TW202325723A - 不含血清之細胞培養基 - Google Patents

Abstract

本說明書敘述一種改良的不含血清之動物細胞培養基，其可用以產生所欲蛋白質。可添加鳥胺酸、或一種鳥胺酸及腐胺的組合物至不含血清之培養基，或化學成分確定之培養基，而改善活細胞密度、降低細胞倍增時間，並增加所欲蛋白質的產量。

Description

不含血清之細胞培養基

本發明涉及用來培育細胞與用來生產重組蛋白質之培養基，本發明特別涉及不含血清之培養基，其用來培養重組的中國倉鼠卵巢細胞(CHO cells)，以製造生物治療性蛋白質。

含有血清或蛋白質水解產物成份(例：蛋白腖及胰腖)之細胞培養基已長期用於培養細胞中重組蛋白質的生產，這些成份包含生長因子及多種益於細胞生長與培育的其他未明組成物；然而，它們也包含減緩生長或其他對重組蛋白質生產有負面影響的未明組成物，它們亦可為一種不受歡迎的變異性之潛在來源。除了它們的缺點，使用血清及水解產物的好處已勝過一些缺點，而被廣泛應用於多種細胞培養用途。

人類生物性治療劑(生物藥劑)通常產自哺乳動物細胞培養，特別是中國倉鼠卵巢細胞培養，在這些細胞培養中出現的未明或部份定性成份對於製造供人類使用的生物藥劑是極不理想的，使用這樣的未明或部份定性成份不僅導致生產與管理的不協調，它引發生產細胞培養物被病毒或真菌感染的可能性。

降低藥品產量與成份批次之間的變異是篩選培養過程的另一項重要因素，血清、水解產物及其他未明組成物導致產量、成份及生物製藥生產批次的變化。因為藥物效價往往部分仰賴於養分維持於一特定平衡，培養基組成物之品質與純度亦可能影響產量，當一批培養基批次之養分的相對量異於另一批，則藥物產量改變，且此變化可能是不可接受或不 經濟的。

使用含有血清或以水解產物為基底的培養基造成下游處理的難度，在培養物中理想的生物藥劑濃度通常為克/升，培養基中出現血清及水解產物可增加超過10克/升之未知胜肽與蛋白質，其必須於後續處理過程中被移除，血清與水解產物亦可導致該培養基中金屬及其他微量組成物含量的變化，由培養基中去除血清與水解產物，從而消除這些變化與製造及加工藥劑的潛在阻礙。

其中，使用不含血清與水解產物之培養基的優點包括：降低成本、減少藥品批次間的變異、縮小引入來自未明及未精煉成份之外來試劑的風險。此外，將流程批次間的培養基定性及統一成份，則同樣可縮減現行培養基與新培養基批次之間的比對驗證流程，因此，有必要研究培養哺乳動物細胞之培養基的技術，其中該培養機化學成分明確，且不含血清與水解產物，或其不含血清且含有少量易處理的水解產物，並使健康及強健細胞仍得以生長與維持，且高量生產生物藥劑物質。

本發明者已有驚人的發現，該包含鳥胺酸，具有或不具有腐胺之不含血清細胞培養基(「OS」培養基)可增加細胞活性與密度、降低細胞倍增時間，並使得這些細胞產生高量蛋白質；本發明者亦發現，含有低或少量蛋白質水解產物或化學成分明確(即：不含蛋白質水解產物)之OS培養基可特別提供修復細胞活性及密度、細胞倍增時間、及高量蛋白質生產力。

在一方面，本發明提供一種細胞培養基，其不含血清，並含有至少0.09mM±0.014mM鳥胺酸。於一具體實例中，存在於該培養基中的鳥胺酸濃度範圍由0.09±0.014mM至0.9±0.14mM，諸如：0.09±0.014mM、0.3±0.05mM、0.6±0.09mM，或0.9±0.14mM鳥胺酸。於一些具體 實例中，該培養基亦含有至少0.20±0.03mM腐胺。於一些具體實例中，額外的腐胺濃度範圍由0.20±0.03mM至0.714±0.11mM，諸如：0.20±0.03mM、0.35±0.06，或0.714±0.11mM腐胺。於一些具體實例中，該培養基含有小於等於7.5克/升水解產物。於一些具體實例中，該培養基不含任何水解產物。

於一具體實例中，該培養基包含一種化學成分明確的基礎培養基，諸如：一種習用配方或一種市售基礎培養基。於一具體實例中，該完整培養基化學成分明確，不含血清且不含水解產物。

於一些具體實例中，於其使用濃度(例：1倍)之培養基含有至少40±6mM，或至少70±10.5mM的胺基酸混合物或胺基酸鹽類。於一具體實例中，該培養基含有至少40mM胺基酸混合物。於此或其他具體實例中，該培養基含有至少70mM胺基酸混合物。於一具體實例中，該胺基酸混合物(顯著的例外為麩醯胺酸，其可在使用時加入培養基中)含有丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸，及纈胺酸。

於一些具體實例中，該培養基含有一或多種脂肪酸。於一特定具體實例中，該培養基含有脂肪酸(或脂肪酸衍生物)及維生素E的混合物，脂肪酸或脂肪酸衍生物選自該群組，包含：亞麻油酸、次亞麻油酸、硫辛酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、花生油酸、月桂酸、二十二酸、癸酸、十二酸、己酸、十四酸、肉豆蔻酸，及辛酸。

於一些具體實例中，該培養基含有核苷之混合物。於一具體實例中，該培養基含有腺核苷、鳥糞核苷、胞嘧啶核苷、尿核苷、胸腺嘧啶核苷，及次黃嘌呤。

於一些具體實例中，該培養基含有鹽類的混合物，鹽類包括二價陽離子，諸如：鈣及鎂。於一具體實例中，該培養基含有氯化鈣及 硫酸鎂，其他鹽類可包括那些二價陽離子的磷酸鹽類。

於一特別具體實例中，該培養基(1)含有小於等於7.5克/升水解產物，(2)不含血清，(3)含有0.09±0.014mM、0.3±0.05mM、0.6±0.09mM，或0.9±0.14mM鳥胺酸，(4)非強制性的額外含有0.20±0.03mM、0.35±0.06，或0.714±0.11mM腐胺，(5)含有至少約40mM，或至少約70mM胺基酸混合物，包括：丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸，及纈胺酸，(6)含有維生素E及一種脂肪酸混合物，(7)含有核苷混合物，包括：腺核苷、鳥糞核苷、胞嘧啶核苷、尿核苷、胸腺嘧啶核苷，及次黃嘌呤，及(8)含有鈣、鎂及磷酸之鹽類。

在另一方面，本發明提供一種方法，用來在一種細胞培養基中培養細胞，諸如：前述方面任何具體實例之培養基。於一具體實例中，該方法採用在一培養基中增殖或維持一種細胞或多種細胞的步驟，該培養基(1)含有小於等於7.5克/升水解產物，或無水解產物，(2)不含血清，(3)含有鳥胺酸，濃度至少為0.09mM±0.014mM，(4)及非強制性的含有腐胺，諸如：至少0.20±0.03mM。

於一些具體實例中，該細胞或多種細胞係哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆蟲細胞、真菌細胞，或細菌細胞。於一具體實例中，該細胞為哺乳動物細胞，用於生產重組蛋白質，諸如：中國倉鼠卵巢細胞或衍生的中國倉鼠卵巢細胞K1細胞株。於一些具體實例中，該細胞表現一種所欲蛋白質，諸如：一種生物治療性蛋白質，該生物治療性蛋白質可能為一種抗原結合蛋白，其可能含有一個Fc域。於一些具體實例中，該所欲蛋白質係一種受體-Fc融合蛋白，諸如：一種單鏈可變區段分子或一種阱分子(trap molecule)，阱分子包括血管內皮生長因子(VEGF)阱蛋白及介白素-1阱蛋白。於一些具體實例中，該所欲蛋白質係一種抗體，諸如：一種人源化單株抗體、一種雙特異性抗體，或一種抗體片段。

含鳥胺酸，或鳥胺酸與腐胺組合的不含血清培養基對於細胞生長有正向功效，依據此法所培養之細胞的平均倍增時間不超過30小時。於一具體實例中，該細胞倍增時間不超過24小時。於一具體實例中，與生長於含有少於0.09±0.014mM鳥胺酸(或少於0.09±0.014mM鳥胺酸及少於0.2±0.03mM腐胺)之培養基的細胞相較，依據此法所生長之細胞的平均倍增時間為比較對照組培養細胞倍增時間的至少三分之一。

相同地，與不含有鳥胺酸或鳥胺酸與腐胺組合物相較，不含血清之培養基中含有鳥胺酸或鳥胺酸與腐胺組合物使得培養細胞達到較高的活細胞計數密度。於一個不含血清與水解產物之OS培養基的具體實例中，與培養在含有少於0.09±0.014mM鳥胺酸(或少於0.09±0.014mM鳥胺酸及少於0.2±0.03mM腐胺)類似培養基的類似細胞培養相較，該細胞培養可達到超過至少15%之活細胞計數密度。於另一個不含血清與水解產物之OS培養基的具體實例中，與培養在含有少於0.09±0.014mM鳥胺酸(或少於0.09±0.014mM鳥胺酸及少於0.2±0.03mM腐胺)類似培養基的類似細胞培養相較，該細胞培養可達到超過至少3倍之活細胞計數密度。

於另一具體實例中，該方法包括添加一或多種屆時添加物至該細胞培養基的步驟。於一些具體實例中，該屆時添加物係任何一或多個碳酸氫鈉、麩醯胺酸、胰島素、葡萄糖、硫酸銅、硫酸鋅、氯化鐵、硫酸鎳、乙二胺四乙酸四鈉，及檸檬酸三鈉。於一具體實例中，該方法採用添加各個下列屆時添加物至該細胞培養基之步驟：碳酸氫鈉、麩醯胺酸、胰島素、葡萄糖、硫酸銅、硫酸鋅、氯化鐵、硫酸鎳、乙二胺四乙酸四鈉，及檸檬酸三鈉。於一些具體實例中，該屆時添加物可於初始時加入該培養基中。

