KR101644954B1 - 배양 동안 락테이트의 축적을 감소시키는 방법 및 폴리펩타이드를 생산하는 방법 - Google Patents

배양 동안 락테이트의 축적을 감소시키는 방법 및 폴리펩타이드를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2가 전이 금속염을 사용하여 세포 배양액에 락테이트의 생산을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 락테이트 축적을 감소시키기 위해 세포 배지에 2가 전이 금속염을 첨가하고 폴리펩타이드를 발효하고 회수함으로써 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

배양 동안 락테이트의 축적을 감소시키는 방법 및 폴리펩타이드를 생산하는 방법{Methods for Reducing Accumulation of Lactate During Culturing and Method for Producing Polypeptide}
본 발명은 세포 배양액에 락테이트의 축적을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 세포 배양액에 2가 전이 금속염을 첨가하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 락테이트 축적을 감소시키기 위해 세포 배지에 2가 전이 금속염을 첨가하는 단계 및 폴리펩타이드를 발효하고 회수하는 단계를 포함한다. 더욱 구체적으로 본 발명은 배지에서 락테이트의 축적을 감소시키는 세포 배양 시스템에서 세포들을 성장시키는 방법에 관한 것이다.
동물 세포 배양 기술은 생물학 연구와 약학 산업에서 널리 사용된다. 세포 성장과 신진대사 활성의 평가는 세포 배양 과정의 제어와 개선에서 성공에 대해 필수적이다. 가장 일반적으로 관찰된 대사산물들 중 두 개는 글루코스 및 락테이트이다. 글루코스는 대부분의 배지 형성에서 주요 탄소 공급원 및 중요한 에너지 공급원으로 작용한다. 해당경로(glycolytic pathway) 속으로 글루코스의 진입은 최종 생성물로서 피루베이트의 형성을 유도한다. 동물 세포들에서, 피루베이트는 TCA 사이클 속에 운반될 수 있거나 락테이트로 전환될 수 있다. 피루베이트에 대한 글루코스의 높은 유동 및 해당과 TCA 사이클 사이의 불충분한 결합 때문에, 락테이트 축적은 연속적인 세포 배양에서 일어나는 경향이 있다. 락테이트 축적은 배양 환경의 산성화를 유도할 것이다. 또한, 락테이트 자체는 제어된 pH 하에서도 포유류 세포들에게 독성일 수 있다. 락테이트의 축적은 특히 세포 밀도가 높을 때 주로 세포 배양 과정의 중요한 제한 인자이다.
생약 제조에서, 측정의 단순성과 신뢰성뿐만 아니라 배지에서 이들의 화학적 안정성 때문에 글루코스와 락테이트 관찰은 일상적인 관행이 되었다. 더욱 중요한 것은, 글루코스 농도가 에너지의 평가를 제공하는 반면 락테이트는 신진대사 부생성물들의 축적에 대한 중요한 변수 및 배양 환경을 악화시키는 징후로 고려된다. 중요 배양 변수들로서, 글루코스 및 락테이트 측정은 주로 공급 또는 주입 전략과 같은 바이오리액터 작동에서 공정 제어를 위한 설계에서 주요 구성요소이다.
글루코스 및 락테이트 신진대사와 세포 밀도를 서로 연관시키기 위해 과거에 상당한 노력을 했다. 글루코스의 소비 속도 및 락테이트의 축적 속도는 배양된 세포들의 신진대사 활성을 나타낸다.
상기한 대로 락테이트와 같은 독성 부생성물의 축적은 세포 성장과 항체 생산에 억제 효과를 가진다. 과도한 락테이트 축적은 증가된 배지 삼투압 또는 pH 제어의 부존재에서, 감소된 배양액 pH를 초래할 수 있다. 락테이트의 주요 부정적 효과는 배양 배지로의 이의 배출에 의해 일어나는 pH의 감소에 의해 유발된다.
미국특허 no. 6156570은 락테이트의 축적을 최소화하는 세포들, 바람직하게는 포유류 세포들을 배양하는 방법을 교시한다.
미국특허 no. 7429491은 유가 배양(fed-batch culture)에서 제한된 글루코스를 사용하는 동물 세포 배양에서 단백질 생산을 개선하는 방법을 교시한다.
과거에, A] 매우 낮은 수준의 글루코스를 공급하고 유지하거나 B] 분자 생물학 기술을 사용하여 세포들의 신진대사 처리함으로써 주로 락테이트 수준을 감소시키는 시도들을 하였다.
이 연구는 2가 전이 금속염(구리, 아연)의 첨가와 락테이트 축적 사이의 상관관계 및 이를 감소시키는 가능한 방식들 사이의 상관관계를 나타낸다.
