JP6944969B2 - 無血清細胞培養培地 - Google Patents

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Description

本発明は、細胞の培養のためおよび組換えタンパク質の生成のための培地に関する。本発明は、具体的には、タンパク質生物治療剤の生成のための組換えCHO細胞の培養のための無血清培地に関する。
血清またはタンパク質加水分解物構成要素(即ち、ペプトンおよびトリプトン)を含む細胞培養培地は、培養細胞からの組換えタンパク質の生成における使用の長い歴史を有する。これらの構成要素は、増殖因子ならびに細胞の増殖および培養にとって有益な広範な種々の他の特徴付けられていない要素を含む。しかし、これらは、増殖を低減させる、または組換えタンパク質生成に他の方法で負の影響を与える、特徴付けられていない要素もまた含む。これらは、可変性の、歓迎されない潜在的供給源でもあり得る。それらの欠点にもかかわらず、血清および加水分解物を使用することの利点は、欠点のいくつかを凌いでおり、多くの細胞培養適用において広く使用されてきた。
ヒト生物学的治療剤(バイオ医薬品)は、哺乳動物細胞培養物、特にCHO細胞培養物において一般に生成される。それらの細胞培養物中の特徴付けられていない構成要素または部分的に特徴付けられた構成要素の存在は、ヒト使用のためのバイオ医薬品の製造にとって非常に望ましくない。かかる特徴付けられていない構成要素または部分的に特徴付けられた構成要素の使用は、生成および調節の矛盾を導入するだけではなく、生成培養物のウイルス感染または真菌感染の可能性を上昇させる。
薬物生成物の収量および組成のロットごとの可変性の低減は、培養プロセスを選択する際の別の重要な因子である。血清、加水分解物および他の未定義の要素は、バイオ医薬品生成ロットの収量、組成および品質において可変性を導入する。培地要素の品質および純度は、収量にも影響を与え得るが、これは、薬物力価が、栄養素の特定のバランスを維持することに一部依存する場合が多いからである。栄養素の相対的な量が、培地ロットによって変動する場合、薬物収量は変動し得、この変動は、許容できないまたは経済的でない可能性がある。
血清含有培地または加水分解物ベースの培地を使用することは、下流の加工の課題を導入する。培養物中の所望のバイオ医薬品の濃度は、一般に、グラム/リットルのオーダーである。培地中の血清および加水分解物の存在は、引き続く加工ステップにおいて除去すべき、10g/L超の特徴付けられていないペプチドおよびタンパク質を追加し得る。血清および加水分解物は、培地中の金属および他の微量元素の量においても、可変性を導入し得る。従って、培養培地からの血清および加水分解物の排除は、これらのバリエーションならびに薬物物質の生成および加工に対する潜在的妨害を排除する。
とりわけ、無血清で加水分解物を含まない培地を使用することの利点は、費用の低減、薬物ロット間の可変性における低減、ならびに未規定および未精錬の構成要素からの偶発的な因子を導入する危険性の最小化が含まれる。さらに、培地がバッチ試行間で規定されており均一である場合、現在の培地に対して新たな培養バッチを試験するための検定試行が、同様に最小化される。従って、哺乳動物細胞を培養するための培地が当技術分野で必要とされており、ここで、この培地は、化学的に規定されており血清および加水分解物を含まないか、または無血清であり低い管理可能なレベルの加水分解物を含み、健康で頑強な細胞の増殖および維持、ならびにバイオ医薬品薬物物質の高力価生成をなおも可能にする。
本発明者らは、血清を含まない細胞培養培地(「OS」培地)中に、オルニチンをプトレシンありまたはなしのいずれかで含めることが、細胞の生存度および密度を増加させ、細胞倍加時間を低減させ、これらの細胞による高力価タンパク質生成を可能にすることを、驚くべきことに発見した。本発明者らは、低い量または微量のタンパク質加水分解物を含むOS培地または化学的に規定された(即ち、タンパク質加水分解物を含まない)OS培地が、特に、回復された細胞の生存度および密度、細胞倍加時間、ならびに高力価タンパク質生成を提供することもまた発見した。
一態様では、本発明は、無血清であり、少なくとも0.09mM±0.014mMのオルニチンを含む、細胞培養培地を提供する。一実施形態では、このオルニチンは、0.09±0.014mM〜0.9±0.14mMの範囲、例えば、0.09±0.014mM、0.3±0.05mM、0.6±0.09mMまたは0.9±0.14mMの濃度のオルニチンで、培地中に存在する。一部の実施形態では、この培地は、少なくとも0.20±0.03mMのプトレシンもまた含む。一部の実施形態では、このさらなるプトレシンは、0.20±0.03mM〜0.714±0.11mMの範囲、例えば0.20±0.03mM、0.35±0.06または0.714±0.11mMの濃度のプトレシンである。一部の実施形態では、この培地は、≦7.5g/Lの加水分解物を含む。一部の実施形態では、この培地は、いずれの加水分解物も含まない。
一実施形態では、この培地は、化学的に規定された基本培地、例えば、カスタム処方のまたは市販の基本培地を含む。一実施形態では、完全培地は、化学的に規定され、血清を含まず、加水分解物を含まない。
一部の実施形態では、その有用な濃度(即ち、1×)での培地は、少なくとも40±6mMまたは少なくとも70±10.5mMの、アミノ酸またはアミノ酸塩の混合物を含む。一実施形態では、この培地は、少なくとも40mMのアミノ酸の混合物を含む。この実施形態または別の実施形態では、この培地は、少なくとも70mMのアミノ酸の混合物を含む。一実施形態では、このアミノ酸の混合物(ユースポイント添加物として培地に後で添加され得るグルタミンを明らかに除く)は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含む。
一部の実施形態では、この培地は、1種または複数の脂肪酸を含む。特定の一実施形態では、この培地は、脂肪酸(または脂肪酸誘導体)の混合物およびアルファトコフェロールを含む。脂肪酸または脂肪酸誘導体は、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸およびオクタン酸からなる群より選択される。
一部の実施形態では、この培地は、ヌクレオシドの混合物を含む。一実施形態では、この培地は、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含む。
一部の実施形態では、この培地は、塩の混合物を含む。塩は、二価カチオン、例えばカルシウムおよびマグネシウムを含む。一実施形態では、この培地は、塩化カルシウムおよび硫酸マグネシウムを含む。他の塩には、リン酸の塩が含まれ得る。
具体的な一実施形態では、この培地は、(1)≦7.5g/Lの加水分解物を含む、(2)無血清である、(3)0.09±0.014mM、0.3±0.05mM、0.6±0.09mMまたは0.9±0.14mMのオルニチンを含む、(4)任意選択でさらに、0.20±0.03mM、0.35±0.06または0.714±0.11mMのプトレシンを含む、(5)少なくとも約40mMまたは少なくとも約70mMの、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含むアミノ酸の混合物を含む、(6)トコフェロールおよび脂肪酸の混合物を含む、(7)アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含むヌクレオシドの混合物を含む、ならびに(8)カルシウム、マグネシウムおよびリン酸の塩を含む。
別の一態様では、本発明は、上述の態様に記載された培地の任意の実施形態などの細胞培養培地中で細胞を培養する(cultivating)方法を提供する。一実施形態では、この方法は、(1)≦7.5g/Lの加水分解物を含むまたは加水分解物を含まない、(2)血清を含まない、(3)少なくとも0.09mM±0.014mMの濃度でオルニチンを含む、および(4)任意選択で、少なくとも0.20±0.03mMなどのプトレシンを含む培地中で、細胞(単数または複数)を成長させまたは維持するステップを使用する。
一部の実施形態では、この細胞(単数または複数)は、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、酵母細胞または細菌細胞である。一実施形態では、これらの細胞は、組換えタンパク質の生成において有用な哺乳動物細胞、例えば、CHO細胞または誘導体CHO−K1である。一部の実施形態では、これらの細胞は、目的のタンパク質、例えば生物治療剤タンパク質を発現する。この生物治療剤タンパク質は、Fcドメインを含み得る抗原結合性タンパク質であり得る。一部の実施形態では、この目的のタンパク質は、受容体−Fc−融合タンパク質、例えばScFv分子またはtrap分子である。trap分子には、VEGF trapタンパク質およびIL−1 Trapタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、この目的のタンパク質は、抗体、例えばヒト化モノクローナル抗体、二重特異性抗体または抗体断片である。
無血清培地中にオルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの組合せを含めることによる細胞増殖に対する正の影響を考慮すると、この方法に従って培養された細胞は、30時間以下の平均倍加時間を有する。一実施形態では、この細胞倍加時間は、24時間以下である。一実施形態では、0.09±0.014mM未満のオルニチン(または0.09±0.014mM未満のオルニチンおよび0.2±0.03mM未満のプトレシン)を含む培地中での細胞増殖と比較した場合、この方法に従って増殖した細胞は、コンパレーター対照培養物の倍加時間の少なくとも3分の1である平均倍加時間を有する。
同様に、無血清培地中にオルニチン単独またはオルニチンおよびプトレシンの組合せを含めることは、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの組合せを含めない場合よりも高い生存細胞計数密度に培養細胞が達するのを可能にする。OS培地の1つの無血清で加水分解物を含まない実施形態では、この細胞培養物は、0.09±0.014mM未満のオルニチン(または0.09±0.014mM未満のオルニチンおよび0.2±0.03mM未満のプトレシン)を含む類似の細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも15%大きい生存細胞計数密度に達することが可能である。OS培地の別の無血清で加水分解物を含まない実施形態では、この細胞培養物は、0.09±0.014mM未満のオルニチン(または0.09±0.014mM未満のオルニチンおよび0.2±0.03mM未満のプトレシン)を含む類似の細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも3倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である。
別の一実施形態では、この方法は、1種または複数のユースポイント添加物を細胞培養培地に添加するステップを含む。一部の実施形態では、このユースポイント添加物は、NaHCO、グルタミン、インスリン、グルコース、CuSO、ZnSO、FeCl、NiSO、Na EDTAおよびクエン酸Naのうちの任意の1種または複数である。一実施形態では、この方法は、以下のユースポイント化学物質の各々を細胞培養培地に添加するステップを使用する:NaHCO、グルタミン、インスリン、グルコース、CuSO、ZnSO、FeCl、NiSO、Na EDTAおよびクエン酸Na。一部の実施形態では、これらのユースポイント添加物は、開始時に培地中に含まれ得る。
具体的な一実施形態では、この態様は、以下:(1)0.09±0.014mM、0.3±0.05mM、0.6±0.09mMまたは0.9±0.14mMのいずれかのオルニチンの細胞培養培地;(2)任意選択でさらに、0.20±0.03mM、0.35±0.06または0.714±0.11mMのいずれかのプトレシン;(3)少なくとも約40mMまたは少なくとも約70mMの、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含むアミノ酸の混合物;(4)トコフェロールおよび脂肪酸の混合物;(6)アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含むヌクレオシドの混合物、ならびに(9)カルシウム、マグネシウムおよびリン酸の塩を含む無血清培地において細胞を培養する(cultivating)方法を提供し、この方法に従って培養された細胞は、24時間以下の平均倍加時間またはコンパレーター対照培養物の倍加時間の少なくとも3分の1の平均倍加時間を有し;培養された細胞は、0.09±0.015mM未満のオルニチン(または0.09±0.014mM未満のオルニチンおよび0.2±0.03mM未満のプトレシン)を含む類似の細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも15%大きいまたは少なくとも3倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である。別の一実施形態では、この細胞培養物は、0.09±0.014mM未満のオルニチン(または0.09±0.014mM未満のオルニチンおよび0.2±0.03mM未満のプトレシン)を含む類似の細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも3倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である。一実施形態では、この培地は、≦7.5g/Lの加水分解物を含む;別の一実施形態では、加水分解物を含まない。
