BR112015022682B1 - Método para cultivar células e para produzir uma proteína - Google Patents

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Abstract

MEIO PARA CULTURA DE CÉLULA, CULTURA DE CÉLULA, E, MÉTODO PARA CULTIVAR CÉLULAS E PRODUZIR UMA PROTEÍNA. O relatório descritivo descreve um meio para cultura de célula animal livre de soro que pode ser usado para a produção de uma proteína de interesse. Ornitina ou uma combinação de ornitina e putrescina podem ser adicionadas ao meio livre de soro ou meio quimicamente definido para melhorar a densidade celular viável, para reduzir o tempo de duplicação celular e aumentar a produção de uma proteína de interesse.

Description

CAMPO
[001] A invenção refere-se a meios para a cultura de células e para a produção de proteínas recombinantes. A invenção, especificamente, refere-se a meios livres de soro para o cultivo de células CHO recombinantes para a produção de bioterapêuticos de proteína.
FUNDAMENTOS
[002] Meios de cultura de célula que compreende componentes hidrolisados de soro ou proteína (isto é, peptonas e triptonas) têm um histórico longo de uso na produção de proteínas recombinantes a partir das células cultivadas. Estes componentes contêm fatores de desenvolvimento e uma variedade ampla de outros elementos não caracterizados benéficos para o desenvolvimento e cultura de células. Entretanto, estes também contêm elementos não caracterizados que reduzem o desenvolvimento ou, de outra maneira, impactam negativamente a produção de proteína recombinante. Esta também pode ser uma fonte potencial indesejável de variabilidade. A despeito de suas desvantagens, os benefícios de usar os soros e os hidrolisados têm excedido algumas das desvantagens e estes foram amplamente usados em muitas aplicações de cultura de célula.
[003] Os terapêuticos biológicos humanos (biofarmacêuticos) são geralmente produzidos na cultura de célula de mamífero, particularmente cultura de célula CHO. A presença de componentes não caracterizados ou parcialmente caracterizados naquelas culturas celulares são altamente indesejáveis para a fabricação de biofarmacêuticos para o uso humano. O uso de tais componentes não caracterizados ou parcialmente caracterizados são apenas introduz as inconsistências de produção e reguladoras, aumenta a possibilidade de infecção viral ou fúngica da cultura de produção.
[004] A redução da variabilidade lote a lote no rendimento de produto e composição é outro fator importante na seleção de um processo de cultura. Soros, hidrolisados e outros elementos não definidos introduz a variabilidade no rendimento, composição e qualidade de lotes de produção de produtos biofarmacêuticos. A qualidade e a pureza de elementos de meios também podem afetar o rendimento, visto que os tituladores de medicamento frequentemente contam, em parte com a manutenção de um equilíbrio particular de nutrientes. Quando as quantidades relativas de nutrientes variam de um lote de meios para outro, o rendimento de medicamento pode variar e esta variação pode ser inaceitável ou não econômica.
[005] Usando-se soro contendo ou introduz os meios com base em hidrolisado a jusante das mudanças do processamento. A concentração de um produto biofarmacêutico desejado na cultura está, em geral, na ordem de gramas por litro. A presença de soro e hidrolisados em meios podem adicionar mais do que 10 g/L de peptídeos e proteínas não caracterizados, que devem ser removidos nas etapas de processamento subsequentes. O soro e os hidrolisados também podem introduzir a variabilidade na quantidade de metais e outros elementos traço nos meios. A eliminação de soro e hidrolisados a partir dos meios de cultura, portanto, eliminam estas variações e dificuldades potenciais para a produção e processamento de substância de medicamento.
[006] Entre outros, os benefícios de usar meios livres de soro e meios livres de hidrolisado incluem a redução em custo, redução na variabilidade entre os lotes de medicamento e a minimização do risco na introdução e agentes adventícios a partir de componentes não definidos e não refinados. Além disso, quando os meios são definidos e uniformes entre as séries de batelada, a qualificação funciona para testar novas bateladas de meios também são minimizados. Da mesma maneira, existe uma necessidade na técnica quanto a meios para a cultura de células de mamífero, em que os meios são definidos quimicamente e livre de soros e hidrolisados ou que são livres de soro e contêm níveis controláveis baixos de hidrolisados e ainda permitem o desenvolvimento e a manutenção celular saudáveis e robustos e a produção de titulador alta de substância de medicamento biofarmacêutico. SUMÁRIO
[007] Os inventores fizeram a averiguação surpreendente que a inclusão de ornitina, com ou sem putrescina, em meios de cultura de célula que são livres de soros (meios “OS”) aumenta a viabilidade e a densidade celular, reduz o tempo de duplicação celular e permite a produção de proteína tituladora alta por aquelas células. Os inventores também descobriram que os meios OS contendo quantidades baixas ou traço de hidrolisados de proteína ou são quimicamente definidos (isto é, não contêm hidrolisados de proteína) em particular fornece a viabilidade e a densidade celular restauradas, tempo de duplicação celular e produção de proteína tituladora alta.
[008] Em um aspecto, a invenção fornece um meio para cultura de célula, que é livre de soro e compreende pelo menos 0,09 mM de ± 0,014 mM de ornitina. Em uma modalidade, a ornitina está presente no meio em uma concentração que varia de 0,09 ± 0,014 mM a 0,9 ± 0,14 mM, tal como 0,09 ± 0,014 mM, 0,3 ± 0,05 mM, 0,6 ± 0,09 mM ou 0,9 ± 0,14 mM de ornitina. Em algumas modalidades, o meio também contém pelo menos 0,20 ± 0,03 mM de putrescina. Em algumas modalidades, a putrescina adicional está em uma concentração que varia de 0,20 ± 0,03 mM a 0,714 ± 0,11 mM, tal como 0,20 ± 0,03 mM, 0,35 ± 0,06 ou 0,714 ± 0,11 mM de putrescina. Em algumas modalidades, o meio contém < 7,5 g/L de hidrolisado. Em algumas modalidades, o meio é livre de qualquer hidrolisado.
[009] Em uma modalidade, o meio contém um meio de base que é quimicamente definido, tal como uma formulação de costume ou um meio de base comercialmente disponível. Em uma modalidade, o meio completo é quimicamente definido, livre de soro e livre de hidrolisado.
[0010] Em algumas modalidades, o meio, que está em sua concentração útil (isto é, 1X) contém pelo menos 40 ± 6 mM de ou pelo menos 70 ± 10,5 mM de uma mistura de aminoácidos ou sais de aminoácido. Em uma modalidade, o meio contém pelo menos 40 mM de uma mistura de aminoácidos. Nesta ou em outra modalidade, o meio contém pelo menos 70 mM de uma mistura de aminoácidos. Em uma modalidade, a mistura de aminoácidos (com a exceção notável de glutamina, que pode ser adicionado novamente ao meio como um ponto de adição de uso) contém alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
[0011] Em algumas modalidades, o meio contém um ou mais ácidos graxos. Em uma modalidade particular, o meio contém uma mistura de ácidos graxos (ou derivados de ácidos graxos) e alfa tocoferol. Ácidos graxos ou derivados de ácidos graxos são selecionados do grupo que consiste de ácido linoleico, ácido linolênico, ácido tióctico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido láurico, ácido beênico, ácido decanóico, ácido dodecanóico, ácido hexanóico, ácido lignocérico, ácido mirístico e ácido octanóico.
[0012] Em algumas modalidades, o meio contém uma mistura de nucleosídeos. Em uma modalidade, o meio contém adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina.
[0013] Em algumas modalidades, o meio contém uma mistura de sais. Os sais incluem cátions bivalentes, tais como cálcio e magnésio. Em uma modalidade, o meio contém cloreto de sódio e sulfato de magnésio. Outros sais podem incluir aqueles de fosfato.
[0014] Em uma modalidade específica, o meio (1) contém < 7,5 g/L de um hidrolisado, (2) é livre de soro, (3) contém 0,09 ± 0,014 mM, 0,3 ± 0,05 mM, 0,6 ± 0,09 mM ou 0,9 ± 0,14 mM de ornitina, (4) de maneira opcionalmente adicional contém 0,20 ± 0,03 mM, 0,35 ± 0,06 ou 0,714 ± 0,11 mM de putrescina, (5) contém pelo menos cerca de 40 mM de ou pelo menos cerca de 70 mM de uma mistura de aminoácidos incluindo alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina, (6) contém tocoferol e uma mistura de ácidos graxos, (7) contém uma mistura de nucleosídeos incluindo adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina e (8) contém sais de cálcio, magnésio e fosfato.
[0015] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para cultivar células em um meio para cultura de célula, tal como qualquer modalidade do meio descrito no aspecto precedente. Em uma modalidade, o método utiliza as etapas de propagar ou manter uma célula ou células em um meio que (1) contém < 7,5 g/L de hidrolisado ou no hidrolisado, (2) é livre de soros, (3) contém ornitina em uma concentração de pelo menos 0,09 mM de ± 0,014 mM, (4) e, opcionalmente, contém putrescina, tal como pelo menos 0,20 ± 0,03 mM.
[0016] Em algumas modalidades, a célula ou células são células de mamífero, células aviárias, células de inseto, células de levedura ou células de bactérias. Em uma modalidade, as células são células de mamífero úteis na produção de proteínas recombinantes, tais como células CHO ou os derivados CHO-K1. Em algumas modalidades, as células expressam uma proteína de interesse, tal como uma proteína bioterapêutica. A proteína bioterapêutica pode ser uma proteína de ligação de antígeno, que pode conter um domínio Fc. Em algumas modalidades, a proteína de interesse proteína de fusão de Fc de receptor, tal como uma molécula ScFv ou uma molécula de captura. As moléculas de captura incluem VEGF de captura e proteínas IL-1 de captura. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é um anticorpo, tal como um anticorpo monoclonal humanizado, um anticorpo biespecífico ou um fragmento de anticorpo.
[0017] Dando os efeitos positivos no desenvolvimento celular incluindo ornitina ou uma combinação de ornitina e putrescina em meios livres de soro, as células cultivadas de acordo com este método têm um tempo de duplicação médio que não é maior do que 30 horas. Em uma modalidade, o tempo de duplicação celular não é maior do que 24 horas. Em uma modalidade, quando comparado com o desenvolvimento celular em meio contendo menos do que 0,09 ± 0,014 mM de ornitina (ou menor do que 0,09 ± 0,014 mM de ornitina e menor do que 0,2 ± 0,03 mM de putrescina), o desenvolvimento celular de acordo com este método tem um tempo de duplicação médio que é pelo menos um terço do tempo de duplicação da cultura do controle comparador.