따라서, 본 발명은 세포 배양액에 2가 전이 금속염을 첨가하는 단계를 포함하는 세포 배양액에 락테이트의 축적을 감소시키는 방법 및 락테이트 축적을 감소시키기 위해 a) 세포 배지에 2가 전이 금속염을 첨가하는 단계 및 b) 폴리펩타이드를 발효하고 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1a는 구리염 Vs 대조군의 존재하에서 락테이트 축적의 수준에서의 차이를 설명한다.
도 1b는 아연염 Vs 대조군의 존재하에서 락테이트 축적의 수준에서의 차이를 설명한다.
도 2a는 구리염 Vs 대조군의 존재하에서 락테이트 축적의 수준에서의 차이를 설명한다.
도 2b는 아연염 Vs 대조군의 존재하에서 락테이트 축적의 수준에서의 차이를 설명한다.
도 3은 아연염 Vs 대조군의 존재하에서 락테이트 축적의 수준에서의 차이를 설명한다.
도 4a는 구리염 Vs 대조군의 존재하에서 락테이트 축적의 수준에서의 차이를 설명한다.
도 4b는 아연염 Vs 대조군의 존재하에서 락테이트 축적의 수준에서의 차이를 설명한다.
도 5a는 구리염 Vs 대조군의 존재하에서 락테이트 축적의 수준에서의 차이를 설명한다.
도 5b는 아연염 Vs 대조군의 존재하에서 락테이트 축적의 수준에서의 차이를 설명한다.
도 6은 마그네슘염 Vs 대조군의 존재하에서 락테이트 축적의 수준에서의 차이를 설명한다.
도 7은 아연염 Vs 대조군의 존재하에서 락테이트 축적의 수준에서의 차이를 설명한다.
본 발명은 세포 배양액에 락테이트의 축적을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 세포 배양액에 2가 전이 금속염을 첨가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 실시태양에서, 2가 전이 금속염은 구리 및 아연을 포함하는 그룹으로부터 선택된 금속을 가진다.
본 발명의 한 실시태양에서, 구리염은 황산구리이며 아연염은 황산아연이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 세포는 포유류 세포주로부터 얻어진다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 포유류 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0(비 분비 0(non secreting 0)) 및 BHK(아기 햄스터 신장)를 포함하나 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 염은 약 0.2mM 내지 약 0.4mM 범위의 농도로 첨가된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 배양은 유가 배양, 배치 배양, 쉐이크 플라스크 및 바이오리액터를 포함하나 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택된 시스템에서 실행된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 락테이트 수준의 축적 감소는 약 5% 내지 약 40%이다.
본 발명은 또한 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 락테이트 축적을 감소시키기 위해 세포 배지에 2가 전이 금속염을 첨가하는 단계 및 폴리펩타이드를 발효하고 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 세포들은 포유류 세포주로부터 얻는다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 포유류 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 및 BHK를 포함하나 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 2가 전이 금속염은 구리 및 아연을 포함하는 그룹으로부터 선택된 금속을 가진다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 구리염은 황산구리이며 아연염은 황산아연이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 2가 전이 금속 이온은 약 0.2mM 내지 약 0.4mM 범위의 농도로 첨가된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 폴리펩타이드는 안티 VEGF-A 항체, 안티 Her-2 항체, 안티 CD6 항체 및 안티 TNF 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 배양 공정은 유가 배양, 배치 배양, 쉐이크 플라스크 및 바이오리액터를 포함하나 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택된 임의의 시스템에서 실행된다.
본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명은 세포 성장 단계 및 폴리펩타이드 생산 단계를 포함하는 변형 세포 배양 방법을 사용하여 락테이트 축적을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
따라서 본 발명은 감소된 락테이트 축적을 가진 공정에 의해, 단클론 항체에 의해 예시화된, 폴리펩타이드의 생산을 위한 공정을 제공한다.
추가 발명은 락테이트 축적 감소는 약 5% 내지 약 40% 범위에서 감소하는 것을 언급한다.
본 발명은 감소된 락테이트 축적을 가진 공정에 의해 단클론 항체의 생산 공정에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시태양에서, 락테이트 축적의 양을 낮추는 것은 일반적으로 표준 생산 절차와 관련이 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 2가 전이 금속염의 첨가가 유가 시스템에서 락테이트의 축적을 감소시키는 공정이 기술된다.