別の一態様では、本発明は、(1)目的のタンパク質をコードする核酸配列を細胞中に導入するステップ;(2)この核酸配列を保有する細胞を選択するステップ;(3)第1の態様に記載される無血清細胞培養培地の一実施形態において、または第2の態様に記載される方法の任意の実施形態に従って、この選択された細胞を培養するステップ;および(4)この細胞において目的のタンパク質を発現させるステップを使用することによって、目的のタンパク質を生成する方法を提供し、目的のタンパク質は培地中に分泌される。一部の実施形態では、タンパク質の生成において使用される細胞は、生物治療剤を生成することが可能な哺乳動物細胞、例えばCHO、293およびBHK細胞、またはこれらの任意の誘導体である。一実施形態では、この細胞は、CHO細胞、例えばCHO−K1細胞である。
一部の実施形態では、この目的のタンパク質は、抗原結合性タンパク質である。一部の実施形態では、この目的のタンパク質は、Fcドメインを有するタンパク質である。一部の場合には、例えば、受容体−Fc−融合タンパク質、抗体およびScFvタンパク質などの場合には、これら2つの目的のタンパク質は、重複し得る。従って、一部の実施形態では、この目的のタンパク質は、抗体、例えばヒト抗体またはヒト化抗体、抗体断片、例えばFabまたはF(ab’)、二重特異性抗体、trap分子、例えばVEGF−TrapまたはIL−1−Trap、ScFv分子、可溶性TCR−Fc融合タンパク質などである。
一実施形態では、この目的のタンパク質は、0.09±0.014mM未満のオルニチン(または0.09±0.014mM未満のオルニチンおよび0.2±0.03mM未満のプトレシン)を含む無血清細胞培養培地(「非OS」培地)中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも7%大きい、少なくとも14%大きい、少なくとも80%大きい、少なくとも2倍大きい、または少なくとも3倍大きい、平均7日目力価で生成されることが可能である。
具体的な一実施形態では、この目的のタンパク質は、(1)目的のタンパク質、例えば抗体または他の抗原結合性タンパク質をコードする核酸配列をCHO細胞中に導入すること;(2)この核酸配列を保有する細胞を選択すること;(3)(a)0.09±0.014、0.3±0.05mM、0.6±0.09mMまたは0.9±0.14mMのいずれかのオルニチン;(b)任意選択でさらに、0.20±0.03mM、0.35±0.06または0.714±0.11mMのいずれかのプトレシン;(c)少なくとも40mMまたは少なくとも70mMの、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含むアミノ酸の混合物;(d)トコフェロールおよび脂肪酸の混合物;(e)アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含むヌクレオシドの混合物、ならびに(f)カルシウム、マグネシウムおよびリン酸の塩を含む無血清細胞培養培地中で、この選択された細胞を培養すること;ならびに(d)このCHO細胞において目的のタンパク質を発現させることによって生成され、目的のタンパク質は培地中に分泌される。一部の実施形態では、この無血清細胞培養培地は、≦7.5g/Lの加水分解物を含み得る;または他の実施形態では、加水分解物を全く含まなくてもよい。
[本発明1001]
≧0.09mM±0.014mMのオルニチンを含む、無血清である細胞培養培地。
[本発明1002]
≧0.20±0.03mMのプトレシンを含む、本発明1001の細胞培養培地。
[本発明1003]
0.09±0.014mM〜0.9±0.14mMのオルニチンを含む、本発明1001および1002のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1004]
0.09±0.014mM、0.3±0.05mM、0.6±0.09mMまたは0.9±0.14mMでオルニチンを含む、本発明1001から1003のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1005]
0.20±0.03mM〜0.714±0.11mMのプトレシンを含む、本発明1001から1004のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1006]
0.20±0.03mM、0.35±0.06または0.714±0.11mMでプトレシンを含む、本発明1001から1004のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1007]
加水分解物を含まない、本発明1001から1006のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1008]
化学的に規定されている、本発明1001から1006のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1009]
≧40±6mMのアミノ酸またはその塩の混合物を含む、本発明1001から1008のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1010]
アミノ酸の前記混合物が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる、本発明1009の細胞培養培地。
[本発明1011]
1種または複数の脂肪酸を含む、本発明1001から1010のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1012]
前記1種または複数の脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸およびオクタン酸からなる群より選択される、本発明1011の細胞培養培地。
[本発明1013]
ヌクレオシドの混合物を含む、本発明1001から1012のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1014]
ヌクレオシドの前記混合物が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンのうちの1種または複数を含む、本発明1013の細胞培養培地。
[本発明1015]
アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含む、本発明1001から1014のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1016]
1種または複数の二価カチオンを含む、本発明1001から1015のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1017]
前記二価カチオンが、マグネシウム、カルシウムまたはそれらの両方である、本発明1016の細胞培養培地。
[本発明1018]
Ca2+およびMg2+を含む、本発明1001から1017のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1019]
細胞を培養するための方法であって、(a)本発明1001から1018のいずれかの細胞培養培地を提供するステップ、および(b)前記細胞培養培地中で細胞を成長させるかまたは維持して、細胞培養物を形成するステップを含む、方法。
[本発明1020]
前記細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、細菌細胞および酵母細胞からなる群より選択される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記細胞がCHO細胞である、本発明1019または本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記細胞が目的のタンパク質を発現する、本発明1019から1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記目的のタンパク質が抗原結合性タンパク質である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記目的のタンパク質がFcドメインを含む、本発明1022または1023の方法。
[本発明1025]
前記目的のタンパク質が受容体−Fc−融合タンパク質である、本発明1022から1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記受容体−Fc−融合タンパク質がtrapタンパク質である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記trapタンパク質が、IL−1アンタゴニストまたはVEGFアンタゴニストである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記目的のタンパク質が、抗体または抗体断片である、本発明1022または1023の方法。
[本発明1029]
前記抗体または前記抗体断片が、組換えヒト抗体またはその断片である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記細胞が、≦30時間の平均倍加時間を有する、本発明1019から1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記細胞が、≦24時間の平均倍加時間を有する、本発明1019から1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記細胞が、<0.3±0.045mMのオルニチンおよび<0.2±0.03mMのプトレシンを含む細胞培養培地において増殖した細胞の平均倍加時間の少なくとも3分の1である平均倍加時間を有する、本発明1019から1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記細胞培養物が、<0.09±0.014mMのオルニチンおよび<0.2±0.03mMのプトレシンを含む培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも15%大きい生存細胞計数密度に達することが可能である、本発明1019から1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記細胞培養物が、<0.09±0.014mMのオルニチンおよび<0.2±0.03mMのプトレシンを含む類似の細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも3倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である、本発明1019から1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
1種または複数のユースポイント添加物を、前記細胞培養培地に添加するステップを含む、本発明1019から1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記ユースポイント添加物が、NaHCO3、グルタミン、インスリン、グルコース、CuSO4、ZnSO4、FeCl3、NiSO4、Na4 EDTAおよびクエン酸Na3のうちの1種または複数を含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
NaHCO3、グルタミン、インスリン、グルコース、CuSO4、ZnSO4、FeCl3、NiSO4、Na4 EDTAおよびクエン酸Na3の各々が、ユースポイント添加物として前記培地に添加される、本発明1035または1036の方法。
[本発明1038]
タンパク質を生成するための方法であって、前記方法は、(a)目的のタンパク質をコードする配列を含む核酸を細胞中に導入するステップ;(b)前記核酸を保有する細胞を選択するステップ;(c)本発明1001から1018のいずれかの細胞培養培地において、または本発明1019から1037のいずれかの方法に従って、選択された前記細胞を培養するステップ;および(d)前記細胞において前記目的のタンパク質を発現させるステップを含み、前記目的のタンパク質が前記培地中に分泌される、方法。
[本発明1039]
前記細胞が、CHO細胞、293細胞またはBHK細胞である、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記目的のタンパク質が抗原結合性タンパク質である、本発明1038または1039の方法。
[本発明1041]
