивировать в суспензии или прикрепленными к твердому субстрату. Для культур клеток млекопитающих доступны биореакторы с псевдоожиженным слоем, биореакторы с пористыми волокнами, биореакторы с роллерными флаконами, встряхиваемыми колбами или смесительными баками с микроносители или без и функционирующие в периодическом режиме, в периодическом режиме с подпиткой, непрерывном, полунепрерывном режиме или режиме с орошением. В течение культивирования в культуру непрерывно или с интервалами можно добавлять среды для культивирования клеток или концентрированные питательные среды. Например, культуру можно подпитывать раз в сутки, через сутки, каждые трое суток или можно подпитывать, когда концентрация конкретного компонента среда, который подвергают контролю, падает ниже желаемого диапазона.
Животные клетки, такие как клетки CHO, можно культивировать в культурах малого масштаба, например, в 125 мл контейнерах, содержащих приблизительно 25 мл среды, 250 мл контейнерах, содержащих приблизительно от 50 до 100 мл среды, 500 мл контейнерах, содержащих приблизительно от 100 до 200 мл среды. Альтернативно, культуры могут быть крупномасштабными, такими как, например, 1000 мл контейнеры, содержащие приблизительно от 300 до 1000 мл среды, 3000 мл контейнеры, содержащие приблизительно от 500 до 3000 мл среды, 8000 мл контейнеры, содержащие приблизительно от 2000 до 8000 мл среды и 15000 мл контейнеры, содержащие от 4000 до 15000 мл среды. Культуры для производства могут содержать 10000 л среды или более. Крупномасштабные культуры клеток, такие как для клинического производства белковых терапевтических средства, как правило, поддерживают в течение нескольких суток или даже недель, при этом клетки продуцируют желаемый белок(ки). В течение этого времени культуру можно обогащать концентрированной питательной средой, содержащей такие компоненты, как питательные вещества и аминокислоты, которые расходуются в течение культивирования. Концентрированная питательная среда может быть основана на любых составах сред для культивирования клеток. Такая концентрированная питательная среда может содержать большинство компонентов среды для культивирования клеток, например, приблизительно в количестве 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 12х, 14х, 16х, 20х, 30х, 50х, 100х, 200х, 400х, 600х, 800х или даже приблизительно 1000х от их нормального пригодного количества. Концентрированные питательные среды часто используют в процессах культивирования с периодической подпиткой.
В определенных вариантах осуществления среды для культивирования клеток в течение роста клеток или продукции белка обогащают добавками в момент использования, также известными как добавки, ингредиенты, добавляемые в момент использования, или химические вещества, добавляемые в момент использования. Добавки в момент использования включают один или несколько из факторов роста или других белков, буферов, источников энергии, солей, аминокислот, металлов и хелаторов. Другие белки включают трансферрин и альбумин. Факторы роста, которые включают цитокины и хемокины, в основном известны в данной области и известно, что они стимулируют рост клеток или, в некоторых случаях, дифференцировку клеток. Как правило, фактор роста представляет собой белок (например, инсулин), небольшой пептид или стероидный гормон, такой как эстроген, DHEA, тестостерон и т.п. В некоторых случаях фактор роста может представляет собой искусственное химическое вещество, которое стимулирует клеточную пролиферацию или продукцию белка, такое как, например, тетрагидрофолат (THF), метотрексат и т.п. Неограничивающие примеры белковых и пептидных факторов роста включают ангиопоэтины, морфогенетические белки кости (BMP), выделенный из головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), эпидермальный фактор роста (EGF), эритропоэтин (ЕРО), фактор роста фибробластов (FGF), выделенный из линий глиальных клеток нейротрофический фактор (GDNF), гранулоцитар
- 10 037568 ный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), ростовой фактор дифференцировки 9 (GDF9), фактор роста гепатоцитов (HGF), выделенный из гепатомы фактор роста (FIDGF), инсулин, инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор стимуляции миграции, миостатин (GDF-8), фактор роста нервов (NGF) и другие нейротрофины, выделенный из тромбоцитов фактор роста (PDGF), тромбопоэтин (ТРО), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), агонисты путь передачи сигнала wnt, плацентарный фактор роста (PlGF), эмбриональный телячий соматотрофин (FBS), интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 и т.п. В одном из вариантов осуществления среду для культивирования клеток обогащают добавляемым в момент использования фактором роста инсулином. В одном из вариантов осуществления концентрация инсулина в средах, например, количество инсулина в средах для культивирования клеток после добавления, составляет приблизительно от 0,1 до 10 мкМ. Также в составы сред по определенным вариантам осуществления можно включать одну или несколько добавок в момент использования.
Буферы общеизвестны в данной области. Изобретение не ограничено каким-либо конкретным буфером или буферами, и любой специалист в данной области может выбрать соответствующие буфер или буферную систему для использования с конкретной линией клеток, продуцирующей конкретный белок. В одном из вариантов осуществления буфер, добавляемый в момент использования, представляет собой NaHCO3. В одном из вариантов осуществления буфер, добавляемый в момент использования, содержит NaHCO3. В другом варианте осуществления буфер представляет собой HEPES.
Источники энергии для применения в качестве добавки в момент использования в культуре клеток также хорошо известны в данной области. Без ограничения в одном из вариантов осуществления источник энергии, добавляемый в момент использования, представляет собой глюкозу. Учитывая конкретные и определенные требования конкретных линии клеток и продуцируемого белка, в одном из вариантов осуществления глюкозу в среды можно добавлять в концентрации приблизительно от 1 до 20 мМ. В определенных случаях глюкозу можно добавлять на высоких уровнях вплоть до 10 г/л.
Также в области культуры клеток и продукции белка хорошо известны хелаторы. Двумя стандартными хелаторами, используемыми в данной области, являются дигидрат ЭДТА натрия и цитрат, хотя в практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать другие хелаторы. В одном из вариантов осуществления хелатор, добавляемый в момент использования, представляет собой дигидрат ЭДТА натрия. В одном из вариантов осуществления хелатор, добавляемый в момент использования, представляет собой цитрат, такой как Na3C6H5O7.
В одном из вариантов осуществления культуру клеток можно обогащать одной или несколькими аминокислотами, добавляемыми в момент использования, например, такими как глутамин. В одном из вариантов осуществления среда для культивирования клеток обогащена глутамином, добавляемым в момент использования в конечной концентрации приблизительно от 1 до 13 мМ.
Другие добавки в момент использования включают одну или несколько из различных солей металлов, такие как соли железа, никеля, цинка и меди. В одном из вариантов осуществления среды для культивирования клеток обогащают любым одним или несколькими из сульфата меди, сульфата цинка, хлорида железа и сульфата никеля.
В одном из вариантов осуществления среды для культивирования клеток обогащают любой одной или несколькими или всеми из указанных ниже добавок в момент использования: приблизительно 29,8 мМ NaHCO3, приблизительно 2 мМ глутамин, приблизительно 0,86 мкМ инсулин, приблизительно 11,1 мМ глюкоза, приблизительно 6,54 мкМ сульфат цинка, приблизительно 0,168 мкМ сульфат меди, приблизительно 75 мкМ хлорид железа, приблизительно 0,639 мкМ сульфат никеля, приблизительно 85 мкМ ЭДТА и приблизительно 50 мкМ цитрат.
В одном из вариантов осуществления среды обогащают с интервалами в течение культивирования клеток в соответствии с процессом с периодической подпиткой. Культивирование с периодической подпиткой общеизвестно в данной области и применяется для оптимизированной продукции белка (см. Y.M. Huang et al., Biotechnol Prog. 2010 Sep-Oct;26(5): 1400-10).