본 발명의 한 실시태양에서, 2가 전이 금속염은 아연과 구리염을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 배양 배지에 사용된 아연과 구리염의 농도는 약 0.4mM이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 구리의 2가 전이 금속염은 황산구리이며 아연의 금속염은 황산아연이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 2가 전이 금속염의 농도는 배지에서 염의 농도로서 언급된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 이런 아연 및 구리 금속 이온들은 해당 및 TCA 경로에 관여된 효소들의 활성에 필요하며 따라서, 이런 이온들의 첨가는 세포들의 전체 신진대사 효율을 개선하여 대부분의 글루코스가 완전히 산화되게 하여서, 락테이트의 축적은 감소한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 배지는 HyClone CDM4NS0 및 HyClone CDM4Mab를 포함하나 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택된 화학적 규명 배지이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 포유류 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0(비 분비 0) 및 BHK(아기 햄스터 신장)를 포함하나 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 폴리펩타이드는 안티 VEGF-A 항체, 안티 Her-2 항체, 안티 CD6 항체 및 안티 TNF 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 배지에서 락테이트의 수준은 장치 YSI 7100 MBS 분석기를 사용하여 분석된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 락테이트 축적의 감소는 전체 pH 유지, 세포 유지가 좋기 때문에 전체적으로 좋은 배양 성능을 유도한다. 2가 전이 금속염 예를 들어 아연/구리염의 첨가는 락테이트 축적을 감소시키며 따라서, 배지의 pH 또한 유지된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 2가 전이 금속염은 또한 2가 전이 금속 이온으로 정의될 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 단백질 생산, 예를 들어, 대용량 상업용 단백질 생산, 예를 들어, 항체 생산을 개선하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 배양 배지에서 락테이트의 축적을 감소시키는 세포 배양 시스템에서 세포를 성장시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 2가 전이 금속염 즉 아연/구리염의 첨가는 약 5% 내지 약 40%의 락테이트 축적의 감소를 추가로 증가시킨다.
용어의 정의:
본 발명에서 기술하고 요구하는데, 다음 용어는 이하에서 설정한 정의에 따라 사용될 것이다.
용어 "항체"는 항체 또는 항체 유도체 또는 이의 단편을 포함하며 항체의 세부사항은 또한 본 발명의 항체 제조에 적용된다. 항체 단편 중에서 폴리펩타이드를 포함하는 항체의 기능적 등가물 또는 상동물은 면역글로불린 결합 도메인 또는 Fc 영역 또는 Fc 영역과 상동인 영역 또는 이의 적어도 일부와 함께 이런 결합 도메인을 모방하는 펩타이드를 포함한다. 면역글로불린 결합 도메인 또는 다른 폴리펩타이드에 융합된 등가물을 포함하는 키메릭 분자도 포함된다.
예시적 항체 분자는 손상되지 않은 면역글로불린 분자이며 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및 F(v)뿐만 아니라 N-글리칸 구조로 알려진 이런 부분을 포함하는 파라토프를 함유하는 면역글로불린 분자의 이런 부분이다.
항체는 혈청의 기능성 구성요소를 기술하며 주로 분자(항체 또는 면역글로불린, 단편 등)의 집합 또는 한 분자(항체 분자 또는 면역글로불린 분자)의 하나로 불린다. 항체 분자는 특이적 항원 결정부위(항원 또는 항원 에피토프)와 결합하거나 반응할 수 있어서, 면역학적 작동체 메커니즘의 유도를 일으킬 수 있다. 개별 항체 분자는 일반적으로 단일특이적인 것으로 생각되며 항체 분자의 조성물은 단클론(즉, 동일한 항체 분자로 이루어짐) 또는 다클론(즉, 동일한 항원 또는 구별된, 다른 항원에서 동일하거나 다른 에피토프와 반응하는 다른 항체 분자로 이루어짐)일 수 있다. 다클론 항체를 구성하는 구별되고 다른 항체 분자는 "멤버"로 부를 수 있다. 각 항체 분자는 이의 상응하는 항원에 특이적으로 결합하게 하는 독특한 구조를 가지며 모든 천연 항체 분자는 2개의 동일한 경사슬 및 2개의 동일한 중사슬의 동일한 전체 기본 구조를 가진다.
본 발명에서 사용된 대로, 구 " 폴리펩타이드 " 또는 " 폴리펩타이드 생성물"은 각각 용어 "단백질" 및 "단백질 생성물"와 동의어이며, 당업계에서 이해되는 것과 같이, 연속적인 펩타이드 결합을 통해 연결된 아미노산의 적어도 하나의 사슬을 의미한다. 특정 실시태양에서, "관심 단백질" 또는 "관심 폴리펩타이드" 등은 숙주 세포로 변형된 외인성 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질이다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포가 이에 의해 변형된 외인성 DNA는 "관심 단백질"을 암호화하며, 외인성 DNA의 핵산 서열은 아미노산의 서열을 결정한다. 특정 실시태양에서, "관심 단백질"은 숙주 세포에 대해 내인성인 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질이다. 특정 실시태양에서, 이런 관심 내인성 단백질의 발현은 숙주 세포를, 예를 들어, 하나 이상의 제어 서열을 포함 및/또는 관심 단백질의 발현을 증대시키는 단백질을 암호화할 수 있는 외인성 핵산 분자로 형질감염시킴으로써 변형된다.