[0018] Da mesma maneira, a inclusão de ornitina apenas ou uma combinação de ornitina e putrescina em meios livres de soro permite que as células cultivadas para atingir uma contagem de célula viável mais alta do que sem a inclusão de ornitina ou a combinação de ornitina e putrescina. Em uma modalidade isenta de soro e isenta de hidrolisado do meio OS, a cultura de célula é capaz de atingir uma densidade de contagem celular viável que é pelo menos 15% maior do que uma cultura de célula similar em um meio para cultura de célula similar contendo menos do que 0,09 ± 0,014 mM de ornitina (ou menor do que 0,09 ± 0,014 mM de ornitina e menor do que 0,2 ± 0,03 mM de putrescina). Em outra modalidade isenta de soro e isenta de hidrolisado do meio OS, a cultura de célula é capaz de atingir uma densidade de contagem celular viável que é pelo menos 3 vezes maior do que uma cultura de célula similar em um meio para cultura de célula similar contendo menos do que 0,09 ± 0,014 mM de ornitina (ou menor do que 0,09 ± 0,014 mM de ornitina e menor do que 0,2 ± 0,03 mM de putrescina).
[0019] Em outra modalidade, o método inclui a etapa de adicionar uma ou mais adições de ponto de uso ao meio para cultura de célula. Em algumas modalidades, a adição de ponto de uso é qualquer um ou mais de NaHCO3, glutamina, insulina, glicose, CuSO4, ZnSO4, FeCl3, NiSO4, Na4 EDTA, e citrato de Na3. Em uma modalidade, o método utiliza a etapa de adicionar cada um dos seguintes produtos químicos do ponto de uso ao meio para cultura de célula: NaHCO3, glutamina, insulina, glicose, CuSO4, ZnSO4, FeCl3, NiSO4, Na4 EDTA e Na3 Citrato. Em algumas modalidades, a adição de pontos de uso pode ser incluída no meio no início.
[0020] Em uma modalidade específica, o aspecto fornece um método para cultivar células em um meio livre de soro que contém (1) ornitina em 0,09 ± 0,014 mM, 0,3 ± 0,05 mM, 0,6 ± 0,09 mM ou 0,9 ± 0,14 mM de meio para cultura de célula; (2) de maneira opcionalmente putrescina adicional em 0,20 ± 0,03 mM, 0,35 ± 0,06 ou 0,714 ± 0,11 mM; (3) pelo menos cerca de 40 mM de ou pelo menos cerca de 70 mM de uma mistura de aminoácidos incluindo alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; (4) tocoferol e uma mistura de ácidos graxos; (6) uma mistura de nucleosídeos incluindo adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina e (9) sais de cálcio, magnésio e fosfato, em que as células cultivadas de acordo com este método têm um tempo de duplicação médio que não é maior do que 24 horas ou pelo menos um terço do tempo de duplicação da cultura do controle comparador e as células cultivadas são capazes de atingir uma densidade de contagem celular viável que é pelo menos 15% maior ou pelo menos 3 vezes maior do que uma cultura de célula similar em um meio para cultura de célula similar contendo menos do que 0,09 ± 0,015 mM de ornitina (ou menor do que 0,09 ± 0,014 mM de ornitina e menor do que 0,2 ± 0,03 mM de putrescina). Em outra modalidade, a cultura de célula é capaz de atingir uma densidade de contagem celular viável que é pelo menos 3 vezes maior do que uma cultura de célula similar em um meio para cultura de célula similar contendo menos do que 0,09 ± 0,014 mM de ornitina (ou menor do que 0,09 ± 0,014 mM de ornitina e menor do que 0,2 ± 0,03 mM de putrescina). Em uma modalidade, o meio contém < 7,5 g/L de hidrolisado e em outra modalidade, livre de hidrolisados.
[0021] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir uma proteína de interesse usando-se as etapas de (1) introduzir em uma célula uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse; (2) selecionar uma célula que carrega aquela sequência de ácido nucleico; (3) cultivar a célula selecionada em uma modalidade do meio para cultura de célula livre de soro descrito no primeiro aspecto ou de acordo com qualquer modalidade do método descrito na segunda etapa e (4) expressar a proteína de interesse na célula, em que a proteína de interesse é secretada no meio. Em algumas modalidades, a célula usada na produção da proteína é uma célula de mamífero capaz de produzir um produto bioterapêutico, tal como CHO, 293 e célula BHK ou quaisquer derivados dos mesmos. Em uma modalidade, a célula é uma célula CHO, tal como uma célula CHO-K1.
[0022] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína que tem um domínio Fc. Em alguns casos, aquelas duas proteínas de interesse podem se sobrepor, tal como no caso de uma fusão de receptor de Fc, um anticorpo e uma proteína ScFv, por exemplo. Da mesma maneira, em algumas modalidades, a proteína de interesse é um anticorpo, tal como um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado, um fragmento de anticorpo, tal como um Fab ou F(ab’)2, um anticorpo biespecífico, uma molécula de captura, tal como um VEGF-De captura ou um IL-1-De captura, uma molécula ScFv, uma fusão de TCR-Fc solúvel ou semelhante.
[0023] Em uma modalidade, a proteína de interesse é capaz de ser produzida em um titulador do dia sete médio que é pelo menos 7% maior, pelo menos 14% maior, pelo menos 80% maior, pelo menos duas vezes maior ou pelo menos três vezes maior do que o titulador do dia sete médio produzido por uma célula similar em um meio para cultura de célula livre de soro contendo menos do que 0,09 ± 0,014 mM de ornitina (ou menor do que 0,09 ± 0,014 mM de ornitina e menor do que 0,2 ± 0,03 mM de putrescina) (meio “não OS”).
[0024] Em uma modalidade específica, a proteína de interesse é produzida por (1) introduzir em uma célula CHO, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse, tal como um anticorpo ou outra proteína de ligação de antígeno; (2) selecionar uma célula que carrega aquela sequência de ácido nucleico; (3) cultivar a célula selecionada em um meio para cultura de célula livre de soro que contém (a) ornitina em 0,09 ± 0,014, 0,3 ± 0,05 mM, 0,6 ± 0,09 mM ou 0,9 ± 0,14 mM; (b) de maneira opcionalmente putrescina adicional em 0,20 ± 0,03 mM, 0,35 ± 0,06 ou 0,714 ± 0,11 mM; (c) pelo menos 40 mM de ou pelo menos 70 mM de uma mistura de aminoácidos incluindo: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina; (d) tocoferol e uma mistura de ácidos graxos; (e) uma mistura de nucleosídeos incluindo adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina e (f) sais de cálcio, magnésio e fosfato e (d) que expressa a proteína de interesse na célula CHO, em que a proteína de interesse é secretada no meio. Em algumas modalidades, o meio para cultura de célula livre de soro pode incluir < 7,5 g/L de hidrolisados ou em outras modalidades nos hidrolisados em todos.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0025] Os requerentes fizeram a averiguação surpreendente que a adição de ornitina ou uma combinação de ornitina e putrescina (“meio OS”) melhora a densidade celular viável, tempo de duplicação celular e produção de proteína por uma célula em uma cultura de célula com relação a um meio livre de soro contendo muito pouca ou nenhuma ornitina ou pouca ou nenhuma de uma combinação de ornitina e putrescina (“meio não OS”).
[0026] Antes das presentes culturas celulares e métodos serem descritos, deve ser entendido que esta invenção não é limitada a métodos particulares e condições experimentais descritas, como tais métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrever modalidades particulares apenas e não é pretendido ser limitante.
[0027] A não ser que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste pedido têm o mesmo significado como comumente entendido como comumente entendido por uma pessoa habilitada na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste pedido podem ser usados na prática ou teste da presente invenção, certos métodos específicos e materiais são agora descritos. Unidades, prefixos e símbolos podem ser indicados em sua forma aceita SI. As faixas numéricas citadas aqui são parênteses abertos, significando que estes incluem os números que definem as faixas. A não ser que observado de outra maneira, os termos “um” ou “uma” devem ser construídos como significando “pelo menos um de”. Os cabeçalhos da seção usada aqui são para os propósitos organizacionais apenas e não devem ser construídos como limitantes do assunto descrito. Os métodos e técnicas descritos aqui são, em geral, realizados de acordo com métodos convencionais conhecidos na técnica e como descrito em vários métodos gerais e referências mais específicas que são citadas e debatidas por todo o presente relatório descritivo a não ser que indicado de outra maneira. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), and Julio E. Celis, Cell Biology: A Laboratory Handbook, 2nd ed., Academic Press, New York, N.Y. (1998) e Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1995). Todas as publicações mencionadas por toda esta divulgação são incorporadas aqui por referência em sua totalidade. DEFINIÇÕES
[0028] Como usado aqui "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são usados de maneira intercambiável e referem-se a uma molécula que compreende dois ou mais resíduos de aminoácido unidos um ao outro por uma ligação de peptídeo. Os Peptídeos, polipeptídeos e proteínas também podem incluir modificações, tais como glicosilação, ligação de lipídeo, sulfatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, alquilação, hidroxilação e ADP-ribosilação. Peptídeos, polipeptídeos e proteínas podem ser de interesse científico e comercial, incluindo, medicamentos com base em proteína. Peptídeos, polipeptídeos e proteínas incluem, entre outras coisas, anticorpos e proteínas quiméricas ou de fusão. Peptídeos, polipeptídeos e proteínas são produzidos por linhas de célula animal recombinante usando-se métodos de cultura de célula.
[0029] O termo “sequência de polinucleotídeo heterólogo”, como usado aqui, refere-se a polímeros de ácido nucleico que codificam as proteínas de interesse, tais como proteínas quiméricas (como moléculas de captura), anticorpos ou porções de anticorpo (por exemplo, VH, VL, CDR3) que são produzidos como uma substância de medicamento biofarmacêutico. A sequência de polinucleotídeo heterólogo pode ser fabricada por técnicas de engenharia genética (por exemplo, tal como uma sequência que codifica uma proteína quimérica ou uma sequência otimizada por códon, uma sequência sem íntron, et cetera) e introduzido na célula, quando este pode residir como um epissoma ou ser integrado no genoma da célula. A sequência de polinucleotídeo heterólogo pode ser uma sequência de ocorrência natural que é introduzida em um local ectópico dentro do genoma da célula de produção. A sequência de polipeptídeo heterólogo pode ser uma sequência de ocorrência natural a partir de outro organismo, tal como uma sequência que codifica um ortólogo humano.
[0030] “Anticorpo” refere-se a uma molécula de imunoglobulina que consiste de quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves interconectadas (L) por ligações de bissulfeto. Cada cadeia pesada tem uma região variável de cadeia pesada (HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada contém três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve tem uma região variável de cadeia leve e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve consiste de um domínio (CL). As regiões VH e VL ainda podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinadoras de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL são compostos de três CDRs e quatro FRs, dispostos de terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. O termo "anticorpo" inclui referência tanto a imunoglobulinas glicosiladas quanto não glicosiladas de qualquer isotipo ou subclasse. O termo "anticorpo" inclui moléculas de anticorpo preparadas, expressadas, criadas ou isoladas por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de uma célula hospedeira transfectada para expressar o anticorpo. O termo anticorpo também inclui anticorpo biespecífico, que inclui uma imunoglobulina heterotetramétrica que pode ligar-se a mais do que um epítopo diferente. Os anticorpos biespecíficos são, em geral, descritos na Publicação do Pedido de Patente US N° 2010/0331527, que é incorporado por referência neste pedido.