於一特別具體實例中，該方面提供一種方法，用來在一種不含血清之培養基中培養細胞，其包含(1)細胞培養基中鳥胺酸濃度為0.09±0.014mM、0.3±0.05mM、0.6±0.09mM，或0.9±0.14mM；(2)非強制性外加腐胺0.20±0.03mM、0.35±0.06，或0.714±0.11mM；(3)至少約40 mM，或至少約70mM之胺基酸混合物，包含：丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸，及纈胺酸；(4)維生素E及一種脂肪酸混合物；(6)核苷混合物，包括：腺核苷、鳥糞核苷、胞嘧啶核苷、尿核苷、胸腺嘧啶核苷，及次黃嘌呤，及(9)鈣、鎂，及磷酸鹽類，其中依據此法所培養之細胞的平均倍增時間不超過24小時，或相較對照培養倍增時間的至少三分之一；並且與培養在含有少於0.09±0.015mM鳥胺酸(或少於0.09±0.014mM鳥胺酸及少於0.2±0.03mM腐胺)類似培養基的類似細胞培養相較，該細胞培養可達到超過至少15%，或超過至少3倍之活細胞計數密度。於另一具體實例中，與培養在含有少於0.09±0.014mM鳥胺酸(或少於0.09±0.014mM鳥胺酸及少於0.2±0.03mM腐胺)相似培養基的相似細胞培養物相較，該細胞培養可達到超過至少3倍之活細胞計數密度。於一具體實例中，該培養基含有小於等於7.5克/升水解產物；且於另一具體實例中，不含水解產物。

在另一方面，本發明提供一種方法，經由採用該步驟而生產所欲蛋白質：(1)細胞導入一段核酸序列，其編碼所欲之蛋白質；(2)篩選攜帶該核酸序列之細胞；(3)於第一方面所述之具體實例的不含血清之細胞培養基中，或依據第二方面所述任何具體實例之方法培養該篩選細胞；及(4)於該細胞中表現所欲蛋白質，其中該所欲蛋白質被分泌至培養基中。於一些具體實例中，用來生產該蛋白質的細胞是一種可產生生物治療劑的哺乳動物細胞，諸如：中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、293細胞，及幼倉鼠細胞(BHK)，或任何它們的衍生系。於一具體實例中，該細胞係一種中國倉鼠卵巢細胞，諸如：中國倉鼠卵巢細胞K1細胞株細胞。

於一些具體實例中，該所欲蛋白質係一種抗原結合蛋白。於一些具體實例中，該所欲蛋白質係一種具有Fc域的蛋白質，於某些實例中，這兩類所欲蛋白質可能重疊，諸如例：在受體-Fc融合蛋白、抗體，及 單鏈可變區段蛋白之實例中。因此，於一些具體實例中，該所欲蛋白質係一種抗體，諸如：一種人類抗體或人源化抗體，一種抗體片段，諸如：一種抗原結合區段或抗原結合區段雙體，一種雙特異性抗體，一種阱分子，諸如：一種血管內皮生長因子阱分子或介白素-1阱分子，一種單鏈可變區段分子，一種可溶性T細胞受器(TCR)-Fc融合蛋白，或該類似物。

於一具體實例中，與培養在含有少於0.09±0.014mM鳥胺酸(或少於0.09±0.014mM鳥胺酸及少於0.2±0.03mM腐胺)(「非OS」培養基)不含血清細胞培養基之類似細胞產生的平均7天效價相較，可產生的所欲蛋白質之平均7天效價超過至少7%、超過至少14%、超過至少80%、超過至少2倍，或超過至少3倍。

於一特別具體實例中，該所欲蛋白質的生產是由(1)中國倉鼠卵巢細胞導入一段核酸序列，其編碼一種所欲蛋白質，諸如：一種抗體，或其他抗原結合蛋白；(2)篩選攜帶該核酸序列之細胞；(3)在一種不含血清之細胞培養基中培養該篩選細胞，該培養基含有(a)鳥胺酸為0.09±0.014、0.3±0.05mM、0.6±0.09mM，或0.9±0.14mM；(b)非強制性外加腐胺0.20±0.03mM、0.35±0.06，或0.714±0.11mM；(c)至少40mM或至少70mM之胺基酸混合物，包括：丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸，及纈胺酸；(d)維生素E及一種脂肪酸混合物；(e)核苷混合物，包括：腺核苷、鳥糞核苷、胞嘧啶核苷、尿核苷、胸腺嘧啶核苷，及次黃嘌呤，以及(f)鈣、鎂及磷酸之鹽類；及(d)於中國倉鼠卵巢細胞中表現該所欲蛋白質，其中該所欲蛋白質被分泌至培養基中。於一些具體實例中，該不含血清之細胞培養基可能含有小於等於7.5克/升水解產物；或於其他具體實例中，無水解產物。

該申請人已有驚人發現，相對於含有非常少量或沒有鳥胺酸，或小量或沒有鳥胺酸與腐胺組合物(「非OS培養基」)之不含血清培養基，添加鳥胺酸，或鳥胺酸與腐胺組合(「OS培養基」)可增進活細胞密度、細胞倍增時間，及細胞培養中細胞的蛋白質生產。

在說明本細胞培養物及方法之前，應了解本發明並不限於所述之特定方法及實驗條件，該方法與條件可做變化，亦應了解本文所用之術語僅為說明特定具體實例，而非為了進行限定。

除非另有定義，本申請書使用之所有技術及科學術語與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解之意義相同，雖然任何類似或等同於那些本申請中所述之方法及材料可被用於實施或測試本發明，仍列舉某些特定方法及材料。單位、前綴字首及符號被表示為其國際單位常規的形式，本文列舉之數值範圍是無限制括弧內同類項的，意指其包括限定於該範圍之數值。除非另有註明，該專有名詞「一」或「一種」應理解為「至少一個」。本文中使用的章節標題僅為了文章組織，而不應當被解釋為限制所述之主題，除非另有指明，本文所述之方法和技術通常根據本領域已知習用方法，並照本說明書中引用與討論之各種通用及較專門的參考文獻來進行，參見，例：Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3^rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)，及Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992),Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，及Julio E.Celis,Cell Biology：A Laboratory Handbook,2^nd ed.,Academic Press,New York,N.Y.(1998)，及Dieffenbach and Dveksler,PCR Primer：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1995)。本說明書中提及之所有刊物以其全文併入本文參考文獻中。

定義

本文所用之「胜肽」、「多肽」及「蛋白質」於全文中可互換使用，並意指彼此間以一個肽鍵連結，由兩個或多個胺基酸殘基組成的一種分子，胜肽、多肽及蛋白質亦可包含修飾作用，諸如：醣化作用、脂質附加作用、硫酸化作用、麩胺酸殘基之γ-羧化作用、烷基化作用、羥化作用，及腺核苷二磷酸-核糖基化作用。胜肽、多肽及蛋白質可以是在科學上或商業上令人感興趣的，包括以蛋白質為基底的藥物，在其中，胜肽、多肽及蛋白質包括：抗體，及嵌合或融合蛋白。由使用細胞培養方法之重組動物細胞株產生胜肽、多肽及蛋白質。

本文所用該專有名詞「異源性多核苷酸序列」意指編碼所欲蛋白質之核酸聚合物，諸如：嵌合蛋白質(如：阱分子)、抗體或抗體的一部分(例：重鏈變異區、輕鏈變異區、互補決定區3)，其製成一種生物藥劑材料。可經由基因工程技術製造該異源性多核苷酸序列(例如：編碼一種嵌合蛋白的一段序列，或一段密碼子優化序列、一段無內含子的序列...等)，並導入該細胞中，其中該序列可能以一種游離基因體存在，或被併入該細胞之基因體中，該異源性多核苷酸序列可能為一種天然存在之序列，其被導入該生產細胞基因體內的一個異位點中，該異源性多肽序列可能為來自其他生物的一種天然存在之序列，諸如：編碼一種人類異種同源物的一段序列。

「抗體」意指一種免疫球蛋白分子，由四條多肽鏈構成，其中兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈互相以雙硫鍵連結，每一條重鏈具有一個重鏈變異區(HCVR或VH)，及一個重鏈恒定區，該重鏈恒定區含有三個域—重鏈恒定域1(CH1)、重鏈恒定域2(CH2)及重鏈恒定域3(CH3)；每一條輕鏈具有一個輕鏈變異區，及一個輕鏈恒定區，該輕鏈恒定區含有一個域(輕鏈恒定域(CL))。該重鏈變異區與輕鏈變異區可被進一步細分為高度變異區，稱為互補決定區(CDR)，其中散布較保守的區域，稱為框架區(FR)，每一個重鏈變異區與輕鏈變異區由三個互補決定區及四個框架區構成，由氨基末端至羧基末端排列順序如下：框架區1、互補決定 區1、框架區2、互補決定區2、框架區3、互補決定區3、框架區4。該專有名詞「抗體」包括所提到的任何同型或亞類的兩種醣化與非醣化免疫球蛋白。該專有名詞「抗體」包括經由重組方式製備、表現、製造或分離的抗體分子，諸如：由轉染而表達該抗體的宿主細胞中分離出的抗體。該專有名詞「抗體」亦包括雙特異性抗體，其包含可結合至一個以上不同抗原決定位的一種異四聚體免疫球蛋白，雙特異性抗體通常於美國專利申請公開號2010/0331527中說明，其併入本申請書參考文獻中。

該專有名詞抗體(或「抗體片段」)之「抗原結合部分」，意指一種抗體的一或多個片段，其保留特異性結合抗原的能力。該專有名詞抗體之「抗原結合部分」所囊括的結合片段例證包括(i)一種抗原結合區段之片段，由輕鏈變異區、重鏈變異區、輕鏈恒定域及重鏈恒定域1構成的一種單價片段；(ii)一種抗原結合區段之雙體片段，由在鉸鏈區經由雙硫鍵連結的兩個抗原結合區段片段組成的一種雙價片段；(iii)由重鏈變異區及重鏈恒定域1組成的一種重鏈區段之片段；(iv)由抗體單臂的輕鏈變異區及重鏈變異區域組成的一種可變區段之片段；(v)一種域抗體片段(Ward et al.(1989)Nature 241：544-546)，其含有一個重鏈變異區域；(vi)一種分離的互補決定區；及(vii)一種單鏈可變區段，其含有經由合成鍵結而連結的可變區段片段的兩個域、輕鏈變異區及重鏈變異區，以形成一個單一蛋白鏈，其中該輕鏈變異區與重鏈變異區域配對以形成單價分子。其他形式的單鏈抗體，諸如：雙體抗體，亦囊括於該專有名詞「抗體」之中(參見，例：Holliger et al.(1993)PNAS USA 90：6444-6448；Poljak et al.(1994)Structure 2：1121-1123)。

再更進一步，抗體或其抗原結合部分可以是更大的免疫黏附分子的一部分，其由共價鍵或非共價鍵連結該抗體或部分抗體與一種或多種其他蛋白質或胜肽而形成，該免疫黏附分子之例子包括使用鏈霉抗生物素蛋白核心區以製成一種四聚體的單鏈可變區段分子(Kipriyanov et al.(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)，並使用一種半胱胺酸 殘基、一種標記胜肽，及一種羧基末端聚組胺酸標籤，以製成雙價且生物素化的單鏈可變區段分子(Kipriyanov et al.(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。部分抗體，諸如：抗原結合區段及抗原結合區段雙體之片段，可使用習用技術由完整抗體中製備，諸如：經由木瓜酶或胃蛋白酶分解完整抗體。此外，可使用本領域已知的標準重組DNA技術(參見Sambrook et al.,1989)來獲得抗體、部分抗體，及免疫黏附分子。