본 발명에 사용된 대로, "항체 변형물"은 부모 항체의 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열을 가진 항체를 의미한다. 바람직하게는, 항체 변형물은 자연에서 발견되지 않는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변성 도메인 또는 경사슬 가변성 도메인을 포함한다. 이런 변형물은 부모 항체와 100% 미만 서열 동일성 또는 유사성을 필수적으로 가진다. 한 바람직한 실시태양에서, 항체 변형물은 부모 항체의 중사슬 또는 경사슬 가변성 도메인의 아미노산 서열과 약 75% 내지 100% 미만 아미노산 서열 동일성 또는 유사성, 더욱 바람직하게는 약 80% 내지 100% 미만, 더욱 바람직하게는 약 85% 내지 100% 미만, 더욱 바람직하게는 약 90% 내지 100% 미만 및 가장 바람직하게는 약 95% 내지 100% 미만의 아미노산 서열을 가질 것이다. 이 서열에 대한 동일성 또는 유사성은 서열들을 정렬하고 간격을 제공한 후, 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동일성을 얻기 위해, 부모 항체 잔기들과 동일한(즉 같은 잔기) 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다.
본 발명에서 사용된 용어 "배지들", "배지", "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 동물 세포, 예를 들어 포유류 세포를 성장시키는데 영양분을 제공하는 영양소들을 함유하는 용액을 의미하며 세포들과 조합된 배지를 의미할 수 있다.
바람직한 포유류 숙주들은 중국 햄스터 난소( CHO ) 세포들이다. 관심 단백질을 발현하기 위해 세포 및/또는 세포주를 유전적으로 처리하기 위한 방법 및 벡터는 당업계에 주지되어 있다. 유전자 처리 기술은 발현 벡터, 표적화된 상동 재조합 및 유전자 활성화를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 선택적으로, 단백질은, 예를 들어, 폴리펩타이드의 생산을 자연 상태에서 유도하지 않는 프로모터와 같은 이종 제어 요소의 제어하에서 발현된다. 예를 들어, 프로모터는 포유류 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 강한 바이러스 프로모터(예를 들어, CMV, SV40)일 수 있다. 숙주 세포는 정상적으로 단백질을 생산하거나 생산하지 않을 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 단백질을 생산하도록 유전적으로 처리된 CHO 세포일 수 있으며, 단백질을 암호화하는 핵산이 CHO 세포 속에 주입되었다는 것을 의미한다.
세포에 잠재적으로 독성인 부산물 락테이트가 포유류 세포 성장 동안 발생되었다. 락테이트의 축적은 배지의 버퍼링 능력에 영향을 미쳐 pH의 감소를 초래한다. 락테이는 세포 성장과 생산성뿐만 아니라 전체 생성물 품질에 악영향을 미친다. 배양 배지에서 락테이트 축적을 감소시키는 여러 시도가 이루어졌다. 이런 시도는 낮은 글루코스 농도하에서 세포 성장, 피루베이트 디카복실레이트의 과다 발현 및 락테이트 디하이드로지나제-A(LDH-A) 유전자의 낙-아웃을 포함한다.
다음 실시예들은 공정에서 락테이트 축적을 감소시키기 위해 특정 2가 전이 금속염의 첨가에 의해 어떻게 공정이 조작될 수 있는지를 보여준다. 락테이트는 작업 전체에서 거의 5-40% 감소한다.
본 발명의 한 실시태양에서, 2가 전이 금속염은 2가 전이 금속 이온으로 정의될 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 배양 배지로부터 단백질들/항체들을 분리하는데 사용될 수 있는 통상적으로 공지된 기술은 이온 교환 크로마토그래피, 겔 투과 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 친화성 크로마토그래피 기술은 배지로부터 항체들을 분리하기 위한 바람직한 기술로 사용되었다.
본 발명의 구체적인 실시태양들의 상기 설명은 예시와 설명을 위해 제공된다. 이들은 개시된 정확한 형태에 대한 배타적이거나 제한적이지 않다. 여러 변형과 변화가 상기교시의 관점에서 가능하다. 또한, 여러 변형이 가해져서 특정 상황, 재료, 물질의 조성물, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 취지 및 범위에 적합하게 할 수 있다. 모든 이런 변형은 본 발명에 첨부된 청구항의 범위 내에 있는 것으로 생각된다.