Относительно роста клеток в культуре без орнитина или путресцина жизнеспособность клеток, плотность жизнеспособных клеток и удвоение клеток улучшены. Относительно жизнеспособности клеток, клетки, растущие в OS средах демонстрирует жизнеспособность, которая по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере, 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 100% или по меньшей мере в 3 раза выше, чем жизнеспособность сходных или идентичных клеток, растущих не в OS средах.
В определенных вариантах осуществления скорость удвоения жизнеспособных клеток млекопитающих в OS средах по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 6%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 9%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 11%, по меньшей мере на 12%, по меньшей мере на 13%, по меньшей мере на 14%, по меньшей мере на 15%, по
- 11 037568 меньшей мере на 16%, по меньшей мере на 17%, по меньшей мере на 18%, по меньшей мере на 19%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 21%, по меньшей мере на 22%, по меньшей мере на 23%, по меньшей мере на 24%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 26%, по меньшей мере на 27%, по меньшей мере на 28%, по меньшей мере на 29%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 100% или по меньшей мере в 3 раза выше, чем скорость удвоения клеток млекопитающих, культивируемых не в OS средах. В определенных вариантах осуществления скорость удвоения жизнеспособных клеток млекопитающих в OS средах приблизительно на 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30% выше, чем скорость удвоения клеток млекопитающих не в OS средах.
В определенных вариантах осуществления время удвоения активно проходящих цикл клеток млекопитающих в OS средах составляет менее 30 ч, менее 29 ч, менее 28 ч, менее 27 ч, менее 26 ч, менее 25 ч, менее 24 ч, менее 23 ч, менее 22 ч, менее 21 ч, менее 20 ч, менее 19 ч или менее 18 ч. В определенных вариантах осуществления время удвоения активно растущих клеток млекопитающих в OS средах составляет менее 28 ч. В определенных вариантах осуществления время удвоения клеток млекопитающих в OS средах составляет приблизительно 27±1 ч, приблизительно 26±1 ч, приблизительно 25±1 ч, приблизительно 24±1 ч, приблизительно 23±1 ч, приблизительно 22±1 ч или приблизительно 21±1 ч. В определенных вариантах осуществления время удвоения активно проходящих цикл клеток млекопитающих в OS средах составляет приблизительно 24±1 ч. В определенных вариантах осуществления время удвоения активно делящихся клеток, культивируемых в OS средах по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 16%, по меньшей мере на 17%, по меньшей мере на 18%, по меньшей мере на 19%, по меньшей мере на 20% или по меньшей мере на 25% меньше, чем время удвоения активно проходящих цикл клеток, культивируемых не в OS средах.
Продукция белка
В дополнение к химически определенным OS средам и способам культивирования клеток в OS средах настоящее изобретение относится к способам продукции белков, таких как терапевтически эффективное антитело или другое биофармацевтическое лекарственное вещество, в клетках, культивируемых в OS средах.
В определенных вариантах осуществления скорость продукции белка клетками млекопитающих, культивируемыми в OS средах, по меньшей мере на 5, 10, 15 или 20% выше, чем скорость продукции белка идентичными клетками млекопитающих, культивируемыми не в OS средах. В определенных вариантах осуществления скорость продукции белка в клетках, культивируемых в OS средах, составляет по меньшей мере 1 пкг/клетку/сутки (PCD), по меньшей мере 2 PCD, по меньшей мере 3 PCD, по меньшей мере 4 PCD, по меньшей мере 5 PCD, по меньшей мере 6 PCD, по меньшей мере 7 PCD, по меньшей мере 8 PCD, по меньшей мере 9 PCD, по меньшей мере 10 PCD, по меньшей мере 15 PCD, по меньшей мере 20 PCD, по меньшей мере 25 PCD, по меньшей мере 30 PCD, по меньшей мере 35 PCD, по меньшей мере 40 PCD, по меньшей мере 45 PCD, по меньшей мере 50 PCD, по меньшей мере 75 PCD или по меньшей мере 100 PCD.
В определенных вариантах осуществления выход или титр продукции белка, которые можно выражать в граммах белкового продукта на литр среды для культивирования, из клеток, культивируемых в OS средах, составляет по меньшей мере 100 мг/л, по меньшей мере 1 г/л, по меньшей мере 1,2 г/л, по меньшей мере 1,4 г/л, по меньшей мере 1,6 г/л, по меньшей мере 1,8 г/л, по меньшей мере 2 г/л, по меньшей мере 2,5 г/л, по меньшей мере 3 г/л, по меньшей мере, 3,5 г/л, по меньшей мере 4 г/л, по меньшей мере 4,5 г/л, по меньшей мере 5 г/л, по меньшей мере 5,5 г/л, по меньшей мере 6 г/л, по меньшей мере 6,5 г/л, по меньшей мере 7 г/л, по меньшей мере 7,5 г/л, по меньшей мере 8 г/л, по меньшей мере 8,5 г/л, по меньшей мере 9 г/л, по меньшей мере 9,5 г/л, по меньшей мере 10 г/л или по меньшей мере 20 г/л.
В определенных вариантах осуществления белковый продукт (представляющий интерес белок) представляет собой антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, моноклональное антитело, полиспецифическое антитело, биспецифическое антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, одноцепочечное антитело, диатело, триотело или тетратело, фрагмент Fab или фрагмент F(ab')2, антитело IgD, антитело IgE, антитело IgM, антитело IgG, антитело IgG1, антитело IgG2, антитело IgG3 или антитело IgG4. В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело IgG1. В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело IgG2. В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело IgG4.
В определенных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой рекомбинантный белок, который содержит молекулу Fc и другой домен (например, слитый с Fc белок). В определенных вариантах осуществления слитый с Fc белок представляет собой слитый белок рецепторFc, который содержит один или несколько из одного или нескольких внеклеточных доменов рецептора, связанных с молекулой Fc. В определенных вариантах осуществления молекула Fc содержит шарнирную область с последующими доменами СН2 и CH3 IgG. В определенных вариантах осуществления слитый
- 12 037568 белок рецептор-Fc содержит два или более различных рецепторных цепи, которые связываются с одним лигандом или несколькими лигандами. Например, слитый с Fc белок представляет собой ловушку, например, такую как ловушка IL-1 (например, рилонацепт, который содержит связывающую лиганд IL1RAcP область, слитую с внеклеточной областью IL-1R1, слитую с Fc hIgG1; см. патент США № 6927004, который полностью включен в настоящий документ в качестве ссылки) ловушка VEGF (например, афлиберцепт, который содержит домен 2 Ig рецептора VEGF Flt1, слитый с доменом 3 Ig рецептора VEGF Flk1, слитый с Fc hIgG1; см. патенты США №№ 7087411 и 7279159).
Настоящее изобретение для продукции белка не ограничено конкретным типом клеток. Примеры типов клеток, подходящих для продукции белка, включают клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки птиц, клетки бактерий и клетки дрожжей. Клетки могут представлять собой стволовые клетки или рекомбинантные клетки, трансформированные вектором для рекомбинантной экспрессии генов, или клетки, трансфицированные вирусом для продукции вирусных продуктов. Клетки могут содержать рекомбинантную гетерологичную полинуклеотидную конструкцию, кодирующую представляющий интерес белок. Эта конструкция может представлять собой эписому, или она может представлять собой элемент, который физически интегрирован в геном клетки. Также клетки могут продуцировать представляющий интерес белок без кодирования этого белка гетерологичной полипептидной конструкцией. Другими словами, клетка может кодировать представляющий интерес белок в природе, например В-клетка, продуцирующая антитело. Клетки также могут являться первичными клетками, такими как клетки куриного эмбриона или первичными линиями клеток. Примеры пригодных клеток включают клетки BSC, клетки LLC-MK, клетки CV-1, клетки COS, клетки VERO, клетки MDBK, клетки MDCK, клетки CRFK, клетки RAF, клетки RK, клетки ТСМК-1, клетки LLCPK, клетки РК15, клетки LLC-RK, клетки MDOK, клетки BHK-21, курица embryo клетки, клетки NS-1, клетки MRC-5, клетки WI-38, клетки BHK, клетки 293, клетки RK, клетки Per.C6 и клетки CHO. В различных вариантах осуществления линия клеток представляет собой производное клеток CHO, такое как мутантные линии CHO-K1, CHO DUX В-11, CHO DG-44, Veggie-CHO, GS-CHO, S-CHO или CHO lec.