前記目的のタンパク質がFcドメインを含む、本発明1038から1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記目的のタンパク質が、受容体−Fc−融合タンパク質(TRAP)、可溶性TCR−Fc融合タンパク質、抗体、Fc−融合タンパク質およびScFvタンパク質からなる群より選択される、本発明1038から1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記目的のタンパク質が、0.09±0.014mM未満のオルニチンおよび0.2±0.03mM未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも7%大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記目的のタンパク質が、0.09±0.014mM未満のオルニチンおよび0.2±0.03mM未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも14%大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記目的のタンパク質が、0.09±0.014mM未満のオルニチンおよび0.2±0.03mM未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも80%大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記目的のタンパク質が、0.09±0.014mM未満のオルニチンおよび0.2±0.03mM未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも2倍大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
前記目的のタンパク質が、0.09±0.014mM未満のオルニチンおよび0.2±0.03mM未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも3倍大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記目的のタンパク質が組換えヒト抗体である、本発明1038から1047のいずれかの方法。
本出願人らは、オルニチン、またはオルニチンおよびプトレシンの組合せの添加(「OS培地」)が、オルニチンをごく僅かしか含まないもしくは全く含まない、またはオルニチンおよびプトレシンの組合せをごく僅かしか含まないもしくは全く含まない無血清培地(「非OS培地」)と比較して、細胞培養物中の細胞による生存細胞密度、細胞倍加時間およびタンパク質生成を改善することを、驚くべきことに発見した。
本発明の細胞培養物および方法を記載する前に、本発明が、記載される特定の方法および実験条件に限定されず、かかる方法および条件が変動し得ることを理解すべきである。本明細書で使用される専門用語が、特定の実施形態のみを記載することを目的とするものであって、限定を意図しないこともまた理解すべきである。
特記しない限り、本出願で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本出願に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、特定の具体的な方法および材料がここに記載されている。単位、接頭辞および記号は、そのSI承認された形態で示され得る。本明細書に引用される数値範囲は、オープンブラケットであり、それらがその範囲を規定する数字を含んでいることを意味する。特記しない限り、用語「1つの(a)」または「1つの(an)」は、「〜のうち少なくとも1つ」を意味すると解釈すべきである。本明細書で使用されるセクション見出しは、組織化を目的とするに過ぎず、記載された主題を限定すると解釈すべきではない。本明細書に記載される方法および技術は、一般に、当技術分野で公知の、ならびに特記しない限り本明細書を通じて引用および議論される種々の一般的な参考文献およびより具体的な参考文献中に記載される従来の方法に従って、実施される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(2001年)ならびにAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates(1992年)、Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1990年)、ならびにJulio E. Celis、Cell Biology: A Laboratory Handbook、第2版、Academic Press、New York、N.Y.(1998年)、ならびにDieffenbachおよびDveksler、PCR Primer: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1995年)を参照のこと。本開示を通じて言及される全ての刊行物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
定義
本明細書で使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、至る所で相互交換可能に使用され、ペプチド結合によって互いに接続された2つまたはそれ超のアミノ酸残基を含む分子を指す。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、改変、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化およびADP−リボシル化もまた含み得る。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、タンパク質ベースの薬物を含む、科学的または商業的に興味を持たれるものであり得る。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質には、とりわけ、抗体およびキメラまたは融合タンパク質が含まれる。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、細胞培養方法を使用して組換え動物細胞株によって生成される。
用語「異種ポリヌクレオチド配列」とは、本明細書で使用する場合、バイオ医薬品薬物物質として生成される、目的のタンパク質、例えばキメラタンパク質(trap分子など)、抗体または抗体部分(例えば、VH、VL、CDR3)をコードする核酸ポリマーを指す。この異種ポリヌクレオチド配列は、遺伝子操作技術(例えば、キメラタンパク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、イントロン無し配列、など)によって製造され得、細胞中に導入され得、この細胞中で、この異種ポリヌクレオチド配列は、エピソームとして存在し得るか、または細胞のゲノム中に組み込まれ得る。この異種ポリヌクレオチド配列は、生成細胞ゲノム内の異所的部位中に導入された天然に存在する配列であり得る。この異種ポリペプチド配列は、別の生物由来の天然に存在する配列、例えばヒトオルソログをコードする配列であり得る。
「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された4つのポリペプチド鎖、2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、1つの重鎖可変領域(HCVRまたはVH)および1つの重鎖定常領域を有する。この重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3を含む。各軽鎖は、1つの軽鎖可変領域および1つの軽鎖定常領域を有する。この軽鎖定常領域は、1つのドメイン(CL)からなる。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域に散在した相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域へとさらに下位分割され得る。各VHおよびVLは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと整列された、3つのCDRおよび4つのFRから構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。用語「抗体」は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化免疫グロブリンおよび非グリコシル化免疫グロブリンの両方に対する言及を含む。用語「抗体」には、組換え手段によって調製、発現、創出または単離された抗体分子、例えば、その抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体、が含まれる。用語抗体には、1つよりも多い異なるエピトープに結合し得るヘテロ四量体免疫グロブリンを含む二重特異性抗体もまた含まれる。二重特異性抗体は、参照によって本出願に組み込まれる米国特許出願公開第2010/0331527号中に一般に記載されている。
用語、抗体の「抗原結合性部分」(または「抗体断片」)とは、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の1つまたは複数の断片を指す。用語、抗体の「抗原結合性部分」内に包含される結合性断片の例には、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片、Fab断片;(ii)ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片、F(ab’)2断片;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片、(v)VHドメインからなるdAb断片(Wardら(1989年)Nature 241巻:544〜546頁)、(vi)単離されたCDR、ならびに(vii)単一のタンパク質鎖を形成するように合成リンカーによって接続されたFv断片の2つのドメインVLおよびVHからなるscFvであって、ここで、VL領域およびVH領域が対になって一価の分子を形成する、scFv、が含まれる。他の形態の単鎖抗体、例えばディアボディ(diabody)もまた、用語「抗体」の下に包含される(例えば、Holligerら(1993年)PNAS USA 90巻:6444〜6448頁;Poljakら(1994年)Structure 2巻:1121〜1123頁を参照のこと)。
なおさらに、抗体またはその抗原結合性部分は、1つまたは複数の他タンパク質またはペプチドとの、抗体または抗体部分の共有結合的会合または非共有結合的会合によって形成される、より大きい免疫接着分子の一部であり得る。かかる免疫接着分子の例には、四量体scFv分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanovら(1995年)Human Antibodies and Hybridomas 6巻:93〜101頁)、および二価のビオチン化scFv分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびC末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanovら(1994年)Mol. Immunol. 31巻:1047〜1058頁)が含まれる。抗体部分、例えばFabおよびF(ab’)2断片は、従来の技術を使用して、例えば、抗体全体のパパイン消化またはペプシン消化によって、抗体全体から調製され得る。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、当技術分野で一般に公知の標準的な組換えDNA技術を使用して得ることができる(Sambrookら、1989年を参照のこと)。
用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された可変領域および定常領域を有する抗体を含む意図である。本発明のヒト抗体は、例えば、CDRおよび特にCDR3中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基(例えば、ランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によってin vitroで、または体細胞変異によってin vivoで導入された変異)を含み得る。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列から誘導されたCDR配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことは意図しない。
用語「組換えヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、組換え手段によって調製、発現、創出もしくは単離された全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離された抗体(例えば、Taylorら(1992年)Nucl. Acids Res. 20巻:6287〜6295頁を参照のこと)、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、創出もしくは単離された抗体を含む意図である。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された可変領域および定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、in vitro変異誘発(または、ヒトIg配列に関してトランスジェニックの動物を使用する場合、in vivo体細胞変異誘発)に供され、従って、これらの組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH配列およびVL配列から誘導され、ヒト生殖系列VH配列およびVL配列と関連してはいるが、in vivoのヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然に存在しない可能性がある配列である。