본 출원의 기술은 다음 실시예들의 도움으로 더욱 설명된다. 그러나, 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 :
락테이트의 수준은 YSI 7100 MBS 분석기의 사용에 의해 아래 실시예에서 모든 다음 실험에 대해 분석한다. 다음 실시예에서 인용한 대로 모든 아래 실험에 대한 pH는 pH 6.85-7.2로 유지된다. 산소의 수준은 교반 배양기에서의 교반에 의해 유지된 산소 수준에 의해 유지된다. 모든 아래 언급한 실시예에서, 첨가된 염의 농도는 배지에 존재하는 염의 농도이다. 온도는 사용된 세포들의 특성 및 다른 관련 변수를 기초로, 적절하게 변할 수 있다.
본 발명을 실행하는데 2개의 2가 전이 금속염을 사용하였다. 2개의 2가 전이 금속염은 황산구리 오수화물 및 황산아연 칠수화물이다.
실시예 1:
실시예 1(A)
세포 배양은 유가 방식으로 실행하였다. 세포 배양시에, 사용된 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포였고 HyClone CDM4NS0 배양 배지를 최초로 공급하였다. CHO 세포를 유전적으로 처리하여 안티 VEGF-A 항체를 생산하였다. 황산구리 칠수화물 염을 0.4mM의 농도로 배지에 첨가하였다. 반대로, 대조군 배지에 어떠한 구리염의 첨가가 없었다. 생산 발효 작업은 37±1℃에서 0.3-0.45x106 cells/ml의 최초 세포수로 시작하였고, 배치 단계에서 세포를 성장시키는데 처음 3-4일을 사용하였다. 다음 단계에서, 온도는 31+/-1℃로 낮추고 작업은 7일까지 지속한다. 아래 표 1은 작업 전체에서 감소된 락테이트의 수준을 개시한다. 그런 후에 생산된 안티 VEGF-A 항체를 친화성 크로마토그래피의 기술을 사용하여 배지로부터 수집하였다.
수명(시간)
대조군-
잔여 락테이트( mM ) 		구리염 첨가 - 잔여 락테이트 ( mM )
72 18 16
96 17.2 14.8
120 11.1 5.9
144 8 3.4
168 7 2
대조군은 락테이트의 축적을 약 61% 만큼 감소시킨 반면 첨가된 염을 가진 배지는 락테이트의 축적을 약 87.5% 만큼 감소시켰다. 본 실시예는 상기 염의 존재하에서 락테이트의 축적에 약 26.5% 만큼의 추가 감소를 나타내었다.
도 1(a)는 배양 배지에서 락테이트의 감소 수준을 예시한다.
실시예 1(B)
세포 배양은 유가 방식으로 실행하였다. 세포 배양시에, 사용된 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포였고 HyClone CDM4NS0 배양 배지를 최초로 공급하였다. CHO 세포를 유전적으로 처리하여 안티 VEGF-A 항체를 생산하였다. 황산아연 칠수화물 염을 0.4mM의 농도로 배지에 첨가하였다. 반대로, 대조군 배지에 어떠한 아연염의 첨가가 없었다. 생산 발효 작업은 37±1℃에서 0.3-0.45x106 cells/ml의 최초 세포수로 시작하였고, 배치 단계에서 세포를 성장시키는데 처음 3-4일을 사용하였다. 다음 단계에서, 온도는 31+/-1℃로 낮추고 작업은 7일까지 지속한다. 아래 표 2는 작업 전체에서 감소된 락테이트의 수준을 개시한다. 그런 후에 생산된 안티 VEGF-A 항체를 친화성 크로마토그래피의 기술을 사용하여 배지로부터 수집하였다.
수명(시간)
대조군 -
잔여 락테이트( mM ) 		아연염 첨가 - 잔여 락테이트 ( mM )
72 18.1 16.6
96 17.2 14.7
120 11.1 7.6
144 8 6.2
168 7 4.5
대조군은 락테이트의 축적을 약 61.32% 만큼 감소시킨 반면 첨가된 염을 가진 배지는 락테이트의 축적을 약 72.89% 만큼 감소시켰다. 본 실시예는 상기 염의 존재하에서 락테이트의 축적에 약 11.57% 만큼의 추가 감소를 나타내었다.
도 1(b)는 배양 배지에서 락테이트의 감소 수준을 예시한다.
실시예 2:
실시예 2A:
세포 배양은 유가 방식으로 실행하였다. 세포 배양시에, 사용된 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포였고 HyClone CDM4NS0 배양 배지를 최초로 공급하였다. CHO 세포를 유전적으로 처리하여 안티 Her-2 항체를 생산하였다. 황산구리 오수화물 염을 0.4mM의 농도로 배지에 첨가하였다. 반대로, 대조군 배지에 어떠한 구리염의 첨가가 없었다. 생산 발효 작업은 37±1℃에서 0.3-0.45x106 cells/ml의 최초 세포수로 시작하였고, 배치 단계에서 세포를 성장시키는데 처음 3-4일을 사용하였다. 다음 단계에서, 온도는 31+/-1℃로 낮추고 작업은 7일까지 지속한다. 아래 표 3은 작업 전체에서 감소된 락테이트의 수준을 개시한다. 그런 후에 생산된 안티 Her-2 항체를 친화성 크로마토그래피의 기술을 사용하여 배지로부터 수집하였다.