該專有名詞「人類抗體」有意包含源自人類生殖系免疫球蛋白序列之具有變異區及恒定區的抗體，本發明之人類抗體可包括不是由人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(例：在體外經由隨機或定點誘突變作用導入的突變，或在體內經由體細胞突變作用導致的突變)，例如：在互補決定區，及特定互補決定區3。然而，本文所用之專有名詞「人類抗體」無意包括將源自其他哺乳動物物種(諸如：小鼠)生殖系互補決定區序列移植至人類框架序列之抗體。

本文所用之專有名詞「重組人類抗體」有意包括經由重組方式製備、表現、製造或分離的所有人類抗體，諸如：使用重組表現載體轉染宿主細胞而表現的抗體、由重組組合型人類抗體庫分離的抗體、由人類免疫球蛋白基因轉殖動物(例：小鼠)分離的抗體(參見，例：Taylor et al.(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或經由任何其它方式製備、表現、製造或分離的抗體，其中該方式涉及剪接人類免疫球蛋白基因序列至其他DNA序列，此類重組人類抗體具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列的變異區及恒定區。然而，於某些具體實例中，將此重組人類抗體進行體外誘突變作用(或使用人類免疫球蛋白序列轉殖動物時，則為體內體細胞誘突變作用)，則僅管源自人類生殖系重鏈變異區與輕鏈變異區序列並與人類生殖系重鏈變異區與輕鏈變異區序列有關，該重組抗體之重鏈變異區與輕鏈變異區的胺基酸序列可能不是天然存在於體內的人類抗體生殖系指令碼的序列。

「Fc融合蛋白」包含部分或全部的兩種或多種蛋白質，其 中一種是免疫球蛋白分子之Fc部分，該蛋白質在其他狀況下無法在自然中一同被發現。含有某些融合至多種抗體源性多肽部分(包括Fc域)之異源性多肽的融合蛋白之製備法已說明於例如：Ashkenazi et al.,Proc.Natl.Acad.ScL USA 88：10535,1991；Byrn et al.,Nature 344：677,1990；及Hollenbaugh et al.,"Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins",in Current Protocols in Immunology,Suppl.4,pages 10.19.1-10.19.11,1992。「受體Fc融合蛋白」含有耦合Fc部分的一或多種受體之細胞外域，其在一些具體實例中包含一個鉸鏈區，其接續免疫球蛋白之重鏈恒定域2及重鏈恒定域3。於一些具體實例中，該Fc融合蛋白含有兩種或多種不同的受體鏈，其可結合至一或多個配體，例如：一種Fc融合蛋白是一種阱分子，諸如：一種介白素-1阱分子(例：介白素-1受體拮抗劑(rilonacept)，其含有介白素-1RAcP配體結合區，該區融合至合併人類免疫球蛋白G1(hIgG1)Fc的介白素-1R1細胞外區域；參見美國專利號6,927,004)，或一種血管內皮生長因子阱分子(例：阿柏西普(aflibercept)，其含有血管內皮生長因子受體Flt1之人類免疫球蛋白域2，該域融合至合併人類免疫球蛋白G1(hIgG1)Fc的血管內皮生長因子受體Flk1的人類免疫球蛋白域3；參見美國專利號7,087,411及7,279,159)。

培養基

本發明提供一種不含血清之培養基，其用於培養細胞，及生產一種生物藥劑材料。將「不含血清」應用於一種細胞培養基，其不含動物血清，諸如：胎牛血清，該不含血清之培養基可含小於等於7.5克/升之水解產物，諸如：大豆水解產物。本發明亦提供化學成分明確的培養基，其不僅不含血清，且不含水解產物，將「不含水解產物」應用於細胞培養基，其不含外源性蛋白質水解產物，諸如：動物或植物蛋白質水解產物，例如：蛋白腖、胰腖...等。

為了降低批次間的變化並增益下游處理步驟，由細胞培養基中除去血清，及減少或除去水解產物，但不幸地會減低細胞發育、活力，及蛋白質表現，因此，化學成分明確的不含血清，低量到無水解產物之培 養基需要額外成份，以增進細胞生長及蛋白質生成。本發明之細胞培養基可增補額外成份，諸如：多胺，或增加組成份之濃度，譬如：胺基酸、鹽類、醣類、維生素、激素、生長因子、緩衝劑、抗生素、脂質、微量組成物...等，取決於培養細胞之需求，或所欲細胞培養物參數之需求。具體而言，本文之細胞培養基增補鳥胺酸、腐胺，或兩者皆有(「OS培養基」)，以增進細胞生長、細胞活性，及重組蛋白質生產。

於一些具體實例中，該OS培養基含有鳥胺酸，濃度(以微莫耳/升表示)為至少約90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、540、545、550、555、560、565、568、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、620、625、630、635、640、645、650、700、750、800、850，或900μM。

於一些具體實例中，該培養基含有鳥胺酸，濃度為約85、90、95、100、105、110、113，或115μM。於一具體實例中，該培養基含有100μM±15μM鳥胺酸。於一具體實例中，該培養基含有15毫克/升±2.25毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽。

於一些具體實例中，該培養基含有鳥胺酸，濃度為約255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340，或345μM。於一具體實例中，該培養基含有300μM±45μM鳥胺酸。於一具體實例中，該培養基含有50毫克/升±7.5毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽。

於一些具體實例中，該培養基含有鳥胺酸，濃度為約510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、 645、650、655、660、665、670、675、680、685，或690μM。於一具體實例中，該培養基含有600μM±90μM鳥胺酸。於一具體實例中，該培養基含有100毫克/升±15毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽。

於一些具體實例中，該培養基含有鳥胺酸，濃度為765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、1,000、1,005、1,010、1,015、1,020、1,025、1,030，或1,035μM。於一具體實例中，該培養基含有900μM±135μM鳥胺酸。於一具體實例中，該培養基含有150毫克/升±22.5毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽。

可非強制性添加腐胺至該鳥胺酸增補培養基中，在一些細胞培養基配方中，非常低濃度的腐胺已作為一種成份被包含於內；參見例如：世界專利第2005/028626號，其中記述0.02-0.08毫克/升腐胺；美國專利第5,426,699號(0.08毫克/升)；美國專利第RE30,985號(0.16毫克/升)；美國專利第5,811,299號(0.27毫克/升)；美國專利第5,122,469號(0.5635毫克/升)；美國專利第5,063,157號(1毫克/升)；世界專利第2008/154014號(~100μM-~1000μM)；美國專利申請案第2007/0212770號(0.5-30毫克/升多胺；2毫克/升腐胺；2毫克/升腐胺+2毫克/升鳥胺酸；2毫克/升腐胺+10毫克/升鳥胺酸)。

於一些具體實例中，該培養基含有鳥胺酸與腐胺之組合物，其中腐胺濃度至少為約150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、260、365、370、375、380、385、390、395、400、405，或410μM。

於一些具體實例中，該培養基含有腐胺，濃度為約170、 175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225，或230μM。於一具體實例中，除了含有

90μM±14μM鳥胺酸之外，該培養基含有200μM±30μM腐胺。於一具體實例中，除了含有

15毫克/升±2.25毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽之外，該培養基含有30毫克/升±4.5毫克/升腐胺二鹽酸鹽。

於一些具體實例中，該培養基含有腐胺，濃度為約295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400，或405μM。於一具體實例中，除了含有

90μM±14μM鳥胺酸之外，該培養基含有350μM±52.5μM腐胺。於一具體實例中，除了含有

15毫克/升±2.25毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽之外，該培養基含有57毫克/升±8.55毫克/升腐胺二鹽酸鹽。

於一些具體實例中，該培養基含有腐胺，濃度為約595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800，或805μM。於一具體實例中，除了含有

90μM±14μM鳥胺酸之外，該培養基含有714μM±105μM腐胺。於一具體實例中，除了含有

15毫克/升±2.25毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽之外，該培養基含有115毫克/升±17.25毫克/升腐胺二鹽酸鹽。

於一些具體實例中，該培養基含有上文列出的任何濃度之腐胺與鳥胺酸的成對組合。於一些具體實例中，該培養基含有任何成對組合的約595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800，或805μM腐胺，與約510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685，或690μM鳥胺酸。例如：於一具體實例之培養基含 有約700μM腐胺，加上參照以下任何一個濃度之鳥胺酸：510、511、512μM；或701μM腐胺，加上參照以下任何一個濃度之鳥胺酸：510、511、512μM...等。亦例如：於一具體實例之培養基含有約600μM鳥胺酸，加上參照以下任何一個濃度之腐胺：700、701、702μM；或601μM鳥胺酸，加上參照以下任何一個濃度之腐胺：700、701、702μM...等。於一些具體實例中，該培養基含有702μM±106μM腐胺，加上593μM±89μM鳥胺酸。於一特定具體實例中，該培養基含有約714μM腐胺與593μM鳥胺酸。於一具體實例中，該培養基含有115毫克/升±17毫克/升腐胺二鹽酸鹽與100毫克/升±15毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽。於一特定具體實例中，該培養基含有115毫克/升腐胺二鹽酸鹽與100毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽。

於一具體實例中，除了含有鳥胺酸或腐胺，該培養基含有核苷之混合物，累積濃度為至少50μM、至少60μM、至少70μM、至少80μM、至少90μM、至少100μM、至少110μM、至少115μM、至少120μM、至少125μM、至少130μM、至少135μM、至少140μM、至少145μM、至少150μM、至少155μM、至少160μM、至少165μM，或至少170μM。於一具體實例中，該培養基含有約174μM±26μM核苷。於一具體實例中，該培養基含有嘌呤衍生物，累積濃度為至少40μM、至少45μM、至少50μM、至少55μM、至少60μM、至少65μM、至少70μM、至少75μM、至少80μM、至少85μM、至少90μM、至少95μM、至少100μM，或至少105μM。於一具體實例中，該培養基含有約106μM±5μM之嘌呤衍生物，嘌呤衍生物包括次黃嘌呤，及該核苷：腺核苷及鳥糞核苷。於一具體實例中，該培養基含有嘧啶衍生物，累積濃度為至少30μM、至少35μM、至少40μM、至少45μM、至少50μM、至少55μM、至少60μM，或至少65μM。於一具體實例中，該培養基含有約68μM±5μM之嘧啶衍生物，嘧啶衍生物包括該核苷：胸腺嘧啶核苷、尿核苷，及胞嘧啶核苷。於一特定具體實例中，該培養基含有腺核苷、鳥糞核苷、胞嘧啶核苷、尿核苷、胸腺嘧啶核苷及次黃嘌呤。