[0031] O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo (ou “fragmento de anticorpo”), refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade para a ligação específica a um antígeno. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste dos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de bissulfeto na região de junta; (iii) um fragmento Fd que consiste dos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste dos domínios VL e VH de um membro simples de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), que consiste de um domínio de VH, (vi) um CDR isolado e (vii) um scFv, que consiste dos dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, unidos por um ligante sintético para formar uma cadeia de proteína simples e que o par de regiões de VL e VH para formar moléculas monovalentes. Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como os diacorpos também estão abrangidos sob o termo “anticorpo” (ver, por exemplo, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).
[0032] Ainda, um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo pode ser parte de uma molécula de imunoadesão maior, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo ou porção de anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídeos. Os exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem o uso da região de núcleo de estreptavidina para a fabricação de uma molécula de scFv tetramétrica (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) e uso de um resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e um rótulo de poliistidina de terminal C para fabricar moléculas de scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Porções de anticorpo, tais como, fragmentos Fab e F(ab')2, podem ser preparadas a partir de anticorpos totais usando-se técnicas convencionais, tais como por intermédio da digestão de papaína ou pepsina de anticorpos totais. Além disso, os anticorpos, porções de anticorpo e moléculas de imunoadesão podem ser obtidos usando-se técnicas de DNA recombinante padrão comumente conhecidas na técnica (ver Sambrook et al., 1989).
[0033] O termo "anticorpo humano” é pretendido incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinativa. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica de local in vitro ou pela mutação somática in vivo), por exemplo, nos CDRs e, em particular, CDR3. Entretanto, o termo "anticorpo humano", como usado aqui, não é pretendido incluir anticorpos em que as sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas nas sequências de estrutura humanas.
[0034] O termo "anticorpo humano recombinante", como usado aqui, é pretendido incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressados, criados u isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressados usando-se um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano combinatório recombinante, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico quanto a genes de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressados, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem a união de sequências de gene de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivados de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Em certas modalidades, entretanto, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um transgênico animal para sequências de IgG humanas é usado, mutagênese somática in vivo) e, da mesma maneira, as sequências de aminoácido das regiões de VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, enquanto derivados e relacionados às sequências VH e VL de linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linha germinativa humana de anticorpo in vivo.
[0035] As “proteínas de fusão de Fc” compreendem partes ou todas de duas ou mais proteínas, uma das quais é a porção de Fc de uma molécula de imunoglobulina, que não são, de outra maneira, encontradas juntas na natureza. A preparação de proteínas de fusão que compreende certos polipeptídeos heterólogos fundidos a várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpo (incluindo o domínio de Fc) foi descrito, por exemplo, por Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; and Hollenbaugh et al., "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", em Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10,19.1 - 10,19.11, 1992. “Receptor proteínas de fusão de Fc” compreende um ou mais domínios extracelulares de um receptor ligado a uma porção Fc, que em algumas modalidades compreende uma região de junta seguida por um domínio CH2 e CH3 de uma imunoglobulina. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de Fc contém duas ou mais cadeias de receptor distintas que ligam a um ou mais ligantes. Por exemplo, uma proteína de fusão de Fc é uma de captura, tal como, por exemplo, uma IL-1 de captura (por exemplo, rilonacept, que contém a região de ligação de ligando IL-1RAcP fundida à região extracelular de IL-1R1 a Fc de hIgG1; ver Patente U. S. N° 6,927,004) ou um VEGF de captura (por exemplo, aflibercept, que contém o domínio de Ig 2 do receptor VEGF Flt1 fundido ao domínio Ig 3 do receptor de VEGF Flk1 fundido a Fc de hIgG1; ver a Patente U.S. N° 7,087,411 and 7,279,159).
MEIOS
[0036] A presente invenção fornece um meio livre de soro que é útil nas células de cultura e produção de uma substância de medicamento biofarmacêutico. "Livre de soro" aplica-se a um meio para cultura de célula que não contém soros animais, tais como soro fetal bovino. Os meios livres de soro podem conter < 7,5 g/L de hidrolisados, tais como hidrolisado de soja. A presente invenção também fornece meios quimicamente definidos, que não é apenas livre de soro, mas também livres de hidrolisado. "Livre de hidrolisado" aplica-se a meios de cultura de célula não contendo hidrolisados de proteína exógena tais como hidrolisados de proteína animal ou vegetal tais como, por exemplo, peptonas, triptonas e outros.
[0037] A eliminação de soro e a redução ou a eliminação de hidrolisados a partir de meios de cultura de célula, enquanto reduz-se a variabilidade lote a lote e intensifica as etapas de processamento a jusante, infelizmente diminui o desenvolvimento celular, viabilidade e expressão de proteína. Da mesma maneira, os meios livres de soro quimicamente definidos com baixo teor ou nenhum hidrolisado requerem ingredientes adicionais para melhorar o desenvolvimento celular e a produção de proteína. Um meio celular de cultura da invenção pode ser complementado com ingredientes adicionais, tais como poliaminas ou concentrações aumentadas de componentes como aminoácidos, sais, açúcares, vitaminas, hormônios, fatores de desenvolvimento, tampões, antibióticos, lipídeos, elementos traço e outros, dependendo dos requerimentos das células a serem cultivas ou os parâmetros de cultura de célula desejados. Especificamente, o meio para cultura de célula aqui, é complementado cm ornitina, putrescina ou ambos (“meios OS”) para melhorar o desenvolvimento celular, viabilidade celular e produção de proteína recombinante.
[0038] Em algumas modalidades, o meio OS contém ornitina em uma concentração (expressada em micromols por litro) de pelo menos cerca de 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 568, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580,581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595,596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610,611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650,700, 750, 800, 850 ou 900 μ M.
[0039] Em algumas modalidades, os meios contêm ornitina em uma concentração de cerca de 85, 90, 95, 100, 105, 110, 113 ou 115 μM. Em uma modalidade, o meio contém 100 μM ± 15 μM ornitina. Em uma modalidade, o meio contém 15 mg/L ± 2,25 mg/L de ornitina • HCl.
[0040] Em algumas modalidades, os meios contêm ornitina em uma concentração de cerca de 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340 ou 345 μM. Em uma modalidade, o meio contém 300 μM ± 45 μM ornitina. Em uma modalidade, o meio contém 50 mg/L ± 7,5 mg/L de ornitina • HCl.
[0041] Em algumas modalidades, os meios contêm ornitina em uma concentração de cerca de 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685 ou 690 μM. Em uma modalidade, o meio contém 600 μM ± 90 μM ornitina. Em uma modalidade, o meio contém 100 mg/L ± 15 mg/L de ornitina • HCl.
[0042] Em algumas modalidades, os meios contêm ornitina em uma concentração de 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, 1,000, 1,005, 1,010, 1,015, 1,020, 1,025, 1,030 ou 1,035 μM. Em uma modalidade, o meio contém 900 μM ± 135 μM ornitina. Em uma modalidade, o meio contém 150 mg/L ± 22,5 mg/L de ornitina • HCl.
[0043] A Putrescina pode ser opcionalmente adicionada aos meios suplementados com ornitina. A Putrescina foi incluída, em concentrações muito baixas, como um componente em algumas formulações de meios de cultura de célula; ver, por exemplo, WO 2005/028626, que descreve 0,02 a 0,08 mg/L de putrescina; Patente US N° 5,426,699 (0,08 mg/L); Patente US N° RE30,985 (0,16 mg/L); Patente US N° 5,811,299 (0,27 mg/L); Patente US N° 5,122,469 (0,5635 mg/L); Patente US N° 5,063,157 (1 mg/1); WO 2008/154014 (~100 μM - ~ 1000 μM); Pedido de Patente US N° 2007/0212770 (0,5 a 30 mg/L de poliamina; 2 mg/L de putrescina; 2 mg/L de putrescina + 2 mg/L de ornitina; 2 mg/L de putrescina + 10 mg/L de ornitina).
[0044] Em algumas modalidades, os meios contêm uma combinação de ornitina e putrescina, em que a putrescina pode estar em uma concentração de pelo menos cerca de 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 260, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405 ou 410 μM.
[0045] Em algumas modalidades, os meios contêm putrescina em uma concentração de cerca de 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225 ou 230 μM. Em uma modalidade, o meio contém 200 μM ± 30 μM putrescina além de > 90 μM ± 14 μM de ornitina. Em uma modalidade, o meio contém 30 mg/L ± 4,5 mg/L putrescina • 2HCl além de > 15 mg/L ± 2,25 mg/L de ornitina • HCl.
[0046] Em algumas modalidades, os meios contêm putrescina em uma concentração de cerca de 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400 ou 405 μM. Em uma modalidade, o meio contém 350 μM ± 52,5 μM putrescina além de > 90 μM ± 14 μM ornitina. Em uma modalidade, o meio contém 57 mg/L ± 8,55 mg/L putrescina • 2HCl além de > 15 mg/L ± 2,25 mg/L de ornitina • HCl.
[0047] Em algumas modalidades, os meios contêm putrescina em uma concentração de cerca de 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640,645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800 ou 805 μM. Em uma modalidade, o meio contém 714 μM ± 105 μM putrescina além de > 90 μM ± 14 μM ornitina. Em uma modalidade, o meio contém 115 mg/L ± 17,25 mg/L putrescina • 2HCl além de > 15 mg/L ± 2,25 mg/L de ornitina • HCl.
[0048] Em algumas modalidades, os meios contêm uma concentração em pares de qualquer concentração de putrescina e ornitina listada acima. Em algumas modalidades, os meios contêm qualquer combinação em pares de cerca de 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800 ou 805 μM de putrescina e cerca de 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685 ou 690 μM de ornitina. Por exemplo, os meios em uma modalidade, contém cerca de 700 μM putrescina mais qualquer um de 510, 511, 512 μM, et sequens de ornitina ou 701 μM putrescina mais qualquer um de 510, 511, 512 μM, et sequens de ornitina; et cetera. Também, por exemplo, os meios uma modalidade, contém cerca de 600 μM de ornitina mais qualquer um de 700, 701, 702 μM, et sequens de putrescina ou 601 μM de ornitina mais qualquer um de 700, 701, 702 μM, et sequens de putrescina; et cetera. Em algumas modalidades, os meios contêm 702 μM ± 106 μM de putrescina + 593 μM ± 89 μM de ornitina. Em uma modalidade particular, os meios contêm cerca de 714 μM de putrescina e 593 μM de ornitina. Em uma modalidade, os meios contêm 115 mg/L ± 17 mg/L de putrescina • 2HCl e 100 mg/L ± 15 mg/L de ornitina • HCl. Em uma modalidade particular, os meios contêm 115 mg/L de putrescina • 2HCl e 100 mg/L de ornitina • HCl.