「Fc融合タンパク質」は、2つまたはそれ超のタンパク質の一部または全てを含み、そのうち1つは、免疫グロブリン分子のFc部分であり、これらは、天然には別なふうに一緒には見出されない。抗体由来ポリペプチドの種々の部分(Fcドメインを含む)に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ashkenaziら、Proc. Natl. Acad. ScL USA 88巻:10535頁、1991年;Byrnら、Nature 344巻:677頁、1990年;およびHollenbaughら、「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」、Current Protocols in Immunology、 補遺4、10.19.1〜10.19.11頁、1992年によって記載されている。「受容体Fc融合タンパク質」は、Fc部分にカップリングされた受容体の1つまたは複数の細胞外ドメイン(複数可)を含み、一部の実施形態では、免疫グロブリンのCH2およびCH3ドメインが後に続くヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、このFc−融合タンパク質は、1つまたは複数のリガンド(複数可)と結合する2つまたはそれ超の別個の受容体鎖を含む。例えば、Fc−融合タンパク質は、trap、例えば、IL−1 trap(例えば、hIgG1のFcに融合されたIL−1R1細胞外領域に融合されたIL−1RAcPリガンド結合領域を含むリロナセプト;米国特許第6,927,004号を参照のこと)、またはVEGF trap(例えば、hIgG1のFcに融合されたVEGF受容体Flk1のIgドメイン3に融合されたVEGF受容体Flt1のIgドメイン2を含むアフリベルセプト;米国特許第7,087,411号および米国特許第7,279,159号を参照のこと)などである。
培地
本発明は、細胞を培養する際およびバイオ医薬品薬物物質を生成する際に有用な無血清培地を提供する。「無血清」は、動物血清、例えば胎仔ウシ血清を含まない細胞培養培地に適用される。この無血清培地は、≦7.5g/Lの加水分解物、例えばダイズ加水分解物を含み得る。本発明はまた、無血清なだけでなく、加水分解物もまた含まない、化学的に規定された培地を提供する。「加水分解物を含まない」は、外因性タンパク質加水分解物、例えば動物または植物のタンパク質加水分解物、例えば、ペプトン、トリプトンなどを含まない細胞培養培地に適用される。
細胞培養培地からの血清の排除および加水分解物を低減または排除することは、ロットごとの可変性を低減させ、下流の加工ステップを増強するが、残念ながら、細胞増殖、生存度およびタンパク質発現を減退させる。従って、化学的に規定された、無血清で低い加水分解物〜加水分解物なしの培地は、細胞増殖およびタンパク質生成を改善するためのさらなる成分を必要とする。本発明の細胞培養培地には、培養される細胞の要件または所望の細胞培養パラメーターに依存して、ポリアミンなどのさらなる成分、または増加した濃度の構成要素、例えばアミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素などが補充され得る。具体的には、本明細書の細胞培養培地は、細胞増殖、細胞生存度および組換えタンパク質生成を改善するために、オルニチン、プトレシン、または両方が補充される(「OS培地」)。
一部の実施形態では、このOS培地は、少なくとも約90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、540、545、550、555、560、565、568、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、620、625、630、635、640、645、650、700、750、800、850または900μMの濃度(マイクロモル/リットルで表される)で、オルニチンを含む。
一部の実施形態では、この培地は、約85、90、95、100、105、110、113または115μMの濃度でオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、100μM±15μMのオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、15mg/L±2.25mg/Lのオルニチン・HClを含む。
一部の実施形態では、この培地は、約255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340または345μMの濃度でオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、300μM±45μMのオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、50mg/L±7.5mg/Lのオルニチン・HClを含む。
一部の実施形態では、この培地は、約510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685または690μMの濃度でオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、600μM±90μMのオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、100mg/L±15mg/Lのオルニチン・HClを含む。
一部の実施形態では、この培地は、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、1,000、1,005、1,010、1,015、1,020、1,025、1,030または1,035μMの濃度でオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、900μM±135μMのオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、150mg/L±22.5mg/Lのオルニチン・HClを含む。
プトレシンは、任意選択で、オルニチン補充培地に添加され得る。プトレシンは、非常に低い濃度で、いくつかの細胞培養培地処方において構成要素として含まれてきた;例えば、0.02〜0.08mg/Lのプトレシンを記載するWO2005/028626;米国特許第5,426,699号(0.08mg/L);米国再発行特許第30,985号(0.16mg/L);米国特許第5,811,299号(0.27mg/L);米国特許第5,122,469号(0.5635mg/L);米国特許第5,063,157号(1mg/1);WO2008/154014(約100μM〜約1000μM);米国特許出願公開第2007/0212770号(0.5〜30mg/Lのポリアミン;2mg/Lのプトレシン;2mg/Lのプトレシン+2mg/Lのオルニチン;2mg/Lのプトレシン+10mg/Lのオルニチン)を参照のこと。
一部の実施形態では、この培地は、オルニチンおよびプトレシンの組合せを含み、ここで、プトレシンは、少なくとも約150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、260、365、370、375、380、385、390、395、400、405または410μMの濃度であり得る。
一部の実施形態では、この培地は、約170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225または230μMの濃度でプトレシンを含む。一実施形態では、この培地は、≧90μM±14μMのオルニチンに加えて、200μM±30μMのプトレシンを含む。一実施形態では、この培地は、≧15mg/L±2.25mg/Lのオルニチン・HClに加えて、30mg/L±4.5mg/Lのプトレシン・2HClを含む。
一部の実施形態では、この培地は、約295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400または405μMの濃度でプトレシンを含む。一実施形態では、この培地は、≧90μM±14μMのオルニチンに加えて、350μM±52.5μMのプトレシンを含む。一実施形態では、この培地は、≧15mg/L±2.25mg/Lのオルニチン・HClに加えて、57mg/L±8.55mg/Lのプトレシン・2HClを含む。
一部の実施形態では、この培地は、約595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800または805μMの濃度でプトレシンを含む。一実施形態では、この培地は、≧90μM±14μMのオルニチンに加えて、714μM±105μMのプトレシンを含む。一実施形態では、この培地は、≧15mg/L±2.25mg/Lのオルニチン・HClに加えて、115mg/L±17.25mg/Lのプトレシン・2HClを含む。
一部の実施形態では、この培地は、上に列挙した任意の濃度のプトレシンおよびオルニチンのペアになった組合せを含む。一部の実施形態では、この培地は、約595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800または805μMのプトレシンおよび約510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685または690μMのオルニチンの、任意のペアになった組合せを含む。例えば、この培地は、一実施形態では、約700μMのプトレシン+510、511、512μM、以下参照のオルニチンのいずれか1つ;または701μMのプトレシン+510、511、512μM、以下参照のオルニチンのいずれか1つ;などを含む。また例えば、この培地は、一実施形態では、約600μMのオルニチン+700、701、702μM、以下参照のプトレシンのいずれか1つ;または601μMのオルニチン+700、701、702μM、以下参照のプトレシンのいずれか1つ;などを含む。一部の実施形態では、この培地は、702μM±106μMのプトレシン(purescine)+593μM±89μMのオルニチンを含む。特定の一実施形態では、この培地は、約714μMのプトレシンおよび593μMのオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、115mg/L±17mg/Lのプトレシン・2HClおよび100mg/L±15mg/Lのオルニチン・HClを含む。特定の一実施形態では、この培地は、115mg/Lのプトレシン・2HClおよび100mg/Lのオルニチン・HClを含む。
一実施形態では、オルニチンまたはプトレシンを含めることに加えて、この培地は、少なくとも50μM、少なくとも60μM、少なくとも70μM、少なくとも80μM、少なくとも90μM、少なくとも100μM、少なくとも110μM、少なくとも115μM、少なくとも120μM、少なくとも125μM、少なくとも130μM、少なくとも135μM、少なくとも140μM、少なくとも145μM、少なくとも150μM、少なくとも155μM、少なくとも160μM、少なくとも165μMまたは少なくとも170μMの累積濃度で、ヌクレオシドの混合物を含む。一実施形態では、この培地は、約174μM±26μMのヌクレオシドを含む。一実施形態では、この培地は、少なくとも40μM、少なくとも45μM、少なくとも50μM、少なくとも55μM、少なくとも60μM、少なくとも65μM、少なくとも70μM、少なくとも75μM、少なくとも80μM、少なくとも85μM、少なくとも90μM、少なくとも95μM、少なくとも100μMまたは少なくとも105μMの累積濃度で、プリン誘導体を含む。一実施形態では、この培地は、約106μM±5μMのプリン誘導体を含む。プリン誘導体には、ヒポキサンチンならびにヌクレオシドアデノシンおよびグアノシンが含まれる。一実施形態では、この培地は、少なくとも30μM、少なくとも35μM、少なくとも40μM、少なくとも45μM、少なくとも50μM、少なくとも55μM、少なくとも60μMまたは少なくとも65μMの累積濃度で、ピリミジン誘導体を含む。一実施形態では、この培地は、約68μM±5μMのピリミジン誘導体を含む。ピリミジン誘導体には、ヌクレオシドチミジン、ウリジンおよびシチジンが含まれる。特定の一実施形態では、この培地は、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含む。
オルニチンまたはプトレシンを含めることに加えて、一実施形態では、この培地はまた、少なくとも40mMの累積濃度でアミノ酸を含み、ここで、グルタミンの量は、累計の計算に含めない。一実施形態では、グルタミンは、培地中には含まれないが、タンパク質の生成の間などの細胞の培養の間に、培地に「ユースポイント添加物」として供給され得る。従って、一部の実施形態では、細胞を培養する方法または目的のタンパク質を生成する方法などにおいて、この培地には、ユースポイント添加物としてグルタミンが補充され得る。かかる一実施形態では、グルタミンは、約40mM未満、約35mM未満、約30mM未満、約25mM未満、約20mM未満、約15mM未満、約10mM未満、約8mM未満、約7mM未満、約6mM未満、約5mM未満、約4mM未満、約3mM未満または約2.5mM未満の量で添加される。一実施形態では、グルタミンが補充された培地中のグルタミンの量は、約2mM±0.5mMである。