除了包含鳥胺酸或腐胺，於一具體實例中，該培養基亦含有胺基酸，累積濃度為至少40mM，其中總累積量之計算不計入麩醯胺酸的量。於一具體實例中，該培養基不包括麩醯胺酸，但當培養細胞時，諸如：當產生蛋白質時，麩醯胺酸可作為「屆時添加物」補充至該培養基中。因此，於一些具體實例中，諸如：在培養細胞之方法中，或產生所欲蛋白質之方法中，該培養基可補充麩醯胺酸以作為一種屆時添加物。於一個這樣的具體實例中，麩醯胺酸添加量少於約40mM、少於約35mM、少於約30mM、少於約25mM、少於約20mM、少於約15mM、少於約10mM、少於約8mM、少於約7mM、少於約6mM、少於約5mM、少於約4mM、少於約3mM，或少於約2.5mM。於一具體實例中，該追加麩醯胺酸之培養基中麩醯胺酸的量為約2mM±0.5mM。

於一具體實例中，除了包含鳥胺酸，或鳥胺酸與腐胺兩者之組合，該培養基亦含有具非極性側基團之胺基酸，濃度為至少15mM、至少24mM、至少25mM、至少26mM、至少27mM、至少28mM、至少29mM，或至少30mM。於一具體實例中，該培養基含有約30mM的具有非極性側基團之胺基酸。於一具體實例中，該培養基所含有的胺基酸總量(以莫耳數計量)中至少32%、至少33%、至少34%、至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%、至少40%，或至少41%的胺基酸具有非極性側基團。於一具體實例中，該培養基中約42%±1%莫耳的胺基酸為具有非極性側基團的胺基酸，具有非極性側基團之胺基酸包括：丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸，及甲硫胺酸。

於一具體實例中，除了包含鳥胺酸，或鳥胺酸與腐胺兩者之組合，該培養基亦含有具不帶電荷的極性側基團之胺基酸，濃度為約10mM至34mM、約11mM至33mM、約12mM至32mM、約13mM至31mM、約14mM至30mM、約15mM至29mM、約16mM至28mM、約17mM至27mM、約18mM至26mM、約19mM至25mM、約20mM至24mM、約21mM 至23mM，或約22mM。於一具體實例中，該培養基含有約22mM具有不帶電荷的極性側基團之胺基酸。於另一具體實例中，該培養基含有約12mM具有不帶電荷的極性側基團之胺基酸。於一具體實例中，該培養基所含有的胺基酸總量(以莫耳數計量)中約14%至46%、約15%至45%、約16%至44%、約17%至43%、約18%至42%、約19%至41%、約20%至40%、約21%至39%、約22%至38%、約23%至37%、約24%至36%、約25%至35%、約26%至34%、約27%至33%、約28%至32%、約29%至31%，或約30%的胺基酸具有不帶電荷的極性側基團。於一具體實例中，該培養基中約30%±3%莫耳的胺基酸為具有不帶電荷的極性側基團之胺基酸，具有不帶電荷的極性側基團之胺基酸包括：甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸，及麩醯胺酸。

於一具體實例中，除了包含鳥胺酸，或鳥胺酸與腐胺兩者之組合，該培養基亦含有於酸鹼值為6時，具負電荷的胺基酸(亦即酸性胺基酸)，濃度為約4mM至14mM、約5mM至13mM、約6mM至12mM、約7mM至11mM、約8mM至10mM、約9mM，或約4mM。於一具體實例中，該培養基含有約9mM的酸性胺基酸。於一具體實例中，該培養基含有9mM±1mM的酸性胺基酸。於一具體實例中，該培養基所含有的胺基酸總量(以莫耳數計量)中約8%至18%、約9%至17%、約10%至16%、約11%至15%、約12%至14%，或約13%為酸性胺基酸。於一具體實例中，該培養基中約12.6%±1%莫耳的胺基酸為酸性胺基酸，酸性胺基酸包括天門冬胺酸及麩胺酸。

於一具體實例中，除了包含鳥胺酸，或鳥胺酸與腐胺兩者之組合，該培養基亦含有於酸鹼值為6時，具正電荷的胺基酸(亦即鹼性胺基酸)，濃度為至少3.5mM、至少4mM、至少5mM、至少6mM、至少7mM、至少8mM、至少9mM、至少10mM，或至少11mM。於一具體實例中，該培養基含有約11mM的鹼性胺基酸。於一具體實例中，該培養基含有約11.42mM±1mM的鹼性胺基酸。於一具體實例中，該培養基所含有的胺基酸總 量(以莫耳數計量)中至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%，或至少15%為鹼性胺基酸。於一具體實例中，該培養基中約16%莫耳的胺基酸為鹼性胺基酸。於一具體實例中，該培養基中約15.8%±2.4%莫耳的胺基酸為鹼性胺基酸。於一具體實例中，該培養基中約21%±3.2%莫耳的胺基酸為鹼性胺基酸，鹼性胺基酸包括：離胺酸、精胺酸，及組胺酸。

於一具體實例中，除了包含鳥胺酸，或鳥胺酸與腐胺兩者之組合，該培養基亦含有約30mM非極性胺基酸、約22mM不帶電荷的極性胺基酸，約9mM酸性胺基酸，及約11mM鹼性胺基酸。於一些具體實例，該培養基中約42%莫耳的胺基酸為非極性胺基酸，約30%莫耳的胺基酸為不帶電荷的極性胺基酸，約13%莫耳的胺基酸為酸性胺基酸，及約16%莫耳的胺基酸為鹼性胺基酸。

除了包含鳥胺酸，或鳥胺酸與腐胺兩者之組合，於一具體實例中，該培養基含有微莫耳量的脂肪酸(或脂肪酸衍生物)及維生素E。於一具體實例中，該脂肪酸包括一或多個亞麻油酸、次亞麻油酸、硫辛酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、花生油酸、月桂酸、二十二酸、癸酸、十二酸、己酸、二十四酸、肉豆蔻酸，及辛酸。於一具體實例中，該培養基含有維生素E、亞麻油酸，及硫辛酸。

於一具體實例中，該培養基亦含有維生素之混合物，其中包括其他營養素及必須營養素，累積濃度為至少約700μM，或至少約2mM。於一具體實例中，該維生素混合物含有一或多個D-生物素、氯化膽鹼、葉酸、肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醇鹽酸鹽、D-泛酸(血鈣(hemiCa))、核黃素、噻胺鹽酸鹽、維生素B12...等。於一具體實例中，該維生素混合物包括所有的D-生物素、氯化膽鹼、葉酸、肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醇鹽酸鹽、D-泛酸(血鈣)、核黃素、噻胺鹽酸鹽，及維生素B12。

本發明培養基的各種具體實例包括上述具體實例之任何組合，包括化學成分明確、不含水解產物、不含血清之培養基，該培養基含 有所指示量之鳥胺酸或腐胺，加上其中包括(a)胺基酸；(b)任選的核苷；(c)二價陽離子之鹽類；(d)脂肪酸與維生素E；及(e)維生素。於一些具體實例中，所有少量的水解產物可被添加到該OS培養基中。

該申請人設想此發明之實施方式為使用任何一或多種不同的基礎培養基或其組合物，其中該基礎培養基被加入鳥氨酸或鳥氨酸與腐胺兩者之組合物，基礎培養基一般為該領域所知，且其中包括：伊格爾氏最低必需培養基(Eagle’s MEM)(Eagle,Science,1955,112(3168)：501-504)、漢氏F12培養基(Ham’s F12 medium)(Ham,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,1965,53：288-293)、漢氏F-12K培養基、達爾伯克氏培養基(Dulbecco’s medium)、達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle medium)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1952 August；38(8)：747-752)、達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基/漢氏F12培養基1：1培養基、索威爾氏T8培養基(Trowell’s T8 medium)、索威爾氏A2培養基(Holmes and Wolf,Biophys.Biochem.Cytol.,1961,10：389-401)、威貿司培養基(Waymouth medium)(Davidson and Waymouth,Biochem.J.,1945,39(2)：188-199)、威廉斯E培養基(Williams E medium)(William’s et al.,Exp.Cell Res.,1971,69：105 et seq.)、洛斯維帕克紀念研究所1640培養基(RPMI 1640 medium)(Moore et al.,J.Amer.Med.Assoc.,1967,199：519-524)、MCDB 104/110培養基(Bettger et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,1981,78(9)：5588-5592)、凡萃斯HL-1培養基(Ventrex HL-1 medium)、白蛋白-球蛋白 培養基(Orr et al.,Appl.Microbiol.,1973,25(1)：49-54)、洛斯維帕克紀念研究所-1640培養基、洛斯維帕克紀念研究所-1641培養基、伊斯科夫式改良達爾伯克氏培養基(Iscove's Modified Dulbecco's medium)、邁克伊氏5 A培養基(McCoy's 5 A medium)、萊柏維茲氏L-15培養基(Leibovitz's L-15 medium)，及不含血清之培養基，諸如：EX-細胞^TM 300系列培養基 (JRH生科公司，列涅薩，堪薩斯州(Lenexa,Kansas))、魚精蛋白-鋅-胰島素培養基(Weiss et al.,1974,US 4,072,565)、生物素-葉酸鹽培養基(Cartaya,1978,US Re30,985)、運鐵蛋白-脂肪酸培養基(Baker,1982,US 4,560,655)、運鐵蛋白-表皮生長因子培養基(Hasegawa,1982,US 4,615,977；Chessebeuf,1984,US 4,786,599)，及其他培養基排列(參見Inlow,US 6,048,728；Drapeau,US 7,294,484；Mather,US 5,122,469；Furukawa,US 5,976,833；Chen,US 6,180,401；Chen,US 5,856,179；Etcheverry,US 5,705,364；Etcheverry,US 7,666,416；Ryll,US 6,528,286；Singh,US 6,924,124；Luan,US 7,429,491...等)。

於一特定具體實例中，該培養基化學成分明確，除了鳥胺酸，或鳥胺酸與腐胺兩者之組合，並包含：二水氯化鈣；羥乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，HEPES)緩衝劑、氯化鉀；硫酸鎂；氯化鈉；磷酸氫二鈉或其他磷酸鹽類；丙酮酸鹽；L-丙胺酸；L-精胺酸鹽酸鹽；L-一水天門冬醯胺酸；L-天門冬胺酸；L-一水半胱胺酸鹽酸鹽；L-麩胺酸；甘胺酸；L-一水組胺酸鹽酸鹽；L-異白胺酸；L-白胺酸；L-離胺酸鹽酸鹽；L-甲硫胺酸；L-鳥胺酸鹽酸鹽；L-苯丙胺酸；L-脯胺酸；L-絲胺酸；L-蘇胺酸；L-色胺酸；L-二水酪胺酸二鈉；L-纈胺酸；D-生物素；氯化膽鹼；葉酸；肌醇；菸鹼醯胺；吡哆醇鹽酸鹽；D-泛酸；核黃素；噻胺鹽酸鹽；維生素B12；對胺苯甲酸；乙醇胺鹽酸鹽；低泡嵌段聚醚F68(Pluronic F68)；DL-a-磷酸生育酚；亞麻油酸；亞硒酸鈉；硫辛酸；及葡萄糖；及可自由選擇的腺核苷；鳥糞核苷；胞嘧啶核苷；尿核苷；胸腺嘧啶核苷；及次黃嘌呤二鈉。