[0049] Em uma modalidade e além da inclusão de ornitina ou putrescina, os meios contêm uma mistura de nucleosídeos em uma concentração cumulativa de pelo menos 50 μ M, pelo menos 60 μ M, pelo menos 70 μ M, pelo menos 80 μ M, pelo menos 90 μ M, pelo menos 100 μ M, pelo menos 110 μM, pelo menos 115 μM, pelo menos 120 μM, pelo menos 125 μM, pelo menos 130 μM, pelo menos 135 μM, pelo menos 140 μM, pelo menos 145 μM, pelo menos 150 μM, pelo menos 155 μM, pelo menos 160 μM, pelo menos 165 μM ou pelo menos 170 μM. Em uma modalidade, os meios contêm cerca de 174 μM ± 26 μM de nucleosídeo. Em uma modalidade, os meios contêm derivados de purina em uma concentração cumulativa de pelo menos 40 μM, pelo menos 45 μM, pelo menos 50 μM, pelo menos 55 μM, pelo menos 60 μM, pelo menos 65 μM, pelo menos 70 μM, pelo menos 75 μM, pelo menos 80 μM, pelo menos 85 μM, pelo menos 90 μM, pelo menos 95 μM, pelo menos 100 μM ou pelo menos 105 μM. Em uma modalidade, os meios contêm cerca de 106 μM ± 5 μM de derivados de purina. Os derivados de purina incluem hipoxantina e os nucleosídeos adenosina e guanosina. Em uma modalidade, os meios contêm derivados de pirimidina em uma concentração cumulativa de pelo menos 30 μM, pelo menos 35 μM, pelo menos 40 μM, pelo menos 45 μM, pelo menos 50 μM, pelo menos 55 μM, pelo menos 60 μM ou pelo menos 65 μM. Em uma modalidade, os meios contêm cerca de 68 μM ± 5 μM de derivados de pirimidina. Os derivados de pirimidina incluem os nucleosídeos timidina, uridina e citidina. Em uma modalidade particular, os meios contêm adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina.
[0050] Além da inclusão de ornitina ou putrescina, em uma modalidade, os meios também contêm aminoácidos em uma concentração cumulativa de pelo menos 40 mM, em que a quantidade de glutamina não está incluída no cálculo do total cumulativo. Em uma modalidade, a glutamina não está incluída nos meios, mas pode ser fornecido como uma “adição de ponto de uso” aos meios durante a cultura de células, tais como durante a produção de proteína. Da mesma maneira, em algumas modalidades, tal como no método para célula de cultura ou o método para a produção de uma proteína de interesse, os meios podem ser complementados com glutamina como uma adição de ponto de uso. Em uma tal modalidade, a glutamina é adicionada em uma quantidade menor do que cerca de 40 mM, menor do que cerca de 35 mM, menor do que cerca de 30 mM, menor do que cerca de 25 mM, menor do que cerca de 20 mM, menor do que cerca de 15 mM, menor do que cerca de 10 mM, menor do que cerca de 8 mM, menor do que cerca de 7 mM, menor do que cerca de 6 mM, menor do que cerca de 5 mM, menor do que cerca de 4 mM, menor do que cerca de 3 mM ou menor do que cerca de 2,5 mM. Em uma modalidade, a quantidade de glutamina nos meios que foram complementados com glutamina é de cerca de 2 mM ± 0,5 mM.
[0051] Em uma modalidade, além da inclusão de ornitina ou uma combinação tanto de ornitina quanto de putrescina, os meios também contêm aminoácidos tendo um grupo secundário não polar em uma concentração de pelo menos 15 mM, pelo menos 24 mM, pelo menos 25 mM, pelo menos 26 mM, pelo menos 27 mM, pelo menos 28 mM, pelo menos 29 mM ou pelo menos 30 mM. Em uma modalidade, os meios contêm cerca de 30 mM de aminoácidos tendo um grupo secundário não polar. Em uma modalidade, da quantidade total de aminoácidos por mol contido dentro dos meios, pelo menos 32%, pelo menos 33%, pelo menos 34%, pelo menos 35%, pelo menos 36%, pelo menos 37%, pelo menos 38%, pelo menos 39%, pelo menos 40% ou pelo menos 41% são aminoácidos tendo grupos secundários não polares. Em uma modalidade, cerca de 42% ± 1% por mol dos aminoácidos nos meios são aminoácidos tendo um grupo secundário não polar. Os aminoácidos tendo um grupo secundário não polar incluem alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina.
[0052] Em uma modalidade, além da inclusão de ornitina ou uma combinação tanto de ornitina quanto putrescina, os meios também contêm aminoácidos tendo um grupo secundário polar não carregado em uma concentração de cerca de 10 mM a 34 mM, cerca de 11 mM a 33 mM, cerca de 12 mM a 32 mM, cerca de 13 mM a 31 mM, cerca de 14 mM a 30 mM, cerca de 15 mM a 29 mM, cerca de 16 mM a 28 mM, cerca de 17 mM a 27 mM, cerca de 18 mM a 26 mM, cerca de 19 mM a 25 mM, cerca de 20 mM a 24 mM, cerca de 21 mM a 23 mM ou cerca de 22 mM. Em uma modalidade, o meio contém cerca de 22 mM de aminoácidos tendo um grupo secundário polar não carregado. Em outra modalidade, o meio contém cerca de 12 mM de aminoácidos tendo um grupo secundário polar não carregado. Em uma modalidade, da quantidade total por mol de aminoácidos contidos com os meios, cerca de 14% a 46%, cerca de 15% a 45%, cerca de 16% a 44%, cerca de 17% a 43%, cerca de 18% a 42%, cerca de 19% a 41%, cerca de 20% a 40%, cerca de 21% a 39%, cerca de 22% a 38%, cerca de 23% a 37%, cerca de 24% a 36%, cerca de 25% a 35%, cerca de 26% a 34%, cerca de 27% a 33%, cerca de 28% a 32%, cerca de 29% a 31% ou cerca de 30% são aminoácidos tendo grupos secundários polares não carregados. Em uma modalidade, cerca de 30% ± 3% por mol dos aminoácidos nos meios são aminoácidos tendo um grupo secundário polar não carregado. Os aminoácidos tendo um grupo secundário polar não carregado incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina.
[0053] Em uma modalidade, além da inclusão de ornitina ou uma combinação tanto de ornitina quanto putrescina, os meios também contêm aminoácidos têm uma carga negativa em pH 6 (isto é, aminoácidos ácidos) em uma concentração de cerca de 4 mM a 14 mM, cerca de 5 mM a 13 mM, cerca de 6 mM a 12 mM, cerca de 7 mM a 11 mM, cerca de 8 mM a 10 mM, cerca de 9 mM ou cerca de 4 mM. Em uma modalidade, os meios contêm cerca de 9 mM de aminoácidos ácidos. Em uma modalidade, os meios contêm 9 mM ± 1 mM de aminoácidos ácidos. Em uma modalidade, da quantidade total por mole de aminoácidos contidos dentro dos meios, cerca de 8% a 18%, cerca de 9% a 17%, cerca de 10% a 16%, cerca de 11% a 15%, cerca de 12% a 14% ou cerca de 13% são aminoácidos ácidos. Em uma modalidade, cerca de 12,6% ± 1% por mol dos aminoácidos nos meios são aminoácidos ácidos. Os aminoácidos ácidos incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.
[0054] Em uma modalidade, em adição a inclusão de ornitina ou uma combinação tanto de ornitina quanto putrescina, o meio também contém aminoácidos tendo uma carga positiva ao pH 6 (isto é, aminoácidos básicos) em uma concentração de pelo menos 3,5 mM, pelo menos 4 mM, pelo menos 5 mM, pelo menos 6 mM, pelo menos 7 mM, pelo menos 8 mM, pelo menos 9 mM, pelo menos 10 mM ou pelo menos 11 mM. Em uma modalidade, os meios contêm cerca de 11 mM de aminoácidos básicos. Em uma modalidade, os meios contêm cerca de 11,42 mM ± 1 mM dos aminoácidos básicos. Em uma modalidade, da quantidade total por mol de aminoácidos contidos dentro do meio, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14% ou pelo menos 15% são aminoácidos básicos. Em uma modalidade, cerca de 16% por mol dos aminoácidos no meio são aminoácidos básicos. Em uma modalidade, cerca de 15,8% ± 2,4% por mol dos aminoácidos no meio são aminoácidos básicos. Em uma modalidade, cerca de 21% ± 3,2% por mol dos aminoácidos no meio são aminoácidos básicos. Os aminoácidos básicos incluem lisina, arginina e histidina.
[0055] Em uma modalidade, em adição a inclusão de ornitina ou uma combinação tanto de ornitina quanto putrescina, o meio também contém cerca de 30 mM aminoácidos não polares, cerca de 22 mM aminoácidos polares não carregados, cerca de 9 mM dos aminoácidos ácidos e cerca de 11 mM de aminoácidos básicos. Em uma modalidade, dos aminoácidos no meio cerca de 42% por mol são aminoácidos não polares, cerca de 30% por mol são aminoácidos polares não carregados, cerca de 13% por mol são aminoácidos ácidos e cerca de 16% por mol são aminoácidos básicos.
[0056] Em adição a inclusão de ornitina ou uma combinação tanto de ornitina quanto putrescina, em uma modalidade, os meios contém quantidades micromolares dos ácidos graxos (ou derivados de ácido graxo) e tocoferol. Em uma modalidade, os ácidos graxos incluem qualquer um ou mais de ácido linoleico, ácido linolênico, ácido tióctico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido araquidônico, ácido láurico, ácido beênico, ácido decanóico, ácido dodecanóico, ácido hexanóico, ácido lignocérico, ácido mirístico e ácido octanóico. Em uma modalidade, os meios contêm tocoferol, ácido linoleico e ácido tióctico.
[0057] Em uma modalidade, o meio também contém uma mistura de vitaminas, que incluem outros nutrientes e nutrientes essenciais, em uma concentração cumulativa de pelo menos cerca de 700 μM ou pelo menos cerca de 2 mM. Em uma modalidade, a mistura de vitaminas contém um ou mais de D-biotina, cloreto de colina, ácido fólico, mio-inositol, niacinamida, piridoxina HCl, ácido D-pantotênico (hemiCa), riboflavina, tiamina HCl, vitamina B12 e outros. Em uma modalidade, a mistura de vitaminas inclui todos de D-biotina, cloreto de colina, ácido fólico, mio-inositol, niacinamida, piridoxina HCl, ácido D-pantotênico (hemiCa), riboflavina, tiamina HCl e vitamina B12.