수명(시간)
대조군 -
잔여 락테이트( mM ) 		구리염 첨가 -
잔여 락테이트 ( mM )
72 18 16
96 13.1 11.8
120 8.3 7.4
144 7.4 6.9
168 8.9 5.6
대조군은 락테이트의 축적을 약 50.05% 만큼 감소시킨 반면 첨가된 염을 가진 배지는 락테이트의 축적을 약 65% 만큼 감소시켰다. 본 실시예는 상기 염의 존재하에서 락테이트의 축적에 약 14.5% 만큼의 추가 감소를 나타내었다.
도 2(a)는 배양 배지에서 락테이트의 감소 수준을 예시한다.
실시예 2B:
세포 배양은 유가 방식으로 실행하였다. 세포 배양시에, 사용된 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포였고 HyClone CDM4NS0 배양 배지를 최초로 공급하였다. CHO 세포를 유전적으로 처리하여 안티 Her-2 항체를 생산하였다. 황산아연 칠수화물 염을 0.4mM의 농도로 배지에 첨가하였다. 반대로, 대조군 배지에 어떠한 아연염의 첨가가 없었다. 생산 발효 작업은 37±1℃에서 0.3-0.45x106 cells/ml의 최초 세포수로 시작하였고, 배치 단계에서 세포를 성장시키는데 처음 3-4일을 사용하였다. 다음 단계에서, 온도는 31+/-1℃로 낮추고 작업은 7일까지 지속한다. 아래 표 4는 작업 전체에서 감소된 락테이트의 수준을 개시한다. 그런 후에 생산된 안티 Her-2 항체를 친화성 크로마토그래피의 기술을 사용하여 배지로부터 수집하였다.
수명(시간)
대조군 -
잔여 락테이트( mM ) 		아연염 첨가 - 잔여 락테이트 ( mM )
72 18 16
96 13.1 11.8
120 8.3 7.4
144 7.4 6.9
168 8.9 5.6
대조군은 락테이트의 축적을 약 34.5% 만큼 감소시킨 반면 첨가된 염을 가진 배지는 락테이트의 축적을 약 64.88% 만큼 감소시켰다. 본 실시예는 상기 염의 존재하에서 락테이트의 축적에 약 30.38% 만큼의 추가 감소를 나타내었다.
도 2(b)는 배양 배지에서 락테이트의 감소 수준을 예시한다.
실시예 3:
세포 배양은 유가 방식으로 실행하였다. 세포 배양시에, 사용된 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포였고 HyClone CDM4NS0 배양 배지를 최초로 공급하였다. CHO 세포를 유전적으로 처리하여 안티 CD6 항체를 생산하였다. 황산아연 칠수화물 염을 0.4mM의 농도로 배지에 첨가하였다. 반대로, 대조군 배지에 어떠한 아연염의 첨가가 없었다. 생산 발효 작업은 37±1℃에서 0.3-0.45x106 cells/ml의 최초 세포수로 시작하였고, 배치 단계에서 세포를 성장시키는데 처음 3-4일을 사용하였다. 다음 단계에서, 온도는 31±1℃로 낮추고 작업은 7일까지 지속한다. 아래 표 5는 작업 전체에서 감소된 락테이트의 수준을 개시한다. 그런 후에 생산된 안티 CD6 항체를 친화성 크로마토그래피의 기술을 사용하여 배지로부터 수집하였다.
수명(시간)
대조군 -
잔여 락테이트( mM ) 		아연염 첨가 -
잔여 락테이트 ( mM )
72 18 18
96 11.2 11.2
120 9.8 6.2
144 4.6 3
168 5.3 3.2
대조군은 락테이트의 축적을 약 70.55% 만큼 감소시킨 반면 첨가된 염을 가진 배지는 락테이트의 축적을 약 82.22% 만큼 감소시켰다. 본 실시예는 상기 염의 존재하에서 락테이트의 축적에 약 11.67% 만큼의 추가 감소를 나타내었다.
도 3은 배양 배지에서 락테이트의 감소 수준을 예시한다.