於一具體實例中，本發明培養基之初始容積滲透濃度為200-500、250-400、275-350，或約300毫滲(mOsm)，在細胞於本發明培養基生長期間，依據補料程序，接著各自加入任何補料物，該培養物的容積滲透濃度可增加高達約350、400、450，或高達500毫滲。

於一些具體實例中，其中該明訂培養基的容積滲透濃度少 於約300，加入一或多種超過指定量的鹽類，該容積滲透濃度達到約300。於一具體實例中，經由添加一或多種滲透物，容積滲透濃度可增加至預期值，該滲透物係選自：氯化鈉、氯化鉀、一種鎂鹽、一種鈣鹽、一種胺基酸鹽、一種脂肪酸的一種鹽類、碳酸氫鈉、碳酸鈉、碳酸鉀、一種為鹽類的螯合劑、一種醣類(例：半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖...等)，及其組合。於一具體實例中，該滲透物被過量添加，且超過已存在於該明訂培養基中其成份之濃度(例：一種醣類被過量添加，且超過醣類成份指定的濃度)。

上述各個及每一個具體實例的培養基，以及含有至少約90μM鳥胺酸(或含有至少約100μM鳥胺酸加上至少約200μM腐胺的組合)的任合其他不含血清之培養基此後稱為鳥胺酸增補(「OS」)培養基；相反地，不含鳥胺酸之培養基(或沒有鳥胺酸/腐胺組合物)，或含有少於100μM鳥胺酸的培養基(或含有少於100μM鳥胺酸及少於200μM腐胺的培養基)此後稱為非鳥胺酸增補(「非OS」)培養基。

細胞培養

本發明提供一種細胞培養物，含有在上述OS培養基中表現所欲蛋白質的一種細胞株。於一具體實例中，該細胞培養物含有胰島素，其可作為一種屆時材料添加至該培養基中，或囊括於該培養基配方中。於一具體實例中，該細胞株包含可產生一種生物治療性蛋白質的細胞，常規用於生產生物治療性蛋白質之細胞株的例子其中包括：初級細胞、非洲綠猴腎細胞(BSC cells)、海拉細胞(HeLa cells)、人類肝癌細胞(HepG2 cells)、猴腎細胞(LLC-MK cells)、非洲綠猴腎細胞(CV-1 cells)、非洲綠猴腎臟纖維細胞(COS cells)、非洲綠猴腎異倍體細胞(VERO cells)、牛腎上皮細胞(MDBK cells)、犬腎上皮細胞(MDCK cells)、貓腎細胞(CRFK cells)、兔纖維細胞(RAF cells)、兔腎細胞(RK cells)、小鼠腎細胞(TCMK-1 cells)、豬腎小管上皮細胞(LLCPK cells)、豬腎臟細胞(PK15 cells)、兔腎臟細胞(LLC-RK cells)、綿羊腎上皮細胞(MDOK cells)、幼倉鼠腎 細胞(BHK cells)、幼倉鼠腎細胞21細胞株、中國倉鼠卵巢細胞(CHO cells)、中國倉鼠卵巢細胞K1細胞株(CHO-K1)、鼠骨髓瘤細胞(NS-1 cells)、人類肺細胞(MRC-5 cells)、人類纖維細胞(WI-38 cells)、幼倉鼠腎細胞、3T3細胞、293細胞、兔腎細胞(RK cells)、人類視網膜細胞(Per.C6 cells)，及雞胚細胞。於一具體實例中，該細胞株為一種中國倉鼠卵巢細胞株，或一或多種的數個特定中國倉鼠卵巢細胞變異株，其適宜用來大規模生產蛋白質，例：中國倉鼠卵巢細胞K1細胞株。

「細胞培養」或「培養」意為細胞在多細胞生物體或組織外生長與增殖，哺乳動物細胞之適宜培養條件為本領域已知，參見，例：Animal cell culture：A Practical Approach,D.Rickwood,ed.,Oxford University Press,New York(1992)。哺乳動物細胞可培養於懸浮液，或附著於固態基底，準流體床生物反應器、中空纖維管柱生物反應器、滾瓶、搖瓶，或攪拌式生物反應器，具有或不具有微載體，及分批、分批補料、連續、半連續，或灌注操作模式可用於哺乳動物細胞培養。在培養期間，可持續或間隔性的將細胞培養基或濃縮的補料培養基添加至該培養物中，例如：培養物可每日一次、隔日一次、三日一次進行補料，或當被監測的特定培養基成份之濃度低於預期範圍則進行補料。

動物細胞，如：中國倉鼠卵巢細胞，可以小規模培養，諸如：在含有約25毫升培養基的125毫升容器、在含有約50至100毫升培養基的250毫升容器、在含有約100至200毫升培養基的500毫升容器；或者是，該培養物可以大規模，譬如：在含有約300至1000毫升培養基的1000毫升容器，在含有約500至3000毫升培養基的3000毫升容器，在含有約2000至8000毫升培養基的8000毫升容器，及在含有約4000至15000毫升培養基的15000毫升容器，工業培養物可含有10,000升或更多的培養基。大規模細胞培養物，諸如：為了臨床製造蛋白質治療劑，通常持續數日，或甚至數週期間使細胞產生所欲蛋白質，在此期間，該培養物可增補濃縮的補料培養基，其含有在培養期間被消耗的成份譬如：養分及胺基酸，濃縮的補料培養基 可根據任何細胞培養基之配方，該濃縮補料培養基可含有細胞培養基的大部分成份，濃度為其正常使用量的例如：約5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、400倍、600倍、800倍，或甚至約1000倍，濃縮的補料培養基常用於補料批次培養過程。

於一些具體實例中，於細胞生長或蛋白質生產期間，該細胞培養基增補以「屆時添加物」，亦稱為添加物、屆時成份，或屆時化學物，屆時添加物包括任何一或多種的生長因子或其他蛋白質、緩衝劑、能量來源、鹽類、胺基酸、金屬，及螯合劑。其他蛋白質包括運鐵蛋白及白蛋白，生長因子，其包括細胞介素及趨化介素，通常為本領域所知，並已知可刺激細胞生長，或在一些情況下可使細胞分化。生長因子通常為蛋白質(例：胰島素)、小胜肽，或類固醇激素，諸如：動情素、去氫表雄固酮、睪固酮...等。於某些例證中，生長因子可為非天然化學物，其促進細胞增殖或蛋白質生成，譬如：四氫葉酸(THF)、胺甲喋呤...等。蛋白質及胜肽生長因子的非限定實例包括：促血管生成素、骨成形性蛋白質(BMPs)、腦源性神經營養因子(BDNF)、表皮生長因子(EGF)、紅血球生成素(EPO)、纖維母細胞生長因子(FGF)、神經膠細胞株源性神經營養因子(GDNF)、顆粒球群叢刺激因子(G-CSF)、顆粒球巨噬細胞群叢刺激因子(GM-CSF)、生長分化因子-9(GDF9)、肝細胞生長因子(HGF)、肝腫瘤源性生長因子(HDGF)、胰島素、類胰島素生長因子(IGF)、促移行因子、肌骨素(GDF-8)、神經生長因子(NGF)，及其他神經滋養素、血小板衍生生長因子(PDGF)、促血小板生成素(TPO)、轉變生長因子α(TGF-α)、轉變生長因子β(TGF-β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管內皮生長因子(VEGF),wnt信號通路促效劑、胎盤生長因子(PlGF)、胎牛生長激素(FBS)、介白素-1(IL-1)、介白素-2、介白素-3、介白素-4、介白素-5、介白素-6、介白素-7...等。於一具體實例中，該細胞培養基增補之屆時添加物為生長因子胰島素。於一具體實例中，該培養基中胰島素的濃度，例：添加後該細胞培養基中胰島素的量為約0.1μM至10μM。一些具 體實例之培養基配方亦可包括一或多種屆時添加物。

緩衝劑通常為本領域所知，本發明並不局限於任何特定的緩衝劑或多種緩衝劑，且任何一位本領域的普通技術人員可選擇適宜的緩衝劑或緩衝劑系統，使用於一種特定細胞株中，以產生一種特定蛋白質。於一具體實例中，屆時添加物之緩衝劑係碳酸氫鈉。於一具體實例中，該屆時添加物之緩衝劑含有碳酸氫鈉。於另一具體實例中，該緩衝劑係羥乙基哌嗪乙磺酸。

細胞培養物中作為一種屆時添加物的能量來源亦為本領域所熟知，不進行限制，於一具體實例中，該屆時添加物之能量來源係葡萄糖。於一具體實例中，給予一種特定細胞株特定與專門的需要量，可加入濃度約1至20mM葡萄糖於培養基中。於一些例證中，葡萄糖加入量可達10克/升。

螯合劑同樣為細胞培養與蛋白質生成領域所熟知，雖然本發明操作可使用其他螯合劑，乙二胺四乙酸四鈉水合物及檸檬酸鹽是本領域兩種常用螯合劑。於一具體實例中，屆時添加物之螯合劑係二水合乙二胺四乙酸四鈉。於一具體實例中，屆時添加物之螯合劑係檸檬酸鹽，諸如：檸檬酸鈉。

於一具體實例中，該細胞培養物可增補一或多種屆時添加物之胺基酸，譬如：麩醯胺酸。於一具體實例中，該細胞培養基增補的屆時添加物麩醯胺酸最後濃度為約1mM至13mM。

其他屆時添加物包括一或多種各式各樣的金屬鹽類諸如：鐵、鎳、鋅及銅之鹽類。於一具體實例中，該細胞培養基可增補一或多種的硫酸銅、硫酸鋅、氯化鐵，及硫酸鎳。

於一具體實例中，該細胞培養基可增補任何一或多種，或所有的下列屆時添加物：約29.8mM碳酸氫鈉、約2mM麩醯胺酸、約0.86μM胰島素、約11.1mM葡萄糖、約6.54μM硫酸鋅、約0.168μM硫酸銅、約75μM氯化鐵、約0.639μM硫酸鎳、約85μM乙二胺四乙酸，及約50μM檸檬酸。