[0058] Várias modalidades do meio da invenção incluem qualquer uma das combinações das modalidades descritas acima, incluindo meios livres de soro livres hidrolisados quimicamente definidos que compreende ornitina ou putrescina nas quantidades indicadas, mais inter alia (a) aminoácidos; (b) opcionalmente nucleosídeos; (c) sais de cátions bivalentes; (d) ácidos graxos e tocoferol; e (e) vitaminas. Em algumas modalidades, todas as quantidades menores de hidrolisados podem ser adicionados ao meio OS.
[0059] Os requerentes preveem que, na prática da mesma invenção, qualquer uma ou mais de uma variedade do meio de base ou combinações dos mesmos, em que a ornitina ou uma combinação tanto de ornitina quanto putrescina são adicionadas, podem ser usadas. Os meios de base são geralmente conhecidos na técnica e incluem inter alia Eagle’s MEME (meio essencial mínimo) (Eagle, Science, 1955, 112(3168):501-504), Ham’s F12 (Ham, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 1965, 53:288-293), meio F-12 K, meio Dulbecco, meio Eagle modificado por Dulbecco (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1952 August; 38(8): 747-752), DMEM/ Ham’s F12 1:1, Trowell’s T8, meio A2 Holmes and Wolf, Biophys. Biochem. Citol., 1961, 10:389-401), meio Waymouth (Davidson and Waymouth, Biochem. J., 1945, 39(2):188-199), meio Williams E (William’s et al., Exp. Cell Res., 1971, 69:105 et seq.), RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc., 1967, 199:519-524), meio MCDB 104/110 (Bettger et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 1981, 78(9):5588-5592), meio Ventrex HL-1, meio de albumina-globulina (Orr et al., Appl. Microbiol., 1973, 25(1):49-54), meio RPMI- 1640, meio RPMI- 1641, meio Dulbecco modificado por Iscove, meio McCoy's 5 A, meio Leibovitz's L- 15 e meios livres de soro tais como séries EX-CELL™ 300 (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), meio de protamina-zinco-insulina (Weiss et al., 1974, US 4.072.565), meio de biotina-folato (Cartaya, 1978, US Re30.985), meio de ácido graxo-Transferrina (Baker, 1982, US 4.560.655), meio de transferrina-EGF (Hasegawa, 1982, US 4.615.977; Chessebeuf, 1984, US 4.786.599) e outras trocas de meio (ver Inlow, US 6.048.728; Drapeau, US 7.294.484; Mather, US 5.122.469; Furukawa, US 5.976.833; Chen, US 6.180.401; Chen, US 5.856.179; Etcheverry, US 5.705.364; Etcheverry, US 7.666.416; Ryll, US 6.528.286; Singh, US 6.924.124; Luan, US 7.429.491; e outros).
[0060] Em uma modalidade particular, o meio é quimicamente definido e contém em adição a uma ornitina ou combinação tanto de ornitina quanto putrescina: CaCl2 2H2O; tampão de HEPES, KCl; MgSO4; NaCl; Na2HPO4 ou outros sais de fosfato; piruvato; L-alanina; L-arginina HCl; L- asparagina H2O; L-ácido aspártico; L-cisteína HCl H2O; L-ácido glutâmico;Glicina; L-histidina HCl H2O; L-isoleucina; L-leucina; L-lisina HCl; L- metionina; L-ornitina HCl; L-fenilalanina; L-prolina; L-serina; L-treonina; L- triptofano; L-tirosina 2Na 2 H2O; L-valina; D-biotina; cloreto de colina; ácido fólico; mio-inositol; niacinamida; piridoxina HCl; ácido D-pantotênico; riboflavina; tiamina HCl; vitamina B12; ácido p-aminobenzóico; etanolamina HCl; Plurônico F68; fosfato de DL-a-tocoferol; ácido linoleico; Na2SeO3; ácido tióctico; e glicose; e opcionalmente adenosina; guanosina; citidina; uridina; timidina; e hipoxantina 2Na.
[0061] Em uma modalidade, a osmolaridade de partida do meio da invenção é 200-500, 250-400, 275-350 ou cerca de 300 mOsm. Durante o desenvolvimento das células no meio da invenção e em particular seguindo quaisquer alimentações de acordo com um protocolo de batelada por alimentação, a osmolaridade da cultura pode aumentar até cerca de 350, 400, 450 ou tão alto quanto 500 mOsm.
[0062] Em algumas modalidades em que a osmolaridade do meio definido é menor do que cerca de 300, a osmolaridade é conduzida a cerca de 300 com a adição de um ou mais sais em excesso da quantidade especificada. Em uma modalidade, a osmolaridade é aumentada a um nível desejado pela adição de um ou mais de um osmólito selecionados a partir do cloreto de sódio, cloreto de potássio, um sal de magnésio, um sal de cálcio, um sal de aminoácido, um sal de um ácido graxo, bicarbonato de sódio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, um quelante que é um sal, um açúcar (por exemplo, galactose, glicose, sacarose, frutose, fucose, etc.) e uma combinação do mesmo. Em uma modalidade, o osmólito é adicionado em e acima de sua concentração em um componente já presente no meio definido (por exemplo, um açúcar é adicionado em e acima da concentração especificada para um componente do açúcar).
[0063] Em cada e a cada modalidade do meio descrito acima, bem como quaisquer outros meios livres de soro contendo pelo menos cerca de 90 μM de ornitina (ou contendo uma combinação de pelo menos cerca de 100 μM de ornitina mais pelo menos cerca de 200 μM de putrescina) são referidos a seguir como meio de ornitina suplementado (“OS”). Reciprocamente, o meio não contendo ornitina (ou nenhuma combinação de ornitina/putrescina) ou meio contendo menos do que 100 μ M de ornitina (ou meio contendo menos do que 100 μM de ornitina e menos do que 200 μ M de putrescina), são referidos a seguir como meio não suplementado com ornitina (“não OS”). CULTURA DE CÉLULA
[0064] A presente invenção fornece uma cultura de célula que compreende uma linha celular que expressa uma proteína de interesse em um meio OS como descrito acima. Em uma modalidade, a cultura de célula contém insulina, que pode ser adicionada como um ingrediente pronto para o uso ou pode ser incluído na formulação do meio. Em uma modalidade, a linha celular compreende as células capazes de produzir uma proteína bioterapêutica. Os exemplos das linhas celulares que são rotineiramente usados para produzir os bioterapêuticos de proteína incluem células primárias inter alia, células BSC, células HeLa, células HepG2, células LLC-MK, células CV-1, células COS, células VERO, células MDBK, células MDCK, células CRFK, células RAF, células RK, células TCMK-1, células LLCPK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células BHK, células BHK- 21, células CHO, células CHO-K1, células NS-1, células MRC-5, células WI- 38, células BHK, células 3T3, células 293, células RK, células Per.C6 e células de embrião de galinha. Em uma modalidade, a linha celular é uma linha celular CHO ou uma ou mais das diversas variantes da célula CHO específica otimizadas pela produção de proteína de ampla escala, por exemplo, CHO-K1.
[0065] A “cultura de célula” ou “cultura” significa o desenvolvimento e propagação das células fora de um organismo multicelular ou tecido. As condições da cultura adequada para as células de mamífero são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Animal Culture Cellular: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992). As células de mamíferos podem ser cultivadas na suspensão ou enquanto ligadas a um substrato sólido. Os biorreatores de leito fluidizado, biorreatores de fibra oca, garrafas cilíndricas, frascos de agitação ou biorreatores de tanque agitado, com ou sem microcarregadores e operados em uma batelada, batelada por alimentação, modo de perfusão contínuo ou semi-contínuo são disponíveis para a cultura de célula de mamífero. Os meios de cultura de célula ou meio de alimentação concentrado podem ser adicionados à cultura continuamente ou em intervalos durante a cultura. Por exemplo, uma cultura pode ser alimentada uma vez por dia, dia sim, dia não, a cada três dias ou pode ser alimentada quando a concentração de um componente de meio específico, que está sendo monitorado, está fora de uma faixa desejada.
[0066] As células animais, tal como células CHO, podem ser cultivadas nas culturas de escala menor, tal como nos recipientes 125 ml tendo cerca de 25 ml do meio, 250 ml dos recipientes tendo cerca de 50 a 100 ml do meio, 500 ml dos recipientes tendo cerca de 100 a 200 ml do meio. Alternativamente, as culturas podem ser amplas tal como, por exemplo, 1000 ml dos recipientes tendo cerca de 300 a 1000 ml do meio, 3000 ml dos recipientes tendo cerca de 500 ml a 3000 ml do meio, 8000 ml dos recipientes tendo cerca de 2000 ml a 8000 ml do meio e 15000 ml dos recipientes tendo cerca de 4000 ml a 15000 ml do meio. As culturas para a fabricação podem conter 10.000 L do meio ou mais. As culturas celulares de ampla escala, tal como para fabricação clínica das proteínas terapêuticas, são tipicamente mantidas por dias ou ainda semanas, enquanto as células produzem as proteínas desejadas. Durante este período a cultura pode ser suplementada com um meio de alimentação concentrado contendo componentes, tal como nutrientes e aminoácidos, que são consumidos durante o curso da cultura. O meio de alimentação concentrado pode ser baseado em qualquer formulação dos meios de cultura de célula. Um tal meio de alimentação concentrado pode conter mais dos componentes do meio para cultura de célula a, por exemplo, cerca de 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100x, 200X, 400X, 600X, 800X ou ainda cerca de 1000X de sua quantidade útil normal. Os meios de alimentação concentrados são frequentemente usados nos processos de cultura de batelada por alimentação.