一実施形態では、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せを含めることに加えて、この培地は、少なくとも15mM、少なくとも24mM、少なくとも25mM、少なくとも26mM、少なくとも27mM、少なくとも28mM、少なくとも29mMまたは少なくとも30mMの濃度で、非極性側基を有するアミノ酸もまた含む。一実施形態では、この培地は、約30mMの、非極性側基を有するアミノ酸を含む。一実施形態では、培地内に含まれるアミノ酸の総量の少なくとも32モル%、少なくとも33モル%、少なくとも34モル%、少なくとも35モル%、少なくとも36モル%、少なくとも37モル%、少なくとも38モル%、少なくとも39モル%、少なくとも40モル%または少なくとも41モル%は、非極性側基を有するアミノ酸である。一実施形態では、培地中のアミノ酸の約42モル%±1モル%が、非極性側基を有するアミノ酸である。非極性側基を有するアミノ酸には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。
一実施形態では、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せを含めることに加えて、この培地は、約10mM〜34mM、約11mM〜33mM、約12mM〜32mM、約13mM〜31mM、約14mM〜30mM、約15mM〜29mM、約16mM〜28mM、約17mM〜27mM、約18mM〜26mM、約19mM〜25mM、約20mM〜24mM、約21mM〜23mMまたは約22mMの濃度で、非荷電極性側基を有するアミノ酸もまた含む。一実施形態では、この培地は、約22mMの、非荷電極性側基を有するアミノ酸を含む。別の一実施形態では、この培地は、約12mMの、非荷電極性側基を有するアミノ酸を含む。一実施形態では、培地内に含まれるアミノ酸の総量の約14モル%〜46モル%、約15モル%〜45モル%、約16モル%〜44モル%、約17モル%〜43モル%、約18モル%〜42モル%、約19モル%〜41モル%、約20モル%〜40モル%、約21モル%〜39モル%、約22モル%〜38モル%、約23モル%〜37モル%、約24モル%〜36モル%、約25モル%〜35モル%、約26モル%〜34モル%、約27モル%〜33モル%、約28モル%〜32モル%、約29モル%〜31モル%または約30モル%が、非荷電極性側基を有するアミノ酸である。一実施形態では、培地中のアミノ酸の約30モル%±3モル%が、非荷電極性側基を有するアミノ酸である。非荷電極性側基を有するアミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。
一実施形態では、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せを含めることに加えて、この培地は、約4mM〜14mM、約5mM〜13mM、約6mM〜12mM、約7mM〜11mM、約8mM〜10mM、約9mMまたは約4mMの濃度で、pH6において負の電荷を有するアミノ酸(即ち、酸性アミノ酸)もまた含む。一実施形態では、この培地は、約9mMの酸性アミノ酸を含む。一実施形態では、この培地は、9mM±1mMの酸性アミノ酸を含む。一実施形態では、培地内に含まれるアミノ酸の総量の約8モル%〜18モル%、約9モル%〜17モル%、約10モル%〜16モル%、約11モル%〜15モル%、約12モル%〜14モル%または約13モル%が、酸性アミノ酸である。一実施形態では、培地中のアミノ酸の約12.6モル%±1モル%が、酸性アミノ酸である。酸性アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
一実施形態では、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せを含めることに加えて、この培地は、少なくとも3.5mM、少なくとも4mM、少なくとも5mM、少なくとも6mM、少なくとも7mM、少なくとも8mM、少なくとも9mM、少なくとも10mMまたは少なくとも11mMの濃度で、pH6において正の電荷を有するアミノ酸(即ち、塩基性アミノ酸)もまた含む。一実施形態では、この培地は、約11mMの塩基性アミノ酸を含む。一実施形態では、この培地は、約11.42mM±1mMの塩基性アミノ酸を含む。一実施形態では、培地内に含まれるアミノ酸の総量の少なくとも5モル%、少なくとも6モル%、少なくとも7モル%、少なくとも8モル%、少なくとも9モル%、少なくとも10モル%、少なくとも11モル%、少なくとも12モル%、少なくとも13モル%、少なくとも14モル%または少なくとも15モル%が、塩基性アミノ酸である。一実施形態では、培地中のアミノ酸の約16モル%が、塩基性アミノ酸である。一実施形態では、培地中のアミノ酸の約15.8モル%±2.4モル%が、塩基性アミノ酸である。一実施形態では、培地中のアミノ酸の約21モル%±3.2モル%が、塩基性アミノ酸である。塩基性アミノ酸には、リシン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれる。
一実施形態では、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せを含めることに加えて、この培地は、約30mMの非極性アミノ酸、約22mMの非荷電極性アミノ酸、約9mMの酸性アミノ酸および約11mMの塩基性アミノ酸もまた含む。一実施形態では、培地中のアミノ酸のうち、約42モル%が非極性アミノ酸であり、約30モル%が非荷電極性アミノ酸であり、約13モル%が酸性アミノ酸であり、約16モル%が塩基性アミノ酸である。
オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せを含めることに加えて、一実施形態では、この培地は、マイクロモル濃度量の脂肪酸(または脂肪酸誘導体)およびトコフェロールを含む。一実施形態では、この脂肪酸には、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸およびオクタン酸のうちのいずれか1種または複数が含まれる。一実施形態では、この培地は、トコフェロール、リノール酸およびチオクト酸を含む。
一実施形態では、この培地は、少なくとも約700μMまたは少なくとも約2mMの累積濃度で、他の栄養素および必須栄養素を含むビタミンの混合物もまた含む。一実施形態では、このビタミンの混合物は、D−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシンHCl、D−パントテン酸(hemiCa)、リボフラビン、チアミンHCl、ビタミンB12などのうち1種または複数を含む。一実施形態では、このビタミンの混合物は、D−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシンHCl、D−パントテン酸(hemiCa)、リボフラビン、チアミンHClおよびビタミンB12の全てを含む。
本発明の培地の種々の実施形態は、示された量のオルニチンまたはプトレシン+とりわけ(a)アミノ酸;(b)任意選択でヌクレオシド;(c)二価カチオンの塩;(d)脂肪酸およびトコフェロール;ならびに(e)ビタミンを含む、化学的に規定された加水分解物を含まない無血清培地を含む、上記実施形態の組合せのいずれかを含む。一部の実施形態では、全ての少量の加水分解物が、OS培地に添加され得る。
本出願人らは、本発明の実施において、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せが添加される種々の基本培地またはそれらの組合せのうちの任意の1つまたは複数が使用され得ることを想定している。基本培地は、当技術分野で一般に公知であり、とりわけ以下が含まれる:イーグルMEME(最小必須培地)(Eagle、Science、1955年、112巻(3168号):501〜504頁)、ハムF12(Ham、 Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA、1965年、53巻:288〜293頁)、F−12 K培地、ダルベッコ培地、ダルベッコ改変イーグル培地(Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、1952年8月;38巻(8号):747〜752頁)、DMEM/ハムF12 1:1、TrowellのT8、A2培地(HolmesおよびWolf、Biophys. Biochem. Cytol.、1961年、10巻:389〜401頁)、Waymouth培地(DavidsonおよびWaymouth、Biochem. J.、1945年、39巻(2号):188〜199頁)、Williams E培地(William’sら、Exp. Cell Res.、1971年、69巻:105頁以下参照)、RPMI 1640(Mooreら、J. Amer. Med. Assoc.、1967年、199巻:519〜524頁)、MCDB 104/110培地(Bettgerら、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA、1981年、78巻(9号):5588〜5592頁)、Ventrex HL−1培地、アルブミン−グロブリン培地(Orrら、Appl. Microbiol.、1973年、25巻(1号):49〜54頁)、RPMI−1640培地、RPMI−1641培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、McCoyの5A培地、LeibovitzのL−15培地、および無血清培地、例えばEX−CELL(商標)300 Series(JRH Biosciences、Lenexa、Kansas)、プロタミン−亜鉛−インスリン培地(Weissら、1974年、米国特許第4,072,565号)、ビオチン−フォレート培地(Cartaya、1978年、米国再発行特許第30,985号)、トランスフェリン−脂肪酸培地(Baker、1982年、米国特許第4,560,655号)、トランスフェリン−EGF培地(Hasegawa、1982年、米国特許第4,615,977号;Chessebeuf、1984年、米国特許第4,786,599号)、ならびに他の培地の順列(Inlow、米国特許第6,048,728号;Drapeau、米国特許第7,294,484号;Mather、米国特許第5,122,469号;Furukawa、米国特許第5,976,833号;Chen、米国特許第6,180,401号;Chen、米国特許第5,856,179号;Etcheverry、米国特許第5,705,364号;Etcheverry、米国特許第7,666,416号;Ryll、米国特許第6,528,286号;Singh、米国特許第6,924,124号;Luan、米国特許第7,429,491号;などを参照のこと)。
特定の一実施形態では、この培地は、化学的に規定されており、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せに加えて以下を含む:CaCl 2HO;HEPES緩衝液、KCl;MgSO;NaCl;NaHPOまたは他のリン酸塩;ピルベート;L−アラニン;L−アルギニンHCl;L−アスパラギンHO;L−アスパラギン酸;L−システインHCl HO;L−グルタミン酸;グリシン;L−ヒスチジンHCl HO;L−イソロイシン;L−ロイシン;L−リシンHCl;L−メチオニン;L−オルニチンHCl;L−フェニルアラニン;L−プロリン;L−セリン;L−スレオニン;L−トリプトファン;L−チロシン2Na 2HO;L−バリン;D−ビオチン;塩化コリン;葉酸;ミオイノシトール;ナイアシンアミド;ピリドキシンHCl;D−パントテン酸;リボフラビン;チアミンHCl;ビタミンB12;ρ−アミノ安息香酸;エタノールアミンHCl;Pluronic F68;リン酸DL−a−トコフェロール;リノール酸;NaSeO;チオクト酸;およびグルコース;ならびに任意選択でアデノシン;グアノシン;シチジン;ウリジン;チミジン;およびヒポキサンチン2Na。
一実施形態では、本発明の培地の出発モル浸透圧濃度は、200〜500、250〜400、275〜350または約300mOsmである。本発明の培地中での細胞の増殖の間、特に流加プロトコールに従う任意の供給の後、培養物のモル浸透圧濃度は、最大で約350、400、450または500mOsmの高さまで増加し得る。
規定された培地のモル浸透圧濃度が約300未満である一部の実施形態では、このモル浸透圧濃度は、特定した量を超えた1種または複数の塩の添加によって、約300にされる。一実施形態では、モル浸透圧濃度は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マグネシウム塩、カルシウム塩、アミノ酸塩、脂肪酸の塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、塩であるキレーター、糖(例えば、ガラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、フコースなど)、ならびにそれらの組合せから選択される浸透圧調節物質のうちの1種または複数を添加することによって、所望のレベルまで増加される。一実施形態では、この浸透圧調節物質は、規定された培地中に既に存在する構成要素におけるその濃度を超えおよび上回って、添加される(例えば、糖が、糖構成要素について特定された濃度を超えおよび上回って、添加される)。