В одном из вариантов осуществления клетка, которая представляет собой клетку CHO, экспрессирует белок эктопически. В одном из вариантов осуществления белок содержит область тяжелой цепи иммуноглобулина, такую как область CH1, CH2 или CH3. В одном из вариантов осуществления белок содержит область СН2 и CH3 иммуноглобулина человека или грызуна. В одном из вариантов осуществления белок содержит область CH1, CH2 и CH3 иммуноглобулина человека или грызуна. В одном из вариантов осуществления белок содержит шарнирную область и область CH1, CH2 и CH3. В конкретном варианте осуществления белок содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления белок содержит вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления белок содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления белок представляет собой антитело, такое как антитело человека, антитело грызуна или химерное антитело человека/грызуна (например, человека/мыши, человека/крысы или человека/хомяка).
Фазу продукции можно проводить в культуре любого масштаба от отдельных колб и колб на шейкере или одноразовых реакторов Wave bags, до однолитровых биореакторов и до крупномасштабных промышленных биореакторы. Крупномасштабный процесс можно проводить в объеме приблизительно от 100 л до 20000 л или более. Для контроля продукции белка можно использовать одно или несколько средств, таких как температурный сдвиг или химическая индукция. Фаза роста может происходить при более высокой температуре, чем фаза продукции. Например, фаза роста может происходить при одной температуре приблизительно от 35 до 38°С, а фаза продукции может происходить при другой температуре приблизительно от 29 до 37°С, необязательно приблизительно от 30 до 36°С или приблизительно от 30 до 34°С. Кроме того, вместе, до или после температурного сдвига можно добавлять химические индукторы продукции белка, такие как кофеин, бутират, тамоксифен, эстроген, тетрациклин, доксициклин и бисацетамид гексаметилена (НМВА). Если индукторы добавляют после температурного сдвига, их можно добавлять в пределах от одного часа доя пяти суток после температурного сдвига, например, в пределах от одних до двух суток после температурного сдвига. Продуцирующие культуры клеток можно запускать в качестве непрерывной подпитываемой системы культивирования, как в хемостате (см. С. Altamirano et al., Biotechnol Prog. 2001 Nov-Dec; 17(6): 1032-41), или в соответствии с процессом с периодической подпиткой (Huang, 2010).
Изобретение пригодно для улучшения продукции белка способами культивирования клеток. Линии клеток, используемые по изобретению, можно генетически конструировать для экспрессии полипептида, представляющего коммерческий или научный интерес. Генетическая инженерия линий клеток включает трансфекцию, трансформацию или трансдукцию клеток рекомбинантной полинуклеотидной молекулой или иной способ изменения (например, посредством гомологичной рекомбинации и активации генов или слияния рекомбинантной клетки с нерекомбинантной клеткой) для того, чтобы вызвать экспрессию клеткой-хозяином желаемого рекомбинантного полипептида. Способы и векторы для генетической инженерии клеток или линий клеток для экспрессии представляющего интерес полипептида хорошо известны специалистам в данной области; например, различные способы проиллюстрированы в Current
- 13 037568
Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988 и ежеквартальные обновления); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69. Широкий спектр линий клеток, подходящий для выращивания в культуре, доступен в American Type Culture Collection (Manassas, Va.) и у коммерческих поставщиков. Примеры линий клеток, широко используемых в промышленности, включают клетки VERO, BHK, HeLa, CV1 (включая Cos), MDCK, 293, 3T3, клетки миеломных линий (например, NSO, NS1), PC12, клетки WI38 и клетки яичника китайского хомяка (CHO). Клетки CHO широко используют для получения комплексных рекомбинантных белков, таких как цитокины, факторы свертывания крови и антитела (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al. (1988), J.Biol Chem 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J MoI Endocrinol 6:231-239; Wood et al. (1990), J Immunol. 145:3011-3016). Желательными линиями клеток-хозяев CHO являются мутантные линии клеток с дефицитом дигидрофолатредуктазы (DHFR) (Urlaub et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220), DXB1 1 и DG-44, так как эффективная система селекции и амплификации экспрессии гена на основе DHFR обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка в этих клетках (Kaufman RJ. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). Кроме того, с этими клетками легко обращаться в качестве адгезивных или суспензионных культур, и они демонстрируют относительно хорошую генетическую стабильность. Клетки CHO и белки, рекомбинантно экспрессируемые ими, всесторонне охарактеризованы и одобрены для применения в клиническом и коммерческом производстве органами регулирования. В определенных вариантах осуществления линии клеток CHO представляют собой линии клеток, как описано в публикациях патентных заявок США №№ 2010/0304436 А1, 2009/0162901 А1 и 2009/0137416 А1 и патентах США №№ 7455988 В2, 7435553 В2 и 7105348 В2.
Настоящее изобретение не ограничено объемом указанных вариантов осуществления, описываемых в настоящем документе, которые предназначены для иллюстрации отдельных аспектов или вариантов осуществления изобретения. В объем изобретения входят функционально эквивалентные способы и компоненты. Специалистам в данной области из приведенного выше описания и сопровождающих фигур в дополнение к описанному в настоящем документе очевидны различные модификации изобретения. Такие модификации находятся в объеме изобретения.
Изобретение частично основано на открытии, что добавление орнитина или комбинации орнитина и путресцина в не содержащие сыворотки среды для культивирования клеток приводит к увеличенным росту клеток, жизнеспособности и продукции полипептидов в рекомбинантно сконструированных линиях клеток животных (или природных клеток), экспрессирующих представляющий интерес белок, таким образом, увеличивая надежность культуры, улучшая выход представляющего интерес полипептида.
Пример 1. Увеличенная плотность культуры жизнеспособных клеток
В 250 мл встряхиваемую колбу проводили инокуляцию из затравочной культуры линии рекомбинантных продуцирующих антитела клеток, происходящих из CHO K1. Инокулированные клетки выращивали при 36,5°С в течение семи суток и подпитывали глюкозой на сутки три и пять. Клетки выращивали в каждой из двух раздельных химически определенных (не содержащих гидролизата и не содержащих сыворотки) средах. Первая среда содержала приблизительно 75 мМ аминокислот (среда 1), вторая среда содержала приблизительно 40 мМ аминокислот (среда 2), и оба состава содержали не более 2,5 мкМ (0,4 мг/л) путресцина. Другую группу условий среды получали, добавляя в среду 2 соевый гидролизат в концентрации 7,5 г/л. В каждую из трех контрольных сред добавляли приблизительно 593 мкМ орнитина (в виде 100 мг/л L-орнитина·HCl) или комбинация приблизительно 593 мкМ орнитина (в виде 100 мг/л L-орниmина·HCl) и приблизительно 714 мкМ путресцина (в виде 115 мг/л путресцина· 2HCl). На сутки 3, 5 и 7 отбирали аликвоты по 3 мл культур и подсчет количества жизнеспособных клеток проводили с использованием исключения трипанового синего на устройстве BioProfi1le FLEX™ (Nova Biomedical). В начальные сутки все культуры содержали 0,8х106 жизнеспособных клеток на мл. Для данных сред (среда 1, среда 2 или среда 2 + соя) количества жизнеспособных клеток через период семь суток продемонстрировали, что у клеток CHO, растущих в средах, дополненных орнитином или орнитином и путресцином, повышена плотность жизнеспособных клеток. Эффект в течение семисуточного периода был особенно выражен в не содержащих гидролизатов средах (например, от 2-кратного до 4-кратного или более возрастание плотности жизнеспособных клеток). Не содержащая гидролизата OS среда 2 действовала сравнимо с содержащей сою не OS средой 2, что указывает на то, что преимущество соевого гидролизата для роста клеток можно воспроизвести посредством замены на орнитин. Также наблюдали увеличенную плотность клеток при добавлении орнитина или орнитина и путресцин в среду 2 + соя. Результаты представлены в табл. 1.