[0067] Em algumas modalidades, um meio para cultura de célula é suplementado com “adições prontas para o uso”, também conhecidas como adições, ingredientes prontos para o uso ou produtos químicos prontos para o uso, durante o curso do desenvolvimento celular ou produção da proteína. As adições prontas para o uso incluem qualquer um ou mais de um fator de desenvolvimento ou outras proteínas, um tampão, uma fonte de energia, um sal, um aminoácido, um metal e um quelante. Outras proteínas incluem transferrina e albumina. Os fatores de desenvolvimento, que incluem citocinas e quimiocinas, são geralmente conhecidos na técnica e são conhecidos para estimular o desenvolvimento celular ou em alguns casos, diferenciação celular. Um fator de desenvolvimento é usualmente uma proteína (por exemplo, insulina), um peptídeo menor ou um hormônio esteroide, tal como estrógeno, DHEA, testosterona e outros. Em alguns casos, um fator de desenvolvimento pode ser um produto químico natural que promove a proliferação celular ou produção de proteína, tal como por exemplo, tetraidrofolato (THF), metotrexato e outros. Exemplos não limitantes dos fatores de desenvolvimentos da proteína e peptídeo incluem angiopoietinas, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), fator neurotrófico cerebral (BDNF), fator de desenvolvimento epidermal (EGF), eritropoietina (EPO), fator de desenvolvimento de fibroblasto (FGF), fator neurotrófico derivado da linha celular glial (GDNF), fator de estimulação da colônia de granulócito (G-CSF), fator de estimulação da colônia de macrófago de granulócito (GM-CSF), fator de diferenciação do desenvolvimento 9 (GDF9), fator de desenvolvimento de hepatócito (HGF), fator de desenvolvimento derivado de hepatoma (HDGF), insulina, fator de desenvolvimento semelhante a insulina (IGF), fator de estimulação de migração, mioestatina (GDF-8), fator de desenvolvimento nervoso (NGF) e outras neurotrofinas, fator de desenvolvimento derivado por plaqueta (PDGF), trombopoietina (TPO), transformação do fator de desenvolvimento alfa(TGF-α), transformação do fator de desenvolvimento beta(TGF-β), fator de necrose do tumor-alfa(TNF-α), fator de desenvolvimento endotelial vascular (VEGF), agonistas de caminho de sinalização wnt, fator de desenvolvimento placental (PlGF), somatotrofina bovina fetal (FBS), interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 e outros. Em uma modalidade, um meio para cultura de célula é suplementado com a insulina do fator de desenvolvimento da adição pronta-para-uso. Em uma modalidade, a concentração de insulina no meio, isto é, a quantidade de insulina no meio para cultura de célula após adição, é de cerca de 0,1 μ M a 10 μ M. Uma ou mais adições prontas para o uso também podem ser incluídas na formulação do meio de alguma modalidade.
[0068] Os tampões são geralmente conhecidos na técnica. A invenção não é restrita em qualquer tampão particular ou tampões e qualquer uma habilidade comum na técnica pode selecionar um tampão apropriado ou sistema de tampão para uso com uma linha celular particular que produz uma proteína particular. Em uma modalidade, um tampão de adição pronta para o uso é NaHCO3. Em uma modalidade, o tampão de adição pronta para o uso compreende NaHCO3. Em outra modalidade, o tampão é HEPES.
[0069] As fontes de energia para uso como uma adição pronta-para- uso na cultura de célula também são bem conhecidas na técnica. Sem limitação, em uma modalidade, a fonte de energia de adição pronta para o uso é glicose. Dando os requerimentos particulares e específicos da linha celular particular e a proteína a ser produzida. Em uma modalidade, a glicose pode ser adicionada a uma concentração de cerca de 1 a 20 mM no meio. Em alguns casos, a glicose pode ser adicionada nos níveis altos até 10 g/L.
[0070] Os quelantes são igualmente bem conhecidos na técnica da cultura de célula e produção da proteína. EDTA desidratado e citrato tetrassódico são dois quelantes comuns usados na técnica, embora outros quelantes podem ser utilizados na prática da mesma invenção. Em uma modalidade, um quelante de adição pronta para o uso é EDTA tetrassódico di- hidratado. Em uma modalidade, um quelante de adição pronta para o uso é citrato, tal como Na3C6H5O7.
[0071] Em uma modalidade, a cultura de célula pode ser suplementada com um ou mais aminoácidos de adição pronta para o uso, tal como, por exemplo, glutamina. Em uma modalidade, um meio para cultura de célula é suplementado com a glutamina de adição pronta para o uso em uma concentração final de cerca de 1 mM a 13 mM.
[0072] Outras adições prontas para o uso incluem um ou mais de vários sais metálicos, tal como sais de ferro, níquel, zinco e cobre. Em uma modalidade, um meio para cultura de célula é suplementado com qualquer um ou mais do sulfato de cobre, sulfato de zinco, cloreto férrico; e sulfato de níquel.
[0073] Em uma modalidade, um meio para cultura de célula é suplementado com qualquer um ou mais ou todos das seguintes adições prontas para o uso: cerca de 29,8 mM de NaHCO3, cerca de 2 mM de glutamina, cerca de 0,86 μ M de insulina, cerca de 11,1 mM de glicose, cerca de 6,54 μ M de sulfato de zinco, cerca de 0,168 μ M de sulfato de cobre, cerca de 75 μM de cloreto férrico, cerca de 0,639 μM de sulfato de níquel, cerca de 85 μM de EDTA e cerca de 50 μM de citrato.
[0074] Em uma modalidade, o meio é suplementado nos intervalos durante a cultura de célula de acordo com um processo de batelada por alimentação. A cultura de batelada por alimentação é geralmente conhecida na técnica e utilizada a produção da proteína otimizada (ver Y.M. Huang et al., Biotechnol Prog. 2010 Sep-Oct;26(5):1400-10).
[0075] A viabilidade celular, densidade da célula viável e duplicação celular são melhoradas relativas às células desenvolvidas na cultura sem ornitina ou putrescina. Com relação a viabilidade celular, as células desenvolvidas no meio OS mostra uma viabilidade que é pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos, 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, pelo menos 100% ou pelo menos 3 vezes maior do que a viabilidade das células similares ou idênticas desenvolvidas no meio não OS.
[0076] Em algumas modalidades, a taxa de duplicação das células de mamíferos viáveis no meio OS é pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, pelo menos 20%, pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100% ou pelo menos 3 vezes maior do que a taxa de duplicação das células de mamífero cultivadas no meio não OS. Em algumas modalidades, a taxa de duplicação das células de mamíferos viáveis no meio OS é cerca de 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% ou 30% maior do que a taxa de duplicação das células de mamífero no meio não OS.
[0077] Em algumas modalidades, o tempo de duplicação as células de mamífero que circulam ativamente são menores do que 30 horas, menos do que 29 horas, menos do que 28 horas, menos do que 27 horas, menos do que 26 horas, menos do que 25 horas, menos do que 24 horas, menos do que 23 horas, menos do que 22 horas, menos do que 21 horas, menos do que 20 horas, menos do que 19 horas ou menos do que 18 horas no meio OS. Em algumas modalidades, o tempo de duplicação das células de mamífero de desenvolvimento ativo é menor do que 28 horas no meio OS. Em algumas modalidades, o tempo de duplicação das células de mamífero é cerca de 27 ± 1 horas, cerca de 26 ± 1 horas, cerca de 25 ± 1 horas, cerca de 24 ± 1 horas, cerca de 23 ± 1 horas, cerca de 22 ± 1 horas ou cerca de 21 ± 1 horas no meio OS. Em algumas modalidades, o tempo de duplicação as células de mamífero que circulam ativamente é cerca de 24 ± 1 horas no meio OS. Em algumas modalidades, o tempo de duplicação das células que divide ativamente cultivada no meio OS é pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, pelo menos 20% ou pelo menos 25% menor do que o tempo de duplicação das células de ciclicação ativa cultivadas em um meio não OS.
PRODUÇÃO DE PROTEÍNA
[0078] Além disso o meio OS quimicamente definido e método de cultivação das células no meio OS, a presente invenção fornece os métodos de produzir uma proteína, tal como um anticorpo terapeuticamente efetivo ou outra substância de medicamento biofarmacêutica, em uma cultura de célula no meio OS.
[0079] Em algumas modalidades, a taxa de produção da proteína para as células de mamífero cultivadas no meio OS é pelo menos 5%, 10%, 15% ou 20% maior do que a taxa de produção da proteína por uma cultura de célula de mamífero idêntico no meio não OS. Em algumas modalidades a taxa de produção da proteína nas células cultivadas no meio OS é pelo menos 1 pg/célula/dia (“PCD”), pelo menos 2 PCD, pelo menos 3 PCD, pelo menos 4 PCD, pelo menos 5 PCD, pelo menos 6 PCD, pelo menos 7 PCD, pelo menos 8 PCD, pelo menos 9 PCD, pelo menos 10 PCD, pelo menos 15 PCD, pelo menos 20 PCD, pelo menos 25 PCD, pelo menos 30 PCD, pelo menos 35 PCD, pelo menos 40 PCD, pelo menos 45 PCD, pelo menos 50 PCD, pelo menos 75 PCD ou pelo menos 100 PCD.
[0080] Em algumas modalidades o rendimento ou titulador da produção de proteína, que pode ser expressado em gramas do produto de proteína por litro do meio para cultura, a partir das células cultivadas no meio OS é pelo menos 100 mg/L, pelo menos 1 g/L, pelo menos 1,2 g/L, pelo menos 1,4 g/L, pelo menos 1,6 g/L, pelo menos 1,8 g/L, pelo menos 2 g/L, pelo menos 2,5 g/L, pelo menos 3 g/L, pelo menos, 3,5 g/L, pelo menos 4 g/L, pelo menos 4,5 g/L, pelo menos 5 g/L, pelo menos 5,5 g/L, pelo menos 6 g/L, pelo menos 6,5 g/L, pelo menos 7 g/L, pelo menos 7,5 g/L, pelo menos 8 g/L, pelo menos 8,5 g/L, pelo menos 9 g/L, pelo menos 9,5 g/L, pelo menos 10 g/L ou pelo menos 20 g/L.
[0081] Em algumas modalidades, o produto de proteína (proteína de interesse) é um anticorpo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo biespecífico, um fragmento de anticorpo de ligação de antígeno, um anticorpo de cadeia simples, um diacorpo, triacorpo ou tetracorpo, um fragmento Fab ou um fragmento F(ab')2, um anticorpo IgD, um anticorpo IgE, um anticorpo IgM, um anticorpo IgG, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 ou um anticorpo IgG4. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG1. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG2. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG4.
[0082] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína recombinante que contém uma porção Fc e outro domínio, (por exemplo, uma proteína de fusão Fc). Em algumas modalidades, uma proteína de fusão Fc é uma proteína de fusão do receptor Fca, que contém um ou mais de um ou mais domínios extracelulares de um receptor ligado a uma porção Fc. Em algumas modalidades, a porção Fc compreende uma região de junta seguida por um domínio CH2 e CH3 de um IgG. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do receptor Fc contém duas ou mais cadeias dos receptores distintos que ligam-se aos ligantes simples ou ligantes múltiplos. Por exemplo, uma proteína de fusão Fc é uma de captura, tal como, por exemplo, um IL-1 de captura (por exemplo, rilonacept, que contém a região de ligação do ligando IL-1RAcP fundido a região extracelular Il-1R1 fundido a Fc de hIgG1; ver Patente U.S. N°. 6.927.004, que é neste incorporado por referência em sua totalidade) ou um VEGF de captura (por exemplo, aflibercept, no qual contém o domínio Ig 2 do receptor VEGF Flt1 fundido ao domínio Ig 3 do receptor VEGF Flk1 fundido a Fc de hIgG1; ver Patente U.S. N°. 7.087.411 e 7.279.159).