上記培地の各々および全ての実施形態、ならびに少なくとも約90μMのオルニチンを含む(または少なくとも約100μMのオルニチン+少なくとも約200μMのプトレシンの組合せを含む)任意の他の無血清培地は、本明細書で以降、オルニチン補充(「OS」)培地と称される。逆に、オルニチンを含まない(もしくはオルニチン/プトレシンの組合せを含まない)培地、または100μM未満のオルニチンを含む培地(もしくは100μM未満のオルニチンおよび200μM未満のプトレシンを含む培地)は、本明細書で以降、非オルニチン補充(「非OS」)培地と称される。
細胞培養物
本発明は、上記OS培地中に目的のタンパク質を発現する細胞株を含む細胞培養物を提供する。一実施形態では、この細胞培養物は、ユースポイント成分として培地に添加され得るまたは培地処方中に含まれ得る、インスリンを含む。一実施形態では、この細胞株は、生物治療剤タンパク質を生成することが可能な細胞を含む。タンパク質生物治療剤を生成するために慣用的に使用される細胞株の例には、とりわけ、初代細胞、BSC細胞、HeLa細胞、HepG2細胞、LLC−MK細胞、CV−1細胞、COS細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK細胞、TCMK−1細胞、LLCPK細胞、PK15細胞、LLC−RK細胞、MDOK細胞、BHK細胞、BHK−21細胞、CHO細胞、CHO−K1細胞、NS−1細胞、MRC−5細胞、WI−38細胞、BHK細胞、3T3細胞、293細胞、RK細胞、Per.C6細胞およびニワトリ胚細胞が含まれる。一実施形態では、この細胞株は、CHO細胞株、または大規模タンパク質生成のために最適化されたいくつかの特定のCHO細胞バリアントのうちの1つもしくは複数、例えば、CHO−K1である。
「細胞培養物」または「培養物」は、多細胞生物または組織の外側での細胞の増殖および成長を意味する。哺乳動物細胞に適切な培養条件は、当技術分野で公知である。例えば、Animal cell culture: A Practical Approach、D. Rickwood編、Oxford University Press、New York(1992年)を参照のこと。哺乳動物細胞は、懸濁物中で、または固体基材に結合させながら、培養され得る。マイクロキャリアありまたはなしの、バッチ、流加、連続、半連続または灌流モードで動作する、流動床バイオリアクタ、中空線維バイオリアクタ、ローラーボトル、振盪フラスコまたは撹拌タンクバイオリアクタが、哺乳動物細胞培養のために利用可能である。細胞培養培地または濃縮供給培地は、培養の間、培養物に連続的に、または間隔を置いて添加され得る。例えば、培養物は、1日1回、1日毎に、3日毎に供給され得、またはモニタリングされている特定の培地構成要素の濃度が所望の範囲の外側にある場合に供給され得る。
動物細胞、例えばCHO細胞は、小規模培養物中で、例えば、約25mlの培地を有する125mlコンテナ中で、約50〜100mlの培地を有する250mlコンテナ中で、約100〜200mlの培地を有する500mlコンテナ中で、培養され得る。あるいは、これらの培養物は、例えば、約300〜1000mlの培地を有する1000mlコンテナ、約500ml〜3000mlの培地を有する3000mlコンテナ、約2000ml〜8000mlの培地を有する8000mlコンテナ、および約4000ml〜15000mlの培地を有する15000mlコンテナなど、大規模であり得る。製造のための培養物は、10,000Lまたはそれ超の培地を含み得る。例えばタンパク質治療剤の臨床的製造のための大規模細胞培養物は、典型的には、細胞が所望のタンパク質(複数可)を生成する間、数日間またはさらには数週間にわたって維持される。この時間の間に、培養物には、培養の過程の間に消費される構成要素、例えば栄養素およびアミノ酸を含む濃縮供給培地が補充され得る。濃縮供給培地は、任意の細胞培養培地処方に基づき得る。かかる濃縮供給培地は、その通常の有用な量の、例えば約5×、6×、7×、8×、9×、10×、12×、14×、16×、20×、30×、50×、100×、200×、400×、600×、800×またはさらには約1000×で、細胞培養培地の構成要素のほとんどを含み得る。濃縮供給培地は、流加培養プロセスで使用される場合が多い。
一部の実施形態では、この細胞培養培地には、細胞増殖またはタンパク質生成の過程の間に、添加物、ユースポイント成分またはユースポイント化学物質としても知られる「ユースポイント添加物」が補充される。ユースポイント添加物には、増殖因子または他のタンパク質、緩衝液、エネルギー供給源、塩、アミノ酸、金属およびキレーターのうちの任意の1種または複数を含む。他のタンパク質には、トランスフェリンおよびアルブミンが含まれる。サイトカインおよびケモカインが含まれる増殖因子は、当技術分野で一般に公知であり、細胞増殖、または一部の場合には細胞分化を刺激することが公知である。増殖因子は通常、タンパク質(例えば、インスリン)、小ペプチド、またはステロイドホルモン、例えばエストロゲン、DHEA、テストステロンなどである。一部の場合には、増殖因子は、細胞増殖(proliferation)またはタンパク質生成を促進する非天然の化学物質、例えば、テトラヒドロフォレート(THF)、メトトレキセートなどであり得る。タンパク質およびペプチド増殖因子の非限定的な例には、アンジオポエチン、骨形成タンパク質(BMP)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮増殖因子(EGF)、エリスロポエチン(EPO)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、増殖分化因子−9(GDF9)、肝細胞増殖因子(HGF)、肝癌由来増殖因子(HDGF)、インスリン、インスリン様増殖因子(IGF)、遊走刺激因子、ミオスタチン(GDF−8)、神経増殖因子(NGF)および他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子(PDGF)、トロンボポエチン(TPO)、トランスフォーミング増殖因子アルファ(TGF−α)、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF−β)、腫瘍壊死因子−アルファ(TNF−α)、血管内皮増殖因子(VEGF)、wntシグナル伝達経路アゴニスト、胎盤増殖因子(PlGF)、胎仔ウシソマトトロピン(somatotrophin)(FBS)、インターロイキン−1(IL−1)、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7などが含まれる。一実施形態では、この細胞培養培地には、ユースポイント添加物増殖因子インスリンが補充される。一実施形態では、培地中のインスリンの濃度、即ち、添加後の細胞培養培地中のインスリンの量は、約0.1μM〜10μMである。1種または複数のユースポイント添加物もまた、一部の実施形態の培地処方中に含まれ得る。
緩衝液は、当技術分野で一般に公知である。本発明は、任意の特定の緩衝液(単数または複数)に限定されず、いずれの当業者も、特定のタンパク質を生成する特定の細胞株との使用に適切な緩衝液または緩衝液系を選択できる。一実施形態では、ユースポイント添加物緩衝液は、NaHCOである。一実施形態では、このユースポイント添加物緩衝液は、NaHCOを含む。別の一実施形態では、この緩衝液はHEPESである。
細胞培養におけるユースポイント添加物としての使用のためのエネルギー供給源もまた、当技術分野で周知である。限定ではなく、一実施形態では、このユースポイント添加物エネルギー供給源は、グルコースである。特定の細胞株および生成されるタンパク質の特定のおよび具体的な要件を考慮して、一実施形態では、このグルコースは、培地中に約1〜20mMの濃度になるように添加され得る。一部の場合には、グルコースは、最大で10g/Lの高いレベルで添加され得る。
キレーターは、細胞培養およびタンパク質生成の分野で同様に周知である。四ナトリウムEDTAの二水和物(dehydrate)およびクエン酸塩は、当技術分野で使用される2種の一般的キレーターであるが、他のキレーターが、本発明の実施において使用され得る。一実施形態では、ユースポイント添加物キレーターは、四ナトリウムEDTA二水和物である。一実施形態では、ユースポイント添加物キレーターは、クエン酸塩、例えばNaである。
一実施形態では、この細胞培養物には、例えばグルタミンなどの1種または複数のユースポイント添加物アミノ酸が補充され得る。一実施形態では、この細胞培養培地には、約1mM〜13mMの最終濃度で、ユースポイント添加物グルタミンが補充される。
他のユースポイント添加物は、種々の金属塩、例えば鉄、ニッケル、亜鉛および銅の塩のうちの1種または複数を含む。一実施形態では、この細胞培養培地には、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化第二鉄(ferric chlroide);および硫酸ニッケルのうちの任意の1種または複数が補充される。
一実施形態では、この細胞培養培地には、以下のユースポイント添加物のうちの任意の1種もしくは複数または全てが補充される:約29.8mΜのNaHCO3、約2mΜのグルタミン、約0.86μΜのインスリン、約11.1mΜのグルコース、約6.54μΜの硫酸亜鉛、約0.168μΜの硫酸銅、約75μΜの塩化第二鉄、約0.639μΜの硫酸ニッケル、約85μΜのEDTAおよび約50μΜのクエン酸塩。
一実施形態では、この培地は、流加プロセスに従う細胞培養の間に間隔を置いて補充される。流加培養は、当技術分野で一般に公知であり、最適化されたタンパク質生成のために使用される(Y.M. Huangら、Biotechnol Prog. 2010年9月〜10月;26巻(5号):1400〜10頁を参照のこと)。
細胞生存度、生存細胞密度および細胞倍加は、オルニチンもプトレシンも含まない培養物中で増殖した細胞と比較して改善される。細胞生存度に関して、OS培地中で増殖した細胞は、非OS培地中で増殖した類似のまたは同一の細胞の生存度よりも、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも100%または少なくとも3倍大きい生存度を示す。
一部の実施形態では、OS培地中での生存哺乳動物細胞の倍加速度は、非OS培地中で培養した哺乳動物細胞の倍加速度よりも、少なくとも5%、少なくとも6%、少なくとも7%、少なくとも8%、少なくとも9%、少なくとも10%、少なくとも11%、少なくとも12%、少なくとも13%、少なくとも14%、少なくとも15%、少なくとも16%、少なくとも17%、少なくとも18%、少なくとも19%、少なくとも20%、少なくとも21%、少なくとも22%、少なくとも23%、少なくとも24%、少なくとも25%、少なくとも26%、少なくとも27%、少なくとも28%、少なくとも29%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%または少なくとも3倍大きい。一部の実施形態では、OS培地中の生存哺乳動物細胞の倍加速度は、非OS培地中の哺乳動物細胞の倍加速度よりも、約10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%または30%大きい。
一部の実施形態では、活発にサイクルしている哺乳動物細胞の倍加時間は、OS培地中で、30時間未満、29時間未満、28時間未満、27時間未満、26時間未満、25時間未満、24時間未満、23時間未満、22時間未満、21時間未満、20時間未満、19時間未満または18時間未満である。一部の実施形態では、活発に増殖している哺乳動物細胞の倍加時間は、OS培地中で28時間未満である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞の倍加時間は、OS培地中で、約27±1時間、約26±1時間、約25±1時間、約24±1時間、約23±1時間、約22±1時間または約21±1時間である。一部の実施形態では、活発にサイクルしている哺乳動物細胞の倍加時間は、OS培地中で約24±1時間である。一部の実施形態では、OS培地中で培養された活発に分裂している細胞の倍加時間は、非OS培地中で培養された活発にサイクルしている細胞の倍加時間よりも、少なくとも15%、少なくとも16%、少なくとも17%、少なくとも18%、少なくとも19%、少なくとも20%または少なくとも25%短い。
タンパク質生成
化学的に規定されたOS培地およびOS培地中で細胞を培養する方法に加えて、本発明は、OS培地中で培養された細胞において、タンパク質、例えば、治療的に有効な抗体または他のバイオ医薬品薬物物質を生成する方法を提供する。
一部の実施形態では、OS培地中で培養された哺乳動物細胞によるタンパク質の生成の速度は、非OS培地中で培養された同一の哺乳動物細胞によるタンパク質の生成の速度よりも、少なくとも5%、10%、15%または20%大きい。一部の実施形態では、OS培地中で培養された細胞におけるタンパク質の生成の速度は、少なくとも1ρg/細胞/日(「PCD」)、少なくとも2PCD、少なくとも3PCD、少なくとも4PCD、少なくとも5PCD、少なくとも6PCD、少なくとも7PCD、少なくとも8PCD、少なくとも9PCD、少なくとも10PCD、少なくとも15PCD、少なくとも20PCD、少なくとも25PCD、少なくとも30PCD、少なくとも35PCD、少なくとも40PCD、少なくとも45PCD、少なくとも50PCD、少なくとも75PCDまたは少なくとも100PCDである。