- 14 037568
Таблица 1. Средняя плотность жизнеспособных клеток в культуре (106 клеток на миллилитр) и _________кратность увеличения по сравнению с исходным уровнем*_________
Добавка: Время 3 суток Без добавок 2,4/ 1х Орнитин 6,1 /2,5х Орнитин + путресцин 5,0/2Дх
Среда 1 5 суток 3,4/ 1х 12,6/3,7х 12,4/3,6х
7 суток 3,6/ 1х 7,0/ 1,9х 6,8/ 1,9х
3 суток 1,7/ 1х 5,1 /3,Οχ 5,2/ЗДх
Среда 2 5 суток 2,0/ 1х 7,6/3,8х 8,0/4,0х
7 суток 1,6/ 1х 5,9 /3,7х 5,8 / 3,6х
3 суток 5,2/ 1х 5,4/ 1х 4,7 / 0,9χ
Среда 2 + соевый гидролизат 5 суток 7,7/ 1х 9,3 / 1,2х 9,3 / 1,2х
7 суток н.д. 9,6 / н.д. 9,1 / н.д.
*Исходный уровень представляет собой среды без добавок для данного состава среда на данные сутки.
Авторы также изучили действие различных количеств орнитина-HCl (например, 50, 100 и 150 мг/мл) на плотность жизнеспособных клеток в среде 3, которая содержит приблизительно 75 мМ аминокислот и 0,4 мг/л путресцина HCl (среда 3). Для инокуляции 50 мл биореакторов TubeSpin® (ТРР) при 0,4х106 клеток/мл в рабочем объеме 15 мл использовали одну культуру из системы посевных ферментеров линии рекомбинантных продуцирующих антитела клеток, происходящих из CHO K1. Клетки выращивали в инкубаторе при 37°С в течение трех суток. На сутки 3 отбирали аликвоты по 3 мл культур и определение количеств жизнеспособных клеток проводили с использованием исключения трипанового синего на устройстве BioProfile FLEX™ (Nova Biomedical). Все три уровня орнитина улучшали плотность клеток в среднем (N=3) немногим более чем в два раза. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2. Плотность жизнеспособных клеток в культуре (106 клеток на миллилитр) и кратность увеличения по сравнению с исходным уровнем*
Контроль Орнитин НС1
Концентрация (мг/мл) 0 50 100 150
Плотность жизнеспособных клеток (106 клетки/мл) 1,3 3,2 3,1 3,1
Кратность увеличения по сравнению с контролем 1х 2,5х 2,4х 2,4х
*Исходный уровень представляет собой среду 3 без добавок.
Пример 2. Улучшенное время удвоения культуры клеток
В условиях различных сред для культивирования клеток определяли время удвоения линии рекомбинантных продуцирующих антитела клеток, происходящих из клеток CHO K1, в логарифмической фазе роста. Культуры из системы посевных ферментеров пересевали при 36,5°С в 250 мл встряхиваемые колбы в течение периода 14 суток в каждой из трех отдельных сред: в среде 1, среде 2 и среде 2, содержащей соевый гидролизат (среда 2 + соя). На сутки 0 и во время пересева в системе посевных ферментеров (каждые 2 или 3 суток) для каждого условия отбирали аликвоты по 1 мл и определение количеств жизнеспособных клеток проводили с использованием исключения трипанового синего на устройстве CDV™ (Nova Biomedical). Среду 1 тестировали без добавок или обогащенную орнитином-HCl в концентрации 100 мг/л или путресцином-2HCl в концентрации 115 мг/л и орнитином-HCl в концентрации 100 мг/л. Среду 2 с низким содержанием путресцина-2HCl (0,4 мг/л) тестировали без добавок или обогащенную орнитином-HCl в концентрации 100 мг/л или путресцином-2HCl в концентрации 115 мг/л и орнитином-HCl в концентрации 100 мг/л. Результаты приведены в таблицах 3 и 4. Для достижения значительного роста было необходимо обогащение среды 1 орнитином с путресцином или без. Обогащение не содержащей гидролизата среды 2 орнитином или орнитином + путресцин уменьшало время удвоения клеток приблизительно на величину от 25 до 30%. Также времена удвоения уменьшались после добавления орнитина или орнитина + путресцин в содержащую гидролизат среду 2 хоть и в меньшей степени.
- 15 037568
Таблица 3. Время удвоения клеток (часы) и приблизительный процент уменьшения времени _______________удвоения относительно исходного уровня* в среде 1__________
Добавка Среда 1
* Отсутствует 75
Орнитин 23 69%
Путресцин + орнитин 21 72%
*Исходный уровень представляет собой среду 1 без добавок.
Таблица 4. Время удвоения клеток (часы) и приблизительный процент уменьшения времени удвоения относительно исходного уровня* в среде 2
Добавка Среда 2 Среда 2 + соя
*Без добавок 27 22,5
Орнитин 21 22% 20,5 8,9%
Путресцин + орнитин 19,5 28% 21 6,7%
*Исходный уровень представляет собой среду 2 без добавок.
Пример 3. Увеличенные титры антител
После установления того, что добавление орнитина или орнитина + путресцин улучшает клеточную пролиферацию и плотность жизнеспособных клеток в культуре авторы дополнительно исследовали влияние этих условий на титры продуцируемых рекомбинантных белков. Авторы исследовали экспрессию и секрецию рекомбинантного IgG происходящей из CHO-K1 линией клеток. В этом эксперименте средний титр антител в культуре определяли на сутки семь в различных форматах сред. Как указано выше, тестировали среду 1 с низким содержанием путресцина (0,4 мг/л путресцина·2HCl), орнитина (100 мг/л орнитина-HCl) и с орнитином и путресцином (100 мг/л орнитина-HCl /115 мг/л путресцина-2HCl). Также тестировали среду 2 и среду 2 + соя с низким уровнем путресцина (0,4 мг/л путресцина-2HCl), орнитина (100 мг/л орнитина-HCl) и с орнитином и путресцином (100 мг/л орнитина-HCl /115 мг/л путресцина-2HCl). Во всех случаях добавление орнитина или орнитин и путресцин на уровне выше 0,4 мг/л приводило к значительно более высоким титрам белка, например, по меньшей мере приблизительно в два раза более высоким титрам. Результаты представлены в табл. 5.
Таблица 5. Средние семисуточные титры антител и приблизительная кратность увеличения (х) титров относительно исходного уровня*
Добавка среда 1 среда 2 среда 2 + соя
Без добавок* 0,31 г/л 1х 0,29 г/л 1х 0,54 г/л 1х
Орнитин 0,94 г/л 3,0х 0,65 г/л 2,2х 0,98 г/л 1,8х
Путресцин + орнитин 0,95 г/л 3,1х 0,64 г/л 2,2х 1,07 г/л 2х
*Исходный уровень установлен на титр в средах каждого типа без добавок.