[0083] A presente invenção não é limitada em qualquer tipo particular da célula para a produção da proteína. Os exemplos dos tipos celulares adequados para a produção de proteína incluem as células de mamífero, células de inseto, células aviárias, células bacterianas e células de levedura. As células podem ser as células tronco ou células recombinantes transformadas com um vetor para a expressão do gene recombinante ou células transfectadas com um vírus para produzir os produtos virais. As células podem conter uma construção de polinucleotídeo heterólogo recombinante que codificam uma proteína de interesse. Aquela construção pode ser um epissoma ou pode ser um elemento que é fisicamente integrado no genoma da célula. As células também podem produzir uma proteína de interesse sem ter aquela proteína codificada em uma construção de polipeptídeo heterólogo. Em outras palavras, a célula pode naturalmente codificar uma proteína de interesse, tal como uma célula B que produz um anticorpo. As células também podem ser as células primárias, tal como células de embrião de galinha ou linhas celulares primárias. Os exemplos das células úteis incluem as células BSC, células LLC-MK, células CV-1, células COS, células VERO, células MDBK, células MDCK, células CRFK, células RAF, células RK, células TCMK-1, células LLCPK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células BHK-21, células de embrião de galinha, células NS-1, células MRC-5, células WI-38, células BHK, células 293, células RK, células Per.C6 e células CHO. Em várias modalidades, a linha celular é um derivado celular CHO, tal como CHO-K1, CHO DUX B- 11, CHO DG-44, Veggie-CHO, GS-CHO, S-CHO ou linhas mutantes CHO lec.
[0084] Em uma modalidade, a célula, que é uma célula CHO, ectopicamente expressa uma proteína. Em uma modalidade, a proteína compreende uma região de cadeia pesada de imunoglobulina, tal como uma região CH1, CH2 ou CH3. Em uma modalidade, a proteína compreende uma região CH2 e CH3 da imunoglobulina humana ou roedor. Em uma modalidade, a proteína compreende uma região CH1, CH2 e CH3 de imunoglobulina humana ou roedor. Em uma modalidade, a proteína compreende uma região de junta e uma região CH1, CH2 e CH3. Em uma modalidade específica, a proteína compreende um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, a proteína compreende um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, a proteína compreende um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina e um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, a proteína é um anticorpo, tal como um anticorpo humano, um anticorpo de roedor ou um anticorpo humano/roedor quimérico (por exemplo, humano/camundongo, humano/rato ou humano/hâmster).
[0085] Uma fase de produção pode ser conduzida em qualquer escala de cultura, a partir dos frascos individuais e frascos de agitação ou sacos de onda, aos biorreatores de um litro e aos biorreatores industriais de escala ampla. Um processo de ampla escala pode ser conduzido em um volume de cerca de 100 litros a 20.000 litros ou mais. Um ou mais de diversos meios podem ser usados para controlar a produção de proteína, tal como mudança de temperatura ou indução química. Uma fase de desenvolvimento pode ocorrer em uma temperatura mais alta do que uma fase de produção. Por exemplo, uma fase de desenvolvimento pode ocorrer em uma primeira temperatura de cerca de 35°C a 38°C e uma fase de produção pode ocorrer em uma segunda temperatura de cerca de 29°C a 37°C, opcionalmente de cerca de 30°C a 36°C ou de cerca de 30°C a 34°C. Além disso, indutores químicos da produção de proteína, tal como cafeína, butirato, tamoxifeno, estrógeno, tetraciclina, doxiciclina e hexametileno bisacetamida (HMBA), podem ser adicionados concorrentes com, antes ou depois de uma mudança de temperatura. Se os indutores são adicionados após uma mudança de temperatura, estes podem ser adicionados a partir de uma hora a cinco dias após a mudança de temperatura, tal como a partir de um ou dois dias após a mudança de temperatura. As culturas celulares de produção podem ser realizadas como sistema de cultura de alimentação contínua, como em um quimiostato (ver C. Altamirano et al., Biotechnol Prog. 2001 Nov-Dec; 17(6):1032-41) ou de acordo com um processo de batelada por alimentação (Huang, 2010).
[0086] A invenção é útil para melhorar a produção de proteína por intermédio dos processos da cultura de célula. As linhas celulares usadas na invenção podem ser geneticamente projetadas para expressar um polipeptídeo do interesse comercial ou científico. As linhas celulares geneticamente projetadas envolvem a transfecção, transformação ou transdução das células com uma molécula de polinucleotídeo recombinante ou de outra maneira alternativa (por exemplo, pela recombinação homóloga e ativação de gene ou fusão de uma célula recombinante com uma célula não recombinante) de modo a causar a célula hospedeira para expressar um polipeptídeo recombinante desejado. Os métodos e vetores para as células geneticamente projetadas ou linhas celulares para expressar um polipeptídeo de interesse são bem conhecidos aquela pessoa habilitada na técnica; por exemplo, várias técnicas são ilustradas em Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988 e atualizações trimestrais); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Culture Cell, 1990, pp. 15-69. Uma ampla variedade de linhas celulares adequadas para desenvolvimento na cultura está disponível na American Type Culture Collection (Manassas, Va.) e fornecedores comerciais. Os exemplos das linhas celulares comumente usados na indústria incluem VERO, BHK, HeLa, CVl (incluindo Cos), MDCK, 293, 3T3, linhas celulares de mieloma (por exemplo, NSO, NSl), PC12, células WI38 e células ovarianas de hâmster Chinês (CHO). As células CHO são amplamente usadas para a produção das proteínas recombinantes de complexo, tal como citocinas, fatores de coagulação e anticorpos (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al. (1988), J.Biol Chem 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol 6:231-239; Wood et al. (1990), J Immunol. 145:3011-3016). As linhas celulares mutantes deficientes de redutase de di-hidrofolato (DHFR) (Urlaub et al. (1980), Proc Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220), DXBl 1 e DG-44, são as linhas celulares de hospedeiro CHO desejáveis por causa do sistema de expressão do gene amplificável e selecionável DHFR eficiente permite a expressão da proteína recombinante de nível alto nestas células (Kaufman RJ. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). Além disso, estas células são fáceis para manipular como as culturas de suspensão ou aderentes e exibem estabilidade genética relativamente boa. As células CHO e as proteínas recombinantemente expressadas por estes foram extensivamente caracterizadas e foram aprovadas para o uso na fabricação clínica e comercial pelas agências reguladoras. Em algumas modalidades, as linhas celulares CHO são as linhas celulares são descritas nas Publicações do Pedido de Patente U.S. N°. 2010/0304436 A1, 2009/0162901 A1 e 2009/0137416 A1 e Patentes U.S. N°. 7.455.988 B2, 7.435.553 B2 e 7.105.348 B2.
[0087] A presente invenção não é limitada no escopo pelas modalidades específicas descritas neste, que são pretendidas como ilustrações dos aspectos individuais ou modalidades da invenção. Os métodos funcionalmente equivalentes e componentes estão dentro do escopo da invenção. Várias modificações da invenção, além daquelas descritas aqui, são evidentes para aquela pessoa habilitada na técnica a partir da descrição precedente e desenhos anexos. Tais modificações divergem dentro do escopo da invenção.
[0088] A invenção é baseada, em parte, na averiguação que a adição de ornitina ou uma combinação de ornitina e putrescina aos meios de cultura de célula livres de soro resultam no desenvolvimento celular aumentado, viabilidade e produção de polipeptídeo a partir de uma linha celular animal recombinantemente projetada (ou célula natural) que expressa uma proteína de interesse, portanto, intensificando o vigor da cultura, melhorando o rendimento do polipeptídeo de interesse.
Exemplo 1: Densidade da cultura de célula viável melhorada
[0089] Um frasco de agitação de 250 mL foi inoculado a partir da cultura de semente de um anticorpo recombinante que produz a linha celular derivada de CHO K1. As células inoculadas foram desenvolvidas a 36,5°C por sete dias e alimentadas por glicose nos dias três e cinco. As células foram desenvolvidas em cada um dos dois meios definidos quimicamente separados (hidrolisado livre e livre de soro). O primeiro meio continha cerca de 75 mM de aminoácidos (meio 1), o segundo meio continha cerca de 40 mM de aminoácidos (Meio 2) e ambas as formulações não continham mais do que 2,5 μ M de putrescina (0,4 mg/L). Outro grupo das condições do meio foi gerado pela adição da soja hidrolisada em uma concentração de 7,5 g/L ao meio 2. A cada um dos três meios de controle, cerca de 593 μ M de ornitina (como 100 mg/L de L-ornitina • HCl) ou uma combinação de cerca de 593 μM de ornitina (como 100 mg/L de L-ornitina • HCl) e cerca de 714 μM de putrescina (como 115 mg/L de putrescina • 2HCl) foram adicionados. As alíquotas de 3 mL de cultura foram removidas nos dias 3, 5 e 7 e as contagens da célula viável foram conduzidas usando a exclusão de azul tripano em um instrumento BioProfile FLEX™ (Nova Biomedical). No dia zero, todas as culturas continham 0,8 x 106 células viáveis por mL. Para um meio dado (meio 1, meio 2 ou meio 2 + Soja), contagens da célula viável em um período de sete dias relevou que as células CHO desenvolvidas no meio suplementado com ornitina ou ornitina mais putrescina tiveram densidades da célula viável aumentadas. O efeito foi especialmente pronunciado no meio livre hidrolisado (isto é, 2 vezes a 4 vezes ou mais aumentado na densidade da célula viável) durante o período de sete dias. O meio OS livre hidrolisado 2 realizada comparavelmente a soja contendo meio não OS 2 indica que o benefício do desenvolvimento celular da soja hidrolisada pode ser repetido pela substituição da ornitina. A densidade da célula aumentada pela adição de ornitina ou ornitina e putrescina ao meio 2 + soja também foi observada. Os resultados são apresentados na tabela 1.TABELA 1: DENSIDADE DA CULTURA DE CÉLULA VIÁVEL MÉDIA (106 CÉLULAS POR MILILITRO) E X AUMENTO DE DOBRA NA LINHA DE BASE *
Figure img0001
*linha de base é o meio não suplementado para uma dada formulação do meio em um dado dia.
[0090] Também examinamos o efeito de várias quantidades de ornitina • HCl (isto é, 50 mg/L, 100 mg/L e 150 mg/L) na densidade da célula viável no meio 3, que contém cerca de 75 mM de aminoácidos e 0,4 mg/L de putrescina HCl (“meio 3”). Um trem de semente simples de cultura de um anticorpo recombinante que produz a linha celular derivada de CHO K1 foi usado para inocular 50 mL de biorreatores TubeSpin® (TPP) a 0,4 x 106 células/mL em um volume de trabalho 15 mL. As células foram desenvolvidas em uma incubadora 37°C por três dias. As alíquotas de cultura 3 mL foram removidas no dia 3 e as contagens da célula viável foram conduzidas usando exclusão azul de tripano em um instrumento BioProfile FLEX™ (Nova Biomedical). Todos os três níveis da densidade celular melhorada por ornitina na média (N=3) levemente mais do que duas vezes. Os resultados são descritos na tabela 2.TABELA 2: DENSIDADE DA CULTURA DE CÉLULA VIÁVEL (106 CÉLULAS POR MILILITRO) E X AUMENTO DE DOBRA NA LINHA DE BASE*
Figure img0002
*Linha de base é o meio não suplementado 3.