一部の実施形態では、1リットルの培養培地当たりのタンパク質生成物のグラム数で表され得る、OS培地中で培養された細胞からのこのタンパク質の生成収量または力価は、少なくとも100mg/L、少なくとも1g/L、少なくとも1.2g/L、少なくとも1.4g/L、少なくとも1.6g/L、少なくとも1.8g/L、少なくとも2g/L、少なくとも2.5g/L、少なくとも3g/L、少なくとも、3.5g/L、少なくとも4g/L、少なくとも4.5g/L、少なくとも5g/L、少なくとも5.5g/L、少なくとも6g/L、少なくとも6.5g/L、少なくとも7g/L、少なくとも7.5g/L、少なくとも8g/L、少なくとも8.5g/L、少なくとも9g/L、少なくとも9.5g/L、少なくとも10g/Lまたは少なくとも20g/Lである。
一部の実施形態では、このタンパク質生成物(目的のタンパク質)は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合性抗体断片、単鎖抗体、ディアボディ、トリアボディ(triabody)もしくはテトラボディ(tetrabody)、Fab断片もしくはF(ab’)2断片、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体またはIgG4抗体である。一実施形態では、この抗体はIgG1抗体である。一実施形態では、この抗体はIgG2抗体である。一実施形態では、この抗体はIgG4抗体である。
一部の実施形態では、この目的のタンパク質は、Fc部分および別のドメインを含む組換えタンパク質(例えば、Fc−融合タンパク質)である。一部の実施形態では、Fc−融合タンパク質は、Fc部分にカップリングされた受容体の1つまたは複数の細胞外ドメイン(複数可)のうちの1つまたは複数を含む受容体Fc−融合タンパク質である。一部の実施形態では、このFc部分は、IgGのCH2およびCH3ドメインが後に続くヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、この受容体Fc−融合タンパク質は、単一のリガンドまたは複数のリガンドのいずれかと結合する2つまたはそれ超の別個の受容体鎖を含む。例えば、Fc−融合タンパク質は、trap、例えば、IL−1 trap(例えば、hIgG1のFcに融合されたIl−1R1細胞外領域に融合されたIL−1RAcPリガンド結合領域を含むリロナセプト;その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,927,004号を参照のこと)、またはVEGF trap(例えば、hIgG1のFcに融合されたVEGF受容体Flk1のIgドメイン3に融合されたVEGF受容体Flt1のIgドメイン2を含むアフリベルセプト;米国特許第7,087,411号および米国特許第7,279,159号を参照のこと)などである。
本発明は、タンパク質生成のための任意の特定の型の細胞に限定されない。タンパク質生成に適切な細胞型の例には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、細菌細胞および酵母細胞が含まれる。これらの細胞は、組換え遺伝子発現のためのベクターで形質転換された幹細胞もしくは組換え細胞、またはウイルス生成物を生成するためにウイルスでトランスフェクトされた細胞であり得る。これらの細胞は、目的のタンパク質をコードする組換え異種ポリヌクレオチド構築物を含み得る。この構築物は、エピソームであり得、または細胞のゲノム中に物理的に組み込まれるエレメントであり得る。これらの細胞はまた、異種ポリペプチド構築物上にコードされたそのタンパク質を有することなく、目的のタンパク質を生成し得る。言い換えると、この細胞は、抗体を生成するB細胞のように、目的のタンパク質を天然にコードし得る。これらの細胞は、初代細胞、例えばニワトリ胚細胞、または初代細胞株でもあり得る。有用な細胞の例には、BSC細胞、LLC−MK細胞、CV−1細胞、COS細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK細胞、TCMK−1細胞、LLCPK細胞、PK15細胞、LLC−RK細胞、MDOK細胞、BHK−21細胞、ニワトリ胚細胞、NS−1細胞、MRC−5細胞、WI−38細胞、BHK細胞、293細胞、RK細胞、Per.C6細胞およびCHO細胞が含まれる。種々の実施形態では、この細胞株は、CHO細胞誘導体、例えばCHO−K1、CHO DUX B−11、CHO DG−44、Veggie−CHO、GS−CHO、S−CHOまたはCHO lec変異体株である。
一実施形態では、CHO細胞であるこの細胞は、タンパク質を異所的に発現する。一実施形態では、このタンパク質は、免疫グロブリン重鎖領域、例えばCH1、CH2またはCH3領域を含む。一実施形態では、このタンパク質は、ヒトまたはげっ歯類の免疫グロブリンCH2およびCH3領域を含む。一実施形態では、このタンパク質は、ヒトまたはげっ歯類の免疫グロブリンCH1、CH2およびCH3領域を含む。一実施形態では、このタンパク質は、ヒンジ領域ならびにCH1、CH2およびCH3領域を含む。具体的な一実施形態では、このタンパク質は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む。具体的な一実施形態では、このタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む。具体的な一実施形態では、このタンパク質は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む。具体的な一実施形態では、このタンパク質は、抗体、例えばヒト抗体、げっ歯類抗体またはキメラヒト/げっ歯類抗体(例えば、ヒト/マウス、ヒト/ラットまたはヒト ハムスター)である。
生成期は、個々のフラスコおよびシェーカーフラスコまたはウェイブバッグから、1リットルのバイオリアクタまで、および大規模な個々のバイオリアクタまでの、任意の規模の培養物で実施され得る。大規模プロセスは、約100リットル〜20,000リットルまたはそれ超の体積で実施され得る。いくつかの手段のうちの1つまたは複数、例えば温度シフトまたは化学的誘導が、タンパク質生成を制御するために使用され得る。増殖期は、生成期よりも高い温度で生じ得る。例えば、増殖期は、約35℃〜38℃の第1の温度において生じ得、生成期は、約29℃〜37℃の、任意選択で約30℃〜36℃または約30℃〜34℃の第2の温度において生じ得る。さらに、タンパク質生成の化学的誘導剤、例えばカフェイン、ブチレート、タモキシフェン、エストロゲン、テトラサイクリン、ドキシサイクリンおよびヘキサメチレンビスアセトアミド(HMBA)が、温度シフトと同時発生的に、温度シフトの前に、または温度シフトの後に、添加され得る。誘導剤が温度シフトの後に添加される場合、これらの誘導剤は、温度シフトの1時間後〜5日後、例えば、温度シフトの1〜2日後に添加され得る。生成細胞培養物は、ケモスタットなどにおいて(C. Altamiranoら、Biotechnol Prog. 2001年11月〜12月;17巻(6号):1032〜41頁を参照のこと)、または流加プロセス(Huang、2010年)に従って、連続供給培養系として実行され得る。
本発明は、細胞培養プロセスを介したタンパク質生成を改善するために有用である。本発明において使用される細胞株は、商業的または科学的に興味を持たれるポリペプチドを発現させるために、遺伝子操作され得る。細胞株を遺伝子操作することは、宿主細胞に所望の組換えポリペプチドを発現させるように、組換えポリヌクレオチド分子で細胞をトランスフェクト、形質転換もしくは形質導入すること、または他の方法で変更すること(例えば、相同組換えおよび遺伝子活性化、または組換え細胞と非組換え細胞との融合による)を含む。目的のポリペプチドを発現させるために細胞または細胞株を遺伝子操作するための方法およびベクターは、当業者に周知である;例えば、種々の技術が、Current Protocols in Molecular Biology. Ausubelら、編(Wiley & Sons、New York、1988年および四半期毎の改定);Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Laboratory Press、1989年);Kaufman, R. J.、Large Scale Mammalian Cell Culture、1990年、15〜69頁中に示されている。培養物中での増殖に適切な広範な種々の細胞株は、American Type Culture Collection(Manassas、Va.)および供給業者から入手可能である。産業において一般に使用される細胞株の例には、VERO、BHK、HeLa、CVl(Cosを含む)、MDCK、293、3T3、骨髄腫細胞株(例えば、NSO、NSl)、PC12、WI38細胞およびチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が含まれる。CHO細胞は、複雑な組換えタンパク質、例えばサイトカイン、凝固因子および抗体の生成のために広く使用される(Braselら(1996年)、Blood 88巻:2004〜2012頁;Kaufmanら(1988年)、J.Biol Chem 263巻:6352〜6362頁;McKinnonら(1991年)、J MoI Endocrinol 6巻:231〜239頁;Woodら(1990年)、J Immunol. 145巻:3011〜3016頁)。ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)欠損変異体細胞株(Urlaubら(1980年)、Proc Natl Acad Sci USA 77巻:4216〜4220頁)、DXBl 1およびDG−44が望ましいCHO宿主細胞株であるが、それは、効率的なDHFR選択可能で増幅可能な遺伝子発現系が、これらの細胞において高レベルの組換えタンパク質発現を可能にするからである(Kaufman RJ.(1990年)、Meth Enzymol 185巻:537〜566頁)。さらに、これらの細胞は、接着培養物または懸濁培養物として操作することが容易であり、比較的良好な遺伝的安定性を示す。CHO細胞およびそれらによって組換え発現されたタンパク質は、広範に特徴付けられており、規制機関によって臨床的および商業的製造における使用のために承認されている。一部の実施形態では、このCHO細胞株は、米国特許出願公開第2010/0304436号、米国特許出願公開第2009/0162901号および米国特許出願公開第2009/0137416号、ならびに米国特許第7,455,988号、米国特許第7,435,553号および米国特許第7,105,348号に記載されるような細胞株である。
本発明は、本発明の個々の態様または実施形態の例示として解釈される、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されることはない。機能的に等価な方法および構成要素が、本発明の範囲内である。本明細書に記載されるものに加えて、本発明の種々の改変が、上述の説明および添付の図面から、当業者に明らかである。かかる改変は、本発明の範囲内に入る。
本発明は、無血清細胞培養培地へのオルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの組合せの添加が、増加した細胞増殖、生存度、および目的のタンパク質を発現する組換え操作された動物細胞株(または天然細胞)からのポリペプチド生成を生じ、それによって、培養物の頑強さを増強し、目的のポリペプチドの収量を改善するという発見に、一部基づく。
(実施例1)
改善された生存細胞培養物密度
250mL振盪フラスコに、CHO K1から誘導した組換え抗体生成細胞株の種培養物を接種した。接種した細胞を、36.5℃で7日間増殖させ、3日目および5日目にグルコースを供給した。細胞を、2つの別々の化学的に規定された(加水分解物を含まない無血清の)培地の各々において増殖させた。第1の培地は、約75mMのアミノ酸を含み(培地1)、第2の培地は、約40mMのアミノ酸を含み(培地2)、両方の処方が、2.5μM(0.4mg/L)以下のプトレシンを含んだ。別の群の培地条件を、7.5g/Lの濃度のダイズ加水分解物を培地2に添加することによって生成した。3つの対照培地の各々に、約593μMのオルニチン(100mg/LのL−オルニチン・HClとして)、または約593μMのオルニチン(100mg/LのL−オルニチン・HClとして)および約714μMのプトレシン(115mg/Lのプトレシン・2HClとして)の組合せを添加した。3mL培養物のアリコートを、3日目、5日目および7日目に取り出し、生存細胞計数を、BioProfile FLEX(商標)機器(Nova Biomedical)でトリパンブルー排除を使用して実施した。0日目に、全ての培養物が、1mL当たり0.8×10の生存細胞を含んだ。所与の培地(培地1、培地2または培地2+ダイズ)について、7日の期間にわたる生存細胞計数により、オルニチン(ornitihine)またはオルニチン+プトレシンを補充した培地中で増殖したCHO細胞が、増加した生存細胞密度を有したことが明らかになった。この効果は、7日の期間の間、加水分解物を含まない培地において特に顕著であった(即ち、生存細胞密度における2倍〜4倍またはそれ超の増加)。加水分解物を含まないOS培地2は、ダイズ含有非OS培地2と同等に機能し、ダイズ加水分解物の細胞増殖利益がオルニチン置き換えによって複製できることを示す。オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンを培地2+ダイズに添加することによって増加した細胞密度もまた観察された。結果を表1に示す。