Авторы также исследовали влияние различных количеств орнитина-HCl (например, 50, 100 и 150 мг/мл) в среде 3 на продукцию антител. Для инокуляции 50 мл биореакторов TubeSpin® (ТРР) при 0,4х106 клеток/мл в рабочем объеме 15 мл использовали одну культуру из системы посевных ферментеров линии рекомбинантных продуцирующих антитела клеток, происходящих из CHO K1. Клетки выращивали в инкубаторе при 37°С в течение трех суток. Все три уровня добавляемого орнитина улучшали титры антител в среднем (N=3) немногим более 50%. Результаты приведены в табл. 6.
Таблица 6. Титры антител (грамм на литр) и кратность увеличения титров по сравнению с исходным уровнем*
Контроль Орнитин НС1
Концентрация добавки (мг/мл) 0 50 100 150
Титр антитела (мг/мл) 79 120 127 124
Кратность увеличения относительно контроля 1х 1,5х 1,6х 1,6х
*Исходный уровень представляет собой среду 3 без добавок.

Claims (37)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Среда для культивирования клеток, которая не содержит сыворотки и гидролизата белков, содержащая 0,6±0,09 мМ орнитина, 0,714±0,11 мМ путресцина и смесь аминокислот или их солей.
  2. 2. Среда для культивирования клеток по п.1, в которой смесь аминокислот или их солей содержит не менее 40±6 мМ смеси аминокислот или их солей.
  3. 3. Среда для культивирования клеток по п.1 или 2, в которой смесь аминокислот или их солей состоит из аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина.
  4. 4. Среда для культивирования клеток по любому по пп.1-3, дополнительно содержащая одну или несколько жирных кислот.
  5. 5. Среда для культивирования клеток по п.4, в которой одна или несколько жирных кислот выбраны из линолевой кислоты, липоевой кислоты, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, арахидиновой кислоты, арахидоновой кислоты, лауриновой кислоты, бегеновой кислоты, каприловой кислоты, лауриновой кислоты, гексановой кислоты, лигноцериновой кислоты, миристиновой кислоты и октановой кислоты.
  6. 6. Среда для культивирования клеток по любому по пп.1-5, дополнительно содержащая смесь нуклеозидов.
  7. 7. Среда для культивирования клеток по п.6, в которой смесь нуклеозидов включает аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, тимидин и гипоксантин.
  8. 8. Среда для культивирования клеток по п.7, дополнительно содержащая один или несколько двухвалентных катионов.
  9. 9. Среда для культивирования клеток по п.8, в которой один или несколько двухвалентных катионов выбраны из магния и кальция.
  10. 10. Способ культивирования клеток, включающий этапы:
    (а) предоставление среды для культивирования клеток по любому из предшествующих пунктов и (b) размножение или поддержание клеток в указанной среде с получением культуры клеток.
  11. 11. Способ по п.10, где клетка выбрана из клетки млекопитающего, клетки птицы, клетки насекомых, клетки бактерий и клетки дрожжей.
  12. 12. Способ по п.11, где клетка представляет собой клетку CHO.
  13. 13. Способ по п.12, где клетка экспрессирует представляющий интерес белок.
  14. 14. Способ по п.13, где представляющий интерес белок представляет собой антигенсвязывающий белок.
  15. 15. Способ по любому по пп.13, 14, где представляющий интерес белок содержит домен Fc.
  16. 16. Способ по любому по пп.13, 14, где представляющий интерес белок представляет собой слитый белок рецептор-Fc.
  17. 17. Способ по п.16, где слитый белок рецептор-Fc представляет собой белок-ловушку.
  18. 18. Способ по п.17, где белок-ловушка представляет собой антагонист IL-1 или антагонист VEGF.
  19. 19. Способ по любому по пп.13, 14, где представляющий интерес белок представляет собой антитело или фрагмент антитела.
  20. 20. Способ по п.19, где антитело или фрагмент антитела представляют собой рекомбинантное антитело человека или его фрагмент.
  21. 21. Способ по любому по пп. 10-20, где среднее время удвоения клеток составляет не более 30 ч.
  22. 22. Способ по любому по пп.10-20, где среднее время удвоения клеток составляет не более 24 ч.
  23. 23. Способ по любому из пп.10-20, где культура клеток способна достигать плотности жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере на 15% больше, чем у культуры клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина
  24. 24. Способ по любому из пп.10-20, где культура клеток способна достигать плотности жизнеспособных клеток, которая по меньшей мере в 3 раза больше, чем у культуры клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.
  25. 25. Способ по любому из пп.10-20, дополнительно включающий добавление одной или нескольких добавок, которые выбраны из NaHCO3, глутамина, инсулина, глюкозы, CuSO4, ZnSO4, FeCl3, NiSO4, Na4 ЭДТА и цитрата Na3.
  26. 26. Способ получения белка, представляющего интерес, включающий этапы:
    (a) введение в клетку нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую представляющий интерес белок;
    (b) отбор клетки, несущей эту нуклеиновую кислоту;
    (c) культивирование отобранной клетки в среде для культивирования клеток по любому по пп.1-9 и (d) экспрессия представляющего интерес белка в клетке, причем представляющий интерес белок секретируется в среду.
    - 17 037568
  27. 27. Способ по п.26, где клетка представляет собой клетку CHO, клетку HEK293 или клетку BHK.
  28. 28. Способ по любому по пп.26 или 27, где представляющий интерес белок представляет собой антигенсвязывающий белок.
  29. 29. Способ по любому из пп.26-28, где представляющий интерес белок содержит домен Fc.
  30. 30. Способ по п.28 или 29, где представляющий интерес белок выбран из антитела, слитого с Fc белка и белка ScFv.
  31. 31. Способ по п.30, где слитый с Fc белок представляет собой слитый белок растворимого TCR-Fc или слитый белок рецептор-Fc (TRAP).
  32. 32. Способ по любому из пп.28-31, где представляющий интерес белок получают со средним 7суточным титром, который по меньшей мере на 7% больше, чем средний 7-суточный титр, получаемый при культивировании клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.
  33. 33. Способ по любому из пп.28-31, где представляющий интерес белок получают со средним 7суточным титром, который по меньшей мере на 14% больше, чем средний 7-суточный титр, получаемый при культивировании клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.
  34. 34. Способ по любому из пп.28-31, где представляющий интерес белок получают со средним 7суточным титром, который по меньшей мере на 80% больше, чем средний 7-суточный титр, получаемый при культивировании клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.
  35. 35. Способ по любому из пп.28-31, где представляющий интерес белок получают со средним 7суточным титром, который по меньшей мере в 2 раза больше, чем средний 7-суточный титр, получаемый при культивировании клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.
  36. 36. Способ по любому из пп.28-31, где представляющий интерес белок получают со средним 7суточным титром, который по меньшей мере в 3 раза больше, чем средний 7-суточный титр, получаемый при культивировании клеток в среде, которая содержит менее 0,09±0,014 мМ орнитина и менее 0,2±0,03 мМ путресцина.
  37. 37. Способ по любому из пп.28-31, где представляющий интерес белок представляет собой рекомбинантное антитело человека.