Exemplo 2: período de duplicação da cultura de célula melhorada
[0091] O tempo de duplicação de um anticorpo recombinante produz a linha celular derivada das células CHO K1 na fase de desenvolvimento logarítmico foi determinado sob várias condições dos meios de cultura de célula. As culturas de sequência celular foram passadas a 36,5°C nos frascos de agitação 250 mL em um período de 14 dias em cada um dos três meios separados: meio 1, meio 2 e meio 2 contendo soja hidrolisada (meio 2 + Soja). As alíquotas de 1 mL foram removidas a partir da cada condição no dia 0 e no período da passagem de sequência de semente (a cada 2 ou 3 dias) e contagens da célula viável foram conduzidas usando exclusão de azul tripano em um instrumento CDV™ (Nova Biomedical). O meio 1 foi testado suplementado ou não suplementado com ornitina • HCl a 100 mg/L ou ambos putrescina • 2HCl a 115 mg/L e ornitina • HCl a 100 mg/L. O meio 2 com putrescina baixa • 2HCl (0,4 mg/L) foi testado suplementado ou não suplementado com ornitina • HCl a 100 mg/L ou ambos putrescina • 2HCl a 115 mg/L e ornitina • HCl a 100 mg/L. Os resultados são descritos nas Tabelas 3 e 4. A suplementação de ornitina, com ou sem putrescina, ao meio 1 foi requerida para atingir o desenvolvimento significante. A suplementação do meio 2 livre hidrolisado com ornitina ou ornitina + putrescina diminui o período da duplicação celular por cerca de 25% a 30%. Os períodos de duplicação também foram reduzidos a uma extensão menor na adição de ornitina ou ornitina + putrescina ao hidrolisado contendo Meio 2.TABELA 3: PERÍODO DE DUPLICAÇÃO CELULAR (HORAS) E DIMINUIÇÃO DO PERÍODO DE DUPLICAÇÃO DE PERCENTUAL APROXIMADO RELATIVO À LINHA DE BASE NO MEIO 1
Figure img0003
*Linha de base é o meio 1 não suplementado.TABELA 4: PERÍODO DE DUPLICAÇÃO CELULAR (HORAS) E DIMINUIÇÃO DO PERÍODO DE DUPLICAÇÃO PERCENTUAL
Figure img0004
*Linha de base é o meio 2 não suplementado.
Exemplo 3: TITULADORES DE ANTICORPO MELHORADO
[0092] Tendo estabelecido que a inclusão de ornitina ou Ornitina + putrescina melhora a proliferação celular e densidade da célula viável na cultura, ainda investigamos o efeito das mesmas condições nos tituladores de produção de proteína recombinante. Examinamos a expressão e secreção do IgG recombinante por uma linha celular derivada de CHO-K1. Neste experimento, o titulador de anticorpo médio foi determinado no dia sete na cultura sob vários formatos do meio. Como acima, o meio 1 com putrescina baixa (0,4 mg/L de putrescina • 2HCl), ornitina (100 mg/L de ornitina • HCl) e tanto ornitina quanto putrescina (100 mg/L de ornitina • HCl /115 mg/L de putrescina • 2HCl) foram testadas. O meio 2 e meio 2 + soja com putrescina baixa (0,4 mg/L de putrescina • 2HCl), ornitina (100 mg/L de ornitina • HCl) e tanto ornitina quanto putrescina (100 mg/L de ornitina • HCl /115 mg/L de putrescina • 2HCl) também foram testados. Em todos os casos, a inclusão de ornitina ou ornitina e putrescina em um nível acima 0,4 mg/L resultou em um titulador de proteína significantemente maior, isto é, pelo menos cerca de duas vezes dos tituladores maiores. Os resultados são descritos na tabela 5. TABELA 5: TITULADORES DE ANTICORPO DE SETE DIAS MÉDIOS E AUMENTO DE DOBRA APROXIMADO (X) NO TITULADOR RELATIVO À LINHA DE BASE*
Figure img0005
*Linha de base é apresentada no titulador para o meio não suplementado de cada tipo.
[0093] Também examinamos o efeito de várias quantidades de ornitina • HCl (isto é, 50 mg/L, 100 mg/L e 150 mg/L) no meio 3 na produção de anticorpo. Uma sequência de semente simples de cultura de um anticorpo recombinante produz linha celular derivada de CHO K1 foi usado para semear os biorreatores 50 mL TubeSpin® (TPP) a 0,4 x 106 células/mL em um volume de trabalho 15 mL. As células foram desenvolvidas em uma incubadora 37°C por três dias. Todos os três níveis de titulador de anticorpo melhorado de suplementação de ornitina na média (N=3) lentamente mais do que 50%. Os resultados são descritos na Tabela 6.TABELA 6: TITULADORES DE ANTICORPO (GRAMAS POR LITRO) E X AUMENTO DE DOBRA NO TITULADOR NA LINHADE BASE*
Figure img0006
*Linha de base é o meio não suplementado 3

Claims (27)

1. Método para cultivar células, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) prover um meio para cultura de célula livre de soro, compreendendo 0,6 ± 0,09 mM de ornitina e 0,714 ± 0,11 mM de putrescina, e (b) propagar ou manter uma célula no meio para cultura de célula para formar uma cultura de célula, em que a célula expressa uma proteína de interesse.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura é livre de hidrolisado.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o meio para cultura de célula compreende > 40 ± 6 mM de uma mistura de aminoácidos ou sais dos mesmos.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a mistura de aminoácidos consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o meio para cultura celular compreende um ou mais ácidos graxos.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que um ou mais ácidos graxos são selecionados do grupo que consiste em ácido linoleico, ácido linolênico, ácido tióctico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido araquidônico, ácido láurico, ácido behênico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido hexanoico, ácido lignocérico, ácido mirístico, e ácido octanoico.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o meio para cultura de célula compreende uma mistura de nucleosídeos.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a mistura de nucleosídeos compreende um ou mais de adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina.
9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a mistura de nucleosídeos compreende adenosina, guanosina, citidina, uridina, timidina e hipoxantina.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o meio para cultura de células compreende um ou mais cátions divalentes.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o cátion divalente é magnésio, cálcio ou ambos.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a célula é selecionada do grupo que consiste em uma célula de mamífero, célula de ave, célula de inseto, célula bacteriana e célula de levedura.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula CHO, célula 293 ou célula BHK.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a célula CHO é uma célula CHO-K1.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que (a) a proteína de interesse é uma proteína de ligação de antígeno; (b) a proteína de interesse compreende um domínio de Fc; e/ou (c) a proteína de interesse é uma proteína de fusão de receptor- Fc.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão receptor-Fc é uma proteína de captura.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a proteína de captura é um antagonista IL-1 ou um antagonista de VEGF.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a proteína de interesse é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de anticorpo é um anticorpo humano recombinante ou fragmento do mesmo.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizado pelo fato de que: (a) as células têm um tempo de duplicação médio de < 30 horas quando cultivadas no meio para cultura de célula; (b) as células têm um tempo de duplicação médio de < 24 horas quando cultivadas no meio para cultura de célula; (c) as células têm um tempo de duplicação médio que é pelo menos um terço daquele de células cultivadas em um meio para cultura de célula contendo não mais do que 2,5μM de putrescina e nenhuma ornitina; (d) a cultura de célula é capaz de atingir uma densidade de contagem celular viável que é pelo menos 15% maior do que uma cultura de célula similar em meio que contém não mais do que 2,5μM de putrescina e nenhuma ornitina; (e) a cultura de célula é capaz de atingir uma densidade de contagem celular viável que é pelo menos 3 vezes maior do que uma cultura de célula similar em um meio para cultura de célula similar contendo não mais do que 2,5μM de putrescina e nenhuma ornitina; e/ou (f) o método compreendendo a etapa de adicionar uma ou mais adições de ponto de uso ao meio para cultura de célula.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a adição de pontos de uso compreende um ou mais de NaHCO3, glutamina, insulina, glicose, CuSO4, ZnSO4, FeCl3, NiSO4, Na4 EDTA e Na3 Citrato e/ou cada um de NaHCO3, glutamina, insulina, glicose, CuSO4, ZnSO4, FeCl3, NiSO4, Na4 EDTA e Na3 Citrato são adicionados ao meio como adições de ponto de uso.
22. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) introduzir em uma célula um ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica uma proteína de interesse; (b) selecionar uma célula que carrega o ácido nucleico; (c) cultivar a célula selecionada com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21; e (d) expressar a proteína de interesse na célula, em que a proteína de interesse é secretada no meio.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula CHO, célula 293 ou célula BHK.
24. Método de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que: (a) a proteína de interesse é uma proteína de ligação de antígeno; (b) a proteína de interesse compreende um domínio de Fc; e/ou (c) a proteína de interesse é selecionada do grupo que consiste de proteína de fusão do receptor-Fc (DE CAPTURA), proteína de fusão do TCR-Fc solúvel, anticorpo, proteína de fusão de Fc e proteína de ScFv.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 23, caracterizado pelo fato de que: (a) a proteína de interesse é produzida em um título de 7 dias médio que é pelo menos 7% maior do que o título de 7 dias médio produzido por uma célula similar em um meio para cultura de célula contendo não mais do que 2,5μM de putrescina e nenhuma ornitina; (b) a proteína de interesse é produzida em um título de 7 dias médio que é pelo menos 14% maior do que o título de 7 dias médio produzido por uma célula similar em um meio para cultura de célula contendo não mais do que 2,5μM de putrescina e nenhuma ornitina; (c) a proteína de interesse é produzida em um título de 7 dias médio que é pelo menos 80% maior do que o título de 7 dias médio produzido por uma célula similar em um meio para cultura de célula contendo não mais do que 2,5μM de putrescina e nenhuma ornitina; (d) a proteína de interesse é produzida em um título de 7 dias médio que é pelo menos 2 vezes maior do que o título de 7 dias médio produzido por uma célula similar em um meio para cultura de célula contendo não mais do que 2,5μM de putrescina e nenhuma ornitina; e/ou (e) a proteína de interesse é produzida em um título de 7 dias médio que é pelo menos 3 vezes maior do que o título de 7 dias médio produzido por uma célula similar em um meio para cultura de célula contendo não mais do que 2,5μM de putrescina e nenhuma ornitina.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 22 a 25, caracterizado pelo fato de que a proteína de interesse é um anticorpo humano recombinante.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizado pelo fato de que a proteína de interesse é aflibercept.
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