Figure 0006944969
本発明者らはまた、約75mMのアミノ酸および0.4mg/LのプトレシンHClを含む培地3(「培地3」)における生存細胞密度に対する種々の量のオルニチン・HCl(即ち、50mg/mL、100mg/mLおよび150mg/mL)の影響を試験した。CHO K1から誘導した組換え抗体生成細胞株の単一の種訓練培養物を使用して、15mLの作業体積で0.4×10細胞/mLで、50mL TubeSpin(登録商標)Bioreactors(TPP)を接種した。細胞を、37℃インキュベーター中で3日間増殖させた。3mL培養物のアリコートを、3日目に取り出し、生存細胞計数を、BioProfile FLEX(商標)機器(Nova Biomedical)でトリパンブルー排除を使用して実施した。3つ全てのレベルのオルニチンが、2倍よりも僅かに多く、平均して細胞密度を改善した(N=3)。結果を表2に示す。
Figure 0006944969
(実施例2)
改善された細胞培養物の倍加時間
対数増殖期にある、CHO K1細胞から誘導した組換え抗体生成細胞株の倍加時間を、種々の細胞培養培地条件下で決定した。種訓練培養物を、3つの別々の培地:培地1、培地2、およびダイズ加水分解物を含む培地2(培地2+ダイズ)の各々において、14日間の期間にわたって250mLシェーカーフラスコ中で36.5℃で継代した。1mLのアリコートを、0日目および種訓練継代の時点(2日毎または3日毎)で各条件から取り出し、生存細胞計数を、CDV(商標)機器(Nova Biomedical)でトリパンブルー排除を使用して実施した。培地1を、未補充で、または100mg/Lのオルニチン・HClもしくは115mg/Lのプトレシン・2HClおよび100mg/Lのオルニチン・HClの両方を補充して試験した。低プトレシン・2HCl(0.4mg/L)を含む培地2を、未補充で、または100mg/Lのオルニチン・HClもしくは115mg/Lのプトレシン・2HClおよび100mg/Lのオルニチン・HClの両方を補充して試験した。結果を表3および4に示す。プトレシンありまたはなしのいずれかでの培地1へのオルニチン補充が、顕著な増殖を達成するために必要であった。オルニチンまたはオルニチン+プトレシンを、加水分解物を含まない培地2に補充することで、細胞倍加時間は約25%〜30%減少した。倍加時間はまた、加水分解物含有培地2へのオルニチンまたはオルニチン+プトレシンの添加の際に、より小さい程度まで低減された。
Figure 0006944969
Figure 0006944969
(実施例3)
改善された抗体力価
オルニチンまたはオルニチン+プトレシンを含めることが培養物中の細胞増殖(proliferation)および生存細胞密度を改善することを確立してから、本発明者らは、組換えタンパク質生成力価に対するこれらの条件の影響をさらに調査した。本発明者らは、CHO−K1由来細胞株による組換えIgGの発現および分泌を試験した。この実験では、平均抗体力価を、種々の培地形式下の培養物中で7日目に決定した。上記のように、低いプトレシン(0.4mg/Lのプトレシン・2HCl)、オルニチン(100mg/Lのオルニチン・HCl)、ならびにオルニチンおよびプトレシンの両方(100mg/Lのオルニチン・HCl/115mg/Lのプトレシン・2HCl)を含む培地1を試験した。低いプトレシン(0.4mg/Lのプトレシン・2HCl)、オルニチン(100mg/Lのオルニチン・HCl)、ならびにオルニチンおよびプトレシンの両方(100mg/Lのオルニチン・HCl/115mg/Lのプトレシン・2HCl)を含む培地2および培地2+ダイズもまた試験した。全ての場合において、オルニチンまたはオルニチンおよび0.4mg/L超のレベルのプトレシンを含めることは、顕著により高いタンパク質力価、即ち、少なくとも約2倍高い力価を生じた。結果を表5に示す。
Figure 0006944969
本発明者らは、抗体生成に対する、培地3中の種々の量のオルニチン・HCl(即ち、50mg/mL、100mg/mLおよび150mg/mL)の影響もまた試験した。CHO K1から誘導した組換え抗体生成細胞株の単一の種訓練培養物を使用して、15mLの作業体積で0.4×10細胞/mLで、50mL TubeSpin(登録商標)Bioreactors(TPP)に播種した。細胞を、37℃インキュベーター中で3日間増殖させた。3つ全てのレベルのオルニチン補充が、50%よりも僅かに多く、平均して抗体力価を改善した(N=3)。結果を表6に示す。
Figure 0006944969

Claims (13)

  1. アフリベルセプトを発現する細胞を培養するための方法であって、
    (a)0.6±0.09mMのオルニチンおよび0.714±0.11mMのプトレシンを含み、血清および外因性タンパク質加水分解物を含まない細胞培養培地を提供するステップ、および
    (b)前記細胞培養培地中でアフリベルセプトを発現する細胞を成長させるかまたは維持して、細胞培養物を形成するステップ
    を含む、方法。
  2. 前記細胞培養培地が、以下の(a)、(b)、(c)および/または(d):
    (a)(i)≧40±6mMのアミノ酸またはその塩の混合物;
    (ii)アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなるアミノ酸の混合物;
    (b)(i)1種または複数の脂肪酸;または
    (ii)リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸およびオクタン酸からなる群より選択される1種または複数の脂肪酸;
    (c)(i)ヌクレオシドの混合物;
    (ii)アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンのうちの1種または複数を含むヌクレオシドの混合物;または
    (iii)アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチン;
    (d)(i)1種または複数の二価カチオン;
    (ii)マグネシウム、カルシウムまたは両方より選択される1種または複数の二価カチオン;または
    (iii)Ca2+およびMg2+
    を含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、細菌細胞、酵母細胞およびCHO細胞からなる群より選択される、
    請求項1または2に記載の方法。
  4. (a)前記細胞が、前記細胞培養培地中で培養した場合に、≦30時間の平均倍加時間を有する;
    (b)前記細胞が、前記細胞培養培地中で培養した場合に、≦24時間の平均倍加時間を有する;
    (c)前記細胞が、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地において増殖した細胞の平均倍加時間の少なくとも3分の1である平均倍加時間を有する;
    (d)前記細胞培養物が、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも15%大きい生存細胞計数密度に達することが可能である;
    (e)前記細胞培養物が、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも3倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である;ならびに/または
    (f)前記方法が、
    (i)1種または複数のユースポイント添加物、または
    (ii)NaHCO、グルタミン、インスリン、グルコース、CuSO、ZnSO、FeCl、NiSO、Na EDTAおよびクエン酸Naのうちの1種または複数を含み、NaHCO、グルタミン、インスリン、グルコース、CuSO、ZnSO、FeCl、NiSO、Na EDTAおよびクエン酸Naより選択される1種または複数のユースポイント添加物
    を前記細胞培養培地に添加するステップをさらに含む、
    請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  5. アフリベルセプトを生成するための方法であって、
    (a)アフリベルセプトをコードする配列を含む核酸を細胞中に導入するステップ;
    (b)前記核酸を保有する細胞を選択するステップ;
    (c)求項1から4のいずれか一項に記載の方法に従って、選択された前記細胞を培養するステップ;ならびに
    (d)前記細胞において前記アフリベルセプトを発現させるステップであって、前記アフリベルセプトが前記培地中に分泌される、ステップ
    を含む、方法。
  6. 前記細胞が、CHO細胞、293細胞、またはBHK細胞である、請求項5に記載の方法。
  7. (a)前記アフリベルセプトが、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも7%大きい平均7日目力価で生成される;
    (b)前記アフリベルセプトが、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも14%大きい平均7日目力価で生成される;
    (c)前記アフリベルセプトが、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも80%大きい平均7日目力価で生成される;
    (d)前記アフリベルセプトが、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも2倍大きい平均7日目力価で生成される;ならびに/または
    (e)前記アフリベルセプトが、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも3倍大きい平均7日目力価で生成される、
    請求項5または6に記載の方法。
  8. 0.6±0.09mMのオルニチンおよび0.714±0.11mMでプトレシンを含む細胞培養培地中で細胞を培養するステップであって、前記細胞がアフリベルセプトをコードする核酸を含む、ステップ;ならびに
    前記細胞から前記アフリベルセプトを生成するステップ
    を含む、方法。
  9. 前記細胞が、BHK細胞、293細胞、およびCHO細胞からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
  10. BHK細胞、293細胞、およびCHO細胞からなる群より選択されるアフリベルセプトを発現する細胞を提供するステップ;ならびに
    0.6±0.09mMのオルニチンおよび0.714±0.11mMでプトレシンを含む細胞培養培地中で前記細胞を培養するステップ
    を含む、方法。
  11. (a)前記細胞が、前記細胞培養培地中で培養した場合に、≦23時間の平均倍加時間を有する;
    (b)前記細胞が、前記細胞培養培地中で培養した場合に、≦21時間の平均倍加時間を有する;
    (c)前記細胞が、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中で増殖された細胞の平均倍加時間と比較した場合、少なくとも70%減少した平均倍加時間を有する;または
    (d)前記細胞が、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中で増殖された細胞の平均倍加時間と比較した場合、少なくとも22%減少した平均倍加時間を有する、
    請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. (a)前記細胞が、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照培地中で培養された類似の細胞よりも少なくとも15%大きい生存細胞計数密度に達することが可能である;または
    (b)前記細胞が、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中で培養された類似の細胞よりも2倍〜4倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である、
    請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
  13. (a)前記アフリベルセプトが、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均力価よりも少なくとも40%大きい平均最終力価で生成される;または
    (b)前記アフリベルセプトが、2.5μM以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも2倍大きい平均7日目力価で生成される、
    請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
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