於一具體實例中，依照補料批次過程，於細胞培養期間間隔性增補該培養基，補料批次培養一般為本領域所知，並用來使蛋白質生產最佳化(參見Y.M.Huang et al.,Biotechnol Prog.2010 Sep-Oct；26(5)：1400-10)。

相對於生長在無鳥胺酸或腐胺之培養基的細胞，細胞活力、活性細胞密度及細胞增倍已被提高。關於細胞活力，生長在OS培養基之細胞活力超過生長在非OS培養基的相似或相同細胞之活力至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、至少100%，或至少3倍。

於一些具體實例中，在OS培養基之活性哺乳動物細胞的增倍速率超過生長在非OS培養基的哺乳動物細胞之增倍速率至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%，或至少3倍。於一些具體實例中，在OS培養基之活性哺乳動物細胞的增倍速率超過在非OS培養基的哺乳動物細胞之增倍速率約10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%，或30%。

於一些具體實例中，在OS培養基的活躍循環哺乳動物細胞之倍增時間少於30小時、少於29小時、少於28小時、少於27小時、少於26小時、少於25小時、少於24小時、少於23小時、少於22小時、少於21小時、少於20小時、少於19小時，或少於18小時。於一些具體實例中，在OS培養基的活躍生長哺乳動物細胞之倍增時間少於28小時。於一些具體實例中，在OS培養基的哺乳動物細胞之倍增時間為約27±1小時、約26±1小時、約 25±1小時、約24±1小時、約23±1小時、約22±1小時，或約21±1小時。於一些具體實例中，在OS培養基的活躍循環哺乳動物細胞之倍增時間為約24±1小時。於一些具體實例中，培養在OS培養基的活躍分裂細胞之倍增時間短於培養在非OS培養基的活躍循環細胞之倍增時間的至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%，或至少25%。

蛋白質生產

除了化學成分明確的OS培養基及於OS培養基中培育細胞的方法，本發明提供生產一種蛋白質的方法，諸如：在培養於OS培養基的細胞中產生一種有療效抗體或其他生物藥劑材料。

於一些具體實例中，在OS培養基中培養的哺乳動物細胞之蛋白質產率超過在非OS培養基中培養的相同哺乳動物細胞之蛋白質產率至少5%、10%、15%，或20%。於一些具體實例中，在OS培養基中培養的細胞之蛋白質產率為至少1皮克/細胞/天(「PCD」)、至少2 PCD、至少3 PCD、至少4 PCD、至少5 PCD、至少6 PCD、至少7 PCD、至少8 PCD、至少9 PCD、至少10 PCD、至少15 PCD、至少20 PCD、至少25 PCD、至少30 PCD、至少35 PCD、至少40 PCD、至少45 PCD、至少50 PCD、至少75 PCD，或至少100 PCD。

於一些具體實例中，在OS培養基中培養的細胞之蛋白質產率或效價(可表示為每升培養基中蛋白質產物的克數)為至少100毫克/升、至少1克/升、至少1.2克/升、至少1.4克/升、至少1.6克/升、至少1.8克/升、至少2克/升、至少2.5克/升、至少3克/升、至少3.5克/升、至少4克/升、至少4.5克/升、至少5克/升、至少5.5克/升、至少6克/升、至少6.5克/升、至少7克/升、至少7.5克/升、至少8克/升、至少8.5克/升、至少9克/升、至少9.5克/升、至少10克/升，或至少20克/升。

於一些具體實例中，該蛋白質產物(所欲蛋白質)為抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多效價抗體、雙特異性抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙體抗體、三體抗體或四體抗體、抗 原結合區段片段或抗原結合區段雙體片段、免疫球蛋白D抗體、免疫球蛋白E抗體、免疫球蛋白M抗體、免疫球蛋白G抗體、免疫球蛋白G1抗體、免疫球蛋白G2抗體、免疫球蛋白G3抗體，或免疫球蛋白G4抗體。於一具體實例中，該抗體係一種免疫球蛋白G1抗體。於一具體實例中，該抗體係一種免疫球蛋白G2抗體。於一具體實例中，該抗體係一種免疫球蛋白G4抗體。

於一些具體實例中，該所欲蛋白質係一種重組蛋白質，其含有一個Fc部分及其他域(例：一種Fc融合蛋白質)。於一些具體實例中，Fc融合蛋白是一種受體Fc融合蛋白，其含有耦合Fc部分的一或多種受體之細胞外域。於一些具體實例中，該Fc部分包含一個鉸鏈區，其接續免疫球蛋白G之重鏈恒定域2及重鏈恒定域3。於一些具體實例中，該Fc融合蛋白含有兩種或多種不同的受體鏈，其可結合至單一配體或多個配體，例如：一種Fc融合蛋白是一種阱分子，諸如：一種介白素-1阱分子(例：介白素-1受體拮抗劑(rilonacept)，其含有介白素-1RAcP配體結合區，該區融合至合併人類免疫球蛋白G1(hIgG1)Fc的介白素-1R1細胞外區域；參見美國專利第6,927,004號)，或一種血管內皮生長因子阱分子(例：阿柏西普(aflibercept)，其含有血管內皮生長因子受體Flt1之人類免疫球蛋白域2，該域融合至合併人類免疫球蛋白G1(hIgG1)的血管內皮生長因子受體Flk1的人類免疫球蛋白域3；參見美國專利第7,087,411號及第7,279,159號)。

本發明不限定任何特定類型之細胞來生產蛋白質，適宜生產蛋白質之細胞類型的例子包括：哺乳動物細胞、昆蟲細胞、鳥類細胞、細菌細胞，及真菌細胞，該細胞可為幹細胞，或經重組基因表現載體轉形的重組細胞，或經產生病毒產物之病毒轉染的細胞。該細胞可能含有一種重組異源性多核苷酸之構築體，該構築體編碼所欲蛋白質，此構築體可為游離基因體，或它可為嵌入該細胞基因體的組成物。該細胞亦可能不需編碼蛋白質的異源性多肽構築體，而產生所欲蛋白質，換言之，該細胞天生即可編碼所欲蛋白質，諸如：B-細胞產生抗體。該細胞亦可為初級細胞，諸如：雞胚細胞，或初級細胞株。可用的細胞之例子包括：非洲綠猴腎細 胞(BSC cells)、猴腎細胞(LLC-MK cells)、非洲綠猴腎細胞(CV-1 cells)、非洲綠猴腎臟纖維細胞(COS cells)、非洲綠猴腎異倍體細胞(VERO cells)、牛腎上皮細胞(MDBK cells)、犬腎上皮細胞(MDCK cells)、貓腎細胞(CRFK cells)、兔纖維細胞(RAF cells)、兔腎細胞(RK cells)、小鼠腎細胞(TCMK-1 cells)、豬腎小管上皮細胞(LLCPK cells)、豬腎臟細胞(PK15 cells)、兔腎臟細胞(LLC-RK cells)、綿羊腎上皮細胞(MDOK cells)、幼倉鼠細胞21細胞株、雞胚細胞、鼠骨髓瘤細胞(NS-1 cells)、人類肺細胞(MRC-5 cells)、人類纖維細胞(WI-38 cells)、幼倉鼠細胞(BHK cells)、293細胞、兔腎細胞(RK cells)、人類視網膜細胞(Per.C6 cells)，及中國倉鼠卵巢細胞(CHO cells)。於多種具體實例中，該細胞株為中國倉鼠卵巢細胞衍生株，諸如：中國倉鼠卵巢細胞K1細胞株、中國倉鼠卵巢細胞DUX B-11細胞株、中國倉鼠卵巢細胞DG-44細胞株、Veggie型中國倉鼠卵巢細胞、GS型中國倉鼠卵巢細胞、S型中國倉鼠卵巢細胞，或中國倉鼠卵巢細胞lec基因突變株。

於一具體實例中，該細胞，其為中國倉鼠卵巢細胞，異位性表現蛋白質。於一具體實例中，該蛋白質包含免疫球蛋白之重鏈區域，諸如：一個重鏈恒定域1、重鏈恒定域2，或重鏈恒定域3區域。於一具體實例中，該蛋白質包含一個人類或囓齒類免疫球蛋白之重鏈恒定域2及重鏈恒定域3區域。於一具體實例中，該蛋白質包含一個人類或囓齒類免疫球蛋白之重鏈恒定域1、重鏈恒定域2，及重鏈恒定域3區域。於一具體實例中，該蛋白質包含一個鉸鏈區與一個重鏈恒定域1、重鏈恒定域2，及重鏈恒定域3區域。於一特定具體實例中，該蛋白質包含一個免疫球蛋白之重鏈變異域。於一特定具體實例中，該蛋白質包含一個免疫球蛋白之輕鏈變異域。於一特定具體實例中，該蛋白質包含一個免疫球蛋白之重鏈變異域與一個免疫球蛋白之輕鏈變異域。於一特定具體實例中，該蛋白質係一種抗體，諸如：人類抗體、噻齒類抗體，或嵌合人類/囓齒類抗體(例：人類/小鼠、人類/大鼠，或人類/倉鼠)。

生產階段可處理任何規模之培養物，範圍從單一燒瓶與搖瓶或搖袋至一公升的生物反應器，及至大規模工業生物反應器，大規模步驟可處理體積為約100公升至20,000公升或更多，可用一或多種若干方法來控制蛋白質生產，諸如：溫度轉換或化學誘導，成長期的發生溫度高於生產期，例如：成長期可發生於第一個溫度約攝氏35度至38度，而生產期可發生於第二個溫度約攝氏29度至37度，最好是約攝氏30度至36度，或約攝氏30度至34度。此外，可於溫度轉換的同時間、之前或之後加入蛋白質生產之化學誘導物，諸如：咖啡因、丁酸鹽、泰莫西芬(tamoxifen)、動情素、四環黴素、去氧羥四環素，及六亞甲二乙醯胺(HMBA)，若溫度轉換之後加入誘導物，其可於溫度轉換1小時至5天後加入，諸如：溫度轉換後1至2天。細胞培養物之生產運作可為持續性補料培養系統，如：化學恒定器(參見C.Altamirano et al.,Biotechnol Prog.2001 Nov-Dec；17(6)：1032-41)，或依照補料批次程序(Huang,2010)。