실시예 4:
4(A)에 대한 실험
세포 배양은 유가 방식으로 실행하였다. 세포 배양시에, 사용된 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포였고 HyClone CDM4NS0 배양 배지를 최초로 공급하였다. CHO 세포를 유전적으로 처리하여 안티 TNF 항체를 생산하였다. 황산구리 칠수화물 염을 0.4mM의 농도로 배지에 첨가하였다. 반대로, 대조군 배지에 어떠한 구리염의 첨가가 없었다. 생산 발효 작업은 37±1℃에서 0.3-0.45x106 cells/ml의 최초 세포수로 시작하였고, 배치 단계에서 세포를 성장시키는데 처음 3-4일을 사용하였다. 다음 단계에서, 온도는 31±1℃로 낮추고 작업은 7일까지 지속한다. 아래 표 6은 작업 전체에서 감소된 락테이트의 수준을 개시한다. 그런 후에 생산된 안티 TNF 항체를 친화성 크로마토그래피의 기술을 사용하여 배지로부터 수집하였다.
수명(시간)
대조군 -
잔여 락테이트( mM ) 		구리염 첨가 -
잔여 락테이트 ( mM )
72 20.8 20.4
96 21.3 20.3
120 18.2 16.3
144 15.6 13.2
168 17.6 14.6
대조군은 락테이트의 축적을 약 15.38% 만큼 감소시킨 반면 첨가된 염을 가진 배지는 락테이트의 축적을 약 28.43% 만큼 감소시켰다. 본 실시예는 상기 염의 존재하에서 락테이트의 축적에 약 13.05% 만큼의 추가 감소를 나타내었다.
도 4a는 배양 배지에서 락테이트의 감소 수준을 예시한다.
4(B)에 대한 실험
세포 배양은 유가 방식으로 실행하였다. 세포 배양시에, 사용된 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포였고 HyClone CDM4NS0 배양 배지를 최초로 공급하였다. CHO 세포를 유전적으로 처리하여 안티 TNF 항체를 생산하였다. 황산아연 칠수화물 염을 0.4mM의 농도로 배지에 첨가하였다. 반대로, 대조군 배지에 어떠한 아연염의 첨가가 없었다. 생산 발효 작업은 37±1℃에서 0.3-0.45x106 cells/ml의 최초 세포수로 시작하였고, 배치 단계에서 세포를 성장시키는데 처음 3-4일을 사용하였다. 다음 단계에서, 온도는 31±1℃로 낮추고 작업은 7일까지 지속한다. 아래 표 7은 작업 전체에서 감소된 락테이트의 수준을 개시한다. 그런 후에 생산된 안티 TNF 항체를 친화성 크로마토그래피의 기술을 사용하여 배지로부터 수집하였다.
수명(시간)
대조군 -
잔여 락테이트( mM ) 		아연염 첨가 -
잔여 락테이트 ( mM )
96 21.3 19.6
120 18.2 16.4
144 15.6 13.8
168 17.6 15
대조군은 락테이트의 축적을 약 17.37% 만큼 감소시킨 반면 첨가된 염을 가진 배지는 락테이트의 축적을 약 23.46% 만큼 감소시켰다. 본 실시예는 상기 염의 존재하에서 락테이트의 축적에 약 6.09% 만큼의 추가 감소를 나타내었다.
도 4b는 배양 배지에서 락테이트의 감소 수준을 예시한다.
실시예 5:
5(A)에 대한 실험
세포 배양은 유가 방식으로 실행하였다. 세포 배양시에, 사용된 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포였고 HyClone CDM4NS0 배양 배지를 최초로 공급하였다. CHO 세포를 유전적으로 처리하여 안티 VEGF-A 항체를 생산하였다. 황산구리 오수화물 염을 0.2mM의 농도로 배지에 첨가하였다. 반대로, 대조군 배지에 어떠한 구리염의 첨가가 없었다. 생산 발효 작업은 37±1℃에서 0.3-0.45x106 cells/ml의 최초 세포수로 시작하였고, 배치 단계에서 세포를 성장시키는데 처음 3-4일을 사용하였다. 다음 단계에서, 온도는 31±1℃로 낮추고 작업은 7일까지 지속한다. 아래 표 8은 작업 전체에서 감소된 락테이트의 수준을 개시한다. 그런 후에 생산된 안티 VEGF-A 항체를 친화성 크로마토그래피의 기술을 사용하여 배지로부터 수집하였다.
수명(시간)
대조군 -
잔여 락테이트(mM) 		구리염 첨가 -
잔여 락테이트 (mM)
72 23.3 23.3
96 16.3 16.3
120 11.8 10
144 7.2 5.9
168 4.6 3.4
대조군은 락테이트의 축적을 약 79.23% 만큼 감소시킨 반면 첨가된 염을 가진 배지는 락테이트의 축적을 약 85.40% 만큼 감소시켰다. 본 실시예는 상기 염의 존재하에서 락테이트의 축적에 약 6.17% 만큼의 추가 감소를 나타내었다.