EA201591817A 2013-03-15 2014-03-14 Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток и способы ее применения EA037568B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361790136P 2013-03-15 2013-03-15
US14/211,245 US20140273095A1 (en) 2013-03-15 2014-03-14 Serum-Free Cell Culture Medium
PCT/US2014/028501 WO2014144198A1 (en) 2013-03-15 2014-03-14 Serum-free cell culture medium

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201591817A1 EA201591817A1 (ru) 2016-05-31
EA037568B1 true EA037568B1 (ru) 2021-04-15

Family

ID=51528781

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202191602A EA202191602A3 (ru) 2013-03-15 2014-03-14 Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток
EA201591817A EA037568B1 (ru) 2013-03-15 2014-03-14 Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток и способы ее применения
EA202190326A EA202190326A3 (ru) 2013-03-15 2014-03-14 Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202191602A EA202191602A3 (ru) 2013-03-15 2014-03-14 Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA202190326A EA202190326A3 (ru) 2013-03-15 2014-03-14 Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток

Country Status (22)

Country Link
US (5) US20140273095A1 (ru)
EP (4) EP3919611A1 (ru)
JP (5) JP6781039B2 (ru)
KR (6) KR20240065185A (ru)
CN (2) CN105143444A (ru)
AR (1) AR095196A1 (ru)
AU (4) AU2014227804B2 (ru)
BR (2) BR112015022682B1 (ru)
CA (5) CA3135232A1 (ru)
DK (1) DK2970876T3 (ru)
EA (3) EA202191602A3 (ru)
ES (1) ES2682929T3 (ru)
HK (1) HK1213289A1 (ru)
HU (1) HUE040233T2 (ru)
IL (5) IL281515B2 (ru)
MX (3) MX357977B (ru)
MY (1) MY175957A (ru)
PL (1) PL2970876T3 (ru)
PT (1) PT2970876T (ru)
SG (3) SG10202107444XA (ru)
TW (4) TWI629359B (ru)
WO (1) WO2014144198A1 (ru)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
US11124760B2 (en) * 2014-03-24 2021-09-21 Biogen Ma Inc. Methods for overcoming glutamine deprivation during mammalian cell culture
TW202330904A (zh) 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
KR101936049B1 (ko) * 2015-10-15 2019-01-08 (주)알테오젠 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법
WO2017092841A1 (en) * 2015-12-03 2017-06-08 Merck Patent Gmbh Chemically defined media for the growth or detection of microorganisms
KR20180047404A (ko) * 2016-10-31 2018-05-10 삼성바이오에피스 주식회사 세포 배양 배지에서 원치 않는 배양 부산물을 감소시키는 공정
CN108220334A (zh) * 2016-12-09 2018-06-29 上海迈泰君奥生物技术有限公司 无血清细胞培养基及高效表达重组蛋白质的方法
CN106635953B (zh) * 2016-12-13 2021-02-19 昆明润什生物科技有限公司 无血清无蛋白细胞培养基
CN110997725A (zh) 2017-06-12 2020-04-10 蓝鳍生物医药公司 抗-il1rap抗体和抗体药物缀合物
US20190010531A1 (en) * 2017-07-06 2019-01-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture process for making a glycoprotein
CN108103003B (zh) * 2017-12-12 2021-03-05 四川百诺吉科技有限公司 一种适应pk-15全悬浮生长的无血清培养基及其制备方法和应用于pk-15细胞的全悬浮驯化方法
WO2019135238A1 (en) * 2018-01-03 2019-07-11 Technion Research & Development Foundation Limited Naive pluripotent stem cell media
US10961500B1 (en) * 2019-04-23 2021-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium for eukaryotic cells
WO2020229584A1 (en) * 2019-05-16 2020-11-19 Formycon Ag Method for reducing methionine oxidation in recombinant proteins
CN110438066B (zh) * 2019-08-19 2021-01-12 杭州百凌生物科技有限公司 一种可稳定传代的可悬浮培养的哺乳动物细胞系293 c18p及其制备方法和应用
BR112021025769A2 (pt) 2019-12-06 2022-04-12 Regeneron Pharma Composições de proteína anti-vegf e métodos para a produção das mesmas
US11835527B2 (en) 2020-01-21 2023-12-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Deglycosylation methods for electrophoresis of glycosylated proteins
KR20230058094A (ko) 2020-08-31 2023-05-02 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 세포 배양 성능을 개선하고 아스파라긴 서열 변이체를 완화하기 위한 아스파라긴 공급 전략
MX2023008527A (es) 2021-01-20 2023-07-28 Regeneron Pharma Metodos para mejorar el valor proteico en cultivo celular.
KR20220127465A (ko) 2021-03-11 2022-09-20 주식회사 만도 조향 제어 장치 및 방법

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1321515A1 (en) * 2001-12-21 2003-06-25 Ingenium Pharmaceuticals AG Method of culturing cells
WO2007077217A2 (en) * 2006-01-04 2007-07-12 Baxter International Inc. Oligopeptide-free cell culture media
US20100285533A1 (en) * 2008-01-09 2010-11-11 Krueger Olaf Culture media additive and process for using it
US20110229933A1 (en) * 2008-09-26 2011-09-22 SAchering Corporaton High titer antibody production
US20120034674A1 (en) * 2010-07-08 2012-02-09 Baxter Healthcare S.A. Method of producing recombinant adamts13 in cell culture

Family Cites Families (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4072565A (en) 1974-11-04 1978-02-07 The Dow Chemical Company Production of viruses in tissue culture without use of serum
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
EP0082974B1 (en) 1981-12-24 1986-05-14 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Method for the cultivation of normal diploid cells and cultivation medium used therefor
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
FR2543158B1 (fr) 1983-03-24 1985-11-15 Inst Nat Sante Rech Med Milieu de culture de cellules animales sans serum, sans hormones et sans facteurs de croissance et procedes de culture primaire et d'obtention de lignees cellulaires utilisant ce milieu
DE3801236A1 (de) 1988-01-18 1989-07-27 Boehringer Mannheim Gmbh Pentosansulfat-medium
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
EP0449950A4 (en) 1988-12-14 1991-10-16 Us Health Cell culture medium for human liver epithelial cell line
US5529920A (en) 1988-12-14 1996-06-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Human liver epithelial cell line and culture media therefor
ATE236249T1 (de) 1989-09-12 2003-04-15 Hoffmann La Roche Tfn-bindende proteine
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5426699A (en) 1993-10-25 1995-06-20 Antec Corporation Method and apparatus for digitizing a scrambled analog video signal
EP0666312A1 (en) 1994-02-08 1995-08-09 Wolfgang A. Renner Process for the improvement of mammalian cell growth
US5856179A (en) 1994-03-10 1999-01-05 Genentech, Inc. Polypeptide production in animal cell culture
US5705364A (en) 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
US6656466B1 (en) 1995-06-06 2003-12-02 Genetech, Inc. Human tumor necrosis factor—immunoglobulin(TNFR1-IgG1) chimera composition
HUP0202974A3 (en) 1995-07-17 2005-05-30 Fraunhofer Ges Forschung Metal-containing ribonucleotide polypeptides
JP4306813B2 (ja) 1995-09-19 2009-08-05 アスビオファーマ株式会社 動物細胞の新規培養方法
US6043092A (en) 1996-03-18 2000-03-28 University Of Pittsburgh Cell culture media for mammalian cells
US6146847A (en) 1996-11-01 2000-11-14 Genespan Corporation Stabilized transient gene expression
EP1045898A2 (en) 1998-01-12 2000-10-25 Betagene, Inc. Compositions and methods for regulated secretion from neuroendocrine cell lines
US6528286B1 (en) 1998-05-29 2003-03-04 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing glycoproteins
WO2000057891A1 (en) 1999-03-30 2000-10-05 Trustees Of Boston University Compositions and methods for producing platelets and/or proplatelets from megakaryocytes
AT409379B (de) 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
US7070959B1 (en) 1999-06-08 2006-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
ME00024B (me) * 1999-06-08 2010-02-10 Regeneron Pharma Modifikovani himerni polipeptidi sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
CN1114619C (zh) * 1999-06-25 2003-07-16 中国科学院上海细胞生物学研究所 小鼠杂交瘤株Hepama－1分泌的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20090137416A1 (en) 2001-01-16 2009-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Isolating Cells Expressing Secreted Proteins
AU2002245272B2 (en) 2001-01-16 2006-06-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Isolating cells expressing secreted proteins
CN1240300C (zh) 2001-03-05 2006-02-08 科学与工业研究会 由大豆粉制备蛋白水解物的方法
CN1180080C (zh) * 2002-01-18 2004-12-15 中国科学院上海细胞生物学研究所 一种改进的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法