本發明透過細胞培養過程，有效地提升蛋白質生成，本發明所用之細胞株可經基因工程而表現一種商業或科學所欲之多肽，該細胞株的基因工程涉及以一種重組多核苷酸分子轉染、轉形或轉導細胞，或以其他方式變更細胞(例：經由同源重組及基因活化，或融合重組細胞與非重組細胞)，因而使宿主細胞表現所欲重組多肽。使細胞或細胞株表現所欲多肽的遺傳工程方法及載體為本領域技術人員所熟知，例如：多種技術列舉於Current Protocols in Molecular Biology.Ausubel et al.,eds.(Wiley & Sons,New York,1988,and quarterly updates)；Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Laboratory Press,1989)；Kaufman,R.J.,Large Scale Mammalian Cell Culture,1990,pp.15-69。可由美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)(馬納薩斯，弗吉尼亞州(Manassas,Va.))獲得或商業購得多種適於生長在培養基中的細胞株，工業上常用細胞株的例子包括：非洲綠猴腎異倍體細胞株(VERO)、幼倉鼠腎細胞株(BHK)、海拉細胞株(HeLa)、綠猴腎細胞株(CV1) (包括非洲綠猴腎臟纖維細胞株(Cos))、犬腎上皮細胞株(MDCK)、293細胞株、3T3細胞株、骨髓瘤細胞株(例：鼠骨髓瘤細胞株(NSO)、小鼠骨髓瘤細胞株(NS1))、PC12細胞株、WI38細胞株，及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。中國倉鼠卵巢細胞被廣泛用於產生合成的重組蛋白質，諸如：細胞介素、凝結因子，及抗體(Brasel et al.(1996),Blood 88：2004-2012；Kaufman et al.(1988),J.Biol Chem 263：6352-6362；McKinnon et al.(1991),J MoI Endocrinol 6：231-239；Wood et al.(1990),J Immunol.145：3011-3016)。二氫葉酸還原酶(DHFR)缺失突變細胞株(Urlaub et al.(1980),Proc Natl Acad Sci USA 77：4216-4220)、中國倉鼠卵巢細胞DXB11細胞株及中國倉鼠卵巢細胞DG-44細胞株是理想的中國倉鼠卵巢宿主細胞株，因為有效地二氫葉酸還原酶可篩選與可擴增的基因表現系統使得這些細胞高量表現重組蛋白質(Kaufman RJ.(1990),Meth Enzymol 185：537-566)。此外，這些細胞為附著性或懸浮性培養物，易於操作，並表現出相對良好的基因穩定性，中國倉鼠卵巢細胞及其所表現的重組蛋白質已被充分定性分析，並已被監管機構批准用於臨床及商業生產。於一些具體實例中，該中國倉鼠卵巢細胞株係美國專利申請公開案第2010/0304436 A1號、第2009/0162901 A1號及第2009/0137416 A1號，與美國專利第7,455,988 B2號、第7,435,553 B2號及第7,105,348 B2號所述之細胞株。

本發明不限於內文所述特定具體實例之範疇，該具體實例作為個別方面的例證或本發明之具體實例，功能相當的方法及成份都在本發明範疇之內。除了本文所述的那些修改變型，本領域技術人員由先前敘述及附圖而明白本發明之各種變型，此修改變型屬於本發明範疇。

本發明部份基於發現添加鳥胺酸，或鳥胺酸與腐胺之組合物至不含血清之細胞培養基中，導致細胞生長、活性增加，及表現所欲蛋白質之基因重組動物細胞(或天然細胞)生成的多肽增加，從而提升培養實力，增加所欲多肽之產量。

例1：提高活細胞培養密度

將產生重組抗體之細胞的種源培養物種入一個250毫升搖瓶內，其中該細胞源自中國倉鼠卵巢細胞K1細胞株，該種入的細胞生長於攝氏36.5度達7天，並於第3及5天添補葡萄糖，細胞生長於各自分開的兩種化學成分明確的培養基(不含水解產物及不含血清)中，第一種培養基含有約75mM胺基酸(培養基1)，第二種培養基含有約40mM胺基酸(培養基2)，且兩者配方中含有不超過2.5μM(0.4毫克/升)腐胺，經由加入濃度為7.5克/升大豆水解產物至培養基2中，產生另一組培養基。將約593μM鳥胺酸(為100毫克/升L-鳥胺酸鹽酸鹽)，或593μM鳥胺酸(為100毫克/升L-鳥胺酸鹽酸鹽)與約714μM腐胺(為115毫克/升腐胺二鹽酸鹽)之組合物各別加至該三種對照培養基中，於第3、5，及7天，取出3毫升培養物，使用台盼藍不相容法在多功能過程參數分析儀(BioProfile FLEX^TM instrument)(諾瓦生物醫學公司(Nova Biomedical))中計算活細胞，在第0天，所有培養物每毫升含有0.8x10⁶個活細胞，對於特定培養基(培養基1、培養基2，或培養基2+大豆)，7天期間的活細胞計數值顯示：生長在增補鳥胺酸或鳥胺酸加腐胺之培養基的中國倉鼠卵巢細胞增加了活細胞密度。在7天期間，該效果在不含水解產物之培養基中特別明顯(例：活細胞密度增加2倍或4倍或更多)。不含水解產物之OS培養基2的效果與含大豆之非OS培養基2相當，顯示大豆水解產物對細胞生長的益處可被鳥氨酸替代，亦發現加入鳥胺酸，或鳥胺酸與腐胺至培養基2+大豆可增加細胞密度，結果列於表1。

表1：平均活細胞培養密度(每毫升10⁶細胞)及超過基線*之增加倍數

我們也研究在培養基3中不同量(例：50毫克/毫升、100毫克/毫升，及150毫克/毫升)鳥胺酸鹽酸鹽對活細胞密度的功效，培養基3含有約75mM胺基酸及0.4毫克/升腐胺鹽酸鹽(「培養基3」)。將源自中國倉鼠卵巢細胞K1細胞株，會產生重組抗體之細胞的一個單一種源培養物以0.4 X 10⁶細胞/毫升的密度，以15毫升的操作體積種入50毫升的高通量生物反應器(TubeSpin® Bioreactors(TPP))中，該細胞於攝氏37度之培養器中培育3天，於第3天，取出3毫升培養物，使用台盼藍不相容法在多功能過程參數分析儀(諾瓦生物醫學公司)中計算活細胞，三種量的鳥胺酸均可平均提高細胞密度略超過2倍(N=3)，結果示於表2。

表2：活細胞培養密度(每毫升10⁶細胞)與超過基線*之增加倍數

例2：增進細胞培養倍增時間

探討在不同細胞培養基條件下，處於對數生長期的源自中國倉鼠卵巢細胞K1細胞株，會產生重組抗體之細胞的倍增時間。在14天期間，於攝氏36.5度，250毫升搖瓶中，將種源培養物個別在三種分開的培養 基：培養基1、培養基2，及含有大豆水解產物之培養基2(培養基2+大豆)中進行繼代，在第0天，由每一培養條件基中取出1毫升培養物，並於此時進行繼代(每2或3天)，使用台盼藍不相容法在細胞計數儀(CDV^TM instrument)(諾瓦生物醫學公司)中計算活細胞。將未增補，或增補100毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽，或增補115毫克/升腐胺二鹽酸鹽與100毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽的培養基1進行測試，將未增補，或增補100毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽，或增補115毫克/升腐胺二鹽酸鹽與100毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽之具有少量腐胺二鹽酸鹽(0.4毫克/升)的培養基2進行測試，結果示於表3及4。具有或不具有腐胺的培養基1需要增補鳥胺酸，以達到顯著的細胞生長，不含水解產物之培養基2增補鳥胺酸或鳥胺酸+腐胺，可降低細胞倍增時間約25%至30%，當含有水解產物的培養基2加入鳥胺酸或鳥胺酸+腐胺，亦可降低倍增時間到更少的程度。

表3：細胞倍增時間(小時)與相對於在培養基1的基線*之增倍時間降低近似百分比

表4：細胞倍增時間(小時)與相對於在培養基2的基線*之增倍時間降低近似百分比

例3：提升抗體效價

已確認培養基中含有鳥胺酸或鳥胺酸+腐胺可提高細胞增殖及活細胞密度，我們進一步探討這些培養基對所產生重組蛋白質之效價的影響，我們檢驗中國倉鼠卵巢細胞K1細胞株的衍生細胞株之重組免疫球蛋白G的表現及分泌。於此實驗中，在第7天測定於不同培養基成份之培養物的平均抗體效價，如上述，將具有少量腐胺(0.4克/升腐胺二鹽酸鹽)、鳥胺酸(100毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽)，及鳥胺酸與腐胺兩者(100毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽/115毫克/升腐胺二鹽酸鹽)之培養基1進行測試，將具有少量腐胺(0.4克/升腐胺二鹽酸鹽)、鳥胺酸(100毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽)，及鳥胺酸與腐胺兩者(100毫克/升鳥胺酸鹽酸鹽/115毫克/升腐胺二鹽酸鹽)之培養基2及培養基2+大豆進行測試。在所有的狀況下，含有超過0.4毫克/升的鳥胺酸，或鳥胺酸與腐胺導致明顯增大的蛋白質效價，例：至少約2倍高的效價，結果示於表5。

表5：第7日之平均抗體效價與相對於基線*之效價增加近似倍數(X)

我們也研究在培養基3中不同量(例：50毫克/毫升、100毫克/毫升，及150毫克/毫升)鳥胺酸鹽酸鹽對抗體生成的功效，將源自中國倉鼠卵巢細胞K1細胞株，會產生重組抗體之細胞的一個單一種源培養物以0.4 X 10⁶細胞/毫升的密度，以15毫升的操作體積種入50毫升的高通量生物反應器(TPP)中，該細胞於攝氏37度之培養器中培育3天，三種量的鳥胺酸增補物均可平均提高抗體效價略超過50%(N=3)，結果示於表6。

表6：抗體效價(克/升)與超過基線*之效價增加倍數

Claims (42)

1. 一種生產阿柏西普(aflibercept)的方法，包含：

   (a)在細胞培養基培養中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞，其中該細胞培養基係不含血清；

   (b)在生長期間，將該CHO細胞在35℃至38℃的溫度下培養在該細胞培養基中；及

   (c)當生長期間的細胞密度達到介於每毫升1.6x10⁶及12.6x10⁶活細胞之間，在生產期間將該CHO細胞在29℃至37℃的較低之溫度下培養在該細胞培養基中。
2. 如請求項1之方法，其中步驟(c)包含在生產期間將該CHO細胞在30℃至34℃的較低之溫度下培養在該細胞培養基中。
3. 如請求項1之方法，其中當生長期間的細胞密度達到介於每毫升1.6x10⁶及12.6x10⁶活細胞之間，步驟(c)之在生產期間的較低之溫度開始於第3天及第7天之間。
4. 如請求項2之方法，其中當生長期間的細胞密度達到介於每毫升2.0x10⁶及3.6x10⁶活細胞之間，步驟(c)之在生產期間的較低之溫度開始於第5天及第7天之間。
5. 如請求項1之方法，其中該細胞培養基包含

   

   0.09mM±0.014mM鳥胺酸，且其中當生長期間的細胞密度達到介於每毫升1.6x10⁶及12.6x10⁶活細胞之間，步驟(c)之在生產期間的較低之溫度開始於第3天及第7天之間。
6. 如請求項2之方法，其中該細胞培養基包含