도 5a는 배양 배지에서 락테이트의 감소 수준을 예시한다.
5(B)에 대한 실험
세포 배양은 유가 방식으로 실행하였다. 세포 배양시에, 사용된 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포였고 HyClone CDM4NS0 배양 배지를 최초로 공급하였다. CHO 세포를 유전적으로 처리하여 안티 VEGF-A 항체를 생산하였다. 황산아연 칠수화물 염을 0.2mM의 농도로 배지에 첨가하였다. 반대로, 대조군 배지에 어떠한 아연염의 첨가가 없었다. 생산 발효 작업은 37±1℃에서 0.3-0.45x106 cells/ml의 최초 세포수로 시작하였고, 배치 단계에서 세포를 성장시키는데 처음 3-4일을 사용하였다. 다음 단계에서, 온도는 31±1℃로 낮추고 작업은 7일까지 지속한다. 아래 표 9는 작업 전체에서 감소된 락테이트의 수준을 개시한다. 그런 후에 생산된 안티 VEGF-A 항체를 친화성 크로마토그래피의 기술을 사용하여 배지로부터 수집하였다.
수명(시간)
대조군 -
잔여 락테이트(mM) 		아연염 첨가 -
잔여 락테이트 (mM)
72 23.3 23.3
96 16.2 14.9
120 11.8 7.9
144 7.2 5.8
168 4.6 2.7
대조군은 락테이트의 축적을 약 79.23% 만큼 감소시킨 반면 첨가된 염을 가진 배지는 락테이트의 축적을 약 88.41% 만큼 감소시켰다. 본 실시예는 상기 염의 존재하에서 락테이트의 축적에 약 9.18% 만큼의 추가 감소를 나타내었다.
도 5b는 배양 배지에서 락테이트의 감소 수준을 예시한다.
실시예 6:
세포 배양은 유가 방식으로 실행하였다. 세포 배양시에, 사용된 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포였고 HyClone CDM4NS0 배양 배지를 최초로 공급하였다. 음성 대조군으로 사용된 황산마그네슘 염을 0.4mM의 농도로 배지에 첨가하였다. 반대로, 대조군 배지에 어떠한 마그네슘 염의 첨가가 없었다. 생산 발효 작업은 37±1℃에서 0.3-0.45x106 cells/ml의 최초 세포수로 시작하였고, 배치 단계에서 세포를 성장시키는데 처음 3-4일을 사용하였다. 다음 단계에서, 온도는 31±1℃로 낮추고 작업은 7일까지 지속한다.
도 6은 배양 배지에서 락테이트의 감소 수준을 예시한다.
실시예 7:
세포 배양은 유가 방식으로 실행하였다. 세포 배양시에, 사용된 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포였고 HyClone CDM4Mab 배양 배지를 최초로 공급하였다. 황산아연 칠수화물 염을 0.3mM의 농도로 배지에 첨가하였다. 반대로, 대조군 배지에 어떠한 황산아연 염의 첨가가 없었다. 생산 발효 작업은 37±1℃에서 0.3-0.45x106 cells/ml의 최초 세포수로 시작하였고, 배치 단계에서 세포를 성장시키는데 처음 3-4일을 사용하였다. 다음 단계는 온도를 31±1℃로 낮추고 작업은 7일까지 지속하는 것을 수반하였다.
도 7은 배양 배지에서 락테이트의 감소 수준을 예시한다.

Claims (16)

  1. 세포 배양 시 세포 배지에서 5% 내지 40% 락테이트의 축적을 감소시키는 방법으로서, 세포 배양액에 0.2mM 내지 0.4mM 범위의 농도로 황산아연(zinc sulphate)을 첨가하는 단계를 포함하며, 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    세포는 포유류 세포주로부터 얻어지는 방법.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    배양은 유가 배양, 배치 배양, 쉐이크 플라스크 및 바이오리액터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 시스템에서 실행되는 방법.
  6. 세포로부터 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서,
    a. 5% 내지 40% 락테이트 축적을 감소시키기 위해 세포 배지에 0.2mM 내지 0.4mM 범위의 농도로 황산아연(zinc sulphate)을 첨가하는 단계; 및
    b. 폴리펩타이드를 생산하고 회수하는 단계를 포함하며,
    세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    세포는 포유류 세포주로부터 얻어지는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 6 항에 있어서,
    폴리펩타이드는 안티 VEGF-A 항체, 안티 Her-2 항체, 안티 CD6 항체 및 안티 TNF 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  11. 제 6 항에 있어서,
    배양 공정은 유가 배양, 배치 배양, 쉐이크 플라스크 및 바이오리액터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 시스템에서 실행되는 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
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