DE60309238T2 (de) 2002-03-08 2007-06-06 Asml Netherlands B.V. Lithographische Maske, lithographischer Apparat und Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung
AU2003237259B2 (en) 2002-05-29 2008-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Inducible eukaryotic expression system
US8673589B2 (en) 2002-05-29 2014-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Inducible eukaryotic expression system
US6924124B1 (en) 2002-08-23 2005-08-02 Immunex Corporation Feeding strategies for cell culture
WO2004104186A1 (en) 2003-05-15 2004-12-02 Wyeth Restricted glucose feed for animal cell culture
WO2005010160A2 (en) 2003-07-17 2005-02-03 Wisconsin Alumni Research Foundation Liquid crystals with reduced toxicity and applications thereof
US7462487B2 (en) 2003-09-18 2008-12-09 Raven Biotechnologies, Inc. Cell culture media
US7750138B2 (en) 2004-06-08 2010-07-06 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co. Ltd. Angiogenesis-inhibiting chimeric protein and the use
US7294484B2 (en) 2004-08-27 2007-11-13 Wyeth Research Ireland Limited Production of polypeptides
US7598083B2 (en) 2004-10-29 2009-10-06 Centocor, Inc. Chemically defined media compositions
US20060094104A1 (en) * 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
US8273553B2 (en) 2004-11-02 2012-09-25 Ares Trading S.A. Production of growth hormone in serum-free cell culture medium for mammalian cells
AR058568A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
DE602007008627D1 (de) * 2006-02-14 2010-10-07 Genetix Ltd Zellkulturmedium
US8216575B2 (en) 2006-03-31 2012-07-10 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains
NZ587107A (en) 2006-06-02 2012-05-25 Regeneron Pharma High affinity antibodies to human il-6 receptor
US7608693B2 (en) 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
CN101535469A (zh) 2006-11-08 2009-09-16 惠氏公司 合理设计的细胞培养基
PL2150617T3 (pl) 2007-06-04 2015-04-30 Regeneron Pharma Wzmocniona ekspresja i regiony stabilności
US20100221823A1 (en) 2007-06-11 2010-09-02 Amgen Inc. Method for culturing mammalian cells to improve recombinant protein production
CN101809037B (zh) 2007-07-31 2014-01-15 瑞泽恩制药公司 人cd20的人抗体及其使用方法
US8309088B2 (en) 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
CN100482786C (zh) * 2007-12-28 2009-04-29 天津百若克医药生物技术有限责任公司 一种人胚肾293细胞扩增无蛋白培养基
EP2356247B2 (en) 2008-11-12 2019-05-15 Baxalta Incorporated Method of producing serum-free insulin-free factor vii
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
HUE038596T2 (hu) 2009-06-02 2018-10-29 Regeneron Pharma Fukoziláció-hiányos sejtek
CN101603026B (zh) 2009-06-19 2011-01-19 华东理工大学 适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基
CA2766220C (en) 2009-06-26 2021-02-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
SG178194A1 (en) 2009-07-31 2012-03-29 Baxter Int Cell culture medium for adamts protein expression
EP2516624B1 (en) * 2009-12-23 2020-02-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Cell line 3m
JO3417B1 (ar) 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r
EA022220B1 (ru) 2010-02-24 2015-11-30 Сюменекс А/С Способ получения и очистки рекомбинантной лизосомальной альфа-маннозидазы
KR101828624B1 (ko) 2010-04-26 2018-02-12 노파르티스 아게 개선된 세포 배양 방법
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
ES2599412T3 (es) 2010-05-28 2017-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Disminución del nivel de lactato y aumento de la producción de polipéptidos regulando por disminución la expresión de la lactato deshidrogenasa y de la piruvato deshidrogenasa quinasa
JOP20190250A1 (ar) 2010-07-14 2017-06-16 Regeneron Pharma صيغ مستقرة تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد عامل نمو الأعصاب
KR20130101034A (ko) 2010-08-31 2013-09-12 프리슬랜드 브랜즈 비브이 진핵 세포를 위한 배양 배지
AR083044A1 (es) 2010-09-27 2013-01-30 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-cd48 y usos de los mismos
CA2813587C (en) 2010-10-06 2019-01-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stabilized formulations containing anti-interleukin-4 receptor (il-4r) antibodies
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
MX345399B (es) * 2010-12-28 2017-01-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo de cultivo de celulas animales.
AR087329A1 (es) 2011-06-17 2014-03-19 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos contra proteina 3 de tipo angiopoietina humana
KR102048189B1 (ko) 2011-11-14 2019-11-25 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Ｇｄｆ8 및/또는 액티빈 ａ를 특이적으로 길항함으로써 근육량과 근육 강도를 증가시키는 조성물 및 방법
NZ627859A (en) 2012-01-23 2015-09-25 Regeneron Pharma Stabilized formulations containing anti-ang2 antibodies
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
JP6090735B2 (ja) 2012-03-02 2017-03-08 国立大学法人山口大学 消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地、及びそれを用いた消化器系がん幹細胞の増殖方法
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9150645B2 (en) 2012-04-20 2015-10-06 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
CA2875294C (en) 2012-04-25 2021-06-08 Riken Cell preparation containing myocardium-committed cell
JO3820B1 (ar) 2012-05-03 2021-01-31 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها
SG10201701721TA (en) 2012-06-21 2017-04-27 Baxalta Inc Virus filtration of cell culture media
AR091967A1 (es) 2012-08-02 2015-03-11 Sanofi Sa Articulo de fabricacion que comprende aflibercept o 2iv-aflibercept
WO2014028354A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-pcsk9 antibodies with ph-dependent binding characteristics
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
SG10201901708SA (en) 2012-10-23 2019-03-28 Genzyme Corp Perfusion culturing methods and uses thereof
JO3405B1 (ar) 2013-01-09 2019-10-20 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها
SG10201806083RA (en) 2013-02-22 2018-08-30 Genzyme Corp Microcarrier perfusion culturing methods and uses thereof
PL2971005T3 (pl) 2013-03-12 2020-12-14 Agc Biologics, Inc. Ulepszona ekspresja rekombinowanego białka z zastosowaniem hybrydowego promotora CHEF1
JO3532B1 (ar) 2013-03-13 2020-07-05 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها
TWI659968B (zh) 2013-03-14 2019-05-21 再生元醫藥公司 針對呼吸道融合病毒ｆ蛋白質的人類抗體及其使用方法
US9217168B2 (en) * 2013-03-14 2015-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
WO2014159633A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Medimmune, Llc Recombinant polypeptide production
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
US20160237400A1 (en) 2013-03-15 2016-08-18 The Jackson Laboratory Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof
CA2904377C (en) 2013-03-15 2021-07-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il-33 antagonists and uses thereof
CA2908407C (en) 2013-05-29 2022-06-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Quantitative control of sialylation
TWI641620B (zh) 2013-08-21 2018-11-21 再生元醫藥公司 抗－ｐｒｌｒ抗體及其用途
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US10513723B2 (en) 2014-01-13 2019-12-24 Amgen Inc. Decreasing ornithine production to decrease high mannose glycoform content of recombinant proteins
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
WO2015138460A1 (en) 2014-03-11 2015-09-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-egfrviii antibodies and uses thereof
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
EP3636073B1 (en) 2014-05-05 2023-11-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized c5 and c3 animals
JO3701B1 (ar) 2014-05-23 2021-01-31 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي
CN106661562A (zh) 2014-05-27 2017-05-10 中央研究院 得自类杆菌属的岩藻糖苷酶及其用途
AU2015270137A1 (en) 2014-06-03 2016-12-22 Lupin Limited Cell culture process for producing a protein
BR112017005110A2 (pt) 2014-09-16 2018-01-23 Regeneron Pharma anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, molécula isolada de ácido nucleico, composição farmacêutica, e, método para diminuir níveis de glicose no sangue ou para tratar uma condição ou doença.