   

   0.09mM±0.014mM鳥胺酸，且其中當生長期間的細胞密度達到介於每毫升5.1x10⁶及12.6x10⁶活細胞 之間，步驟(c)之在生產期間的較低之溫度開始於第3天及第7天之間。
7. 如請求項1之方法，其中該細胞培養基包含

   

   0.09mM±0.014mM鳥胺酸，且其中當生長期間的細胞密度達到介於每毫升5.9x10⁶及12.6x10⁶活細胞之間，步驟(c)之在生產期間的較低之溫度開始於第5天及第7天之間。
8. 如請求項1之方法，其中該細胞培養基包含介於0.09±0.014mM至0.9±0.14mM之間的鳥胺酸，且其中當生長期間的細胞密度達到介於每毫升5.1x10⁶及12.6x10⁶活細胞之間，步驟(c)之在生產期間的較低之溫度開始於第3天及第7天之間。
9. 如請求項1之方法，其中該細胞培養基包含介於0.09±0.014mM至0.9±0.14mM之間的鳥胺酸，且其中當生長期間的細胞密度達到介於每毫升5.9x10⁶及12.6x10⁶活細胞之間，步驟(c)之在生產期間的較低之溫度開始於第5天及第7天之間。
10. 如請求項1之方法，其中該細胞培養基包含0.6±0.09mM鳥胺酸及0.714±0.11mM腐胺，且其中當生長期間的細胞密度達到介於每毫升5.0x10⁶及12.4x10⁶活細胞之間，步驟(c)之在生產期間的較低之溫度開始於第3天及第7天之間。
11. 如請求項2之方法，其中該細胞培養基包含0.6mM±0.09mM鳥胺酸及0.714±0.11mM腐胺，且其中當生長期間的細胞密度達到介於每毫升5.8x10⁶及12.4x10⁶活細胞之間，步驟(c)之在生產期間的較低之溫度開始於第5天及第7天之間。
12. 如請求項1之方法，其中該細胞培養基包含0.6mM±0.09mM鳥胺酸及0.714±0.11mM腐胺，且其中當生長期間的細胞密度達到介於每毫升 5.8x10⁶及12.4x10⁶活細胞之間，步驟(c)之在生產期間的較低之溫度開始於第5天及第7天之間。
13. 如請求項2之方法，其中該細胞培養基包含0.6mM±0.09mM鳥胺酸及0.714±0.11mM腐胺，且其中當生長期間的細胞密度達到介於每毫升5.0x10⁶及12.4x10⁶活細胞之間，步驟(c)之在生產期間的較低之溫度開始於第3天及第7天之間。
14. 如請求項1之方法，其中阿柏西普係於至少為100mg/L的滴度來生產。
15. 如請求項1之方法，其中阿柏西普係於至少為1g/L的滴度來生產。
16. 如請求項1之方法，其中該CHO細胞係選自以下群組：CHO K1細胞、CHO DUX B-11細胞、Veggie-CHO細胞、GS-CHO細胞、D-CHO細胞，以及CHO lec突變細胞(CHO lec mutant cell)。
17. 如請求項1之方法，其中細胞培養基包含小於或等於7.5g/L大豆水解產物。
18. 如請求項1之方法，其中細胞培養基包含：

    (a)

    

    40±6mM的胺基酸混合物或其鹽；

    (b)一或多種脂肪酸；

    (c)核苷混合物；或

    (d)一或多種二價陽離子。
19. 一種生產阿柏西普(aflibercept)的方法，包含：

    (a)在35℃至38℃的溫度範圍下培養能夠生產阿柏西普的細胞；並且之後

    (b)當細胞密度達到介於每毫升1.6x10⁶及12.6x10⁶活細胞之間，在29℃至34℃的較低之溫度下培養該細胞，其中該細胞係培養在無血清細胞培養基中。
20. 如請求項19之方法，其中當該生長期間的細胞密度達到介於每毫升1.6x10⁶及12.6x10⁶活細胞之間，步驟(b)之溫度係於第3天及第7天之間降低。
21. 如請求項19之方法，其中該細胞培養基包含

    

    0.09mM±0.014mM鳥胺酸，且其中當細胞密度達到介於每毫升5.1x10⁶及12.6x10⁶活細胞之間，步驟(b)之溫度於第3天及第7天之間降低。
22. 如請求項19之方法，其中該細胞培養基包含

    

    0.09mM±0.014mM鳥胺酸，且其中當細胞密度達到介於每毫升5.9x10⁶及12.6x10⁶活細胞之間，步驟(b)之溫度於第5天及第7天之間降低。
23. 如請求項21之方法，其中該細胞培養基包含

    

    0.09mM±0.014mM鳥胺酸，且其中當細胞密度達到介於每毫升5.1x10⁶及12.6x10⁶活細胞之間，步驟(b)之溫度於第3天及第7天之間降低。
24. 如請求項19之方法，其中所述能夠生產阿柏西普的細胞係選自以下群組：CHO K1細胞、CHO DUX B-11細胞、Veggie-CHO細胞、GS-CHO細胞、D-CHO細胞，以及CHO lec突變細胞(CHO lec mutant cell)。
25. 一種生產阿柏西普(aflibercept)的方法，包含：

    (a)在35℃至38℃的溫度範圍下於細胞培養基中培養能夠生產阿柏西普的中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞，其中所述細胞培養基係不含血清並包含水解產物以及聚胺；並且之後

    (b)當細胞密度達到介於每毫升1.6x10⁶及12.6x10⁶活細胞之間，在29℃至34℃的較低之溫度下培養該CHO細胞。
26. 如請求項25之方法，其中所述能夠生產阿柏西普的CHO細胞係選自以下群組：CHO K1細胞、CHO DUX B-11細胞、Veggie-CHO細胞、GS-CHO細胞、D-CHO細胞，以及CHO lec突變細胞(CHO lec mutant cell)。
27. 如請求項25之方法，其中當該生長期間的細胞密度達到介於每毫升2.0x10⁶及3.6x10⁶活細胞之間，步驟(b)之降低的溫度係開始於第5天及第7天之間。
28. 如請求項27之方法，其中該阿柏西普蛋白質係於至少為100mg/L的滴度來生產。
29. 如請求項28之方法，其中該細胞培養基包含：

    (a)

    

    40±6mM的胺基酸混合物或其鹽；

    (b)一或多種脂肪酸；

    (c)核苷混合物；或

    (d)一或多種二價陽離子。
30. 如請求項26之方法，其中該細胞培養基包含選自於以下群組中的一或多種添加物：

    (i)約29.8mM NaHCO₃，

    (ii)約2mM麩醯胺酸，

    (iii)約0.86μM胰島素，

    (iv)約11.1mM葡萄糖，

    (v)約6.54μM硫酸鋅，

    (vi)硫酸銅，

    (vii)氯化鐵，

    (viii)硫酸鎳，

    (ix)約85μM EDTA，以及

    (x)約50μM檸檬酸。
31. 一種細胞培養基，其為不含血清，包含0.6±0.09mM鳥胺酸以及

    

    0.20±0.03mM腐胺。
32. 如請求項31之細胞培養基，其包含0.714±0.11mM腐胺。
33. 如請求項31或32之細胞培養基，其中：

    (a)該培養基係不含水解產物或化學成分明確；

    (b)該培養基包含

    

    40±6mM的胺基酸混合物或其鹽，較佳地其中該胺基酸混合物係由以下組成：丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸，及纈胺酸；

    (c)該培養基包含一或多種脂肪酸，較佳地其中該一或多種脂肪酸係選自由下列組成之群組：亞麻油酸、次亞麻油酸、硫辛酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、花生油酸、月桂酸、二十二酸、癸酸、十二酸、己酸、十四酸、肉豆蔻酸，及辛酸；

    (d)該培養基包含核苷混合物，較佳地其中該核苷混合物包含一或多種的腺核苷、鳥糞核苷、胞嘧啶核苷、尿核苷、胸腺嘧啶核苷，及次黃嘌呤；

    (e)該培養基包含腺核苷、鳥糞核苷、胞嘧啶核苷、尿核苷、胸腺嘧啶核苷，及次黃嘌呤；

    (f)該培養基包含一或多種二價陽離子，較佳地該二價陽離子係鎂、鈣或兩種；及/或

    (g)該培養基包含Ca²⁺以及Mg²⁺。
34. 一種培養細胞的方法，包含以下步驟：(a)提供如請求項31至33中任一項之細胞培養基，以及(b)在該細胞培養基中增殖或維持細胞，以形成細胞培養物。
35. 如請求項34之方法，其中：

    (a)該細胞係選自下列所組成之群組：哺乳類細胞、鳥類細胞、昆蟲細胞、細菌細胞，以及酵母細胞，較佳地其中該細胞為CHO細胞；及/或

    (b)該細胞表現所欲蛋白質。
36. 如請求項35之方法，其中細胞表現該所欲蛋白質，其中：

    (a)該所欲蛋白質係抗原結合蛋白；

    (b)該所欲蛋白質包含Fc域之蛋白；及/或

    (c)該所欲蛋白質係受體-Fc融合蛋白，較佳地該受體-Fc融合蛋白係為阱蛋白(trap protein)。
37. 如請求項36之方法，其中該所欲蛋白質為受體-Fc融合蛋白，該受體-Fc融合蛋白係阱蛋白，其中該阱蛋白為介白素-1(IL-1)拮抗劑或血管內皮生長因子(VEGF)拮抗劑。
38. 如請求項35之方法，其中該所欲蛋白質係為抗體或抗體片段，較佳地該抗體或抗體片段係為重組人類抗體或其片段。
39. 一種生產蛋白的方法，包含以下步驟：

    (a)將核酸導入細胞，該核酸包含編碼所欲蛋白質的序列；

    (b)篩選攜帶該核酸之細胞；

    (c)根據如請求項34至38中任一項所述之方法在如請求項31至33中任一項所述之細胞培養基中培養所篩選到的細胞；及

    (d)於該細胞中表現該所欲蛋白質，其中該所欲蛋白質被分泌至該培養基中。
40. 如請求項39之方法，其中該細胞為CHO細胞、HEK293細胞或BHK細胞。
41. 如請求項39或40之方法，其中：

    (a)該所欲蛋白質係為抗原結合蛋白；

    (b)該所欲蛋白質包含Fc域；及/或

    (c)該所欲蛋白質係選自由下列組成之群組：受體-Fc融合蛋白(TRAP)、可溶性T細胞受器(TCR)-Fc融合蛋白、抗體、Fc融合蛋白以及單鏈可變區段蛋白(ScFv protein)組成之群組。
42. 如請求項39至41中任一項之方法，其中該所欲蛋白質係為重組人類抗體。