TWI710573B (zh) 2015-01-26 2020-11-21 美商再生元醫藥公司 抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體
CN114410571A (zh) 2015-04-01 2022-04-29 勃林格殷格翰国际公司 细胞培养基
TW202330904A (zh) 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
KR101936049B1 (ko) 2015-10-15 2019-01-08 (주)알테오젠 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법
TW202140776A (zh) 2016-04-26 2021-11-01 美商美國泰福生技股份有限公司 細胞培養基
US20190010531A1 (en) 2017-07-06 2019-01-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture process for making a glycoprotein

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1321515A1 (en) * 2001-12-21 2003-06-25 Ingenium Pharmaceuticals AG Method of culturing cells
WO2007077217A2 (en) * 2006-01-04 2007-07-12 Baxter International Inc. Oligopeptide-free cell culture media
US20100285533A1 (en) * 2008-01-09 2010-11-11 Krueger Olaf Culture media additive and process for using it
US20110229933A1 (en) * 2008-09-26 2011-09-22 SAchering Corporaton High titer antibody production
US20120034674A1 (en) * 2010-07-08 2012-02-09 Baxter Healthcare S.A. Method of producing recombinant adamts13 in cell culture

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAWEL, L. ; TJANDRAWINATA, R.R. ; BYUS, C.V.: "Selective putrescine export is regulated by insulin and ornithine in Reuber H35 hepatoma cells", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (BBA) - MOLECULAR CELL RESEARCH, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM., NL, vol. 1222, no. 1, 26 May 1994 (1994-05-26), NL, pages 15 - 26, XP023788723, ISSN: 0167-4889, DOI: 10.1016/0167-4889(94)90020-5 *
HOLTTA, E. ; POHJANPELTO, P.: "Polyamine dependence of Chinese hamster ovary cells in serum-free culture is due to deficient arginase activity", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (BBA) - MOLECULAR CELL RESEARCH, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM., NL, vol. 721, no. 4, 30 December 1982 (1982-12-30), NL, pages 321 - 327, XP025221778, ISSN: 0167-4889, DOI: 10.1016/0167-4889(82)90085-4 *
IGARASHI, K. ; KASHIWAGI, K.: "Modulation of cellular function by polyamines", INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY, PERGAMON, GB, vol. 42, no. 1, 1 January 2010 (2010-01-01), GB, pages 39 - 51, XP026909603, ISSN: 1357-2725, DOI: 10.1016/j.biocel.2009.07.009 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220372436A1 (en) 2022-11-24
WO2014144198A1 (en) 2014-09-18
EP2970876A1 (en) 2016-01-20
IL264499A (en) 2019-02-28
TW201502273A (zh) 2015-01-16
AU2020200052A1 (en) 2020-01-30
CA3238121A1 (en) 2014-09-18
EA202190326A2 (ru) 2021-05-31
KR20210090732A (ko) 2021-07-20
IL281515A (en) 2021-04-29
IL241195A0 (en) 2015-11-30
AU2021205088B2 (en) 2022-09-22
AU2022211862A1 (en) 2022-08-25
IL289724B1 (en) 2023-04-01
IL241195B (en) 2019-05-30
SG10201707153UA (en) 2017-10-30
MX2021001859A (es) 2021-04-19
KR20200119894A (ko) 2020-10-20
BR112015022682A2 (pt) 2017-07-18
IL289724B2 (en) 2023-08-01
NZ711935A (en) 2021-04-30
TWI701333B (zh) 2020-08-11
CA3188491A1 (en) 2014-09-18
CA2906768A1 (en) 2014-09-18
AU2014227804B2 (en) 2020-01-30
KR102166166B1 (ko) 2020-10-15
US20220228187A1 (en) 2022-07-21
EA202191602A2 (ru) 2021-08-31
US20140273095A1 (en) 2014-09-18
JP2022172390A (ja) 2022-11-15
CN105143444A (zh) 2015-12-09
KR20240065185A (ko) 2024-05-14
PT2970876T (pt) 2018-10-22
CA2906768C (en) 2022-08-30
JP2019150037A (ja) 2019-09-12
HUE040233T2 (hu) 2019-02-28
KR20210031778A (ko) 2021-03-22
US11332771B2 (en) 2022-05-17
JP6781039B2 (ja) 2020-11-04
IL289724A (en) 2022-03-01
BR112015022682B1 (pt) 2023-03-28
TWI629359B (zh) 2018-07-11
MX2015013176A (es) 2016-04-07
KR102278316B1 (ko) 2021-07-19
MX2021008627A (es) 2022-06-14
AU2014227804A1 (en) 2015-09-24
JP2024001357A (ja) 2024-01-09
PL2970876T3 (pl) 2018-11-30
AR095196A1 (es) 2015-09-30
KR102229380B1 (ko) 2021-03-18
CN113481148A (zh) 2021-10-08
IL281515B1 (en) 2024-01-01
SG11201507072TA (en) 2015-10-29
US20200149081A1 (en) 2020-05-14
BR122020021864B1 (pt) 2022-09-20
HK1213289A1 (zh) 2016-06-30
CA3135232A1 (en) 2014-09-18
IL281515B2 (en) 2024-05-01
EA201591817A1 (ru) 2016-05-31
JP2016514452A (ja) 2016-05-23
TWI782295B (zh) 2022-11-01
AU2021205088A1 (en) 2021-08-12
KR20220116571A (ko) 2022-08-23
TW202041672A (zh) 2020-11-16
DK2970876T3 (en) 2018-08-13
MX357977B (es) 2018-08-01
TW201835325A (zh) 2018-10-01
TW202325723A (zh) 2023-07-01
EA202190326A3 (ru) 2021-09-30
MY175957A (en) 2020-07-16
EA202191602A3 (ru) 2021-12-31
US20210332402A1 (en) 2021-10-28
JP7429743B2 (ja) 2024-02-08
SG10202107444XA (en) 2021-08-30
EP2970876B1 (en) 2018-07-11
US11970724B2 (en) 2024-04-30
KR20150128785A (ko) 2015-11-18
EP3919611A1 (en) 2021-12-08
EP3378932A1 (en) 2018-09-26
EP4159841A1 (en) 2023-04-05
JP6944969B2 (ja) 2021-10-06
ES2682929T3 (es) 2018-09-24
AU2020200052B2 (en) 2023-01-19
CA3238123A1 (en) 2014-09-18
JP2021180682A (ja) 2021-11-25
IL300911A (en) 2023-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11970724B2 (en) Serum-free cell culture medium
EA045169B1 (ru) Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток
EA044302B1 (ru) Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток
NZ711935B2 (en) Serum-free cell culture medium